CN108498485B - 二氢青蒿素修饰的药物传递载体及其在药学中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于药物制剂新辅料和新剂型领域，涉及以内源性载脂蛋白E为靶点的药物传递系统的设计和应用，包括二氢青蒿素(DHA)通过聚乙二醇(PEG)连接臂对疏水性材料进行修饰的载体结构设计和合成。所使用的主动定制载脂蛋白E的载体材料，以DHA作为靶头，聚乙二醇作为连接臂，疏水性材料(如PLGA等)作为锚定部位。该载体材料制备的纳米递送制剂可包载多种抗肿瘤药物，并能通过其表面DHA结合的载脂蛋白E与肿瘤细胞高表达的低密度脂蛋白受体(LDLr)相互作用，克服多种生物学传递屏障,有效提高纳米粒在肿瘤部位的蓄积以及在肿瘤细胞中的摄取和抗肿瘤活性。该纳米递送制剂稳定性好，安全性高，靶向性佳，可用于静脉注射，有较大的市场应用前景。

Description

二氢青蒿素修饰的药物传递载体及其在药学中的应用

技术领域

本发明属于药物制剂新辅料和新剂型领域，涉及以内源性载脂蛋白E为靶点的药物传递载体的设计和应用，包括二氢青蒿素(DHA)通过聚乙二醇(PEG)连接臂对疏水性材料进行修饰的载体结构设计、合成及应用。

背景技术

癌症又称恶性肿瘤，目前最有效的治疗方式是化疗，但是化疗在杀死肿瘤细胞的同时，也杀死自身健康细胞。因此，为了降低毒副作用，肿瘤靶向纳米药物传递系统应运而生。靶向纳米药物传递系统的设计原则是对纳米递送形式(例如纳米粒、脂质体、胶束、纳米乳、纳米凝胶和纳米囊泡等)表面进行小分子、配体或抗体修饰，利用肿瘤细胞膜上过度表达的受体或转运体特异性识别、高亲和力地结合纳米药物，进而来提高肿瘤细胞的药物摄取量，增加抑瘤效果、降低毒副作用。然而，靶向递送形式一旦进入到血液后，由于被血中的调理素、补体、巨球蛋白、免疫球蛋白等物质吸附,递送形式表面形成蛋白水化冕，进而被网状内皮系统识别、吞噬，从体循环中清除，不能充分发挥设计所赋予的靶向功能。载脂蛋白E是人血中重要的脂类转运蛋白，被广泛应用于低密度脂蛋白受体(LDLr)为基础的药物传递系统设计。另有文献报道，过度增殖的肿瘤组织会摄取大量载脂蛋白E作为营养供应，主要通过被动EPR效应和主动载脂蛋白E受体(LDLr)转运作用。在此，我们旨在开发能够主动定制载脂蛋白E的纳米递送形式，研究其在体内循环时间、肿瘤组织的靶向和渗透作用、肿瘤细胞的摄取以及体内抗肿瘤活性。

发明内容

本发明旨在提供一种新型的主动定制载脂蛋白E的药物传递载体，该载体为二氢青蒿素通过聚乙二醇连接臂对疏水性材料进行修饰，该载体可以广泛应用于主动定制载脂蛋白E。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

具有如下结构的二氢青蒿素修饰的载体，

其中：

聚合度n为10-45，优选22-45，更优选为n＝45；R为疏水性材料，所述疏水性材料为聚合物、磷脂、脂肪酸、环糊精或疏水性药物中的一种或几种。

其中，所述的聚合物可为聚乳酸羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚己内酯(PCL)、聚乳酸(PLA)、聚-3-羟基丁酸-3-羟基己酸酯(PHBHHx)及其衍生物中的一种或几种；

磷脂可为二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二硬脂酰基磷脂酰丝氨酸(DSPS)、二硬脂酰基磷脂酰肌醇(DSPI)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二月桂酰基磷脂酰乙醇胺(DLPE)、二花生四烯酰基磷脂酰乙醇胺(DAPE)及其衍生物中的一种或几种；

脂肪酸可为硬脂酸、棕榈酸、豆蔻酸、月桂酸、癸酸、辛酸、花生四烯酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸等及其衍生物中的一种或几种；

环糊精可为α、β、γ-环糊精及其衍生物中的一种或几种；

疏水性药物可为紫杉烷类、喜树碱类、蒽醌类、二氢吡啶类、非甾体抗炎药类、维生素类等及其衍生物中的一种或几种。

本发明所述的二氢青蒿素修饰的载体通过如下方法制备：首先，利用聚乙二醇作为引发剂，聚合合成聚乳酸羟基乙酸聚乙二醇嵌段聚合物(PLGA-PEG2000-COOH)，然后在1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI)和1-羟基苯并三唑(HOBt)催化下与二氢青蒿素上的-OH酯化得到PLGA-PEG2000-DHA(PPD)。所述的聚乙二醇为HO-PEG2000-COOH，也可以为其它分子量的聚乙二醇。

本发明还具体提供了PPD的制备过程，如下步骤所述：将聚乙二醇加入到三颈瓶中，减压氮气140℃油浴条件下搅拌2h，然后将等量的乙交酯、丙交酯和适量的辛酸亚锡加入到三颈瓶，140℃油浴条件下回流10h，利用乙醚沉淀萃取得到PLGA-PEG2000-COOH。将上述PLGA-PEG2000-COOH和二氢青蒿素，在EDCI、HObt的催化作用下反应48h，得到PPD。

m＝n＝61。

该聚合物易溶于二氯甲烷、二甲基亚砜等有机溶剂。

本发明的二氢青蒿素修饰的载体为二氢青蒿素通过聚乙二醇连接臂对疏水性材料进行修饰的载体材料，可以作为药物载体或者修饰剂在纳米粒、脂质体、胶束、囊泡、纳米凝胶、纳米乳等药物传递类型中应用。

本发明的二氢青蒿素修饰的载体，可以作为药物载体或者修饰剂制备微粒制剂，所述的微粒制剂为纳米粒、脂质体、胶束、囊泡、纳米凝胶、纳米乳等药物传递类型，是一种稳定性好、能主动结合载脂蛋白E，具有较好的体内循环效果、肿瘤靶向和肿瘤细胞摄取的材料。

所述的二氢青蒿素修饰的载体，可以作为药物载体或者修饰剂制备微粒制剂，用于修饰包载紫杉烷类、喜树碱类、蒽醌类、二氢吡啶类、非甾体抗炎药中的任一物质或其衍生物，以及基因类药物DNA或siRNA。

二氢青蒿素修饰的载体制备的微粒制剂中，药物和二氢青蒿素修饰的载体的比例可在1/10-1/30之间，优选1/15-1/25,高于1/15时药物不能充分包载在纳米载体中，低于1/25时，药物能包载充分，会降低制剂的载药量。

二氢青蒿素修饰的载体，在作为药物载体或者修饰剂制备微粒制剂时，可采用乳化溶剂挥发法或薄膜分散法制备。

乳化溶剂挥发法采用下述步骤：将上述的药物和二氢青蒿素修饰的载体完全溶解于适量的二氯甲烷中，在适当温度和乳化超声时间下，得到具有主动定制载脂蛋白E的纳米粒。

薄膜分散法采用下述步骤：将上述二氢青蒿素修饰的载体、药物、胆固醇、磷脂(重量比为2:1:1:30)(其中载体的重量比可为1-3，优选比例为2)完全溶解于适量的二氯甲烷中，在适当温度下，旋干成膜，加入水化剂水化，并探头超声后，得到具有主动定制载脂蛋白E的脂质体。

本发明将二氢青蒿素通过聚乙二醇(PEG)连接臂对疏水性材料进行修饰，并运用于主动定制载脂蛋白E纳米递送形式的设计和制备，该纳米递送形式具有包封率高、稳定性好、肿瘤靶向等优势，能显著提高小鼠乳腺癌细胞的摄取，大大增强抗肿瘤效率，克服了肿瘤生物学传递屏障。运用该系列聚合物材料制成的纳米递送制剂，在药学中具有广阔的应用前景。

本发明具有以下有益效果：制备了新型的靶向血浆载脂蛋白E的载体材料PPD，载体制备过程温和，易操作。运用该二氢青蒿素修饰的载体制备出能主动定制载脂蛋白E的纳米药物递送形式，并具有粒径较小且均一，包封率高，稳定性好，肿瘤靶向性好等优点。

附图说明

图1为本发明实施例1的(A)PLGA-PEG2000-COOH和(B)PPD的¹HNMR谱图

图2为本发明实施例1的(A)DHA,(B)PLGA-PEG2000-COOH和(C)PPD的IR谱图

图3为本发明实施例2的(A)PP NPs和(B)PPD NPs的动态光散射和透射电镜图

图4为本发明实施例3的DHA-PEG-Stearate修饰的脂质体的动态光散射粒径图

图5为本发明实施例3的DHA-PEG-Stearate修饰的脂质体的透射电镜图

图6为本发明实施例4的PP NPs和PPD NPs的(A)DSC和(B)XRD图

图7为本发明实施例5的PP NPs和PPD NPs的血浆稳定性图

图8为本发明实施例5的PP NPs和PPD NPs的长期稳定性图

图9为本发明实施例6的PP NPs和PPD NPs的体外释放图

图10为本发明实施例7的PP NPs和PPD NPs吸附的前20种含量蛋白图

图11为本发明实施例8的(A-B)空白载体，(C)多西他赛溶液剂，(D)PP NPs和(E)PPD NPs的48h细胞毒性图

图12为本发明实施例9的(A)PPD NPs和(B)PP NPs共聚焦摄取图，(C-D)为PP NPs和PPD NPs流式定量图

图13为本发明实施例10的PP NPs和PPD NPs的药时曲线图

图14为本发明实施例11的Cy7标记的PP NPs和PPD NPs的(A)4h和(B)24h离体器官荧光分布图

图15为本发明实施例12的PP NPs和PPD NPs的在体肿瘤生长曲线图。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不将发明限制在所述的实施例范围之中。

实施例1

二氢青蒿素修饰的载体PPD的制备：

将聚乙二醇(HO-PEG2000-COOH)加入三颈瓶中，在减压氮气140℃油浴条件下搅拌2h，然后将等量的乙交酯、丙交酯和适量的辛酸亚锡加入三颈瓶，140℃油浴条件下回流10h，利用乙醚沉淀萃取得到PLGA-PEG2000-COOH。将上述PLGA-PEG2000-COOH和二氢青蒿素，在EDCI、HObt催化下反应48h，得到PPD。

步骤中PLGA的分子量为8000，但是并不限于此，本发明的PLGA亦可是一端为羧基修饰的PLGA，但是并不局限于以上物质。PLGA的分子量可以在8000-38000范围内。

采用核磁共振测定¹H-NMR氢谱来确定实施例1中PPD的结构(PEG分子量2000，PLGA分子量8000，且PLGA中，单体乳酸和单体羟基乙酸的比例为1：1)，选用的溶剂为CDCl₃，结果如图1。5.43ppm和5.78ppm为二氢青蒿素(-OCH(O-CH-)C-),5.78ppm是(-OCH(O-CO-)C-)上的典型质子H，3.65ppm间的质子峰为聚乙二醇(-CH₂ CH₂ O-)中的H，5.22ppm，1.57ppm和4.83ppm分别为为PLGA上(-OCHCOO-),(-CHCH₃ ),4.83(-COOCH₂ COO-)的质子峰。

实施例2

乳化溶剂挥发法制备包载多西他赛的纳米粒

称取1mg多西他赛或0.1mg香豆素6，溶于适量的二氯甲烷，加入20mg实施例1制备的PPD，加入5mL含有0.5％PVA去离子水，探头超声300W 5min，采用离心法除去未包裹的药物。PP纳米粒的制备方法类似，只是将PPD替换为PP即可。

将实施例2中制备的纳米粒通过动态光散射和透视电镜测定其粒径大小和形态。结果如图3，纳米粒的粒径约为150nm，粒径分布窄；透视电镜图表明载药纳米粒为粒径均匀的球形。

实施例3

薄膜分散法制备载多西他赛或香豆素6的DHA-PEG-Stearate修饰的脂质体

称取1mg多西他赛或0.1mg香豆素6，溶于适量二氯甲烷中，加入2mg实施例2制备的DHA-PEG-Stearate(二氢青蒿素-聚乙二醇-硬脂酸载体)，以及30mg的大豆磷脂和1mg的胆固醇。旋干成膜，加入2mL的去离子水水化30min，探头超声300W，5min，采用微柱离心法除去未包裹的药物。

将实施例3中制备的脂质体通过动态光散射和透视电镜测定脂质体的粒径大小和形态。结果如图4、5，脂质体的粒径约为130nm，粒径分布窄；透视电镜图表明载药脂质体为粒径均一的球形。

实施例4

PEG2000-PLGA8000制备的多西他赛纳米粒(PP NPs)和DHA-PEG2000-PLGA8000制备的多西他赛纳米粒(PPD NPs)的DSC和XRD实验

按照实例2的方法制备的纳米粒，冻干后通过DSC和XRD分析DTX在纳米粒中的存在状态，分析样品包括：DTX原料药，空白PP NPs，DTX原料药和空白PP NPs物理混合物，冻干的PP NPs和PPD NPs。

图6结果表明DTX以无定型或分子态包裹在纳米粒中。

实施例5

PP NPs和PPD NPs的多西他赛纳米粒的稳定性试验

按照实例2制备纳米粒，置于37℃10％FBS pH 7.4溶液中，通过动态光散射测定纳米粒在0.5h,12h,24h,48h,72h的粒径。同时，对纳米粒在4℃pH 7.4溶液中的长期稳定性也进行了考察。

图7、图8结果表明PP NPs和PPD NPs具有较好的稳定性。

实施例6

PP NPs和PPD NPs的多西他赛纳米粒的体外释放试验

采用透析法考察实例2制备的纳米粒体外释药特征。移取含300μg的载药纳米粒溶液于透析袋中，透析袋两端夹紧，分别置于含有30mL pH 7.4PBS(含1％Tween 80)的释放介质的锥形瓶中，在37℃恒温振荡器中以100r/min进行体外释放度考察。分别在2、4、6、8、10、12、24、48和72h取样2mL，同时补充2mL新鲜释放介质，样品经0.45μm微孔滤膜过滤，取20μL进行HPLC测定。

图9结果表明PP NPs和PPD NPs的多西他赛纳米粒释药缓慢，有利于更多的药物达到肿瘤部位。

实施例7

PP NPs和PPD NPs的多西他赛纳米粒的蛋白冕含量测定

采用LC-MS/MS测定实例2制备的纳米粒表面蛋白冕含量。将实施例2制备的纳米粒和大鼠血清37℃孵化1h，16000g离心10min，收集含有蛋白冕的纳米粒，测定纳米粒表面的总蛋白量。这些纳米粒经pH7.4水洗至完全去除软冕，然后再用6％SDS洗完全除去硬冕，合并软冕硬冕进行蛋白组学测定，共价结合的蛋白冕是两者的差值。

图10结果表明PPD NPs的多西他赛纳米粒能够富集载脂蛋白E。

实施例8

细胞毒性实验

将处于对数生长期的4T1和3T3细胞以3×10³/孔/0.2mL的培养液埋于96孔板中，24h后将实施例2制备的PP NPs和PPD NPs的多西他赛纳米粒按不同浓度分别加入各孔，每孔加入200μL含纳米粒溶液，每个浓度5个平行孔，置于培养箱中孵育。孵育48h后，取出96孔板，每孔加入20μL 5mg/mL MTT，再放入培养箱中孵育4h，甩板，将96孔板倒扣于滤纸中充分吸干残留液体，每孔加入200μL DMSO于振荡器中振荡10min，酶标仪测定各孔在490nm处的吸光度。计算抑制率：

细胞存活率(％)＝A_加药孔/A_对照孔×100％

MTT法测定纳米粒细胞毒性结果如图11，细胞抑制率随药物浓度增加而增大，并且PPD NPs对细胞的抑制作用有较好的选择性。

实施例9

细胞摄取实验

将LDLr高表达的4T1和LDLr低表达的3T3细胞以8×10⁴/孔/1mL的培养液埋于12孔板中，24h后加入实施例2制备的PP NPs和PPD NPs的香豆素6修饰的纳米粒(1μg/mL)，平行3孔，置培养箱中孵育2h。弃上清，PBS洗三遍，DAPI染色，使用共聚焦显微镜进行观察。同时，PBS洗三遍后，使用流式细胞仪对定量细胞摄取纳米粒进行了考察。为了证明LDLr介导PPDNPs摄取，Ultroser G诱导的LDLr高表达的4T1-G细胞的摄取也进行了量化。

细胞摄取的结果见图12,相比于成纤维细胞3T3，PPD NPs能被LDLr高表达的4T1细胞选择摄取；相比于4T1细胞，4T1-G具有更高的PPD NPs摄取能力。

实施例10

药动学实验

将实施例2制备的PP NPs和PPD NPs的多西他赛纳米粒(5mg DTX/kg)静脉注射给禁食12h的SD大鼠。给药后在设计的时间点眼眶取血0.3ml，血液立即移入经肝素处理的试管中，离心10min(13000g)，分离血浆，于-80℃冰箱中冷冻直至分析。

药动学结果如图13，PPD NPs具有较好的长循环效果，且AUC能提高1.9倍。

实施例11

PPD NPs的肿瘤靶向性考察

采用活体成像法考察实例2制备Cy7标记的PP NPs和PPD NPs的肿瘤蓄积情况。以2mg/kg Cy7尾静脉给予Balb/c小鼠体内，分别在4h和24h后，将小鼠的心，肝，脾，肺，肾和肿瘤取出，通过活体成像仪观察纳米粒的分布情况。

肿瘤靶向性结果实验结果见图14，结果表明PPD NPs具有更好的肿瘤靶向性，并且主动靶向的LDLr参与了纳米粒的肿瘤蓄积。

实施例12

PPD NPs的抗肿瘤活性研究

荷瘤裸鼠随机分为4组，每组5只，分别为生理盐水组(空白对照组)，DTX-Sol和实例2制备PP NPs和PPD NPs纳米制剂组(5mg DTX/kg)，采取尾静脉注射的给药方式，隔两天给药一次，共给药5次。给药后，隔天测量肿瘤大小，并绘制肿瘤生长曲线。

药效学结果实验结果见图15，结果表明PPD NPs具有最好的肿瘤抑制效果。

Claims (8)

1.二氢青蒿素修饰的药物传递载体的药物微粒制剂，其特征在于，药物和二氢青蒿素修饰的药物传递载体的比例为1/15-1/25，所述的药物为紫杉烷类、香豆素；所述的二氢青蒿素修饰的药物传递载体的结构如下：

其中，n为22-45，R为PLGA。

2.如权利要求1所述的二氢青蒿素修饰的药物传递载体的药物微粒制剂，其特征在于，n=45。

3.如权利要求1或2所述的二氢青蒿素修饰的药物传递载体的药物微粒制剂，其特征在于，所述的二氢青蒿素修饰的药物传递载体的制备方法如下：利用聚乙二醇作为引发剂，聚合合成聚乳酸羟基乙酸聚乙二醇嵌段聚合物，然后在1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和1-羟基苯并三唑催化下与二氢青蒿素上的-OH酯化得到二氢青蒿素修饰的药物传递载体。

4.如权利要求3所述的二氢青蒿素修饰的药物传递载体的药物微粒制剂，其特征在于，所述的引发剂为HO-PEG2000-COOH。

5.如权利要求1所述的二氢青蒿素修饰的药物传递载体的药物微粒制剂，其特征在于，所述的微粒制剂为纳米粒、脂质体、胶束、囊泡、纳米凝胶或纳米乳。

6.如权利要求1、2、4或5所述的二氢青蒿素修饰的药物传递载体的药物微粒制剂，其特征在于，所述的药物微粒制剂采用乳化溶剂挥发法或薄膜分散法制备。

7.如权利要求3所述的二氢青蒿素修饰的药物传递载体的药物微粒制剂，其特征在于，所述的药物微粒制剂采用乳化溶剂挥发法或薄膜分散法制备。

8.权利要求1-7任何一项所述的二氢青蒿素修饰的药物传递载体的药物微粒制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。

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