CN104888235A

CN104888235A - 具有共递送多个药物的pH敏感纳米粒前药及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN104888235A
Application number: CN201510224988.4A
Authority: CN
Inventors: 刘鉴峰; 张玉民; 褚丽萍; 刘金剑; 杨翠红; 高红林
Original assignee: Institute of Radiation Medicine of CAMMS
Current assignee: Institute of Radiation Medicine of CAMMS
Priority date: 2015-05-06
Filing date: 2015-05-06
Publication date: 2015-09-09

Abstract

本发明涉及一种具有共递送多个药物的pH敏感纳米粒前药及其制备方法和应用。外层为具有高度生物相容性的聚乙二醇，内核为与亲水端键和抗肿瘤药物阿霉素（DOX），再通过疏水作用包裹另一疏水抗肿瘤药物姜黄素（Cur）。其结构是为：PEG-DOX-W-NPs。在pH响应条件下，纳米粒前药通过解体同时释放多个抗肿瘤药物以发挥联合治疗作用。本发明提供的pH敏感纳米粒前药，其生物相容性好，体内作用时间长。制备方法简便、稳定性良好、便于操作推广。

Description

具有共递送多个药物的pH敏感纳米粒前药及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及高分子化学和生物医学工程技术领域，涉及一个能够负载多个化疗药物的pH敏感纳米粒前药，特别是具有共递送多个药物的pH敏感纳米粒前药及其制备方法与应用。

背景技术

传统化疗在治疗癌症疾病时受到了多重限制，小分子抗肿瘤药物常作为临床上治疗脑胶质瘤疾病的化疗制剂，但由于其本身的物理化学特性导致的生物利用度差、血液/肾清除速率高、特异性差、肿瘤蓄积浓度低、毒副作用大，以及肿瘤多药耐药等问题严重限制了其临床应用。临床上必须通过增加给药剂量来满足有效浓度的药物到达肿瘤细胞内，由此会导致机体毒副作用的发生。联合治疗的提出给传统化疗提供了新的转机，拟通过药物间对肿瘤细胞的不同作用机制发挥杀伤效果，进而降低每个药物的给药剂量以降低对正常组织的毒副作用。然而，由于不同药物的理化性质导致的体内药代动力学特性的不同，使药物根据各自的特性在体内分布代谢，导致注射到体内的药物不能够“同时同位”的发挥杀伤肿瘤的作用。并没有从根本上解决化疗效率差，毒副作用大的难题。

纳米载体在改善化疗药物的水溶性、生物利用度和延长体内循环时间方面取得了很明显的结果。而传统的纳米载体通过物理负载药物的方法载药量一般都很低，必须通过注射高浓度载体或频繁注射才能实现有效药物浓度被递送至肿瘤内，由此导致体内大量的载体蓄积可能产生未知的毒副作用以及肿瘤耐药的产生。同时一些通过纳米沉淀技术组装的载体，常常会导致纳米药物在注射到体内几小时后会有部分药物发生“突释”。这些过早释放的药物由于被动扩散会导致机体产生严重的副作用；同时二次释放的药物由于浓度低、释放速率慢导致抗肿瘤活性明显降低。因此，有必要设计一个能够可控制药物释放的纳米粒前药，即保证药物活性在长循环时“隐藏”起来，到达肿瘤细胞时实现完全释放，以此来达到高效杀伤肿瘤并降低毒副作用的目的。

发明内容

本发明目的在于提供一个能够负载多个药物并响应肿瘤细胞内环境药物释放的高载药量的纳米粒前药，特点是：实现纳米粒前药通过被动靶向（EPR效应）进入肿瘤细胞内，pH 敏感纳米粒前药实现多个抗肿瘤药物在胞内的响应性释放，根据药物的不同机制发挥联合杀伤肿瘤细胞的作用。即保证了有效浓度的多个药物到达瘤细胞内发挥联合抗肿瘤作用，同时降低了药物在正常组织的渗透和载体蓄积所引起的副作用和系统毒性。

本发明中，设计了一个具有高载药量，肿瘤微环境响应性释放的纳米粒前药，通过物理负载的方式负载其它药物实现同时递送多个药物，以发挥联合抗肿瘤作用彻底杀伤肿瘤细胞，以此来解决化疗药物的相容性和生物利用度的问题，同时解决了载体的负载和递送药物的效率，以及单一药物治疗导致的耐药性的产生。

为实现上述目的，本发明公开了如下的技术内容：

具有共递送多个药物的pH敏感纳米粒前药，具有如下的结构：

PEG-W-Cur-NPs

其中PEG为聚乙二醇；

DOX为：阿霉素；

W为姜黄素、紫杉醇、多西他赛、喜树碱、羟基喜树碱、长春花碱、地塞米松、或博来霉素；

NPs为：nanoparticles，粒径为183.5±4.5 nm纳米粒；

根据透射电子显微镜（TEM）拍照结果，显示本发明的药物形态为圆形的纳米粒子药物，根据动态光散射（DLS）结果显示本发明的纳米粒子药物粒径为183.5±4.5 nm，粒径均一。

本发明所述具有共递送多个药物的pH敏感纳米粒前药的制备方法，其特征在于按如下的步骤进行：

（1）pH敏感纳米粒前药的制备：称取200 mg 分子量为2000的mPEG-CHO（醛基化聚乙二醇）和50 mg 阿霉素，将其共溶于2.0 mL的二甲基亚砜内，加入20 μL三乙胺作为催化剂，40℃水浴锅内震荡反应24 h；

（2）将溶液置于截留分子量为1 KDa的透析袋内，DMSO 作为透析液，透析48 h除去未反应的DOX；再将溶液置于截留分子量为3.5 KDa的透析袋内，pH7.4的PBS作为透析液，透析48 h 除去DMSO；

（3）将得到的pH 敏感的前药纳米粒水分散液冻干，得到可再分散的纳米粒冻干粉（PEG-DOX nanoparticles (NPs) （聚乙二醇化阿霉素纳米粒前药）。

（4）PEG-DOX-Cur（聚乙二醇化的阿霉素-姜黄素）制备：称取PEG-DOX冻干粉30 mg，6 mg姜黄素（w），共溶于2 mL DMSO内，将溶液缓慢的逐滴加入盛有10 mL pH7.4的PBS烧杯内，不断震荡，最后将混合溶液置于截留分子量为1 KDa的透析袋内，pH7.4的PBS作为透析液，透析48 h 以除去未反应的姜黄素和DMSO，得到前药纳米粒溶液PEG-DOX-Cur NPs（聚乙二醇化的阿霉素-姜黄素纳米粒前药）。

本发明更进一步公开了含有具有共递送多个药物的pH敏感纳米粒前药的药物组合物，所述的组合物的剂型为冻干粉或者为生理盐水分散液针剂。

本发明更进一步公开了具有共递送多个药物的pH敏感纳米粒前药在制备用于诊断试剂、荧光探针，诊疗一体化方面的应用。

本发明提供的pH敏感的纳米粒前药，提供了一个负载多个药物的平台，实现了多个药物在肿瘤环境内的同时响应性释放，保证了不同药物的体内动力学一致性，并根据各自的抗肿瘤机制协同杀伤肿瘤细胞。

实验结果证明：以PEG-DOX NPs的基础上，负载另一疏水抗肿瘤药物，能够实现两个或多个药物的共同快速释放，同时根据不同抗肿瘤机制发挥协同杀伤肿瘤细胞的能力，其抗肿瘤效果尤为明显；由于前药的PEG的引入，导致药物在体内的作用时间明显延长，同时由于被动靶向的作用导致药物在肿瘤内的蓄积含量明显的高于裸药（例如DOX），导致其体内体内抗肿瘤效果会更加明显。

本发明典型的含有具有共递送多个药物的pH敏感纳米粒前药，其制备方法为：

pH敏感纳米粒前药的制备方法是：称取200 mg 分子量为2000的mPEG-CHO（Methoxy-poly(ethylene glycol)-aldehyde）和50 mg 阿霉素（DOX），将其共溶于2.0 mL的二甲基亚砜（DMSO）内，加入20 μL三乙胺作为催化剂，40℃水浴锅内震荡反应24 h。将溶液置于截留分子量为1 KDa的透析袋内，DMSO 作为透析液，透析48 h 以除去未反应的DOX；再将溶液置于截留分子量为3.5 KDa的透析袋内，PBS（pH7.4）作为透析液，透析48 h 以除去DMSO。将得到的pH 敏感的前药纳米粒水分散液冻干，得到可再分散的纳米粒冻干粉（PEG-DOX nanoparticles (NPs)）。

PEG-DOX-Cur 制备方法是：称取PEG-DOX冻干粉30 mg，6 mg姜黄素（curcumin），共溶于2 mL DMSO内，将溶液缓慢的逐滴加入盛有10 mL PBS（pH7.4）的烧杯内，不断震荡。最后将混合溶液置于截留分子量为1 KDa的透析袋内，PBS（pH7.4）作为透析液，透析48 h 以除去未反应的curcumin和DMSO。得到前药纳米粒溶液PEG-DOX-Cur NPs。

本发明含有具有共递送多个药物的pH敏感纳米粒前药其pH敏感响应性能够实现药物的特异性释放的同时，纳米粒发生断裂后，药物发挥抗肿瘤作用，亲水端溶于体内可降低体内载体的蓄积。本发明选择聚乙二醇（PEG）为亲水端，抗肿瘤药物阿霉素（DOX）直接作为疏水内核，药物直接键合在亲水分子PEG上能够显著地提高载药能力；亲水端和疏水端通过PEG末端的醛基（CHO）与DOX的氨基（NH2）反应得到具有pH响应的席夫碱键，能够满足药物快速的可控制释放。在此纳米粒前药基础上，搭建一个能够同时递送多个药物的前药纳米粒平台。即通过疏水作用将另外一种疏水抗肿瘤药物包覆在纳米粒前药核内，同时也增强了纳米粒前药内核的稳定性。纳米粒前药在体循环（pH7.4）下持稳定；但被肿瘤细胞摄取后，在内涵体/溶酶体pH 4.0 ~ 6.5条件下，具有pH敏感性的席夫碱键发生响应性断裂，纳米粒前药解体释放DOX，同时由于疏水作用力的消失导致另一疏水药物的释放。由于纳米粒前药的结构较简单，因此当席夫碱键断裂之后会导致所有药物的快速释放，以杀伤肿瘤细胞。

优选的，PEG的分子量为2000，作为Golden standard 的亲水段长度，能够有效的改善DOX的水溶性及药代动力学特性，明显的降低RES对纳米粒的体循环清除。

优选的，疏水性抗肿瘤药物DOX作为纳米粒前药的疏水内核，较强的疏水作用力能够使前药聚集成纳米粒子，由于其适宜的分子量能够使纳米粒前药的载药量高达20%。

优选的，在亲水端和疏水药物之间形成具有pH敏感的席夫碱键，其酸响应性释放特异性高，能够实现纳米粒前药在肿瘤特定环境下的响应性释放及肿瘤细胞的摄取。

优选的，姜黄素（Curcumin，Cur）作为另一疏水药物通过物理包覆的方式负载到纳米粒前药内，通过与DOX良好的疏水作用被包覆到内核。在肿瘤特定环境下的响应性同时释放两个化疗药物，二者根据各自不同的抗肿瘤活性协同，联合杀伤肿瘤细胞。

优选的，在此纳米粒前药PEG-DOX基础上，任何疏水药物包括紫杉醇(PTX)、多西他赛(TXT)、喜树碱(CPT)、羟基喜树碱(HCPT)、长春花碱(VLB)、地塞米松(DXM)、或博来霉素(BLM)都可以通过物理包覆的方式负载要纳米粒前药内，通过同时递送和同时释放多个抗肿瘤药物，实现联合化疗。

本发明公开的含有具有共递送多个药物的pH敏感纳米前药，特点是：

（1）载药量高，原因是将疏水药物直接键合到亲水分子上。

（2）载体量低，原因是抗肿瘤药物DOX直接作为纳米粒的疏水内核。本发明提供的pH敏感的纳米粒前药，其pH 敏感响应性能够实现药物的特异性释放的同时，纳米粒发生断裂后，亲水端溶于体内，药物发挥抗肿瘤作用，降低体内载体的蓄积。

（3）生物相容性好。其pH敏感响应性能够实现药物的特异性释放的同时，纳米粒发生断裂后，药物发挥抗肿瘤作用，亲水端溶于体内可降低体内载体的蓄积。能够负载多个疏水性抗肿瘤药物。原因是纳米粒前药能够通过疏水作用将另一种疏水药物包覆在核内。

(4) 本发明提供了一个负载多个药物的平台，实现了多个药物在肿瘤环境内的同时响应性释放，保证了不同药物的体内动力学一致性，并根据各自的抗肿瘤机制协同杀伤肿瘤细胞。同时制备方法简便易行，稳定性良好，便于操作推广。

附图说明：

图1为本发明实施例的pH 敏感纳米粒前药示意图；

图2为本发明实施例的PEG-CHO (A)纳米粒前药PEG-DOX NPs (B) 的核磁共振氢谱图；

图3为本发明实施例的纳米粒前药PEG-DOX NPs和PEG-DOX-Cur NPs的粒径分布（A）和微观形态(B, C)；

图4为本发明实施例的PEG-DOX-Cur NPs 在酸性条件下的粒径变化（A）和微观解体变化(C)；

图5为本发明实施例的pH 敏感纳米粒前药的体外释放；(A) DOX在不同pH条件下的响应性释放曲线；(B) Cur在不同pH条件下的响应性释放曲线；

图6为本发明实施例的pH 敏感纳米粒前药细胞胞吞：细胞对裸药DOX、裸药Cur，PEG-DOX-Cur NPs 的摄取；

图7为本发明实施例的pH 敏感纳米粒前药细胞毒性评价：裸药DOX、裸药Cur、PEG-DOX NPs、裸药DOX&Cur和PEG-DOX-Cur NPs对(A) HepG2和(B) HeLa细胞的细胞毒性；

图8为本发明实施例的pH 敏感纳米粒前药静脉注射后，药物的瘤内分布：(A) 静脉注射后1 h；(B) 静脉注射后24 h；(C) 静脉注射后48 h。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，下述各实施例仅用于说明本发明而并非对本发明的限制。其中所用到的化学试剂有市售，所用到的阿霉素、姜黄素也有市售。

实施例1

图1为本发明实施例的pH 敏感纳米粒前药示意图。从图1中可以看出，本发明双敏感层交联纳米粒具有三层结构，外层为具有高度生物相容性的PEG，内核为与亲水端键和的抗肿瘤药物DOX，再通过疏水作用包裹另一疏水抗肿瘤药物Cur。

(a) pH 敏感纳米粒前药的制备

称取200mg 分子量为2000的mPEG-CHO（Methoxy-poly(ethylene glycol)-aldehyde）和50 mg 阿霉素（DOX），将其共溶于2.0 mL的二甲基亚砜（DMSO）内，加入20 μL三乙胺作为催化剂，40 ℃水浴锅内震荡反应24 h。将溶液置于截留分子量为1 KDa的透析袋内，DMSO 作为透析液，透析48 h 以除去未反应的DOX；再将溶液置于截留分子量为3.5 KDa的透析袋内，PBS（pH7.4）作为透析液，透析48 h 以除去DMSO。将得到的pH 敏感的前药纳米粒水分散液冻干，得到可再分散的纳米粒冻干粉（PEG-DOX nanoparticles (NPs)）。结构反应式如式1-1所示：

式1-1

(b) PEG-DOX-Cur NPs制备

称取PEG-DOX冻干粉30 mg，6 mg姜黄素（curcumin），共溶于2 mL DMSO内，将溶液缓慢的逐滴加入盛有10 mL PBS（pH7.4）的烧杯内，不断震荡。最后将混合溶液置于截留分子量为1 KDa的透析袋内，PBS（pH7.4）作为透析液，透析48 h 以除去未反应的curcumin和DMSO。得到前药纳米粒溶液PEG-DOX-Cur NPs。

利用核磁共振波谱对纳米粒前药PEG-DOX进行表征，结果如图2所示。对本实施例中所得聚合物的特征峰进行分析，结果表明，该纳米粒前药被成功合成。

实施例2：

PEG-DOX-Cur NPs的敏感性表征，具体步骤如下：

将制备的PEG-DOX-Cur NPs放置在pH5.0酸性溶液条件下，37℃的恒温振荡器中孵育至48 h，利用激光粒度仪和透射电镜检测纳米粒粒径和形态的变化。检测结果如图4A所示，纳米粒前药的粒径在24 h和48 h时发生明显增大，通过扫描电镜显示48 h时的纳米粒发生明显的解体，其形状很不规则（图4C）。

实施例3：

PEG-DOX-Cur NPs的体外释放行为表征，具体步骤如下：

取5 mL PEG-DOX-Cur NPs封装在截留分子量为3500 Da的透析袋中，加入 40 mL透析液，透析液为pH分别为7.4、6.5、5.0的磷酸盐缓冲溶液，释放在37℃的恒温振荡器中进行。在预定的时间点，取出5 mL的释放液，补加相同体积的新鲜释放液。药物的释放量利用紫外分光光度计进行测定。

释放行为的评价结果如图5所示，DOX和Cur表现出相似的释放曲线，原因是由于席夫碱键为酸响应断裂键，导致PEG与DOX发生断裂的同时，纳米粒前药与Cur的疏水作用随之消失，即在纳米粒前药解体的时候，所有被负载的药物均被同时释放。

实施例4：

载药纳米粒的细胞摄取，具体步骤如下：

以含l0％胎牛血清（FBS; Biochrom Ag, Germany）的DMEM（Sigma-Aldrich, USA）为基础培养液，将细胞（HepG2）以1×10⁵个/mL细胞浓度接种于24孔板中，置于37℃、5 % CO₂、饱和湿度条件下培养。将裸药DOX、裸药Cur、PEG-DOX-Cur NPs用DMEM稀释，得到药物浓度在10 ~ 100 μg/mL的溶液。取500 μL各浓度的上述溶液分别加到接种过细胞的孔板中替代原培养液。加入等体积生理盐水的培养在DMEM中的细胞作为对照组。与载药纳米粒孵育培养一段时间后，取出培养板，用流式细胞仪检测细胞对纳米载体的摄取能力。

检测结果如图6所示，药物与细胞作用8 h后，可见HepG2细胞对纳米粒前药中所有药物的摄取能力远远高于裸药，同时明显的提高了药物在胞内的作用时间。

实施例5：

纳米粒前药的细胞毒性评价，具体步骤如下：

以含l0%胎牛血清（FBS; Biochrom Ag, Germany）的DMEM（Sigma-Aldrich, USA）为基础培养液，将细胞（HepG2和HeLa）以1×10⁵个/mL细胞浓度接种于96孔板中，置于37 ℃、5 % CO₂、饱和湿度条件下培养。裸药DOX、裸药Cur、DOX&Cur mixtures，PEG-DOX NPs和PEG-DOX-Cur NPs，取100 μL各浓度的上述溶液分别加到接种过细胞的孔板中替代原培养液。培养在DMEM中的细胞作为对照组。分别培养一段时间后，取出培养板，用MTT法检测材料的毒性。

结果如图7A, B所示，细胞毒性呈现明显的浓度依赖性。并且PEG-DOX-Cur NPs 的协同作用明显高于DOX&Curmixtures，取得了明显的体外联合治疗结果。

实施例6：

PEG-DOX-Cur NPs 静脉注射后，药物在正常组织和肿瘤内分布，具体步骤如下：

取健康Balb/c小鼠，雌性，体重19 ± 2 g，将培养的HepG2细胞在无菌条件下进行快速接种，于小鼠右后腿皮下注射细胞瘤液0.2 mL/只，细胞浓度为5.0×10⁶/只。在接种一周以后，肿瘤体积达到100 mm³(V = 1/2(a × b²))时，小鼠被随机分成2组，即裸药DOX和PEG-DOX-Cur NPs 组，DOX的给药剂量为5 mg/kg。尾静脉注射给药后，在预定的时间处死小鼠，解剖取出肿瘤组织。利用活体成像仪检测药物在肿瘤内的分布。

结果如图8所示，当各制剂静脉注射后，PEG-DOX-Cur NPs 在肿瘤组织的药物富集量显著高于裸药DOX组，并且纳米粒前药的协同作用会保证DOX和Cur共同到达肿瘤部位。此外，由于亲水端PEG的引入明显的延长了DOX和Cur在体内的循环时间，增加了治疗效果。

实施例7：

在此体系基础之上，根据实施例1试验内容,利用PEG-DOX 分别负载疏水抗肿瘤药物紫杉醇（PTX）和喜树碱（CPT）,得到纳米粒前药PEG-DOX-PTX NPs和PEG-DOX-CPT NPs。利用实施例2对纳米粒前药进行表征，其结果见表1。得到的纳米粒前药结构及粒径大小类似于PEG-DOX-Cur NPs，说明在PEG-DOX的前提下负载任何一种抗肿瘤药物都能得到一个很好的纳米级的前药：

表1

Claims

1.具有共递送多个药物的pH敏感纳米粒前药，其结构如下：

PEG-DOX-W-NPs

其中PEG为聚乙二醇；

DOX为：阿霉素；

NPs为：粒径183.5±4.5 nm纳米粒。

2.权利要求1所述具有共递送多个药物的pH敏感纳米粒前药的制备方法，其特征在于按如下的步骤进行：

（1）pH敏感纳米粒前药的制备：称取200 mg 分子量为2000的mPEG-CHO醛基化聚乙二醇和50 mg 阿霉素，将其共溶于2.0 mL的二甲基亚砜内，加入20 μL三乙胺作为催化剂，40℃水浴锅内震荡反应24 h；

（3）将得到的pH 敏感的前药纳米粒水分散液冻干，得到可再分散的纳米粒冻干粉聚乙二醇化阿霉素纳米粒前药；

（4）聚乙二醇化的阿霉素-姜黄素制备：称取PEG-DOX冻干粉30 mg，6 mg姜黄素（w），共溶于2 mL DMSO内，将溶液缓慢的逐滴加入盛有10 mL pH7.4的PBS烧杯内，不断震荡，最后将混合溶液置于截留分子量为1 KDa的透析袋内，pH7.4的PBS作为透析液，透析48 h 以除去未反应的姜黄素和DMSO，得到前药纳米粒溶液聚乙二醇化的阿霉素-姜黄素纳米粒前药。

3.一种药物组合物，其特征在于它含有权利要求1所述的具有共递送多个药物的pH敏感纳米粒前药及要学上和接受的药用载体。

4.权利要求3所述的药物组合物，其特征在于所述的组合物的剂型为冻干粉或者为生理盐水分散液针剂。

5.要求1所述的具有共递送多个药物的pH敏感纳米粒前药在制备用于诊断试剂、荧光探针，诊疗一体化方面的应用。