CN107441043B

CN107441043B - 一种pH敏感性混合胶束及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN107441043B
Application number: CN201710645735.3A
Authority: CN
Inventors: 王永健; 于奡; 王鑫楠; 孙丹丹; 吕学明
Original assignee: Nankai University
Current assignee: Nankai University
Priority date: 2017-08-01
Filing date: 2017-08-01
Publication date: 2020-09-11
Anticipated expiration: 2037-08-01
Also published as: CN107441043A

Abstract

本发明涉及一种pH敏感性混合胶束的制备方法与应用。抗癌药物DOX通过酸敏感的Cbm与mPEG共价连接，作为聚合物前药与TPGS混合，在水溶液中自组装形成核壳型结构的混合胶束。本发明提供的pH敏感性混合胶束能够响应肿瘤组织特殊的低pH环境而特异性释放DOX，有效地抑制药物外排，逆转肿瘤细胞的多药耐药性，其生物相容性好、药物循环时间长、制备方法便于操作推广，具有良好的发展前景。

Description

一种pH敏感性混合胶束及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种pH敏感性混合胶束及其制备方法与应用。抗癌药物阿霉素（DOX）通过酸敏感的氨基甲酸酯键（Cbm）与聚乙二醇单甲醚（mPEG）共价连接作为聚合物前药，与D-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯（TPGS）混合，在水溶液中自组装形成核型结构的纳米胶束。

背景技术

目前全球每年出现约1400万例新发癌症病例，其中800余万人死亡。对抗癌症最主要的治疗方法之一仍然是化学疗法，但多药耐药性的出现使化疗受到挑战，这种耐药性大大降低了化疗效果。例如位于细胞膜中的P-糖蛋白与多药耐药性密切相关，其可将药物排出癌细胞从而降低细胞内的药物浓度，即使给药频率增加也不会提高治疗效果，反而对身体重要器官带来不良副作用，还有可能进一步加剧耐药性。因此，目前迫切需要开发有效的药物输送系统来克服多药耐药性。

纳米药物传递系统在解决传统药物一系列问题上取得了显著进展。当纳米药物传递系统通过肿瘤组织的增强渗透和保留性效应到达肿瘤区域时，可利用药物传递系统的智能性及肿瘤细胞或组织不同空间的pH值、氧化还原性等微环境的变化实现药物的靶向释放。此外，修饰到纳米颗粒上的靶向配体可通过选择性结合过表达于肿瘤细胞表面的受体来特异性的达到靶向肿瘤细胞的作用。除此之外，有研究表明，多种类型的治疗药物或者诊断试剂能够被同一药物传递系统释放到肿瘤组织或细胞从而达到多种药物联合治疗的目的。

发明内容

本发明目的在于提供一种pH敏感性混合胶束及其制备方法与应用。抗癌药物DOX通过酸敏感的Cbm与mPEG共价连接，作为聚合物前药与TPGS混合，在水溶液中自组装形成核壳型结构的纳米胶束。本发明是一种具有共递送多种药物的pH敏感性混合胶束，通过物理混合形成混合胶束的方式实现同时递送多个药物，以发挥联合抗肿瘤作用杀伤肿瘤细胞，以此解决化疗药物生物利用度低的问题，同时提高了递送药物的效率，以及克服肿瘤细胞多药耐药性的问题。

本发明提供的一种pH敏感性混合胶束由下式表示：

mPEG-Cbm-DOX /TPGS

其中，mPEG为聚乙二醇单甲醚；

Cbm为氨基甲酸酯键；

DOX为阿霉素；

TPGS为D-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯。

DOX通过酸敏感的Cbm与mPEG共价连接，即聚合物前药mPEG-Cbm-DOX；聚合物前药与TPGS混合，在水溶液中自组装形成核壳型结构的纳米胶束，即mPEG-Cbm-DOX /TPGS。

mPEG的分子量为1000-5000，优选分子量为 2000。

本发明提供的所述一种pH敏感性混合胶束的制备方法包括如下的步骤:

1）按计量在三乙胺（TEA）的存在下，将mPEG的二氯甲烷（DCM）溶液与溶有氯甲酸对硝基苯酯的无水DCM溶液于0℃下充分混合，25-30℃下反应24-26小时。

2）将步骤1）反应后的溶液于28℃下旋蒸除去DCM，加入无水乙醚，收集析出的白色物质，重沉三次，干燥，得到白色固体，即mPEG-硝基苯基碳酸酯（mPEG-NPC）（化合物I）。

3）在TEA的存在下，以无水N,N二甲基甲酰胺（DMF）为溶剂，将步骤2）得到的化合物Ⅰ与DOX于25-30℃下反应48小时，反应溶液置于截留分子量为3500 Da的透析袋内，蒸馏水作为透析液，透析48小时除去未反应的原料和DMF；将透析袋中的液体装于表面皿中于-20℃冷冻，冻干，得到可再分散的红色冻干粉即为pH敏感性聚合物前药（mPEG-Cbm-DOX）（化合物Ⅱ）。

4）将步骤3）得到的化合物II与TPGS溶于水于50 Hz下超声混合10-15分钟，所得溶液装于表面皿中于-20℃冷冻，冻干，得到红色粉末，即为pH敏感性混合胶束（mPEG-Cbm-DOX/TPGS）。

步骤1）中，mPEG、TEA和氯甲酸对硝基苯酯的摩尔比为1 -3：5：5，优选摩尔比为1：5：5。

步骤3）中，化合物Ⅰ和盐酸DOX的摩尔比为1：1 - 2，优选摩尔比为1：1。

步骤4）中，化合物Ⅱ和TPGS的摩尔比为1- 3：1，优选摩尔比为3：1。

透射电子显微镜测试结果显示本发明的DOX前药形态为球形的纳米粒子。动态光散射实验结果显示本发明的DOX前药粒径为204 nm，PDI为0.232；

透射电子显微镜测试结果显示本发明的pH敏感混合胶束形态为球形的纳米粒子。动态光散射结果显示本发明的pH敏感混合胶束粒径为144 nm，PDI为0.187。

本发明提供了一种pH敏感性混合胶束的药物组合物（包括医学上可以接受的载体），所述的组合物的剂型为冻干粉。

本发明提供了一种pH敏感性混合胶束在用于制备荧光探针、抗肿瘤药物方面的应用。

本发明提供了一种pH敏感性混合胶束作为一个药物释放平台，在逆转肿瘤细胞多药耐药性以及提高肿瘤细胞治疗效果发挥重要作用。实验结果证明：在聚合物前药的基础上，添加TPGS制备成混合胶束，根据不同的抗肿瘤机制协同作用于肿瘤细胞，药物在肿瘤细胞内的累积明显增多，同时有效抑制了耐药细胞对药物的外排；由于前药中mPEG中的聚乙二醇（PEG）与DOX的共同作用，根据与游离DOX的对比，可明显延长DOX在细胞内的作用时间。

本发明提供了一种pH敏感性混合胶束，其pH敏感性能够在肿瘤细胞内特异性响应的同时，药物发挥抗肿瘤药效，PEG可于体内溶解，具有良好的生物相容性。本发明将mPEG作为DOX前药的亲水头部，DOX作为疏水尾部，使其能够在水溶液中自组装成聚合物胶束；mPEG和DOX之间通过将mPEG的羟基端与氯甲酸对硝基苯酯合成mPEG-NPC，通过mPEG-NPC的酯键与DOX的氨基反应得到具有pH敏感性的Cbm，使其在酸性的肿瘤细胞环境中靶向释放，PEG可明显延长DOX在体内的作用时间，避免药物突释造成的药效流失。同时，制备一种两亲性pH敏感混合胶束，TPGS可有效地抑制耐药细胞对药物的泵出，药物对肿瘤细胞的作用得到明显增加。

优选地，mPEG的分子量为 2000，能够有效规避网状内皮系统对纳米粒的体循环清除，增强前药的体内作用时间。

在前药中形成的Cbm，其具有酸敏感性，能够实现在肿瘤组织或细胞中的特异性释放。

在此DOX前药的基础上，同样具有亲水头部和疏水尾部的TPGS也可在水中自组装形成纳米胶束，将两者制备成混合胶束，可同时递送多种药物，既能达到药物的靶向释放，又可规避肿瘤细胞的耐药性，从而提高治疗效果。

总之，本发明提供了一种pH敏感性混合胶束。其中，pH敏感DOX前药实现在胞内的响应性释放，由此触发的药物释放以及TPGS的P-糖蛋白抑制机制增强了药物的滞留效应，根据药物的不同机制发挥克服肿瘤细胞多药耐药性的作用。具体为：

（1）DOX前药具有pH敏感响应性，能够在肿瘤细胞内特异性释放的同时，断裂的亲水端能够在细胞内溶解，不影响药物的药效，降低载体片段在细胞内的富集。

（2）混合胶束中的TPGS作为P-糖蛋白的抑制剂，减少药物的泵出，与前药结合各自的优势。

（3）混合胶束的粒径大小能够使其在肿瘤组织中有效积累，具有良好的尺寸组织保留性。

（4）本发明提供了一种pH敏感性混合胶束，不仅能够响应肿瘤组织和肿瘤细胞的特异酸性环境而特异性释放DOX，有效地抑制药物外排，逆转肿瘤细胞的多药耐药性，同时其生物相容性好、药物循环时间长、制备方法便于操作推广，具有良好的发展前景。

附图说明：

图1为本发明实施例的一种pH敏感性混合胶束mPEG-Cbm-DOX / TPGS 示意图。

图2为本发明实施例的mPEG-NPC（A）和聚合物前药（B）的核磁共振氢谱图。

图3为本发明实施例的聚合物前药（A）和一种pH敏感性混合胶束（B）的粒径分布图。

图4为本发明实施例的聚合物前药（A）和一种pH敏感性混合胶束（B）的透射电子显微镜图。

图5为本发明实施例的聚合物前药（A）和一种pH敏感性混合胶束（B）的体外释放评价。

图6为本发明实施例的聚合物前药和一种pH敏感性混合胶束对MCF-7细胞（A）和MCF-7/ADR细胞（B）的体外细胞毒性评价。

图7为DOX、本发明实施例的聚合物前药和一种pH敏感性混合胶束在MCF-7/ADR细胞中的药物吸收评价。

图8为DOX、本发明实施例的聚合物前药和一种pH敏感性混合胶束在MCF-7/ADR细胞的药物泵出评价。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件以及手册中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件；所用的设备、材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

图1为本发明实施例的 pH 敏感性聚合物前药示意图。从图1可以看出，本发明pH敏感性混合胶束具有双层结构，外层为亲水性良好的PEG，内核为疏水性药物DOX，同时TPGS也由两亲性与之相连。

（a）pH 敏感性聚合物前药的制备

以20 mL无水DCM（二氯甲烷）为溶剂，694 μL TEA作为催化剂，称2.00 g 分子量为2000的mPEG溶解后逐滴加入TEA，以10 mL无水DCM为溶剂将1.0078 g氯甲酸对硝基苯酯溶解后于0℃下逐滴加入，于30℃下反应24小时。将溶液于28℃下旋蒸除去DCM，加入无水乙醚，收集析出的白色物质，重沉三次，干燥，得到可再分散的白色固体，即为mPEG-NPC。以15mL无水DMF为溶剂，694 μL TEA作为催化剂，使100 mg mPEG-NPC和26.7 mg盐酸DOX于25℃下反应48小时。将溶液置于截留分子量为3500 Da的透析袋内，蒸馏水作为透析液，透析48小时除去未反应的原料和DMF。将透析袋中的液体装于表面皿中于-20℃冷冻，冻干，得到可再分散的红色冻干粉即为pH敏感性聚合物前药。结构反应式如式1所示：

式1

利用核磁共振氢谱对mPEG-NPC（图2A）和聚合物前药（图2B）进行表征，结果如图2所示。对本实施例中所得聚合物的特征峰进行分析，结果表明，该聚合物前药被成功合成。

（b）一种pH敏感性混合胶束的制备

以超纯水为溶剂，将聚合物前药和TPGS分别溶解，于50 Hz下超声15分钟，所得溶液装于表面皿中于-20℃冷冻，冻干，得到红色粉末即为pH敏感性混合胶束。

实施例2：

聚合物前药和一种pH敏感性混合胶束的粒径分布表征，具体步骤如下：

将聚合物前药配成浓度为500 μg/mL的溶液，将聚合物前药和TPGS以3:1的摩尔比混合，用马尔文粒径仪对聚合物前药和混合胶束进行粒径的测量。聚合物前药检测结果如图3A所示，该聚合物前药胶束的平均粒径为204 nm，PDI为0.232；混合胶束的检测结果如图3B所示，粒径分布均匀，平均粒径为144 nm，PDI为0.187，此混合胶束粒径分布较窄，而且与聚合物前药的粒径有明显不同，这表明形成了一个新的胶束，而不是聚合物前药和TPGS的物理混合。

实施例3：

聚合物前药和一种pH敏感性混合胶束的形貌表征，具体步骤如下：

用蒸馏水将聚合物前药和一种pH敏感性混合胶束配置成100μg/mL的溶液，滴到铜网上，过夜（14小时）自然晾干。用透射电子显微镜观察形貌。从透射电子显微镜结果我们可以看出，聚合物前药呈现出球状形貌，具有很好的单分散性（图4A），pH敏感性混合胶束呈现出球状结构，具有很好的单分散性（图4B）。

实施例4：

聚合物前药和一种pH敏感性混合胶束的载药量测定，具体步骤如下：

称取适量DOX，用超纯水配置成1 mg/mL的母液，然后稀释成一系列的浓度梯度，即1，5，20，50，70，100 μg/mL。在波长为490 nm下测定一系列浓度梯度的DOX的紫外吸收，制成标准曲线。称取聚合物前药和pH敏感性混合胶束适量，分别用超纯水配置成浓度为200 μg/mL和500 μg/ml的溶液，用多功能酶标仪测定在这两个浓度下的紫外吸收的数值并代入DOX标准曲线，计算载药量。

根据标准曲线计算聚合物前药中DOX的含量为20%， pH敏感性混合胶束中DOX的载药量为12.5%。

实施例5：

聚合物前药和一种pH敏感性混合胶束的体外释放，具体步骤如下：

称取2 mg 聚合物前药分别溶于3 mL乙酸缓冲液（pH=5）和PBS（pH=7.4）缓冲液，称取4 mg的pH敏感性混合胶束分别溶于4 mL乙酸缓冲液（pH=5）和PBS（pH=7.4）缓冲液。然后分别将聚合物前药和pH敏感性混合胶束的乙酸缓冲液和PBS缓冲液置于截留分子量为3500Da的透析袋中，浸入相应的释放介质中，并放置于恒温摇床，保持温度为37℃，转速为160rpm。随后，在一定的时间间隔（0 h，2 h，4 h，6 h，8 h，10 h，24 h，48 h，72 h，96 h）取出200 μL样品，同时，用新鲜的释放介质等量进行补充。药物的释放量采用酶标仪进行检测。

体外释放的评价结果如图5显示。实验结果经过定量计算分析可看出，与pH=7.4的PBS缓冲液相比，聚合物前药在pH=5.0的乙酸缓冲液中对DOX的释放速率相对较快，94 h时，DOX在pH=5.0的乙酸缓冲液中的释放率为40.6%，而在pH=7.4的PBS缓冲液中的释放率则为24.9%，如图5A所示。pH敏感性混合胶束在pH=5.0的乙酸缓冲液中的释放速度比pH=7.4的PBS缓冲液中的释放相对较快，在96 h时，DOX在pH=5.0的乙酸缓冲液中的释放率为44.6%，在pH=7.4的PBS缓冲液中的释放率为32.9%，如图5B所示。由此，聚合物前药和pH敏感性混合胶束都具有pH响应性，能够在酸性条件下对DOX进行控制性释放。

实施例6：

聚合物前药和一种pH敏感性混合胶束的体外细胞毒性评价，具体步骤如下：

收集对数期MCF-7和MCF-7/ADR细胞，调整细胞悬液浓度，在96孔板中每孔加入100μL细胞悬液，使细胞的密度为3000个/孔（MCF-7细胞）和5000个/孔（MCF-7/ADR细胞），96孔板的边缘孔用无菌PBS填充，置于5%CO₂，37℃细胞培养箱中培养24 h。96孔板中加入浓度范围在0.1-100 μg/mL的DOX，浓度范围在0.1-100 μg/mL的聚合物前药和pH敏感性混合胶束各100 μL。当细胞加药培养48 h后，弃去原来的培养基，每孔加入10 μL 5 mg/mL 的MTT溶液和90 μL的培养基，继续培养4 h。用枪吸去原来的培养基后每孔加入150 μL二甲基亚砜，将96孔板低速振荡10分钟使结晶物充分溶解。用多功能酶标仪在570 nm处测量各孔的吸光值并计算细胞的存活率。

结果如图6A，6B和表1所示。混合胶束作用于MCF-7/ADR细胞的IC50较低，作用于MCF-7细胞时具有与游离药物和聚合物前药相似的IC50值（2-5 μg/mL）。聚合物前药作用于MCF-7/ADR细胞的IC50值为110.5 μg/mL，耐药指数为23.5，这表明具有pH敏感性的聚合物前药能够显著降低MCF-7/ADR细胞的耐药性。混合胶束作用于MCF-7/ADR细胞的IC50值为29.8 μg/mL，耐药指数为9.0，这表明，混合胶束能够更加有效地克服细胞的多药耐药性（表1）。

实施例7：

聚合物前药和一种pH敏感性混合胶束的药物吸收评价，具体步骤如下：

将MCF-7/ADR细胞以2×10⁵细胞/孔铺于6孔板中，用不完全RMPI-1640培养基在5%CO₂，37°C的培养箱中培养24 h。用含有游离药物、聚合物前药和混合胶束的细胞培养液替换原来的培养液。细胞继续培养24 h后，弃去原培养液，用PBS清洗3次除去未被细胞吸收的药物，用4%的多聚甲醛固定20分钟，PBS清洗3次后用Hoechst33342染色液进行细胞核的染色，染色4分钟后用抗荧光猝灭剂进行封片。最后，用激光扫描共聚焦显微镜LSM710进行观察。

结果如图7所示。与游离药物DOX相比，在MCF-7/ADR细胞中，聚合物前药和混合胶束实验组显示出了较强的荧光强度。实验结果表明，聚合物前药和混合胶束能够将更多的治疗药物积累在细胞内。

实施例8：

聚合物前药和一种pH敏感性混合胶束的药物泵出评价，具体步骤如下：

将MCF-7/ADR细胞以2×10⁵个/孔均匀铺于6孔板中，于5% CO₂，37°C的培养箱中培养24 小时。用含DOX、聚合物前药和混合胶束的细胞培养液替换原来的培养液培养1 h后，弃去培养液，用PBS清洗3次。加上不含药物的培养基继续培养6个小时，弃去培养液，用PBS清洗3次，然后用4%多聚甲醛固定20分钟，PBS清洗3次后用Hoechst33342染色液进行细胞核的染色，染色4分钟后用抗荧光猝灭剂进行封片，用高级正置荧光显微镜观察。

结果如图8所示，当弃去药物继续培养6 h后，DOX组的细胞内荧光强度最小，而聚合物前药和混合胶束组的荧光强度较强。这个结果表明，混合胶束处理耐药细胞时，药物的泵出量相对于游离药物组很小。聚合物前药和TPGS的协同作用有效的改善了药物对耐药细胞的作用效果，能够有效的抑制耐药细胞对药物的外排作用。

表1 DOX、mPEG-Cbm-DOX和mPEG-Cbm-DOX /TPGS的IC50以及RI和RRI

Claims

1.一种pH敏感性混合胶束，其特征在于由下式表示：

mPEG-Cbm-DOX /TPGS

其中，mPEG为聚乙二醇单甲醚；

Cbm为氨基甲酸酯键；

DOX为阿霉素；

TPGS为D-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯；

所述的DOX通过酸敏感的Cbm与mPEG共价连接，即聚合物前药mPEG-Cbm-DOX；聚合物前药与TPGS混合，在水溶液中自组装形成核壳型结构的纳米胶束，即mPEG-Cbm-DOX /TPGS。

2.根据权利要求1所述的pH敏感性混合胶束，其特征在于所述的DOX前药粒径为204nm，PDI为0.232；所述的pH敏感混合胶束粒径为144 nm，PDI为0.187。

3.根据权利要求1所述的pH敏感性混合胶束，其特征在于所述的mPEG的分子量为1000-5000；聚合物前药中DOX的含量为20%；pH敏感性混合胶束中DOX的载药量为12.5%。

4.权利要求1所述的pH敏感性混合胶束的制备方法，其特征在于包括如下的步骤:

1）按计量在三乙胺的存在下，将mPEG的二氯甲烷溶液与氯甲酸对硝基苯酯的二氯甲烷溶液于0℃下充分混合，25-30℃下反应24-26小时；

2）将步骤1）反应后的溶液于28℃下旋蒸除去二氯甲烷，加入无水乙醚，收集析出的白色物质，重沉三次，干燥，得到白色固体mPEG-NPC，命名为化合物I；

3）在三乙胺的存在下，以无水二甲基甲酰胺为溶剂，将步骤2）得到的mPEG-NPC与DOX于25-30℃下反应48小时，反应溶液置于截留分子量为3500 Da的透析袋内，蒸馏水作为透析液，透析48小时除去原料和二甲基甲酰胺；将透析袋中的液体装于表面皿中于-20℃冷冻，冻干，得到可再分散的红色冻干粉即为pH敏感聚合物前药，命名为化合物Ⅱ；

4）将步骤3）得到的化合物II与TPGS溶于水，于50 Hz下超声10-15分钟，所得溶液装于表面皿中于-20℃冷冻，冻干，得到红色粉末，即为两亲性pH敏感混合胶束。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于步骤1）中，mPEG、三乙胺和氯甲酸对硝基苯酯的摩尔比为1 -3：5：5。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于步骤3）中，化合物I和DOX的摩尔比为1：1 - 2。

7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于步骤4）中，化合物Ⅱ和TPGS的摩尔比为1- 3：1。

8.根据权利要求1-3任一所述的pH敏感性混合胶束与医学上可以接受的载体的药物组合物；所述的组合物的剂型为冻干粉。

9.根据权利要求1-3任一所述的pH敏感性混合胶束用于制备荧光探针、抗肿瘤药物方面的应用。