CN107176911B - 基于肠道上皮细胞顶侧octn2转运体的口服靶向纳米粒 - Google Patents

基于肠道上皮细胞顶侧octn2转运体的口服靶向纳米粒 Download PDF

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Abstract

本发明属于药物制剂新辅料和新剂型领域，涉及一种肠道上皮细胞顶侧OCTN2转运体的底物L‑肉毒碱的衍生物和相应靶向纳米粒的制备，及其作为口服药物载体在药物传递方面的应用。本发明所述的硬脂酰‑L肉毒碱由OCTN2转运体底物L‑肉毒碱和硬脂酸组成的两亲性化合物，是一种稳定性好的用于构建OCTN2靶向纳米药物传递系统的靶向配基。所述的硬脂酸可以为十八酸、十六酸、十四酸等长链脂肪酸。所述的两亲性化合物的结构式如下：

Description

基于肠道上皮细胞顶侧OCTN2转运体的口服靶向纳米粒
技术领域
本发明属于药物制剂新辅料和新剂型领域，涉及一种肠道上皮细胞顶侧OCTN2转运体的底物L-肉毒碱的衍生物和相应靶向纳米粒的制备，及其作为口服药物载体在药物传递方面的应用。
背景技术
纳米技术在21世纪取得了迅速的发展，将纳米技术应用于药物传递的前景十分广阔。与常规的传递系统相比，纳米药物制剂具有独特的小尺寸效应、比表面积大、表面链接或载带的功能基团或活性中心多等优点使得其在缓、控释给药，靶向给药，黏膜和局部给药以及蛋白质和基因药物传递等领域中表现出明显的优势。然而普通纳米粒(nanoparticles,NPs)仍然有些缺陷：注射后易被网状内皮系统吞噬、靶向部位分布少、体内滞留时间较短等。为了改善纳米粒的功效，可以在纳米粒表面连接特定的配体，即主动靶向纳米粒。它通过配体-受体相互作用使NPs与靶部位表达的受体特异性结合，进而提高靶组织、细胞或细胞器中药物的蓄积。常用的配体包括受体介导类(叶酸，黄素单核苷酸，转铁蛋白等)、多肽类(RGD肽，K237肽等)、糖类(半乳糖、透明质酸)以及抗体类(单链抗体片段，单克隆抗体)等。多年来的研究结果表明纳米粒经过修饰之后可显著改善纳米粒的靶向性和药物疗效，使得纳米粒更加智能化。
目前随着分子生物学突飞猛进的发展，科学家们在机体内各器官中揭示了许多与膜转运有关的转运体，这些转运体决定了药物能否有效作用于机体，并在药物体内动态和临床疗效个体差异等方面发挥重要作用。转运体广泛分布于人体各个脏器组织，它们在协调各种物质的摄取和外排的过程中扮演了重要的角色。随着人们对于转运体在体内药物动态处置中的重要性的认识不断加深，以转运体为靶点的主动靶向前药的研究正如火如荼的进行着，而基于转运体介导的主动靶向纳米粒的研究也逐渐引起研究者们的注意，但总体来说目前仍处于探索初期，有待深入研究。相对于受体介导的靶向纳米粒，转运体作为靶点具有明显的优势，配体都是小分子，易于结构修饰，稳定性好，转运效率更高，且受机体内内源性成分干扰较少。此外，目前可供纳米粒靶向的受体选择种类较少，因此药物转运体作为纳米粒主动靶向的靶点是一个非常有潜力的补充和扩展。
目前，基于转运体的靶向纳米粒主要集中于脑部肿瘤的特异性传递。对于口服靶向纳米粒，主要选择的靶点是胆酸转运体和维生素B12相关的转运体等。目前还未见基于OCTN2转运体设计的主动靶向纳米粒的报道。我们将OCTN2转运体的专属性底物L-肉毒碱进行化学修饰，制成其两亲性衍生物硬脂酰-L-肉毒碱，用来修饰PLGA纳米粒，构建全肠段吸收的口服高效纳米药物传递系统，提高所载药物的口服生物利用度。
发明内容
本发明的目的是针对目前抗肿瘤药物不能口服的问题，提供一种新型的以肠道OCTN2转运体为靶点的纳米药物递送系统。
本发明提供了一种肠道上皮细胞顶侧OCTN2转运体的底物两亲性衍生物硬脂酰-L-肉毒碱及其制备方法。
本发明以L-肉毒碱为靶向配基，生物相容性好的可降解高分子材料为基础高分子载体，包载抗肿瘤药物，制成口服靶向纳米药物递送系统。
本发明提供的靶向纳米粒稳定性好、靶向效率高、可有效提高所载药物的口服生物利用度，并且可以应用于其他胃肠道不稳定、吸收差的药物的口服递送。本发明通过以下技术方案实现上述目的：
本发明所述的硬脂酰-L肉毒碱由OCTN2转运体底物L-肉毒碱和硬脂酸组成的两亲性化合物，是一种稳定性好的用于构建OCTN2靶向纳米药物传递系统的靶向配基。
所述的硬脂酸可以为十八酸、十六酸、十四酸等长链脂肪酸。
所述的两亲性化合物的结构式如下：
一种肠道上皮细胞顶侧OCTN2转运体的两亲性底物衍生物硬脂酰-L-肉毒碱的制备方法，其具体采用如下步骤制备：
(a)L-肉毒碱的保护
将L-肉毒碱和溴化苄以摩尔比1：1～1.4的比例加入DMF中搅拌均匀，加热至110～130℃，搅拌条件下反应2～6小时，减压蒸馏除去溶剂DMF及未反应的溴化苄，即得L-肉毒碱苄酯。
(b)硬脂酰氯的合成
将硬脂酸、加入二氯甲烷中搅拌溶解，逐滴加入草酰氯(硬脂酸：草酰氯摩尔比为1：1～1.4)，搅拌条件下反应0.5～2小时，减压蒸馏除去溶剂二氯甲烷及未反应的草酰氯，即得硬脂酰氯。
(c)硬脂酰-L-肉毒碱苄酯的合成
将上述所得到的L-肉毒碱苄酯和硬脂酰氯以摩尔比为1：0.8～1.2的比例加入乙腈中搅拌均匀，加热至40～50℃，搅拌条件下反应12～36小时，减压除去乙腈，采用二氯甲烷：甲醇＝15～40：1的流动相进行柱分离，得到硬脂酰-L-肉毒碱苄酯。
(d)脱保护
将上述所得的硬脂酰-L-肉毒碱苄酯溶于甲醇中搅拌均匀，(加入10％钯碳还原剂，硬脂酰-L-肉毒碱苄酯：10％钯碳还原剂重量比为1：0.1～0.4)，加热至25～35℃，在H2保护条件下反应3～6小时，将反应液过滤除去钯碳，在减压蒸馏条件下除去溶剂甲醇，即得硬脂酰-L-肉毒碱。
以十八酸为例，其反应过程如下所示：
步骤(a)中使用溴苄将肉毒碱的羧基保护起来，避免后续产生不必要的副产物。
步骤(b)中使用草酰氯将硬脂酸活化为硬脂酰氯，目的为提高其反应活性。
所述的肠道上皮细胞顶侧OCTN2转运体的两亲性底物衍生物硬脂酰-L-肉毒碱，可作为OCTN2转运体靶向纳米载体修饰物，用于提高难溶性药物口服生物利用度。其中纳米载体材料可为聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolicacid)，PLGA)、聚乳酸(polylactide，PLA)、聚己内酯(Polycaprolactone，PCL)中任一种难溶性聚合物材料。其中抗肿瘤药物可为紫衫烷类、喜树碱类、蒽醌类或难溶性药物二氢吡啶类、非甾体抗炎药中的任一物质或其衍生物。
所述的纳米粒包含：药物、靶向修饰材料、纳米载体材料，三者的质量比为1：0.1～8：20.
本发明以乳化溶剂挥发法制备OCTN2靶向纳米粒，具体采用下述步骤：乳化溶剂挥发法是将上述的药物、靶向修饰材料以及纳米载体材料同时溶于与水不互溶的有机溶剂(如二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯等)，将其与一定比例(油水相比例为1：1～1：10)的水相(浓度为0.1～10％的表面活性剂溶液，如聚乙烯醇(polyvinyl alcohol，PVA)，Tween 80，普朗尼克F68，TPGS等)混合，以50～300w的功率探头超声3～10min(超声3s，停止2s)，得到均匀的纳米乳，挥去有机溶剂，离心，0.80μm滤膜过滤，得到载药纳米粒溶液；超速离心后，弃去上清液，加入去离子水分散，重复操作三次，洗去表面活性剂。
本发明具有以下突出优点及特征：
利用肠道上皮细胞顶侧的高亲和性转运体OCTN2作为靶点，合成L-肉毒碱衍生物，采用物理镶嵌的方法修饰纳米粒使其携带L-肉毒碱配基，以生物相容性好的高分子材料为基础载体，包载抗肿瘤药物后制成口服OCTN2靶向药物递送系统，用于提高其口服生物利用度。
本发明制备过程简单、易操作。所制备的靶向纳米粒粒径均一，包封率高，稳定性好，可作为难溶性化疗药物的储库，可以达到缓释效果。
本发明制备的靶向纳米粒可直接用于细胞和动物实验。该靶向纳米粒由于系统中L-肉毒碱的作用，提高了其与肠道OCTN2转运体的结合能力，使其更高效地进入肠道上皮细胞、进而跨膜转运进入循环系统，增加摄取转运的同时，避免了P-糖蛋白的外排作用，显著提高所载药物的口服生物利用度。
附图说明
图1为L-肉毒碱衍生物硬脂酰-L-肉毒碱的合成路线。
图2为氢核磁共振表征L-肉毒碱衍生物硬脂酰-L-肉毒碱。
图3为透射电镜观察纳米给药系统的外观形态及粒径(A,PLGA NPs；B,10％LC-PLGA NPs)。
图4为动态光散射法测定纳米给药系统的粒径稳定性。
图5为包载有紫杉醇的纳米粒的体外释放曲线(n＝3)。
图6为XPS考察纳米粒的表面化学特性(A,10％LC-PLGA NPs的全谱图以及PLGANPs和10％LC-PLGA NPs在N峰位置的比较；B,不同修饰比例的纳米粒在N峰位置的比较)。
图7为X射线衍射测定纳米粒包载的紫杉醇药物的存在状态。
图8为不同修饰比例的纳米粒不同条件下(Control:有钠离子和氯离子存在；Na+free:没有钠离子存在；Cl-free:没有氯离子存在；With L-carnitine:有钠离子和氯离子存在,并且有游离的L-肉毒碱存在)在Caco-2细胞水平的摄取(n＝3)。(**,P<0.01,相对于未修饰的纳米粒摄取；α,P<0.05,β,P<0.01,相对于在NaCl存在条件下的摄取)
图9为PLGA NPs和10％LC-PLGA NPs在不同水平抑制剂条件下的摄取(内吞机制的研究)(n＝3)。(α,P<0.05,β,P<0.01,相对于对照条件下的摄取)
图10为不同修饰比例的纳米粒在Caco-2细胞水平摄取的可视化共聚焦图片。
图11为小肠灌流实验中PLGA NPs和10％LC-PLGA NPs在不同肠段的渗透系数(n＝3)。
图12为小肠灌流实验中不同修饰比例的纳米粒在十二指肠的渗透系数和吸收常数(n＝3)。
图13为PLGA NPs和10％LC-PLGA NPs在不同肠段的生物分布情况。
图14为不同修饰比例的纳米粒经口服后的药时曲线(n＝6)。
图15为不同修饰比例的纳米粒经口服后的最大血药浓度和生物利用度(n＝6)。
具体实施方式
实施例1.
靶向修饰物L-肉毒碱衍生物的合成
将L-肉毒碱3mmol(约484mg)、溴化苄3.6mmol加入约25ml DMF中搅拌均匀，加热至125℃，搅拌条件下反应4小时，减压蒸馏除去溶剂DMF及未反应的溴化苄，即得L-肉毒碱苄酯。将硬脂酸3mmol、加入约15ml二氯甲烷中搅拌溶解，逐滴加入草酰氯3.6mmol，搅拌条件下反应0.5h，减压蒸馏除去溶剂二氯甲烷及未反应的草酰氯，即得硬脂酰氯。将上述所得到的L-肉毒碱苄酯和硬脂酰氯加入约25ml乙腈中搅拌均匀，加热至45℃，搅拌条件下反应24h，减压除去乙腈，采用二氯甲烷：甲醇＝19：1的流动相进行柱分离，得到硬脂酰-L-肉毒碱苄酯。将上述所得的硬脂酰-L-肉毒碱苄酯溶于25ml甲醇中搅拌均匀，加入10％钯碳还原剂0.2g，加热至30℃，在H2保护条件下反应5h，将反应液过滤除去钯碳，在减压蒸馏条件下除去溶剂甲醇，即得硬脂酰-L-肉毒碱。
实施例1的反应路线见图1。反应中的硬脂酸可以为十六酸、十四酸等其他长链脂肪酸，但并不局限于此。采用核磁共振1HNMR氢谱来确定实施例1中产物的结构，选用的溶剂为氘代DMSO，结果如图2。硬脂酸特征峰主要分布在0.7ppm到2.4ppm，肉毒碱的季胺基团的特征峰出现在3.3ppm，其他详细峰归属见图2。
实施例2.
普通PLGA NPs的制备
精密称取紫杉醇(或香豆素6)0.50mg，PLGA 10.0mg，溶解在1mL二氯甲烷中，将其与5mL 1％的PVA水溶液相混和，以200w的功率探头超声5min，室温搅拌5h，挥去有机溶剂，得到纳米粒溶液，13000r/min离心30min后，弃去上清液，加入去离子水分散，重复操作三次，洗去表面活性剂，即得普通无修饰的PLGA NPs。
实施例3.
5％LC-PLGA NPs的制备
精密称取紫杉醇(或香豆素6)0.50mg，合成的硬脂酰-L-肉毒碱0.50mg，PLGA10.0mg，溶解在1mL二氯甲烷中，将其与5mL 1％的PVA水溶液相混和，以200w的功率探头超声5min，室温搅拌5h，挥去有机溶剂，得到纳米粒溶液，13000r/min离心30min后，弃去上清液，加入去离子水分散，重复操作三次，洗去表面活性剂，即得5％LC-PLGA NPs。
实施例4.
10％LC-PLGA NPs的制备
精密称取紫杉醇(或香豆素6)0.50mg，合成的硬脂酰-L-肉毒碱1.00mg，PLGA10.0mg，溶解在1mL二氯甲烷中，将其与5mL 1％的PVA水溶液相混和，以200w的功率探头超声5min，室温搅拌5h，挥去有机溶剂，得到纳米粒溶液，13000r/min离心30min后，弃去上清液，加入去离子水分散，重复操作三次，洗去表面活性剂，即得10％LC-PLGA NPs。
实施例5.
20％LC-PLGA NPs的制备
精密称取紫杉醇(或香豆素6)0.50mg，合成的硬脂酰-L-肉毒碱2.00mg，PLGA10.0mg，溶解在1mL二氯甲烷中，将其与5mL 1％的PVA水溶液相混和，以200w的功率探头超声5min，室温搅拌5h，挥去有机溶剂，得到纳米粒溶液，13000r/min离心30min后，弃去上清液，加入去离子水分散，重复操作三次，洗去表面活性剂，即得20％LC-PLGA NPs。
实施例6.
40％LC-PLGA NPs的制备
精密称取紫杉醇(或香豆素6)0.50mg，合成的硬脂酰-L-肉毒碱4.00mg，PLGA10.0mg，溶解在1mL二氯甲烷中，将其与5mL 1％的PVA水溶液相混和，以200w的功率探头超声5min，室温搅拌5h，挥去有机溶剂，得到纳米粒溶液，13000r/min离心30min后，弃去上清液，加入去离子水分散，重复操作三次，洗去表面活性剂，即得40％LC-PLGA NPs。
实施例7.
采用微柱离心法测定靶向纳米粒的包封率和载药量
用蒸馏水浸泡Sephadex G-50 48h，然后取适量平衡好的Sephadex G-50装入2.5mL注射器针筒中，制成Sephadex G-50的微型柱。将制备好的Sephadex G-50微型柱在1000r·min-1离心1min，除去其中的水，弃去；精密量取200μL紫杉醇PLGA纳米粒溶液，1000r·min-1离心1min，收集洗脱液；精密量取200μL蒸馏水，1000r·min-1离心1min，收集洗脱液，共收集5管样品。将所收集所有样品转移至10mL量瓶中，乙腈稀释并定容，0.22μm滤膜过滤，取续滤液进样20μL，按含量测定项下方法测定药物浓度，计算纳米粒中包裹的药物量m包。精密量取200μL紫杉醇纳米粒溶液至10mL量瓶中，乙腈稀释并定容，0.22μm滤膜过滤，取续滤液进样20μL，按含量测定项下方法测定药物浓度，计算投入的总药量m药。另设纳米粒总重量为m总。按公式：包封率(EE％)＝m包/m药×100％计算载药纳米粒的包封率(DL％)和公式：载药量(DL％)＝m包/m总×100％计算载药纳米粒的载药量(EE％)。结果如下表所示，载药纳米粒的包封率在70％以上，载药量在3％以上。
表1，所制备的纳米粒的包封率和载药量
实施例8.
透射电子显微镜观察纳米粒的形态
利用透射电子显微镜观察所制备的对照纳米粒及OCTN2靶向纳米粒的粒子形态及大小。本发明采用复染法制备样品，具体制备方法如下：将自制的纳米粒溶液稀释至适当浓度，滴在表面覆有支持膜的铜网上，用2％磷钨酸溶液染色，用滤纸吸走多余液体后，自然挥干，在透射电镜下观察其形态，并对其拍照。
结果见图3，A为普通纳米粒，B为肉毒碱修饰纳米粒，而这均呈圆整的球形结构，分散性好且粒径分布均一。此外，透射电镜照片显示的纳米粒粒径相较动态光散射测定的粒径较小(图4)，是因为透射电镜样品制备过程中，纳米粒失水发生皱缩，粒径变小，而动态管散射测定的是水动力学半径，由于水化层的影响，粒径相对较大。
实施例9.
动态光散射技术测定纳米粒粒径及分布
采用动态光散射法(dynamic light scattering,DLS)测定纳米粒的粒径及粒径分布，它利用粒子被光束照射时向各个方向散射和衍射的强度与粒子大小有关的原理来测定粒子的大小和分布。具体操作为取一定量纳米粒分散溶液，放入样品池使液柱高为1cm，介质为水，在25℃下进行测定。此外，将所制备的纳米粒溶液放置于4℃环境下贮存，分别于第1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，15天，按照上述方法操作测定制剂的粒径以观察其稳定性。结果见图4，在4℃条件下，半个月内，纳米粒的粒径均不发生明显变化，由此可知，所制备的纳米粒粒径稳定性良好。
实施例10.
体外释放实验
采用透析袋法测定紫杉醇纳米粒的体外释放行为。透析袋的截留分子量为12000～14000Da，以pH 7.4的PBS(含2％Cremophor EL,w/v)在37℃为释放介质，该介质对紫杉醇有较好的增溶作用，从而能较好的保证漏槽条件。具体操作如下：分别移取未修饰的PLGA纳米粒、修饰比为10％的靶向纳米粒和修饰比为20％的靶向纳米粒各2mL置于透析袋中，两端夹紧后，加入30mL的释放介质，于37℃空气浴下振荡，转速100rpm。分别于给定时间内取样2mL，同时补充相同体积的新鲜介质，用0.22μm滤膜过滤，弃去初滤液，取续滤液20μL按含量测定项下方法测定溶液中紫杉醇含量。计算累积释放百分数，并绘制释放曲线。具体结果见图5，相对于溶液剂，纳米粒均能缓慢地将药物释放出来，且没有明显的突释，随着修饰比例的增大，纳米粒释放药物的速度更快。可能与上述的过多的硬脂酰-L-肉毒碱导致纳米粒表面的由于修饰产生的孔洞增多，因此表现出修饰比例越大，纳米粒释放药物越快的特征。
实施例11.
表面元素化学分析
采用X射线光电子能谱分析(X-ray photoelectron spectroscopy,XPS)对纳米粒进行表面元素化学分析。XPS可以用于表面元素的定量分析，根据能谱中光电子谱线强度(光电子峰的面积)来确定表面元素的含量及组成，以此来确定L-肉毒碱修饰在纳米粒表面。直接将制备的纳米粒冻干样品压成片(10×10mm)，置于样品台上，在真空条件下测定。束缚能范围从0至1000eV，通能为50eV。
具体结果见图6，由于制备空白纳米粒的材料中只有肉毒碱含有氮元素，图A显示修饰后的纳米粒相对于未修饰的纳米粒，表面的氮元素增加，说明修饰后的肉毒碱在纳米粒表面，不影响被转运体识别；图B显示随着修饰比例的增加，纳米粒表面的氮元素逐渐增加，更多的肉毒碱被修饰在纳米粒表面。
实施例12.
X射线粉末衍射
对于药物在纳米粒中的存在状态，将纳米粒冻干，采用X射线粉末衍射技术进行测定，结果见图7。从图中可以看出，紫杉醇药物本身具有明显的结晶峰，与空白纳米粒混合之后，结晶峰依然存在，而包载进纳米粒的紫杉醇基本不存在结晶峰，说明紫杉醇在纳米粒中以无定形态存在。
实施例13.
细胞水平评价纳米粒基于OCTN2的摄取机制
将各载体用荧光探针香豆素-6标记，用于评价纳米粒在细胞水平的摄取能力以及基于OCTN2的摄取机制。将Caco-2细胞以1.5×105细胞/孔的密度培养在24孔板中，48h后，在显微镜下观察细胞的密度及形态，当细胞密度达到90％左右且形态良好时，分别用不同的缓冲液(NaCl缓冲液，无Na+缓冲液，无Cl-缓冲液，含有10mM L-肉毒碱的NaCl缓冲液)洗两遍后，分别加入用不同缓冲液稀释的荧光标记的各载体，浓度为5μg/mL，每孔200μL，37℃孵育1h后，用冷PBS洗三次，每孔加入细胞裂解液500μL，避光条件下震荡1h，将孔内液体全部转移至洁净小管，斡旋混匀，转移200μL样品至96孔板中，采用多功能酶标仪测定细胞摄取量(λex＝466nm，λem＝504nm)，另采用BCA试剂盒法测定蛋白浓度，结果用单位蛋白质量的荧光标记物(μg/mg)来表示。结果见图8，在NaCl缓冲液中，L-肉毒碱修饰后，纳米粒可以靶向OCTN2转运体，经肉毒碱修饰后的纳米粒的摄取显著增加，且随着修饰量的增大，摄取效率先增加后减小，可能是由于过多的修饰反倒不利于纳米粒的黏附和摄取；对于OCTN2来说，其主要采用Na+驱动的方式来转运底物，在OCTN2介导的纳米粒摄取中，Na+的驱动作用依然很明显，在无Na+缓冲液中，靶向纳米粒的摄取显著降低；L-肉毒碱作为OCTN2的底物，可以显著降低靶向纳米粒的摄取，说明靶向纳米粒主要采用OCTN2介导的方式入胞。因此，修饰有L-肉毒碱的纳米粒可以靶向OCTN2，提高吸收，并且该过程是Na+驱动的，可以被游离的L-肉毒碱所抑制。实施例14.
纳米粒摄取机制研究
将未修饰纳米粒和10％-LC-PLGA NPs用荧光探针香豆素-6标记，用于考察纳米粒在细胞水平的摄取机制。将Caco-2细胞以1.5×105细胞/孔的密度培养在24孔板中，48h后，在显微镜下观察细胞的密度及形态，当细胞密度达到90％左右且形态良好时，分别加入不同的内吞抑制剂(采用4℃进行能量抑制，直接在4℃孵育1h后，进行后续细胞裂解处理)，37℃处理30min后，用37℃的PBS清洗2次，再分别加入荧光标记的载体，浓度为5μg/mL，每孔200μL，37℃孵育1h后，用冷PBS洗三次，每孔加入细胞裂解液500μL，避光条件下震荡1h，将孔内液体全部转移至洁净小管，斡旋混匀，转移200μL样品至96孔板中，采用多功能酶标仪测定细胞摄取量(λex＝466nm，λem＝504nm)，另采用BCA试剂盒法测定蛋白浓度，计算单位蛋白质量的荧光标记物(μg/mg)，与未经抑制剂处理的组比较，最后结果用相对摄取率(％)表示。结果见图9，未修饰纳米粒和靶向纳米粒均采用内吞的方式入胞，未修饰的纳米粒主要采用网格蛋白和小窝蛋白介导的内吞方式，肉毒碱修饰后的纳米粒主要采用网格蛋白、小屋蛋白介导的、以及巨胞饮的内吞方式入胞，说明修饰后的肉毒碱对纳米粒的入胞方式产生了影响。
实施例13.
共聚焦显微镜可视化观察纳米粒摄取
将各载体用荧光探针香豆素-6标记，用于示踪纳米粒在细胞水平的摄取。将Caco-2细胞以2×105细胞/孔的密度培养在带有盖玻片的24孔板中，48h后，在显微镜下观察细胞的密度及形态，当细胞密度达到90％左右且形态良好时，分别加入荧光标记的各载体，浓度为4μg/mL，每孔200μL，37℃孵育1h后，用冷PBS洗3次，将盖玻片小心取出，用含有DAPI的封片液封片，避光室温保存12h后，用共聚焦显微镜观察。结果见图10，随着修饰量的增加，纳米粒的摄取效率会显著增加，说明该靶向纳米粒可以显著提高摄取；但是，当纳米粒修饰量增加到一定程度后，过多的配基反倒限制了纳米粒的摄取，说明存在一个最优的配基密度，在这个密度条件下，该靶向纳米粒的摄取可以达到最大效果。
实施例14.
大鼠肠灌流实验考察靶向纳米粒的透膜性
大鼠实验前禁食12h(可自由饮水)，用20％(w/w)的乌拉坦腹腔注射麻醉(1.0g·kg-1)。将大鼠固定在恒温手术台上，沿腹中线剪开3.0～4.0cm的开口，打开腹腔后，分离出待考察肠段约10cm，两端切口插管后结扎，用预热至37℃的生理盐水轻缓的将内容物清洗干净，再用空气将生理盐水排净。实验前用供试液将管路饱和30min，直至出液口药液浓度与进液口供试液浓度相等，以消除实验过程中管路对药物的吸附作用。将伤口用浸有生理盐水的脱脂棉覆盖保湿，用红外灯维持体温(37±0.5)℃。进口处用已知重量的装有供试液的小瓶进行灌流，流速为0.2mL·min-1，每隔15min在出口处用一已知重量的小瓶收集一次(同时迅速更换下一个供试液小瓶和收集液小瓶)，称量此时供试液小瓶和收集液小瓶的重量，计算灌入和收集的供试品质量，实验持续时间为105min。实验结束后，将大鼠处死，剪下被灌流肠段，测量其长度(l)和内径(r)，计算小肠吸收的表面积。所收集的样品过滤后用上述HPLC法测定质量浓度。将所测数据按公式计算吸收速率常数Ka和表观渗透系数Papp。每组供试液在体肠吸收实验均按以上操作进行，每组3只。结果见图11、图12，在四个不同的肠段，紫杉醇纳米粒相对于紫杉醇溶液剂表现出了更好的渗透特性，纳米粒可能存在特殊的吸收途径(胞吞、M细胞转运等)；而OCTN2靶向纳米粒比普通纳米粒的渗透性更好，说明靶向纳米粒可增加纳米粒的摄取，可能与OCTN2转运体的相互作用有关；不同修饰比例的纳米粒的吸收特性与细胞水平研究一致，在修饰比例达到10％时，吸收效率最高，当加入过量的肉毒碱时，其摄取效率显著降低，说明OCTN2转运体在靶向纳米粒的摄取过程中具有重要作用。
实施例15.
纳米粒的肠段生物分布
大鼠禁食(自由饮水)12h后，分别灌胃给予香豆素-6标记的PLGA NPs和10％LC-PLGA NPs，给药剂量为1mg/kg。45min后，处死大鼠，分别取出约1cm长的十二指肠、空肠、回肠和结肠，采用PBS清洗干净后，用滤纸吸去肠断表面的水分，置于包埋剂(OTC)中并于-80℃冷冻。将冻实的肠断切成10μm厚的薄片，置于阳离子树脂载玻片上，用4％的多聚甲醛室温固定10min。PBS清洗两次后，用罗丹明鬼笔环肽于37℃孵育90min。PBS清洗两次后，用DAPI于室温染色5min。PBS清洗2次后，滴加封片液，加置盖玻片，采用共聚焦显微镜拍照。结果见图13。由于OCTN2在全肠断均有分布，因此在四个肠断，10％LC-PLGA NPs的摄取显著高于PLGA NPs的摄取，说明该靶向纳米粒具有明显的优势。
实施例16.
大鼠体内药动学实验
大鼠30只于实验前称量体重，禁食12h不禁水。实验时随机分为5组(PLGA NPs，5％-LC-PLGA NPs，10％-LC-PLGA NPs，20％-LC-PLGA NPs，40％-LC-PLGA NPs)，每组6只，口服灌胃方式给药。每只大鼠注射紫杉醇的剂量为10mg·Kg-1。分别与给药后0.5、1、2、3、4、6、8、12、24、36、48、72h眼眶取血0.3mL，置于已涂肝素的试管中，于10000rpm条件下离心10min，取出上层血浆，采用LC-MS-MS技术测定血浆药物含量。结果见图14、图15，修饰后的纳米粒口服吸收显著增加，紫杉醇口服生物利用都显著提高；且与细胞水平和组织水平结果相似的是，过多的肉毒碱修饰反而会抑制靶向纳米粒的吸收。
本发明的载体同样可以与其它抗肿瘤药物，如多西他赛、羟基喜树碱、喜树碱、长春新碱、尼莫地平、丝裂霉素，包载形成OCTN2靶向含药纳米粒，从而提高抗肿瘤药物的口服吸收，提高其口服生物利用度。

Claims (9)

1.一种硬脂酰-L-肉毒碱的纳米粒，其特征在于，由药物、靶向修饰材料、纳米载体材料组成，其质量比为1：0.1～8：20，所述的纳米载体材料为聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乳酸、聚己内酯中任一种难溶性聚合物材料，所述的药物为紫杉烷类，所述的靶向修饰材料为硬脂酰-L-肉毒碱，靶向修饰材料的修饰比例5-10％，其结构式如下：
2.如权利要求1所述的硬脂酰-L-肉毒碱的纳米粒，其特征在于，所述的硬脂酸为十四酸、十六酸或十八酸。
3.如权利要求1或2所述的硬脂酰-L-肉毒碱的纳米粒，其特征在于，所述的硬脂酰-L-肉毒碱的制备方法包括如下步骤：
(a)L-肉毒碱的保护
将L-肉毒碱和溴化苄以加入DMF中搅拌均匀，加热至110-130℃，搅拌条件下反应2-6小时，减压蒸馏除去溶剂DMF及未反应的溴化苄，即得L-肉毒碱苄酯；
(b)硬脂酰氯的合成
将硬脂酸、加入二氯甲烷中搅拌溶解，逐滴加入草酰氯，搅拌条件下反应0.5-2小时，减压蒸馏除去溶剂二氯甲烷及未反应的草酰氯，即得硬脂酰氯；
(c)硬脂酰-L-肉毒碱苄酯的合成
将上述所得到的L-肉毒碱苄酯和硬脂酰氯加入乙腈中搅拌均匀，加热至40-50℃，搅拌条件下反应12–36小时，减压除去乙腈，采用二氯甲烷：甲醇的流动相进行柱分离，得到硬脂酰-L-肉毒碱苄酯；
(d)脱保护
将上述所得的硬脂酰-L-肉毒碱苄酯溶于甲醇中搅拌均匀，加入10％钯碳还原剂硬脂酰-L-肉毒碱苄酯，加热至25-35℃，在H2保护条件下反应3-6小时，将反应液过滤除去钯碳，在减压蒸馏条件下除去溶剂甲醇，即得硬脂酰-L-肉毒碱。
4.如权利要求3所述的硬脂酰-L-肉毒碱的纳米粒，其特征在于，步骤(a)中，L-肉毒碱和溴化苄的摩尔比为：1：1～1.4。
5.如权利要求3所述的硬脂酰-L-肉毒碱的纳米粒，其特征在于，步骤(b)中，硬脂酸和草酰氯摩尔比为：1：1～1.4。
6.如权利要求3所述的硬脂酰-L-肉毒碱的纳米粒，其特征在于，步骤(c)中，L-肉毒碱苄酯和硬脂酰氯的摩尔比为：1：0.8～1.2,二氯甲烷：甲醇为：15～40：1。
7.如权利要求3所述的硬脂酰-L-肉毒碱的纳米粒，其特征在于，步骤(d)中硬脂酰-L-肉毒碱苄酯：10％钯碳还原剂重量比为1：0.1～0.4。
8.如权利要求1所述的纳米粒的制备方法，其特征在于，将药物、靶向修饰材料以及纳米载体材料同时溶于与水不互溶的有机溶剂，所述的有机溶剂为二氯甲烷、氯仿或乙酸乙酯，将其与一定比例的水相混合，以50～300w的功率探头超声3～10min，每次声3s，停止2s，得到均匀的纳米乳，挥去有机溶剂，离心，0.80μm滤膜过滤，得到载药纳米粒溶液；超速离心后，弃去上清液，加入去离子水分散，重复操作三次，洗去表面活性剂，其中油水相比例为1：1～1：10，所述水相为浓度0.1～10％的表面活性剂水溶液，所述的表面活性剂为聚乙烯醇、Tween80、泊洛沙姆188或聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯。
9.权利要求1或2所述的硬脂酰-L-肉毒碱的纳米粒在制备口服靶向纳米药物中的应用。
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