CN103751787A

CN103751787A - 维生素e tpgs在制备多孔药物载体微粒中的用途

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Publication number: CN103751787A
Application number: CN201310700675.2A
Authority: CN
Inventors: 梅林�; 朱慧君; 陈红波; 黄来强; 曾小伟
Original assignee: Shenzhen Graduate School Tsinghua University
Current assignee: Shenzhen Graduate School Tsinghua University
Priority date: 2013-12-18
Filing date: 2013-12-18
Publication date: 2014-04-30

Abstract

本发明公开了维生素E TPGS在制备多孔药物载体微粒中的用途，制备多孔药物载体微粒的方法，以及多孔药物载体微粒。将维生素E TPGS与药物和有机大分子聚合物例如PLGA溶解于有机溶剂，进而进行乳化处理，然后通过挥发去除有机溶剂后，即可得到一种载有药物、表面为孔状结构的多孔药物载体微粒。该多孔药物载体微粒具有毒性小、高靶向性、高包封率、多孔性和加速的药物体外释放能力的特点，并且因含有TPGS，而能够抑制P-gp介导的药物运输，从而抑制施药对象的多药耐药效应，此外，利用该多孔药物载体微粒进行施药，药物的利用率高，因而能够有效减少所需剂量，进一步降低副作用。

Description

维生素E TPGS在制备多孔药物载体微粒中的用途

技术领域

本发明涉及维生素E TPGS在制备多孔药物载体微粒中的用途，制备多孔药物载体微粒的方法，以及多孔药物载体微粒。

背景技术

目前普遍使用的药物载体，容易导致超敏反应，并且施药对象对药物的摄取少，药物对其他身体部分的影响较大，易产生很大的负面效应，且容易导致多药耐药（MDR）效应，从而降低了人体对化学治疗的敏感性。

因而，现阶段迫切需要研发能够高效递送药物至靶点位置并缓慢释放所传递的药物，有效提高药物利用率，减少副作用和多药耐药性，且自身毒性小的药物载体。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种毒性小，能够高效递送药物至靶点位置并缓慢释放所传递的药物，有效提高药物利用率，减少副作用和多药耐药性的药物载体。

根据本发明的一个方面，本发明提供了维生素E TPGS在制备多孔药物载体微粒中的用途。发明人惊奇地发现，将维生素E TPGS与药物和有机大分子聚合物例如PLGA溶解于有机溶剂，进而进行乳化处理，然后通过挥发去除有机溶剂后，即可得到一种载有药物、表面为孔状结构的多孔药物载体微粒。该多孔药物载体微粒具有毒性小、高靶向性、高包封率、多孔性和加速的药物体外释放能力的特点，并且因含有维生素E TPGS，而能够抑制P-gp介导的药物运输，从而抑制施药对象的多药耐药效应。此外，利用该多孔药物载体微粒进行施药，药物的利用率高，因而所需剂量减少，进一步降低了副作用。其中，需要说明的是，该多孔药物载体微粒的获得依赖于维生素E TPGS的使用。维生素E TPGS同时具有亲脂性和亲水性，因而，当将其与药物和有机大分子聚合物混合并形成球状后，亲水的维生素E TPGS会从球状混合物中溶出，相当于致孔剂，从而在混合球上形成多个孔，即形成了具有多孔结构的球状混合物——多孔药物载体微粒。

根据本发明的又一方面，本发明还提供了一种制备多孔药物载体微粒的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：

（1）将所述药物与有机大分子聚合物、维生素E TPGS溶解于有机溶剂，以便获得混合溶液；

（2）将所述混合溶液进行乳化处理，以便获得水包油乳液；以及

（3）将所述水包油乳液依次进行去除有机溶剂、离心和洗涤处理，以便获得所述多孔药物载体微粒。

发明人发现，利用本发明的方法，能够有效地制备多孔药物载体微粒，并且获得的多孔药物载体微粒相对于不添加维生素E TPGS的药物载体微粒，药物释放速率和释放量显著增强。也即本发明制备获得的多孔药物载体微粒具有毒性小、高靶向性、高包封率、多孔性和加速的药物体外释放能力的特点，并且因含有维生素E TPGS，而能够抑制P-gp介导的药物运输，从而能够显著抑制施药对象的多药耐药效应。此外，利用该多孔药物载体微粒进行施药，药物的利用率高，因而所需剂量减少，进一步降低了副作用。

根据本发明的实施例，于1500rpm～20,000rpm下进行所述离心收集微粒。根据本发明的一个实施例，于5000rpm下进行所述离心。根据本发明的另一个实施例，于20,000rpm下进行所述离心。由此，能够有效收集多孔药物载体微粒。

根据本发明的实施例，所述有机大分子聚合物为选自PLGA、PCL、PLA和PCL-PLA的至少一种，优选PLGA。

根据本发明的实施例，所述维生素E TPGS与所述有机大分子聚合物的质量比为1：1.5～9，优选1：4。由此，获得的多孔药物载体微粒表面的孔径大小适宜，药物释放速率和释放量恰当，从而能够有效提高药物载体中药物利用率，减少副作用和多药耐药性。

根据本发明的另一些实施例，于400rpm～1000rpm的搅拌速度下进行所述去除有机溶剂处理。由此，有利于水包油乳液形成所需粒径的多孔药物载体微粒。

根据本发明的实施例，所述多孔药物载体微粒的粒径为80纳米～100微米。

根据本发明的实施例，所述有机溶剂为丙酮、乙酸乙酯或二氯甲烷。由此，能够将药物、有机大分子聚合物和维生素E TPGS有效溶解、混合，有利于后续步骤的进行。

根据本发明的实施例，利用维生素E TPGS的水溶液进行所述乳化处理。

根据本发明的一些实施例，所述维生素E TPGS的水溶液的浓度为0.01质量%-0.05质量%，优选0.03质量%。由此，乳化处理效果好。

根据本发明的实施例，所述药物为选自抗癫痫药、镇痛药、精神抑制药、精神兴奋药、抗帕金森氏症药、麻醉药、拟副交感神经药、成瘾症用药、心脏治疗药、抗高血压药、利尿药、β阻滞剂、钙通道阻滞剂、肾素-血管紧张素系统作用药、调血脂药、抗血栓药、抗出血剂、血液代用品和灌注溶液、口腔药、止吐药、酸相关药物、功能性胃肠病药物、肝胆疾病辅助治疗药物、止泻药、减肥药、糖尿病用药、酶、维生素、抗组胺药、阻塞性气道疾病药物、免疫增强剂、免疫抑制剂、抗炎药和抗风湿药、肌肉松弛剂、泌尿系统药物、生殖系统药物、眼科药物、抗真菌药、创伤和溃疡治疗药、抗生素、消毒剂、祛痘药、抗肿瘤药如烷化剂、抗代谢药物、植物生物碱和其他天然产物、细胞毒性抗生素和相关物质、铂化合物、单克隆抗体、用于光动力疗法或放疗的增敏剂、蛋白激酶抑制剂、抗感染药、抗寄生虫药、激素制剂和解毒剂的至少一种。即利用本发明的方法能够有效地制备可载上述各种药物的多孔药物载体微粒。

根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种多孔药物载体微粒。根据本发明的实施例，该多孔药物载体微粒是通过前面所述的制备多孔药物载体微粒的方法制备获得的。如前所述，根据本发明的实施例，本发明制备获得的多孔药物载体微粒具有毒性小、高靶向性、高包封率、多孔性和加速的药物体外释放能力的特点，并且因含有TPGS，而能够抑制P-gp介导的药物运输，从而能够显著抑制施药对象的多药耐药效应。此外，利用该多孔药物载体微粒进行施药，药物的利用率高，因而所需剂量减少，进一步降低了副作用。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1为实施例1中制备的载多烯紫杉醇微球的场发射电镜图。

图2为实施例2中制备的载多烯紫杉醇纳米颗粒的场发射电镜图。

图3为实施例2中制备的载多烯紫杉醇纳米颗粒的差示扫描量热力学图谱。

图4为实施例2中制备的载多烯紫杉醇的纳米颗粒的热重分析热力学图谱。

图5为据实施例2中制备的载多烯紫杉醇的纳米颗粒的多烯紫杉醇体外释放图谱。

图6为实施例2中，空白纳米颗粒与多烯紫杉醇共施用24h及48h时对MCF7-Adr细胞的细胞毒性检测结果。

图7为实施例2中，空白的多孔纳米颗粒在体外对P-gp ATPase的抑制作用检测结果。

图8为实施例2中制备的载多烯紫杉醇纳米颗粒施用24h和48h后对HeLa细胞的细胞毒性。

图9为实施例2中制备的不同载多烯紫杉醇纳米颗粒制剂以同一多烯紫杉醇浓度施用于HeLa细胞后，用抗α-tubulin抗体进行免疫荧光染色的激光共聚焦扫描电子显微镜的观察结果。

图10为实施例2中，对HeLa细胞成瘤裸鼠施用载多烯紫杉醇纳米颗粒制剂后各组小鼠的体重变化情况。

图11为实施例2中，对HeLa细胞成瘤裸鼠施用载多烯紫杉醇纳米颗粒制剂后各组小鼠的肿瘤生长曲线。

图12为实施例2中，对HeLa细胞成瘤裸鼠施用载多烯紫杉醇纳米颗粒制剂后，在实验终点各组小鼠的肿瘤重量检测结果。

图13为实施例2中，对HeLa细胞成瘤裸鼠施用载多烯紫杉醇纳米颗粒制剂后，在实验终点各组小鼠的肿瘤形态。

图14为实施例3中，激光共聚焦扫描电子显微镜观察到的与载香豆素-6的纳米颗粒在37℃下共孵育30min的HeLa细胞。

图15为实施例4中，载紫杉醇纳米颗粒制剂诱导HeLa细胞的凋亡情况检测结果。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。

首先，需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的：

目前的药物载体系统毒性较大，靶向性仍有待加强，且副作用大，多药耐药效应突出。具体地，以多烯紫杉醇（Docetaxel，简称DTX）药物为例，DTX是一种经典抗肿瘤药物，其已经广泛应用于多种类型的癌症治疗，例如宫颈癌、乳腺癌、前列腺癌、非小细胞肺癌等等。但是，目前的化学疗法中，多烯紫杉醇的大量施用不仅对肿瘤细胞起杀伤作用，而且会引起严重的系统性副作用，如超敏反应、骨髓抑制、骨髓反应、体液潴留、脱发症、外周神经病变、心脏病、疲劳，等等。而且，为了水溶性很差的多烯紫杉醇能进行临床施用，目前DTX的商业化制剂

是以高浓度的非离子表面活性剂吐温-80被用作其的溶剂系统，所述溶剂系统会导致超敏反应、使得肿瘤组织对药物的摄取减少，并增加药物对其他身体部分的影响，产生很大的负面效应。并且，DTX的施用可导致肿瘤细胞产生多药耐药（MDR）效应，从而降低了肿瘤对化学治疗的敏感性。其中，“多药耐药”指的是这样的一种表型：细胞对没有明显的结构相似性、也没有相同分子靶标的多种药物产生抗性。

此外，ABCB1(P-glycoprotein，P-糖蛋白，简称P-gp)是癌细胞中最常过表达的蛋白之一，是ABC（ATP binding cassette，ATP结合盒）运输子蛋白（transporter）超家族成员之一，也叫药物泵出蛋白，由MDR1基因所编码。而多种类型的抗癌药物都是药物泵出蛋白P-gp的底物，包括阿霉素（DOX，Doxorubicin）、正定霉素（daunorubicin）、长春花生物碱（vinca alkaloid）以及紫杉醇类抗癌药。ABC运输子的主要功能是将分子运输到细胞外，因而药物运输子蛋白在癌症细胞内的过表达会减少化疗药物在细胞内的积累，从而相应地会需要大大增加药物施用量。

在药物载体开发领域，纳米颗粒制剂就是一种发展迅速的药物传递系统。近年来，聚合物纳米颗粒（nanoparticles，NPs）由于其能够有效地将药物至靶标肿瘤组织而称为抗癌药物递送系统的理想候选物，得到广泛研究。其中，以多聚（乳酸-共-乙醇酸）（简称PLGA）为例，PLGA是一种FDA批准的多聚物，广泛应用于药品、食物辅料等领域。然而，其具有高度疏水性，结构致密，因此基于PLGA的NPs降解时间较长，甚至在一个月后释放的药物量都不到50%，药物难以在靶标位点达到治疗有效浓度。因而，在近年的PLGA纳米颗粒载体系统的发展过程中，研究者从不同方面对基于PLGA的纳米药物传递系统进行不同改进，包括对PLGA材料进行结构改进，例如合成嵌段共聚物、合成树枝状或星形分子等；还包括在PLGA纳米颗粒表面连接一些分子，进行表面修饰；以及制备多孔纳米颗粒，以促进药物的释放和载体的降解等等。但是目前仍没有显著进展。

维生素E TPGS(D-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯，简称TPGS)是一种天然维生素E的水溶性衍生物，是维生素E琥珀酸和聚乙二醇1000进行酯化反应形成的，TPGS同时具有亲脂性和亲水性，其中PEG部分一般被认为是其的亲水性头部，而生育酚部分则充当亲脂性尾巴，这两部分体积比较庞大，具有相对大的表面积，这些性质使之成为良好的乳化剂，能够用于乳化多种水-油不互溶的系统被广泛用于纳米材料制备的乳化剂。此外，将PLGA、PLA、PCL等聚合物材料与维生素E TPGS共价连接也能增加聚合物的亲水性，改善纳米颗粒的表面结构，达到更好的药物传递效果。维生素E TPGS具有高度的生物安全性，也是FDA批准的安全辅料，广泛用做食品和药物的佐剂。除了作为乳化剂之外，维生素E TPGS自身还能诱导癌细胞的凋亡。维生素E TPGS的前体——维生素E琥珀酸酯（α-TOS）能诱导细胞凋亡。而维生素E TPGS的水溶性更优于α-TOS，甚至呈现出更好的凋亡诱导能力。此外，维生素E TPGS与药物共施用时能增加药物的生物利用率而且能够抑制P-gp介导的药物运输，由此逆转P-gp介导的多药耐药。

根据本发明的一个方面，本发明提供了维生素E TPGS在制备多孔药物载体微粒中的用途。发明人惊奇地发现，将维生素E TPGS与药物和有机大分子聚合物例如PLGA溶解于有机溶剂，进而进行乳化处理，然后通过挥发去除有机溶剂后，即可得到一种载有药物、表面为孔状结构的多孔药物载体微粒。该多孔药物载体微粒具有毒性小、高靶向性、高包封率、多孔性和加速的药物体外释放能力的特点，并且因含有维生素E TPGS，而能够抑制P-gp介导的药物运输，从而抑制施药对象的多药耐药效应，此外，利用该多孔药物载体微粒进行施药，药物的利用率高，所需剂量小，副作用少。其中，需要说明的是，该表面为多孔药物载体微粒的获得依赖于维生素E TPGS的使用。维生素E TPGS同时具有亲脂性和亲水性，因而，当将其与药物和有机大分子聚合物混合并形成球状后，亲水的维生素E TPGS会从球状混合物中溶出，相当于致孔剂，从而在混合球上形成多个孔，即形成了具有多孔结构的球状混合物——多孔药物载体微粒。

发明人发现，利用本发明的方法，能够有效地制备多孔药物载体微粒，并且获得的多孔药物载体微粒相对于不添加维生素E TPGS的药物载体微粒，药物释放速率和释放量显著增强，降解性好。也即本发明制备获得的多孔药物载体微粒具有毒性小、高靶向性、高包封率、多孔性和加速的药物体外释放能力的特点，并且因含有维生素E TPGS，而能够抑制P-gp介导的药物运输，从而能够显著抑制施药对象的多药耐药效应。此外，利用该多孔药物载体微粒进行施药，药物的利用率高，因而所需剂量减少，进一步降低了副作用。

根据本发明的实施例，于1500rpm～20,000rpm下进行所述离心。根据本发明的一个实施例，于5000rpm下进行所述离心。根据本发明的另一个实施例，于20,000rpm下进行所述离心。由此，能够有效收集多孔药物载体微粒。

根据本发明的实施例，所述有机大分子聚合物为选自PLGA（聚乳酸聚羟基乙酸共聚物）、PCL（聚己内酯）、PLA（聚乳酸）和PCL-PLA（聚己内酯聚乳酸共聚物）的至少一种，优选PLGA。由此，制备获得的多孔药物载体微粒靶向性好，能够有效地将药物靶标至目标位置。

此外，需要说明的是，通过调整所述维生素E TPGS与所述有机大分子聚合物的质量比以及进行所述去除有机溶剂处理时的搅拌速度，能够有效控制获得的多孔药物载体微粒上的孔大小，以及多孔药物载体微粒的粒径大小，具体地，维生素E TPGS的添加比例越高，则多孔药物载体微粒的孔径越大，而粒径越小；搅拌速度越大，粒径越小。根据本发明的实施例，所述维生素E TPGS与所述有机大分子聚合物的质量比为1：1.5～9，优选1：4。由此，获得的多孔药物载体微粒表面的孔径大小适宜，药物释放速率和释放量恰当，从而能够有效提高药物载体中药物利用率，减少副作用和多药耐药性。根据本发明的另一些实施例，于400rpm～1000rpm的搅拌速度下进行所述去除有机溶剂处理。由此，有利于从水包油乳液形成所需粒径的多孔药物载体微粒。根据本发明的实施例，根据本发明的实施例，所述有机溶剂为丙酮、乙酸乙酯或二氯甲烷，所制备的多孔药物载体微粒的粒径为80纳米～100微米。其中，有机溶剂为二氯甲烷时，获得的多孔药物载体微粒的粒径为约30～60微米；有机溶剂为丙酮时，获得的多孔药物载体微粒的粒径为约100纳米。

根据本发明的实施例，利用维生素E TPGS的水溶液进行所述乳化处理。即可以利用维生素E TPGS的水溶液作为乳化剂。此外，维生素E TPGS自身能诱导癌细胞的凋亡，而且能够抑制P-gp介导的药物运输，进而，根据本发明的实施例，所制备的多孔纳米颗粒中含有有效的维生素E TPGS的成分，从而其可逆转P-gp介导的多药耐药并由此起到乳化剂之外的活性成分的作用，与多烯紫杉醇协同作用，增强药物的抗癌效应。

根据本发明的另一些实施例，所述维生素E TPGS溶液的浓度为0.01质量%-0.05质量%，优选0.03质量%。由此，利用维生素E TPGS的水溶液进行乳化处理时，效果好。根据本发明的实施例，所述药物为选自抗癫痫药、镇痛药、精神抑制药、精神兴奋药、抗帕金森氏症药、麻醉药、拟副交感神经药、成瘾症用药、心脏治疗药、抗高血压药、利尿药、β阻滞剂、钙通道阻滞剂、肾素-血管紧张素系统作用药、调血脂药、抗血栓药、抗出血剂、血液代用品和灌注溶液、口腔药、止吐药、酸相关药物、功能性胃肠病药物、肝胆疾病辅助治疗药物、止泻药、减肥药、糖尿病用药、酶、维生素、抗组胺药、阻塞性气道疾病药物、免疫增强剂、免疫抑制剂、抗炎药和抗风湿药、肌肉松弛剂、泌尿系统药物、生殖系统药物、眼科药物、抗真菌药、创伤和溃疡治疗药、抗生素、消毒剂、祛痘药、抗肿瘤药如烷化剂、抗代谢药物、植物生物碱和其他天然产物、细胞毒性抗生素和相关物质、铂化合物、单克隆抗体、用于光动力疗法或放疗的增敏剂、蛋白激酶抑制剂、抗感染药、抗寄生虫药、激素制剂和解毒剂的至少一种，优选多烯紫杉醇（简称DTX）和阿霉素。即利用本发明的方法能够有效地制备可载上述各种药物的多孔药物载体微粒。

根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种多孔药物载体微粒。根据本发明的实施例，该多孔药物载体微粒是通过前面所述的制备多孔药物载体微粒的方法制备获得的。如前所述，根据本发明的实施例，本发明制备获得的多孔药物载体微粒具有毒性小、高靶向性、高包封率、多孔性和加速的药物体外释放能力的特点，并且因含有维生素E TPGS，而能够抑制P-gp介导的药物运输，从而能够显著抑制施药对象的多药耐药效应。此外，利用该多孔药物载体微粒进行施药，药物的利用率高，因而所需剂量减少，进一步降低了副作用。

具体地，需要说明的是，本发明的多孔药物载体微粒具有以下优点：

1、毒性小，这是因为所使用的维生素E TPGS和PLGA都是FDA批准的安全生物材料，并且所制备的微粒具有多孔结构，其粒径也得到有效的减小，因而有利于其降解。

2、高包封率，因为维生素E TPGS具有乳化剂的作用，可能因此提高了多孔纳米粒的药物包封率。

3、多孔性和高效的药物控制释放能力，因为维生素E TPGS具有两亲性，所以起到制孔剂的效应，从而形成多孔材料，而载体的多孔性使之具有高效的药物控制释放形式。

4、因含有维生素E TPGS，而能够抑制P-gp介导的药物运输，从而能够显著抑制施药对象的多药耐药效应。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

因研究需要，发明人制备了多种微粒材料，其命名和制备过程总结于表1。具体见下列各实施例（如下所示，在本文中有时也将维生素E TPGS简称为“TPGS”）：

表1

注：材料名称中的数字代表制备中所使用的PLGA/TPGS混合物中TPGS的百分比。

需要说明的是，下列实施例涉及的附图，附图标记中携带的“MPs”表示微米颗粒，“NPs”表示纳米颗粒。

实施例1、载多烯紫杉醇的PLGA微球及PLGA/TPGS共混微球的制备

利用溶剂挥发法制备了三种载多烯紫杉醇的微球。其中MPT0微球（PLGA微球）的制备如下：用精密电子天平精确称量90mg的PLGA/TPGS混合物和10mg的多烯紫杉醇，加入8mL二氯甲烷（DCM）中，室温放置至充分溶解。用量筒量取100mL的0.03%TPGS溶液，加入250mL烧杯，在转速为400rpm的搅拌条件下，将第一步的混合溶液加入其中进行乳化。搅拌过夜，去除有机溶剂并形成PLGA微球。在5000rpm下离心5min，并用去离子水洗涤三次以移除附着的TPGS和多烯紫杉醇。将所得沉淀重悬于3mL去离子水中，-80℃预冻后进行冷冻干燥得粉末状PLGA微球颗粒，所得微球记为MPT0。

MPT10、MPT20和MPT40微球的制备方法同上述MPT0微球制备方法一样，只是其中PLGA/TPGS混合物中TPGS的百分比不同。其中，MPT0、MPT10、MPT20和MPT40中的数字表示制备过程中PLGA/TPGS混合物中TPGS的百分比。例如MPT0表示PLGA/TPGS混合物中TPGS的百分比为0，MPT40表示PLGA/TPGS混合物中TPGS的百分比为40%。

对该实施例制备所得载多烯紫杉醇的PLGA微球及PLGA/TPGS共混微球进行扫描电镜分析。具体方法如下：取冻干后的微球粉末，将其分散于去离子水中，为了使之分散均匀，对其进行超声处理（超声条件为4℃，5W，超声5s，间歇5s，总时间10min）。用移液器取微量混悬液滴在样品座的导电双面胶上，置于通风厨中风干过夜。第二天，首先对样品进行45s的铂金包被处理，以增强有机聚合物的导电性，然后以5kV的电子加速电压进行FESEM成像。结果见图1，微球大小较均一，呈球形，粒径大约在30～60μm左右。其中PLGA微球表面光滑，无孔状结构，而PLGA/TPGS共混微球表面明显可见孔状结构，而且TPGS的添加比例越高，孔径越大。由图中可以看出20%的添加比例能形成孔相对多而无显著形态变化的多孔微球。

实施例2、载多烯紫杉醇（或空白）的PLGA纳米粒及PLGA/TPGS共混纳米粒的制备及性能

纳米粒制备

依据表1所列举的制备条件，参照实施例1的方法制备载多烯紫杉醇的PLGA纳米粒（NPT0）及PLGA/TPGS共混纳米粒（NPT10和NPT20），将其中的溶剂丙酮替换为二氯甲烷，并且搅拌转速为800rpm进行2h后减小为600rpm搅拌过夜，收获纳米颗粒使用的离心条件为20,000rpm，4℃下离心15min。此外，通过不添加多烯紫杉醇制备空白的PLGA纳米粒及PLGA/TPGS共混纳米粒。

纳米粒性能表征

取冷冻干燥前的NPT0、NPT10和NPT20纳米颗粒混悬液,使用动态光散射进行粒径、粒度分布分析，使用激光多普勒测速仪测量纳米颗粒的zeta电位。进行三次重复测量。结果表示为平均值±标准差（SD）。

进行高效液相色谱（HPLC）分析确定纳米颗粒中多烯紫杉醇（DTX）的载药量和包封率。首先确定多烯紫杉醇浓度对HPLC吸光值的的标准曲线：分别配制10、50、100、250、500、1000μg/mL的多烯紫杉醇标准溶液，进行HPLC分析，流动相为去离子水和乙腈（50:50，v/v），使用反向C-18柱子(150mm×4.6mm,孔径5mm,日本GL公司)。流动相的流速为1mL/min，使用UV/VIS检测器检测227nm处的吸光值，将所得A227值对DTX标准溶液浓度进行作图，得到多烯紫杉醇标准曲线线性方程为：A=21.59*C(R²=0.9998)其中A为色谱图峰面积；C为样品浓度。分别称取5mg的NPT0、NPT10和NPT20的纳米颗粒冻干粉末，加入1mL二氯甲烷（DCM）中至完全溶解，并将所得溶液置于真空干燥器中抽真空，直至DCM完全挥发。向仅剩下溶质的管中加入5mL色谱级甲醇（MeOH），充分溶解后，用0.45μm的有机系滤膜进行过滤并加样至色谱仪，使用上述相同条件进行HPLC分析，根据标准曲线由所得吸光值计算DTX含量。通过下列公式计算载药量与包封率（EE）：载药量=NP中包封的DTX量/NP总量。药物EE=NP中包封的DTX量/NP制备中使用的DTX量。所有测试都进行三次独立重复，结果表示为平均值±标准偏差(SD)。

纳米粒的粒径、Zeta电位、粒度分布、载药量、药物包封率总结于表2。

表2.NPT0、NPT10和NPT20的表征分析

由表2可以看出，TPGS的加入减小了纳米粒的粒径（p<0.05），对zeta电位和粒度分布无显著影响。而TPGS显著增加了纳米粒的载药量和药物包封率，TPGS含量越高，载药量和药物包封率越高。

进行扫描电镜分析纳米粒NPT0、NPT10和NPT20的表面形态，电镜样品制备步骤与实施例1中类似。由图2中可见，纳米粒大小较均一，呈球形，直径为100nm左右，这进一步确认了粒径测量的结果。

纳米粒的组成分析

利用差示扫描量热仪和热重分析仪对上文所制备的载多烯紫杉醇的纳米颗粒进行成分分析，分析其中多烯紫杉醇和TPGS的存在状态。方法简述如下：（1）称取5mg的NPT0、NPT10和NPT20的冻干粉末，使用差示扫描量热仪进行DSC分析。用干燥的氮气以20mL/min的流速净化样品，升温速率为10℃/min。（2）称取8mg的NPT0、NPT10和NPT20的冻干粉末进行热重分析，以20℃/min的速率从40℃加热到700℃，氮气的流速为20mL/min。将游离的TPGS粉末用作对照样品。

如图3所示，多孔纳米粒和无孔纳米粒一样，都没有结晶多烯紫杉醇在170℃左右的熔解峰，说明其中多烯紫杉醇以无定形或固态溶液的形式存在。如图4所示，多孔纳米颗粒NPT20有两个显著的失重阶段，分别对应着PLGA和TPGS，说明其中封装有TPGS，NPT10的第二个失重阶段不明显，但仍然可以看出，说明其中也有微量的TPGS存在。

体外药物释放形式

使用透析法测定纳米粒的药物缓释曲线，称取5mg的实施例4中所得纳米颗粒的冻干粉末，用1mL释放缓冲液（由8.5g NaCl、2.2g Na₂HPO₄、0.3g NaH₂PO₄、1.0g吐温-80和去离子水1000ml组成，并经高压灭菌而得。）进行重悬。将混悬液转移至再生纤维素透析膜袋中，封口，浸入含15mL释放缓冲液的50mL离心管中。将离心管在37℃水浴中孵育，以200rpm的速度振荡。每天更透析袋外的释放缓冲液，用1mL二氯甲烷萃取所得的释放缓冲液，然后将二氯甲烷溶液挥发完全并用甲醇溶解，过滤，进行HPLC分析（如上文的HPLC的方法）。对所得数据进行计算分析，获得指定时间释放的累积DTX量，作图。由图5可见，TPGS加入产生的多孔纳米颗粒的药物释放速率和释放量显著大于常规PLGA纳米颗粒，说明其具有良好的药物控制释放特性。

空白纳米颗粒的药物协同效应

进行MTT测定以评估空白纳米颗粒对多烯紫杉醇对耐药细胞株MCF7-Adr细胞毒性的影响。具体步骤如下：在96孔板中，每孔种植4,000个MCF-7/Adr细胞，培养24h使之贴壁，然后，将培养基换成含有空白纳米粒NPT0或NPT20（B-NPT0或B-NPT20，20μg/mL）的新鲜培养基。将1μg/mL的TPGS用作阳性对照，不含纳米颗粒的培养基用作未处理的阴性对照。在经过30min的预处理后，将多烯紫杉醇溶液加入各孔，使之达到终浓度2μg/mL，并将细胞继续培养24h或48h。在指定的时间点取出细胞，弃去培养基并加入100μL的MTT(5mg/mL,溶于DMEM培养液)/孔。将96孔板在37℃培养箱中孵育6h，之后移除MTT并加入DMSO以溶解形成的甲瓒（formazan）晶体（在摇床上孵育30min，避光）。使用酶标仪测量570nm处的吸光值，将不添加MTT的细胞作为空白对照。每种处理设置5个平行样品。进行统计学分析并作图。结果见图6。

图6显示了不载药的多孔纳米颗粒对MCF7-Adr细胞的细胞毒性检测结果（24和48h）。由图6可以看出，NPT20处理组中多烯紫杉醇（DTX）诱导的细胞死亡率比对照及NPT0处理组显著高。因此，这些结果显示本发明制备的基于TPGS的纳米粒可释放其中的TPGS，其释放量足以与药物起协同作用，并增加药物对耐药细胞的效应。

空白纳米粒的P-gp ATPase抑制效应

使用P-gp-Glo^TM测定系统（美国Promega公司）测试空白纳米颗粒对P-gp ATPase的活性影响。在所述测定系统中，作为P-gp ATPase底物的ATP在测定终点的剩余量会转化为由荧光素酶产生的化学发光强度。用完全抑制P-gp ATPase活性的特异性抑制剂Na₃VO₄处理后样品的发光值减去未处理的样品的发光值，得到的是非ATP残留转化而来的非特异性化学发光（即，本底发光值，Δbasal）。而将Na₃VO₄处理后样品的发光值减去经处理的个样品所得的发光值得到的就是各样品的相对光单位变化（Changes in relative light unit，ΔRLU），数值越小，则对P-gp ATPase的抑制率越高。根据制造商说明书进行实验，简言之，将不同浓度的空白NPT20纳米粒（B-NTP20）（0、0.02、0.2、2、20和200μg/mL）或Na₃VO₄与重组表达的人P-gp膜组分相混合，在37℃下孵育5min，使用Mg²⁺ATP引发反应，并在37℃下继续孵育40min以充分反应。然后加入ATP检测反应剂，并在酶标仪上测量化学发光强度，计算ΔRLU，并作图。

由图7可见，随着B-NPT20纳米颗粒剂量的增加，所得的ΔRLU不断降低，也即空白纳米粒NPT20能以剂量依赖的形式抑制P-gp偶联的ATPase活性。

载药纳米颗粒的体内外肿瘤抑制效应

进行MTT测定，以测试不同多烯紫杉醇剂量下，不同纳米颗粒处理后HeLa细胞的活力。在96孔板中，每孔种植4,000个细胞，在细胞贴壁过夜后，将培养基更换为含有不同DTX剂量（为0、0.0128μg/mL、0.064μg/mL、0.32μg/mL、1.6μg/mL和8μg/mL）的载药纳米颗粒NPT0、NPT10及NPT20的培养基。在继续培养24h和48h后取出细胞，按照上文所述的方法进行MTT测定。对数据进行处理，计算不同处理下的细胞活力及指定时间下不同纳米颗粒制剂的IC₅₀值（半量致死浓度）。结果见图8。

图8显示了载多烯紫杉醇的多孔纳米颗粒制剂对HeLa细胞的细胞毒性（24和48h）。由图8可见，在以5种浓度的纳米颗粒处理24h和48h后，不同处理组的细胞存活率为NPT0>NPT10>NPT20。对其中24h和48h的数据进行分析，计算半量致死浓度IC₅₀，得到表3。可见，在这两个时间点，三种纳米制剂的IC₅₀值大小顺序为NPT0>NPT10>NPT20。

为观察载药纳米粒处理后细胞内微管结构变化情况，用抗α-tubulin抗体进行免疫荧光染色。将过HeLa以大约10⁵细胞/孔的密度种植于含有18mm²盖玻片的12孔板中，使细胞贴壁过夜。然后，将培养基换成含有载药纳米粒NPT0、NPT10和NPT20（根据各载药纳米粒的包封率进行计算，使其中DTX的剂量均为100ng/mL）的新鲜培养基，对细胞进行30min的处理，此后，洗去含纳米颗粒的培养基并换为不含药物的DMEM培养基，继续培养6h。不载药纳米颗粒处理的细胞作为阴性对照使用。取出细胞并进行免疫荧光染色。步骤如下：对盖玻片上的细胞进行多聚甲醛固定，用0.4%的Triton X-100溶液（溶于PBS）进行5min的穿透，用3%的BSA封闭液室温封闭1h。加入小鼠单克隆抗α-tubulin抗体（sigma，1:1000）在4℃下孵育过夜。PBS洗涤3次后，室温避光条件下与二抗（罗丹明红偶联的羊抗小鼠二抗，KPL公司，1:200）共孵育1h。PBS洗涤3次，用DAPI染液进行15min的复染。PBS洗涤3次，将盖玻片倒扣置加有防淬灭剂的载玻片上，晾干后对样品进行共聚焦显微镜观察。结果见图9。

图9显示了载多烯紫杉醇的多孔纳米颗粒制剂、非多孔纳米颗粒制剂以同一多烯紫杉醇浓度施用于HeLa细胞后，用抗α-tubulin抗体进行免疫荧光染色的激光共聚焦扫描电子显微镜的观察结果，其中红色表示α-tubulin，蓝色表示细胞核。由图9可见，未施用纳米颗粒的对照细胞中红色荧光（α-tubulin）较为弥散，有细丝状的微管结构，也有游离于细胞质中的微管蛋白，表明其具有正常的微管聚合-解聚平衡。而施用了载DTX的纳米制剂的细胞中，红色荧光集中，形成了比较粗壮的微管结构，证明其中DTX发挥了抑制微管解聚的作用。其中，微管结构的数量为下列顺序：NPT20>NPT10>NPT0。这表明在被细胞摄取后，NPT20产生了最好的微管解聚抑制效果，提示其中多烯紫杉醇的效果最优。

此外，还使用小鼠移植瘤模型测试载多烯紫杉醇的纳米粒的体内抗肿瘤效应。具体方法如下：培养HeLa细胞，在注射成瘤前一天进行最后一次传代，以确保在注射时细胞处于对数生长期，提高成瘤效果。注射当天，用胰酶消化指数生长期的HeLa细胞，并离心洗涤，计数，重悬于PBS中，调整至浓度为2×10⁷细胞/mL。将100μL的HeLa细胞悬液皮下注射于六周龄的雌性裸鼠（体重为15～20g左右）的背部。一周后，可见明显肿瘤生长，将小鼠随机分配至4组，每组5只动物。分别施用载药纳米颗粒NPT0、NPT10、NPT20及生理盐水（阴性对照）。药物的施用剂量为10mg多烯紫杉醇/kg，每隔4天进行腹腔注射。每两天测量肿瘤的长度（D）和宽度（d），并记录小鼠体重。用公式V=d²×D/2计算肿瘤体积，作出肿瘤生长曲线。在研究终点时（第20天，记为d20）处死小鼠，并剥出肿瘤，称重并拍照。结果见图10-13。

图10显示了对HeLa细胞成瘤裸鼠施用载多烯紫杉醇的多孔纳米颗粒制剂、非多孔纳米颗粒制剂后各组小鼠的体重变化情况，其中，生理盐水组为阴性对照。由图10可见，各处理组的小鼠在整个研究过程中体重都稳定增加，其中施用了载药纳米颗粒的小鼠体重增长与生理盐水组相比没有明显减小，证明药物没有显示出显著的系统性毒性。各处理组小鼠肿瘤的生长曲线总结于图11中，可以看出多烯紫杉醇对肿瘤生长有有效的抑制作用，相对于生理盐水对照组，三种载多烯紫杉醇的纳米制剂的施用都对最终的肿瘤生长体积有超过50%的抑制效果，其中NPT20的抑制效果最好，NPT10次之，NPT0的抑制效果相对最弱。如图12所示，可以看出，最终肿瘤重量为NPT20<NPT10<NPT0（生理盐水组为阴性对照），其中NPT20作为载体的多烯紫杉醇制剂将肿瘤抑制到对照组的15%左右，具有比其他组强烈地多的抑制效应。对取出的肿瘤进行拍照，如图13所示，可以直观地看到经过不同纳米制剂处理后的肿瘤形态（生理盐水组为阴性对照），由图13可以看出，经过三种载药纳米粒的处理，荷瘤小鼠在实验终点产生的肿瘤都远小于生理盐水组，这证明三种纳米药物制剂都具有良好的体内疗效，其中NPT20、NPT10处理组的肿瘤明显小于NPT0处理组，其中NPT20的效果最佳。

实施例3、载香豆素的PLGA纳米粒及PLGA/TPGS共混纳米粒的制备及特征

纳米粒制备

依据表1所列举的制备条件，参照实施例2的方法，制备载香豆素-6的PLGA/TPGS共混纳米颗粒，只是其中的多烯紫杉醇用香豆素-6代替，所得的纳米粒记为NPT0C、NPT10C和NPT20C，其中数字表制备时PLGA/TPGS混合物中TPGS的百分比。

表征分析

取冷冻干燥前的NPT0C、NPT10C和NPT20C纳米颗粒混悬液，使用动态光散射进行粒径、粒度分布分析，使用激光多普勒测速仪测量纳米颗粒的zeta电位。进行三次重复测量。结果表示为平均值±标准差（SD）。结果显示于表4。

表4.NPT0C、NPT10C和NPT20C的表征分析

与实施例2中结果类似，由表4可以看出，TPGS的加入减小了纳米粒的粒径（p<0.05），对zeta电位和粒度分布无显著影响。

细胞摄取测定

将HeLa细胞以大约10⁵细胞/孔的密度种植于含有18mm²盖玻片的12孔板中，使细胞贴壁过夜。然后，将培养基换成含有纳米粒NPT0C、NPT10C和NPT20C（20μg/mL）的新鲜培养基。孵育30min后，取出盖玻片，PBS洗涤，用多聚甲醛固定15min后用DAPI染液在室温下避光染色15min，用PBS洗涤并倒扣于加有封片剂的载玻片上，置于共聚焦显微镜下观察并拍照。结果见图14。

图14显示了激光共聚焦扫描电子显微镜观察到的与载香豆素-6纳米粒NPT0C、NPT10C和NPT20C在37℃下共孵育30min后的HeLa细胞。其中绿色荧光为香豆素-6，蓝色表示细胞核。由图14可见，在不同载香豆素-6的纳米颗粒加入细胞30min后，细胞质中就出现大量的绿色荧光的颗粒（香豆素-6），而且几种纳米颗粒产生的荧光强度是可比的。

实施例4、载紫杉醇的PLGA纳米粒及PLGA/TPGS共混纳米粒的制备及特征

纳米粒制备

依据表1所列举的制备条件，参照实施例2的方法，制备载紫杉醇的PLGA/TPGS共混纳米颗粒，只是其中的多烯紫杉醇用紫杉醇代替，所得的纳米粒记为NPT0T、NPT10T和NPT20T，其中数字表制备时PLGA/TPGS混合物中TPGS的百分比。

表征分析

取冷冻干燥前的NPT0T、NPT10T和NPT20T纳米颗粒混悬液，使用激光粒度仪进行粒径、粒度分布分析，使用激光多普勒测速仪测量纳米颗粒的zeta电位。进行三次重复测量。结果表示为平均值±标准差（SD）。结果显示于表5。

表5.NPT0T、NPT10T和NPT20T的表征分析

与实施例2中结果类似，由表5可以看出，TPGS的加入减小了纳米粒的粒径（p<0.05），对zeta电位和粒度分布无显著影响。

细胞凋亡检测

用本实施例中制备的载紫杉醇的纳米颗粒对HeLa细胞进行24h的处理（紫杉醇剂量为100ng/mL），不载药纳米颗粒处理的细胞作为阴性对照使用。紫杉醇溶液（100ng/mL）处理细胞作为阳性对照。根据制造商说明书使用细胞凋亡试剂盒对样品进行处理，进行流式细胞分析。

由图15可见，在以紫杉醇剂量为100ng/mL的浓度施用纳米颗粒24h后，三种纳米制剂都对细胞产生了显著的凋亡诱导作用。其中对细胞的凋亡诱导效果为NPT20T>NPT10T>NPT0T，凋亡百分比分别为52.62%、44.87%和39.03%，其中NPT20T与NPT0T所产生的凋亡效果有显著差异（*代表p<0.05）。

实施例5、载辛伐他汀的PLGA纳米粒及PLGA/TPGS共混纳米粒的制备及特征

纳米粒制备

依据表1所列举的制备条件，参照实施例2的方法，制备载辛伐他汀的PLGA/TPGS共混纳米颗粒，只是其中的多烯紫杉醇用辛伐他汀代替，所得的纳米粒记为NPT0S、NPT10S和NPT20S，其中数字表制备时PLGA/TPGS混合物中TPGS的百分比。

表征分析

取冷冻干燥前的NPT0S、NPT10S和NPT20S纳米颗粒混悬液，使用激光粒度仪进行粒径、粒度分布分析，使用激光多普勒测速仪测量纳米颗粒的zeta电位。进行三次重复测量。结果表示为平均值±标准差（SD）。结果显示于表6。

表6.NPS0S、NPS10S和NPS20S的表征分析

与实施例2中结果类似，由表6可以看出，TPGS的加入减小了纳米粒的粒径（p<0.05），对zeta电位和粒度分布无显著影响。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims

1.维生素E TPGS在制备多孔药物载体微粒中的用途。

2.一种制备多孔药物载体微粒的方法，其特征在于，包括：

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述药物为脂溶性药物。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，于1500rpm～20,000rpm下进行所述离心，

任选地，于5000rpm下进行所述离心，

任选地，于20,000rpm下进行所述离心。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述有机大分子聚合物为选自PLGA、PCL、PLA和PCL-PLA的至少一种，

任选地，所述维生素E TPGS与所述有机大分子聚合物的质量比为1：1.5～9，优选1：4。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述有机溶剂为丙酮、乙酸乙酯或二氯甲烷。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，于400rpm～1000rpm的搅拌速度下进行所述去除有机溶剂处理，

任选地，所述多孔药物载体微粒的粒径为80纳米～100微米。

8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，利用维生素E TPGS的水溶液进行所述乳化处理，

任选地，所述维生素E TPGS的水溶液的浓度为0.01质量%-0.05质量%，优选0.03质量%。

9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述药物为选自抗癫痫药、镇痛药、精神抑制药、精神兴奋药、抗帕金森氏症药、麻醉药、拟副交感神经药、成瘾症用药、心脏治疗药、抗高血压药、利尿药、β阻滞剂、钙通道阻滞剂、肾素-血管紧张素系统作用药、调血脂药、抗血栓药、抗出血剂、血液代用品和灌注溶液、口腔药、止吐药、酸相关药物、功能性胃肠病药物、肝胆疾病辅助治疗药物、止泻药、减肥药、糖尿病用药、酶、维生素、抗组胺药、阻塞性气道疾病药物、免疫增强剂、免疫抑制剂、抗炎药和抗风湿药、肌肉松弛剂、泌尿系统药物、生殖系统药物、眼科药物、抗真菌药、创伤和溃疡治疗药、抗生素、消毒剂、祛痘药、抗肿瘤药如烷化剂、抗代谢药物、植物生物碱和其他天然产物、细胞毒性抗生素和相关物质、铂化合物、单克隆抗体、用于光动力疗法或放疗的增敏剂、蛋白激酶抑制剂、抗感染药、抗寄生虫药、激素制剂和解毒剂的至少一种。

10.一种多孔药物载体微粒，其是通过权利要求2-9任一项所述的方法制备获得的。