CN102641245B

CN102641245B - 一种装载难溶性药物的壳聚糖-壳聚糖衍生物纳米球、制备方法及其作为口服制剂的应用

Info

Publication number: CN102641245B
Application number: CN201210154138.8A
Authority: CN
Inventors: 马光辉; 吕丕平; 魏炜; 王连艳; 周炜清; 苏志国
Original assignee: Institute of Process Engineering of CAS
Current assignee: Institute of Process Engineering of CAS
Priority date: 2011-11-02
Filing date: 2012-05-17
Publication date: 2014-02-26
Anticipated expiration: 2032-05-17
Also published as: CN102641245A

Abstract

本发明提供了一种装载难溶性药物的壳聚糖-壳聚糖衍生物纳米球产品。该产品具有多孔且孔径可控的结构，从而控制药物较快、稳定地释放。作为口服制剂，由于其表面具有大量的正电荷，大大增加了在小肠部位的粘附性和膜通透性，提高了药物的口服生物利用度。同时，该产品还可以联合装载带有负电性的药物或偶联靶向配体，达到协同给药或靶向给药的目的。另外，该产品不但增加了患者的耐受，而且有较低的毒副作用。本发明还提供了一种制备装载难溶性药物的壳聚糖-壳聚糖衍生物纳米球产品的方法，该方法制备的产品粒径均一。该方法适用于水不溶而脂溶性药物，能够控制难溶性药物纳米晶以原位结晶方式均匀分布于纳米球中，提高了对药物的载药率。

Description

一种装载难溶性药物的壳聚糖-壳聚糖衍生物纳米球、制备方法及其作为口服制剂的应用

技术领域

本发明属于药物制剂领域，涉及纳米载体在生物技术领域的应用，具体涉及一种装载难溶性药物的壳聚糖-壳聚糖衍生物纳米球、制备方法及其作为口服制剂的应用。装载难溶性药物的壳聚糖纳米球经口服后到达病变部位，发挥药效。此发明具有潜在的临床治疗应用价值。

背景技术

难溶性药物即水不溶性药物或脂溶性药物。近10年来，科研人员采用药物高通量筛选技术筛选出了大量应用于重大疾病治疗的活性化合物，但筛选出的活性化合物大多分子量高、疏水性强。目前，在新开发的活性药物中至少有40％因溶解度较低问题而不能应用于临床。此外，高达70%的合成药物也都存在溶解度低的问题。

在众多的难溶性药物中，具有代表性的是紫杉醇。紫杉醇（PTX）是红豆杉属植物中一种复杂的次生代谢产物，也是目前所了解的唯一一种可以促进微管聚合和稳定已聚合微管的广谱抗癌药物，对肺癌、卵巢癌、乳腺癌、头颈癌、胃癌、前列腺癌、宫颈癌等都具有良好的治疗作用。然而，由于其水溶性低，目前商品化制剂为了克服药物的难溶问题，临床使用的注射制剂是将药物溶于聚氧乙烯蓖麻油与无水乙醇的混合溶媒中，经葡萄糖或氯化钠稀释后进行静脉注射。这不仅会导致注射部位的疼痛，引起血管炎症，而且聚氧乙烯蓖麻油在体内降会释放组胺，从而导致严重的副反应，如严重的致敏反应、恶心、呼吸困难等。因此，病人在给药前不得不先注射抗过敏药物，导致整个治疗过程繁琐和不便，而且还需谨慎监测用药过程。另外，这种难溶性药物因溶解度问题，导致透膜吸收差、生物利用度低。

尽管科学家们为此做了很多的研究，例如转向新型制剂的研究，研究新的药物载体。药物载体是指能改变药物进入人体的方式和在体内的分布、控制药物的释放速度并将药物输送到靶向器官的体系。由于各种药物载体释放和靶向系统能够减少药物降解及损失，降低副作用，提高生物利用度，因而对它的研究越来越受到重视。为了寻找合适的药物载体，人们对各种体系脂质体、聚合物胶束、聚乳酸（PLA）和固体脂质体纳米球内等进行了广泛研究。然而，脂质体在体内容易被酶类氧化，稳定性差，释放药物缓慢，突释现象严重。而聚合物胶束由于在血液中会被稀释到临界胶束浓度以下，也存在着稳定性差的问题。PLA、固体脂质体等纳米球疏水性强，虽然对难溶性药物可能有较高的包埋率，但由于材料疏水性强，造成释药速率缓慢、血内清除率高和生物利用度低等问题。另外，这些方法还存在着规模化制备困难、产品批次间差异性大的问题。

为了提高难溶性药物的水溶性、解决目前注射制剂严重毒副作用及现行研发制剂存在的问题，急需开发一种亲水性好、载药率高、稳定性好、生物利用度高的载药体系。亲水性生物可降解聚合物纳米球在难溶性药物包埋和传输方面具有潜在优势，通过对纳米球制备材料筛选和制备过程控制，能够使难溶性药物以微晶或细小颗粒形式包裹于载体内部，可大大改善难溶性药物溶出。纳米球还可通过EPR效应（实体瘤组织的高通透性和滞留效应）到达肿瘤部位，实现药物的被动传输。另外，纳米球可以拓展给药途径，如作为口服制剂使用，增加患者的耐受，减轻病人痛苦。

壳聚糖是一种天然的阳离子生物高聚物，具有良好的生物粘附性、生物相容性和生物降解性等优点，是制备口服纳米药物载体的理想材料。然而，目前壳聚糖纳米球主要用于亲水性药物的装载，对于装载难溶性药物还存在许多技术难点。

目前亲水性壳聚糖及其衍生物包埋难溶性药物存在的难点：（1）亲水性的壳聚糖纳米球无法实现对难溶性药物的直接装载，本发明采用O/W/O复乳法实现对难溶性药物的装载，复乳液进一步固化即可制得装载难溶性药物的纳米球。复乳液特别是纳米复乳液滴在制备过程中的稳定性是一个极大的挑战。（2）难溶性药物如紫杉醇在制备过程中很容易析晶形成大的晶体颗粒而破坏乳液，造成药物泄漏甚至包埋失败。（3）纯的壳聚糖纳米球具有实心结构，释放液很难进入纳米球，导致药物释放速率缓慢。（4）壳聚糖制备的纳米球大多采用化学交联法，经化学交联固化后，纳米球表面的活性基团氨基大多被利用，这会大大降低纳米载体的生物粘附性，进而降低其给药后的生物利用度。（5）制备方法非常有限，主要采用机械搅拌法、均质乳化法、超声乳化法等，采用这种方法在制备乳液时，由于粒径不均一，小的乳滴会被大的乳滴吸收，同时大的乳滴又会因剪切力的作用而破坏，这导致所制得的壳聚糖纳米球粒径很不均一。而且，由于乳滴的粒径不均一，在交联过程中小液滴容易被大液滴吸附，大液滴又容易被剪切成小液滴，从而会形成很多交联凝聚物。同时，在液滴的合并和破裂过程中，内包药物容易逃逸到液滴外面，导致药物的包埋率降低。纳米球粒径的不均一还会为壳聚糖及其衍生物纳米球的实际应用带来诸多困难。

发明内容

针对装载难溶性药物的壳聚糖-壳聚糖衍生物纳米球产品及其制备过程中存在的问题，本发明的目的之一在于提供一种装载难溶性药物的壳聚糖-壳聚糖衍生物纳米球及其作为口服制剂的应用。

本发明提供一种装载难溶性药物的壳聚糖-壳聚糖衍生物纳米球，该产品粒径均一，多分散指数在0.1以内，对难溶性药物的载药率高达10-50%。难溶性药物纳米晶以原位结晶的形式均匀分布在壳聚糖及其衍生物纳米球中。通过在纳米球基质中添加一定量的壳聚糖衍生物，实现纳米球多孔结构的构建，孔径可控制在20纳米以内，保证药物稳定快速释放，释放速率可控。该产品是一种口服制剂，由于具有良好的细胞和黏附、细胞内吞及膜通透特性，该产品的口服生物利用度高达5-15%。该产品经口服后对相应的疾病展示出良好的治疗效果及较低的毒副作用。再加之壳聚糖-壳聚糖衍生物天然的亲水性及纳米球本身在EPR效应的作用下被动靶向肿瘤的优势，从而展示出较低的毒副作用。

该产品装载的难溶性药物能够稳定快速释放，还可以通过改变载体孔径控制释药速率。该产品具有良好的细胞黏附和细胞内吞特性，展示出良好的治疗效果。所述载药率按下式计算：

所述装载难性溶药物的壳聚糖-壳聚糖衍生物纳米球对难溶性药物的载药率为10-50%。所述难溶性药物纳米晶均匀分布在壳聚糖-壳聚糖衍生物纳米球中，药物能够稳定快速释放，且释放速率可控。

所述难溶性药物以原位结晶的形式均匀分布在壳聚糖-壳聚糖衍生物纳米球中，极大地提高了亲水性壳聚糖对难溶性药物的装载率和包埋率，克服了亲水性壳聚糖无法实现对难溶性药物的有效包埋等困难，避免了难溶性药物以大的晶体形式存在于载体中而导致的突释现象。

所述难溶性药物纳米晶的粒径为15nm以内，优选10nm以内，进一步优选3nm以内。

所述难溶性药物为脂溶性而水不溶性的药物，优选紫杉醇、O-(氯乙酰氨甲酰基)烟曲霉素醇、尼莫地平、齐墩果酸、丹参酮ⅡA或其混合物，特别优选紫杉醇、O-(氯乙酰氨甲酰基)烟曲霉素醇或其混合物。

所述壳聚糖-壳聚糖衍生物纳米球具有多孔结结构，孔径为40nm以内，优选30nm以内，进一步优选20nm以内。

所述壳聚糖-壳聚糖衍生物纳米球，其粒径均一，平均粒径为20-1500nm，优选为50-350nm。其中粒径及粒径分布由具有粒径分析功能的Zeta电位仪ZetaPlus（BrookhavenInstruments Cooperation,USA）测得。

所述壳聚糖-壳聚糖衍生物纳米球，其粒径多分散指数<0.2，优选<0.1。

壳聚糖-壳聚糖衍生物纳米球粒径均一提高了药物的包埋率，实现了良好的批次重复性，有利于临床报批和生物利用度。

壳聚糖是一种生物降解性高分子材料，其来源广泛、安全、可靠，有良好的生物相容性，成为药物缓释载体的首选材料；壳聚糖作为药物缓释载体在减少给药次数，降低药物毒副作用，提高药物疗效等方面具有重要作用。

本发明采用在基质中添加壳聚糖衍生物（如季铵化壳聚糖），制备成兼具多孔结构和良好生物粘附性的壳聚糖-壳聚糖衍生物纳米球。

所述壳聚糖和壳聚糖衍生物的粘均分子量为5000-980000，优选为10000-100000。

所述壳聚糖与壳聚糖衍生物的质量比为10:0-1:10，优选为5:1-1:5。壳聚糖及其衍生物质量比为10:0表示不含有壳聚糖衍生物。

所述壳聚糖衍生物优选选季铵化壳聚糖、羧化壳聚糖、巯基化壳聚糖或其混合物，特别优选季铵化壳聚糖。

所述壳聚糖-壳聚糖衍生物纳米球表面可通过电荷或活性基团进一步装载其他药物，包括带相反电性的药物以及能与活性基团偶联的药物，特别适用于基因药物的装载或靶向分子的偶联。

本发明另一方面提供了一种装载难溶性药物的壳聚糖-壳聚糖衍生物纳米球的制备方法。

一种制备上述装载难溶性药物的壳聚糖-壳聚糖衍生物纳米球的方法，包括以下步骤：

（1）溶解有难溶性药物的与水不互溶的溶液作为内油相Ⅰ（O_Ⅰ）；

（2）含有水相乳化剂且溶解有壳聚糖或壳聚糖及其衍生物的混合物的酸性水溶液作为水相（W）；

（3）含有油溶性乳化剂且与水互不相溶的油性物质作为外油相Ⅱ（O_Ⅱ）；

（4）将油相Ⅰ与水相混合得到O_Ⅰ/W型初乳液；

（5）将上述制得的O_Ⅰ/W型初乳液与外油相Ⅱ混合得到O_Ⅰ/W/O_Ⅱ型预复乳液；

（6）将上述预复乳液通过微孔膜，得到粒径均一的复乳液；

（7）向复乳液中加入交联剂，使乳滴交联固化得到装载难溶性药物的壳聚糖-壳聚糖衍生物纳米球。

步骤（1）中所述的内油相的有机溶剂具有挥发性，优选为二氯甲烷、三氯甲烷、二氯乙烷、乙酸乙酯。

所述难溶性药物的浓度为5-200mg/mL，优选10-100mg/mL。

所述壳聚糖或壳聚糖及其衍生物浓度可根据需要配置，通常情况下，其浓度优选0.5-2.0wt%。

步骤（2）中所述的水相乳化剂为水溶性乳化剂，选自吐温-20、吐温40、吐温-60、Triton-X405、

35中的一种或两种以上。

步骤（3）中所述油性物质选自液体石蜡、石油醚、橄榄油、棉子油、豆油、葵花子油、其它烷类碳氢化合物中的一种或两种以上。

步骤（3）中所述油溶性乳化剂其亲水亲油平衡值HLB可以在3-6之间，选自失水山梨醇倍半油酸酯、甘油醚的聚合物、聚氧乙烯氢化蓖麻油、失水山梨醇三油酸酯、失水山梨醇单油酸酯、失水山梨醇三硬脂酸酯、亲油-亲水嵌段共聚物、PO-500、PO-310中的一种或两种以上。

基于外油相的质量，所述油溶性乳化剂的浓度为20wt%以下，优选0.5-10wt%。

步骤（4）中所述的初乳液需要油相（O_I）与水相混合经乳化得到，优选经高速均质乳化或超声乳化得到。

所述油相（O_I）与水相（W）的体积比为1:1-1:25，优选1:3-1:20。

步骤（5）中所述预复乳液通过乳化得到，优选通过均质乳化或超声乳化制得。

所述初乳液与外油相（O_II）的体积比为1:1-1:70，优选1:3-1:60。

步骤（6）中所述预复乳液优选在压力作用下通过微孔膜。

步骤（6）中所述压力为基本恒定的压力，所述基本恒定的压力范围为0.5-40MPa，优选0.5-5.0MPa，进一步优选0.5-2.5MPa。

所述基本恒定的压力是指压力的波动不超过10%，优选不超过5%，更优选不超过1%。

压力与所用膜孔径、内外油相粘度和水相中壳聚糖含量有关。例如所述基本恒定的压力范围为0.5-5.0MPa。还例如以孔径为0.5微米的膜、壳聚糖的醋酸水溶液浓度为0.5%制备纳微球，内油相：水相：外油相（V/V/V）=1:5:200时，所用压力可以为2.0MPa；在25℃下，以孔径为0.8微米的膜、其他条件相同时，所用压力可以为1.5MPa，乳化过程均在瞬间完成。

步骤（6）中所述微孔膜为表面亲水或疏水中的一种。

所述微孔膜为表面亲水或疏水中的一种。一般来说，微孔膜孔径较小时，所需操作压力较大，微孔膜的表面亲、疏水性对所制备得到的壳聚糖纳微球粒径和粒径均一性影响不大；当微孔膜孔径较大时，所需操作压力较小时，疏水性微孔膜较亲水性微孔膜所制备得到的壳聚糖纳微球粒径小且粒径均一性好。所述孔径均一的微孔膜的表面疏水性可以通过本领域中已知的方法实现。

所述微孔膜孔径均一，微孔膜的孔径范围为0.1-10.0μm，优选0.2-9.0μm；

所述预复乳液通过过膜的次数为一次以上，即通过同一微孔膜至少一次得到所述O/W/O型乳液，优选为2-5次。

例如，所述预复乳液可以连续或间歇地在相同压力条件下通过两个或更多个孔径均一的微孔膜，这些孔径均一的微孔膜可具有相同或不同的孔径。通过选择具有合适孔径的微孔膜，将预复乳液通过所述孔径均一的微孔膜一次或多次后，所得乳液中的水相液滴的粒径分布多分散指数值会逐渐变小，因此在步骤（7）中交联固化后即可得到本发明的平均粒径为约几十纳米至约几千纳米的载难溶性药物紫杉醇的壳聚糖-壳聚糖衍生物纳米球。

所述步骤（7）中交联剂选自戊二醛、甲醛中的一种或多种。

所述乳滴交联分为两个阶段，第一阶段，乳液在低温下固化，固化温度为5-30℃，优选为10-25℃，固化时间为0.1-4.0小时，优选0.5-3.5小时。该阶段保证纳米球已初步成型，有效地避免了因内油相挥发过快，而导致的破乳、药物包埋率降低甚至失败的结果。第二阶段，乳液缓慢加热至较高温度固化，固化温度为35-70℃，优选为40-65℃，加热速率为0.5℃/min-6℃/min，优选1℃/min-5℃/min，固化时间为4-14小时，优选5-12小时。该阶段控制纳米晶的形成，随着温度的升高，内油相逐渐挥发，纳米晶缓慢原位结晶出来。由于第一阶段的固化限制了紫杉醇的结晶空间，从而控制了药物析出晶体的形状和大小。另外，后期的加热加快了乳液滴的固化速率，避免了乳滴之间发生聚并，从而大大提高了纳米球对疏水性药物的装载率，同时也可以改善最终纳米球的分散性。

步骤（7）中所述O_Ⅰ/W/O_Ⅱ型乳液中可以通过加入化学交联剂饱和的甲苯溶液固化得到装载难溶性药物的壳聚糖及其衍生物纳米球。

所述步骤（7）制得的装载难溶性药物的壳聚糖-壳聚糖衍生物纳米球，需用水洗涤后冻干保存。

所述装载难溶性药物的壳聚糖-壳聚糖衍生物纳米球，其作为口服制剂的应用，口服生物利用度高达5-15%。该产品具有良好的细胞和黏附、细胞内吞及粘膜通透特性。与传统的注射制剂相比，该产品经口服后对相应的疾病展示出良好的治疗效果及较低的毒副作用。

除非特别说明，在本发明中使用的术语具有以下含义。

在本发明中使用的术语“壳聚糖”是指现有技术中命名为“壳聚糖”（Chitosan，缩写CS）的产品，包括天然壳聚糖、改性壳聚糖及其衍生物。例如，从虾壳、蟹壳等海产品废弃物中提取的天然多糖，是由葡糖胺和N-乙酰基葡糖胺（N-acetyl-D-glucosamine）共聚物组成的多糖，是甲壳素（Chitin）脱乙酰基的产物。

在本发明中使用的术语“壳聚糖载药纳米球”是指包埋了难溶性药物的壳聚糖纳米球。

在本发明中使用的术语“均匀乳液”或“均一乳液”是指粒径均一的O/W/O型复乳液。

在本发明中使用的术语“粒径”是指由具有粒径分析功能的Zeta电位仪ZetaPlus（Brookhaven Instruments Cooperation,USA）测得的体积平均粒径。

在本发明中使用的术语“膜孔径”是指微孔膜的体积平均孔径。

本发明装载难溶性药物的壳聚糖-壳聚糖衍生物纳米球采用壳聚糖和壳聚糖衍生物纳米球作为难溶性药物的载体，提供一种低毒高效的口服纳米给药系统。壳聚糖-壳聚糖其衍生物纳米球是一种良好亲水性载体，由壳聚糖阳离子衍生物制备的纳米球是一种良好的口服制剂载体，也可联合装载其他药物或进行功能化修饰。优点是：（1）利用复乳、两阶段的壳聚糖分步交联技术，使难溶性药物以纳米晶的形式均匀分散在纳米球中，实现高的装载率，同时也提高了难溶性药物的溶解度。（2）利用膜乳化技术制备粒径均一的纳米球，实现好的批次重复性，有利于临床报批和高的生物利用度。（3）利用壳聚糖或壳聚糖衍生物的亲水性，实现难溶性药物较快稳定释放。（4）利用壳聚糖衍生物的阳离子或活性基团，可进行正电荷功能化修饰，增加其经口服后在胃肠道的吸收，并结合纳米球的尺寸效应使其可被吞噬细胞吞噬或穿透细胞膜进入细胞内，从而达到治疗疾病的目的。（5）由于具有良好的细胞和黏附、细胞内吞及膜通透特性，该产品的口服生物利用度高达5-15%。相对于传统的注射制剂相比，该产品经口服后对相应的疾病展示出良好的治疗效果及较低的毒副作用。加之壳聚糖-壳聚糖衍生物天然的亲水性及纳米球本身在EPR效应的作用下被动靶向肿瘤的优势，增加其在肿瘤部位的富集，减少对正常细胞的杀伤作用从而展示出较低的毒副作用，有着潜在的临床应用价值（6）利用该纳米球表面留有的电荷或活性基团可以联合装载其他药物或偶联靶向配体。其他药物如基因药物siRNA，抗癌药物阿霉素。靶向配体如RGD肽。（7）不稳定易降解的药物与壳聚糖-壳聚糖衍生物纳米球结合后有较好的稳定性不易被降解，可提高导入细胞的效率和导入细胞后的功效。

附图说明

图1是制备装载难溶性药物的壳聚糖-壳聚糖纳米球的原理及流程示意图。

图2是制备用于形成壳聚糖-壳聚糖衍生物纳米球的均一乳液的装置及原理示意图。A-装置图；B-原理图

图3是实施例1制备的装载难溶性药物的壳聚糖-壳聚糖衍生物纳米球的扫描电镜及透射电镜照片。A-扫描电镜图片；B-透射电镜图片

图4是实施例7中制备的联合装载紫杉醇及siRNA的扫描电镜和透射电镜照片。A-扫描电镜图片；B-透射电镜图片

图5是比较实施例1中恒温固定法制备的壳聚糖-壳聚糖衍生物纳米球透射照片。

图6是实施例1和实施例6中制备的装载难溶性药物紫杉醇的壳聚糖-季铵化壳聚糖纳米球（HTCC-NP:PTX）及壳聚糖纳米球（CS-NP:PTX）的释放曲线和释药10天后纳米球的透射电镜照片。A-纳米球的释放曲线；B-释放10天后纳米球的透射电镜图片

图7体内外评价小肠对实施例1和实施例6制备的壳聚糖-季铵化壳聚糖及壳聚糖纳米球透膜效果。A-透膜速率曲线；B-透膜途径共聚焦结果；C-体内小肠粘附与吸收检测结果

图8体外评价实施例1和实施例6中所制备的壳聚糖-季铵化壳聚糖及壳聚糖纳米球对肿瘤细胞的粘附效果图。

图9是肿瘤细胞LLC对实施例1和实施例6中所制备的壳聚糖-季铵化壳聚糖及壳聚糖纳米球吞噬效果的考察。A-肿瘤细胞对纳米球内吞速率曲线；B-共聚焦检测肿瘤细胞对纳米球内吞量

图10体外评价实施例1和实施例6中所制备的空白或装载难溶性药物紫杉醇的壳聚糖-季铵化壳聚糖及壳聚糖纳米球对癌细胞的毒性。A-空白纳米球与商业化注射剂溶剂细胞毒性结果；B-载药纳米球与商业化注射制剂

细胞毒性结果

图11体内评价实施例1和实施例6中所制备的装载难溶性药物紫杉醇的壳聚糖-季铵化壳聚糖及壳聚糖纳米球经口服给药后的组织分布。A-载药纳米球与商业化注射制剂给药后药物分布结果；B-小动物活体成像检测HTCC-NP:PTX被动靶向效果

图12是实施例1和实施例6中所制备的装载难溶性药物紫杉醇的壳聚糖-季铵化壳聚糖及壳聚糖纳米球经口服给药后对肿瘤生长抑制的评价。A-载药纳米球与商业化注射制剂给药后的抑瘤结果；B-载药纳米球与商业化注射制剂给药后小鼠生存率结果；C-载药纳米球与商业化注射制剂给药后小鼠肿瘤情况及肿瘤细胞核凋亡结果

图13是实施例1和实施例6中所制备的装载难溶性药物紫杉醇的壳聚糖-季铵化壳聚糖及壳聚糖纳米球经口服给药后对机体产生毒副作用的考察。A-载药纳米球与商业化注射制剂致敏结果；B-载药纳米球与商业化注射制剂给药后小鼠血液毒性结果

图14是实施例7中所制备的联合装载难溶性抗肿瘤化疗药物及基因药物的的壳聚糖-季铵化壳聚糖纳米球细胞毒性的考察。

图15是实施例7中所制备的联合装载难溶性抗肿瘤化疗药物及基因药物的的壳聚糖-季铵化壳聚糖纳米球经口服后抑瘤效果的考察。

具体实施方式

如果没有特别指明，本发明中所有浓度单位均为wt%。

本发明说明书附图中所述标记如下：

1-难溶性药物 2-内油相 3-壳聚糖-壳聚糖衍生物 4-酸性水溶液

5-内油相（O_Ⅰ） 6-水相（W） 7-初乳液（O_Ⅰ/W） 8-外油相（O_Ⅱ）

9-预复乳液（O_Ⅰ/W/O_Ⅱ） 10-微孔膜 11-复乳液

12-放气阀 13-放气阀 14-压力表 15-氮气入口 16-容器

17-乳液 18-氮气 19-分散相 20-连续相 21-预乳液

22-均一乳液

为便于理解本发明，本发明列举实施例如下。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制，本领域的技术熟练人员可以根据上述发明内容作出一些非本质的改进和调整。

实施例

为更好地说明本发明，便于理解本发明的技术方案，本发明的典型但非限制性的实施例如下：

装载难溶性药物的壳聚糖及其衍生物纳米球的制备按图1所示的步骤制备，具体步骤如下：

（1）O_I/W/O_II型复乳液的制备

称取一定量的难溶性药物粉末溶解于挥发性且与水不互溶的有机溶剂中作为内油相（O_I）备用；再将一定量的壳聚糖（CS）或壳聚糖衍生物或其混合物、水相乳化剂以及其它添加剂加入到一定量的醋酸或柠檬酸等酸性水溶液中，并在磁力搅拌条件下充分溶解作为水相（W）备用；将一种以上的油溶性乳化剂溶于油性液体作为外油相（O_II）备用。首先将内油相（O_I）和水相（W）混合后，通过均质乳化或超声方法制备O_I/W型初乳液；将初乳液与外油相（O_II）通过均质乳化制备预复乳液，然后将此预乳液在一定压力下反复压过表面亲水或疏水的微孔膜，得到粒径均一的O_I/W/O_II型乳液；该过程在图2A所示的装置中完成。

内油相为溶解有难溶性药物的二氯甲烷、三氯甲烷、二氯乙烷、乙酸乙酯或其混合物的溶液，难溶性药物包括紫杉醇、O-(氯乙酰氨甲酰基)烟曲霉素醇、尼莫地平、齐墩果酸、丹参酮ⅡA及其混合物，难溶性药物的浓度范围优选为10-100mg/mL。壳聚糖及其衍生物的浓度可根据需要配制，通常情况下，其浓度优选为0.5-2.0wt%。水相乳化剂包括Tween-60、Tween-20、Triton X-405及

外油相为在常温下呈液体、且与水不互溶的油性物质，可选择使用液体石蜡和石油醚、橄榄油、棉子油、豆油、葵花子油、其它烷类碳氢化合物等，也可使用其混合物。一般所选择的油相沸点要比较高，挥发性较弱。油性乳化剂要溶解于所使用的油相中，可使用失水山梨醇倍半油酸酯（Arlacel83）、甘油醚的聚合物(如PO-500、PO-310)、聚氧乙烯氢化蓖麻油、失水山梨醇三油酸酯（司班85）、失水山梨醇单油酸酯（司班80）、失水山梨醇三硬脂酸酯（司班65）、亲油-亲水嵌段共聚物等。油相中乳化剂的浓度为0.5-10wt%，内油相：水相：外油相=1:3:30-1:10:600（体积比）。

（2）O_I/W/O_II型复乳液的固化、洗涤

向上述步骤（1）所得到的复乳液中缓慢滴加交联剂或沉淀剂，对乳滴进行固化。固化过程分两个阶段进行，第一阶段，将乳液在低温下固化一段时间。第二阶段缓慢加热至较高温度固化。

实施例1：装载难溶性药物的壳聚糖-壳聚糖衍生物纳米球（HTCC-NP:PTX）的制备

本实施选取紫杉醇为难溶性药物模型，季铵化壳聚糖为壳聚糖衍生物模型。首先将孔径为0.5μm的亲水性膜置于液体石蜡与石油醚（体积比4:1）的混合油相中浸泡过夜或利用超声波清洗机超声1小时使膜孔充分被油相湿润。准确称取一定量的难溶性药物紫杉醇粉末溶解于二氯甲烷中，浓度为60mg/mL，作为内油相备用。称取一定量的壳聚糖与季铵化壳聚糖的混合物（质量比为1:2）溶于1%醋酸水溶液中，得到壳聚糖-季铵化壳聚糖的醋酸水溶液，其浓度为1.0wt%，同时添加8%的水相乳化剂

35。室温下磁力搅拌2小时使乳化剂充分溶解，最后将此溶液在2000rpm下离心除去不溶性杂质，保留上清液作为水相备用。将油溶性乳化剂PO-310加入到100mL的液体石蜡和石油醚的混合物中，其浓度为10wt%，搅拌至完全溶解作为外油相。将1mL上述紫杉醇二氯甲烷溶液与水相壳聚糖-季铵化壳聚糖的醋酸水溶液（1:3，V/V）混合并用超声乳化5分钟，形成初乳液。再将初乳液与配制好的外油相混合，在均质乳化器在24000rpm下乳化1分钟，形成预复乳液。然后，将所得预复乳液迅速倒入如图2所示的膜乳化装置中，在2.0MPa的氮气压力下，使其快速通过孔径均一的微孔膜，得到粒径比较均一的O/W/O型复乳液，将所得复乳液作为预复乳液在2.5MPa的氮气压力下再次通过SPG微孔膜，反复乳化3次，最终得到粒径均一的O/W/O型复乳液。SPG膜为Shirasu Porous Glass membrane的简称，是一种多孔玻璃膜。SPG膜乳化法的特征是用极少量的表面活性剂就可得到良好的乳化物。乳化完毕后，向乳液中加入一定量戊二醛饱和的甲苯溶液。首先在室温（25℃）下交联固化1小时，并缓慢加热（程序升温，1℃/min）至50℃。再恒温交联反应10小时，交联反应的搅拌速率为500rpm。交联反应结束后，在14000rpm下离心，倾去上清液将壳聚糖-季铵化壳聚糖载药纳米球从油相中分离出来，依次用石油醚和蒸馏水洗涤，并将其保存在蒸馏水中。纳米球的平均粒径和粒径分布采用具有粒径分析功能的Zeta电位分析仪ZetaPlus测量，在水中纳米球的平均直径为130.3纳米，多分散指数为0.034。纳米球的扫描电镜照片及透射电镜照片如图3所示。

以紫杉醇为难溶性药物模型，壳聚糖-季铵化壳聚糖为口服纳米载体材料模型，证明壳聚糖-壳聚糖衍生物纳米球能有效的装载难溶性药物、提高药物的溶解度和口服生物利用度，并构建Lewis肺癌作为肿瘤模型进一步验证该口服制剂的抑瘤效果。该产品可以克服现有紫杉醇载体毒性高、亲水性差、血内清除率高、药物生物利用度低且释药速率难以控制、不具备临床应用价值等方面的不足。难溶性药物纳米晶能以原位结晶的方式均匀分布于纳米球中，紫杉醇纳米晶在10纳米以内。通过计算该纳米球的载药率为37.8%。

实施例2：装载不同难溶性药物的壳聚糖-壳聚糖衍生物纳米球的制备

选取羧化壳聚糖为壳聚糖衍生物模型。首先将孔径为1.0μm的亲水性膜置于豆油与葵花子油按体积比2:1的混合油相中浸泡过夜或利用超声波清洗器超声1小时使膜孔充分被油相湿润。分别准确称取一定量的O-(氯乙酰氨甲酰基)烟曲霉素醇、尼莫地平、齐墩果酸、丹参酮ⅡA粉末溶解于内油相三氯甲烷中，浓度分别为10mg/mL、30mg/mL、40mg/mL、80mg/mL，作为内油相备用。称取一定量的壳聚糖-羧化壳聚糖（质量比为10:1）溶于1%柠檬酸水溶液中，得到壳聚糖-羧化壳聚糖水溶液，其浓度为2.0wt%，同时添加5%的水相乳化剂Tween-20。室温下磁力搅拌2小时使乳化剂充分溶解，最后将此溶液在5000rpm下离心除去不溶性杂质，保留上清液作为水相备用。将油溶性乳化剂PO-500加入到100mL的液体石蜡和石油醚的混合物中，其浓度为10wt%，搅拌至完全溶解作为外油相。将1mL的上述四种三氯甲烷溶液与水相（1:10，V/V）混合并用超声乳化10分钟，形成初乳液。再将初乳液与配制好的外油相混合，在均质乳化器在30000rpm下乳化1分钟，形成预复乳液。然后，将所得预复乳液迅速倒入如图2所示的膜乳化装置中，在2.0MPa的氮气压力下，使其快速通过孔径均一的微孔膜，得到粒径比较均一的O/W/O型复乳液，将所得复乳液作为预复乳液在2.0MPa的氮气压力下再次通过微孔膜，反复乳化3次，最终得到粒径均一的O/W/O型复乳液。乳化完毕后，向乳液中加入一定量甲醛饱和的甲苯溶液。首先在较低温度（10℃）下交联固化1小时，并缓慢加热（程序升温，1℃/min）至50℃。再恒温交联反应5小时，交联反应的搅拌速率为500rpm。交联反应结束后，在14000rpm下离心，倾去上清液将壳聚糖-羧化壳聚糖载药纳米球从油相中分离出来，依次用石油醚和蒸馏水洗涤，并将其保存在蒸馏水中。扫描电镜照片及透射电镜照片与实施例1中的结果相似，结果表明这四种难溶性药物同紫杉醇一样，均能被成功包埋于壳聚糖纳米球中，难溶性药物纳米晶也都能以原位结晶的方式均匀分布于纳米球中。纳米球的平均粒径分别为470.2、489.4、462.7、475.6纳米，多分散指数分别为0.042、0.054、0.042、0.071。纳米球的载药率分别为10.3%、27.8%、39.6%、49.7%。

实施例3：装载难溶性药物的不同孔径的壳聚糖-壳聚糖衍生物纳米球的制备

本实施例选取紫杉醇为难溶性药物模型，巯基化壳聚糖作为壳聚糖衍生物模型。首先将孔径为3.0μm的亲水性膜置于液体石蜡与棉子油（体积比1:2）的混合油相中浸泡过夜或超声3小时使膜孔充分被油相湿润。准确称取一定量的难溶性药物紫杉醇粉末溶解于内油相二氯甲烷中，浓度为80mg/mL，作为内油相备用。称取一定量的壳聚糖与季铵化壳聚糖的混合物溶于1%醋酸水溶液中，壳聚糖与巯基化壳聚糖的质量比分别定为10:1，1:1和1:10，得到三种不同的壳聚糖-巯基化壳聚糖的醋酸水溶液，其浓度均为2.0wt%，同时添加8%的水相乳化剂Tween-60。磁力搅拌2小时使乳化剂充分溶解，最后将此溶液在2000rpm下离心除去不溶性杂质，保留上清液作为水相备用。将油溶性乳化剂司班80加入到100mL的液体石蜡和棉子油的混合物中，其浓度为10wt%，搅拌至完全溶解作为外油相。将1mL的上述紫杉醇二氯甲烷溶液与水相（1:3，V/V）混合并用超声乳化5分钟，形成初乳液。再将初乳液与配制好的外油相混合，在均质乳化器在24000rpm下乳化1分钟，形成预复乳液。然后，将所得预复乳液迅速倒入如图2所示的膜乳化装置中，在2.0MPa的氮气压力下，使其快速通过孔径均一的微孔膜，得到粒径比较均一的O/W/O型复乳液，将所得复乳液作为预复乳液在0.8MPa的氮气压力下再次通过SPG微孔膜，反复乳化5次，最终得到粒径均一的O/W/O型复乳液。乳化完毕后，向乳液中加入一定量戊二醛饱和的甲苯溶液。首先在室温（15℃）下交联固化0.5小时，并缓慢加热（程序升温，3℃/min）至55℃。再恒温交联反应10小时，交联反应的搅拌速率为300rpm。交联反应结束后，在8000rpm下离心，倾去上清液将壳聚糖-巯基化壳聚糖载药纳米球从油相中分离出来，依次用石油醚和乙醇洗涤，并将其保存在乙醇中。然后利用临界点干燥仪对制得的纳米球进行干燥，干燥后的纳米球的平均孔径采用BET全自动比表面和孔隙度分析仪测量。测得的纳米球的平均孔径分别为6.78nm、13.96nm和19.57nm。结果表明通过可以改变基质中壳聚糖与季铵化壳聚糖的比例制备不同孔径的壳聚糖-壳聚糖衍生物纳米球。透射电镜与扫面电镜与实施例1结果相似，表明壳聚糖-壳聚糖衍生物纳米球成功包埋难溶性药物紫杉醇。该纳米球的平均粒径分别为524.2、531.7、529.6纳米，对紫杉醇的载药率分别为45.2%、43.7%、41.5%。

实施例4：装载难溶性药物的不同粒径的壳聚糖-壳聚糖衍生物纳米球产品的制备

本实施选取尼莫地平为难溶性药物模型，季铵化壳聚糖为衍生物模型。首先将孔径分别为0.2、1.4、5.2和9.0μm的亲水性膜置于葵花子油与石油醚（体积比4:1）的混合油相中浸泡过夜或利用超声波清洗器超声1小时使膜孔充分被油相湿润。准确称取一定量的难溶性药物尼莫地平粉末溶解于内油相二氯甲烷中，浓度为50mg/mL，作为内油相备用。称取一定量的壳聚糖与季铵化壳聚糖（质量比3:1）溶于1%醋酸水溶液中，得到浓度为0.5wt%水溶液，同时添加8%的水相乳化剂Triton X-405。室温下磁力搅拌3小时使乳化剂充分溶解，最后将此溶液在2000rpm下离心除去不溶性杂质，保留上清液作为水相备用。将油溶性乳化剂司班80加入到100mL的葵花子油和石油醚的混合物中，其浓度为10wt%，搅拌至完全溶解作为外油相。将1mL的上述尼莫地平二氯甲烷溶液与水相（1:3，V/V）混合并用超声乳化5分钟，形成初乳液。再将初乳液与配制好的外油相混合，在均质乳化器在24000rpm下乳化1分钟，形成预复乳液。然后，将所得预复乳液迅速倒入如图2所示的膜乳化装置中，操作压力根据膜孔径的不同而不同，分别在2.5、1.0、0.5、0.2MPa的氮气压力下，使其快速通过不同孔径的微孔膜，得到粒径比较均一的O/W/O型复乳液，将所得复乳液作为预复乳液在相同的氮气压力下再次通过微孔膜，反复乳化3次，最终得到粒径均一的O/W/O型复乳液。乳化完毕后，向乳液中加入一定量甲醛饱和的甲苯溶液。首先在室温（25℃）下交联固化1小时，并缓慢加热（程序升温，升温速率为5℃/min）至50℃。再恒温交联反应5小时，交联反应的搅拌速率为500rpm。交联反应结束后，在14000rpm下离心，倾去上清液将壳聚糖-壳聚糖衍生物载药纳米球从油相中分离出来，依次用石油醚和水洗涤，并将其保存在水中。然后利用利用zeta电位及粒径分析仪测得的纳米球的平均粒径大小分别为25.0、340.5和1946.8纳米，多分散指数分别为0.089、0.056和0.092。结果表明可以通过改变膜孔径及相应的操作压力制得尺寸均一、可控的装载难溶性药物尼莫地平的壳聚糖-壳聚糖衍生物纳米球产品。透射电镜与扫描电镜结果与实施例1中结果相似，说明尼莫地平能够成功包埋于纳米球中，尼莫地平晶体大小分别在2nm、5nm和8nm以下。纳米球对尼莫地平的载药率分别为31.2%、37.1%、39.7%。

实施例5：不同分子量的壳聚糖-壳聚糖衍生物制备装载难溶性药物的纳米球产品

本实施例选取O-(氯乙酰氨甲酰基)烟曲霉素醇为难溶性药物模型，不同分子量的壳聚糖与季铵化壳聚糖作为载体材料。首先将孔径分别为0.7μm的亲水性膜置于橄榄油与棉子油（体积比1:1）的混合油相中浸泡过夜或利用超声波清洗器超声1小时使膜孔充分被油相湿润。准确称取一定量的难溶性药物O-(氯乙酰氨甲酰基)烟曲霉素醇粉末溶解于内油相乙酸乙酯中，浓度为50mg/mL，作为内油相备用。分别称取不同粘均分子量（5000，50000，200000，980000）的壳聚糖及相应的季铵化壳聚糖（质量比2:1）溶于1%醋酸水溶液中，得到不同粘均分子量的壳聚糖-季铵化壳聚糖醋酸水溶液，其浓度为1.0wt%，同时添加8%的水相乳化剂

35。室温下磁力搅拌4小时使乳化剂充分溶解，最后将此溶液在2000rpm下离心除去不溶性杂质，保留上清液作为水相备用。将油溶性乳化剂聚氧乙烯氢化蓖麻油加入到100mL的橄榄油与棉子油（体积比1:1）的混合油相，其浓度为10wt%，搅拌至完全溶解作为外油相。将1mL的上述O-(氯乙酰氨甲酰基)烟曲霉素醇乙酸乙酯溶液与水相（1:5，V/V）混合并用超声乳化5分钟，形成初乳液。再将初乳液与配制好的外油相混合，在均质乳化器在24000rpm下乳化1分钟，形成预复乳液。然后，将所得预复乳液迅速倒入如图2所示的膜乳化装置中，操作压力根据膜孔径的不同而不同，在2.0MPa的氮气压力下，使其快速通过孔径均一的微孔膜，得到粒径比较均一的O/W/O型复乳液，将所得复乳液作为预复乳液在1.6MPa的氮气压力下再次通过SPG微孔膜，反复乳化4次，最终得到粒径均一的O/W/O型复乳液。乳化完毕后，向乳液中加入一定量戊二醛饱和的甲苯溶液。首先在20℃下交联固化1小时，并缓慢加热（程序升温，1℃/min）至50℃。再恒温交联反应10小时，交联反应的搅拌速率为500rpm。交联反应结束后，在14000rpm下离心，倾去上清液将壳聚糖-壳聚糖衍生物载药纳米球从油相中分离出来，依次用乙醇和水迅速洗涤，并将其保存在水中。然后利用zeta电位及粒径分析仪测定各组纳米球的粒径。测得的纳米球的平均粒径大小分别为137.3，125.0、100.5和90.8纳米，多分散指数分别为0.037、0.029、0.054和0.043。结果表明不同分子量的壳聚糖及其衍生物均可作为装载难溶性药物的纳米球载体材料。各种纳米球对难溶性药物O-(氯乙酰氨甲酰基)烟曲霉素醇的载药率分别为27.9%、31.2%、35.7%、39.4%。

实施例6：装载难溶性药物壳聚糖纳米球产品（CS-NP:PTX）的制备

本实施例选取紫杉醇为难溶性药物模型，壳聚糖本身为载体材料。将孔径为0.5μm的亲水性膜置于橄榄油与棉子油（体积比1:1）的混合油相中浸泡过夜或利用超声波清洗器超声3小时使膜孔充分被油相湿润。准确称取一定量的紫杉醇粉末溶解于内油相二氯甲烷中，浓度为50mg/mL，作为内油相备用。称取一定量的壳聚糖溶于2%柠檬酸水溶液中，得到壳聚糖柠檬酸水溶液，其浓度为2.0wt%，同时添加8%的水相乳化剂Triton X-405。室温下磁力搅拌2小时使乳化剂充分溶解，最后将此溶液在2000rpm下离心除去不溶性杂质，保留上清液作为水相备用。将油溶性乳化剂司班-80加入到100mL的橄榄油与棉子油（1:1）的混合油相，其浓度为10wt%，搅拌至完全溶解作为外油相。将1mL的上述紫杉醇二氯甲烷溶液与水相壳聚糖醋酸水溶液（1:10，V/V）混合并用超声乳化5分钟，形成初乳液。再将初乳液与配制好的外油相混合（体积比1:60），在均质乳化器在24000rpm下乳化1分钟，形成预复乳液。然后，将所得预复乳液迅速倒入如图2所示的膜乳化装置中，在2.0MPa的氮气压力下，使其快速通过孔径均一的微孔膜，得到粒径比较均一的O/W/O型复乳液，将所得复乳液作为预复乳液在2.0MPa的氮气压力下再次通过SPG微孔膜，反复乳化3次，最终得到粒径均一的O/W/O型复乳液。乳化完毕后，向乳液中加入一定量戊二醛饱和的甲苯溶液。首先在室温（25℃）下交联固化1小时，并缓慢加热（程序升温，3℃/min）至50℃。再恒温交联反应10小时，交联反应的搅拌速率为500rpm。交联反应结束后，在14000rpm下离心，倾去上清液将壳聚糖载药纳米球从油相中分离出来，依次用石油醚和蒸馏水洗涤，并将其保存在蒸馏水中。纳米球的平均粒径和粒径分布采用具有粒径分析功能的Zeta电位分析仪ZetaPlus测量，在水中纳米球的平均直径为125.0纳米，多分散指数为0.029。扫描电镜照片及透射电镜照片与实施例1中的结果相似，结果表明所制备的壳聚糖纳米球粒径均一，紫杉醇纳米晶以原位结晶的方式均匀分布于纳米球中。壳聚糖纳米球对紫杉醇的载药率为36.7%。

实施例7：联合装载难溶性药物及其他药物的壳聚糖-壳聚糖衍生物纳米球产品的制备

本实施例选取丹参酮ⅡA为难溶性药物模型，季铵化壳聚糖为壳聚糖衍生物模型，选取siRNA为其他药物模型。首先将孔径分别为1.0μm的亲水性膜置于液体石蜡与橄榄油（体积比4:1）的混合油相中浸泡过夜或利用超声波清洗器超声1小时使膜孔充分被油相湿润。准确称取一定量的难溶性药物丹参酮ⅡA粉末溶解于内油相二氯甲烷中，浓度为80mg/mL，作为内油相备用。称取一定量的壳聚糖与季铵化壳聚糖（质量比1:5）的混合物溶于1%醋酸水溶液中，得到壳聚糖与季铵化壳聚糖的混合溶液，其浓度为2.0wt%，同时添加10%的水相乳化剂

35。室温下磁力搅拌2小时使乳化剂充分溶解，最后将此溶液在2000rpm下离心除去不溶性杂质，保留上清液作为水相备用。将油溶性乳化剂PO-310加入到100mL的液体石蜡和橄榄油的混合物中，其浓度为10wt%，搅拌至完全溶解作为外油相。将1mL的上述丹参酮ⅡA二氯甲烷溶液与水相（1:3，V/V）混合并用超声乳化5分钟，形成初乳液。再将初乳液与配制好的外油相混合，在均质乳化器在24000rpm下乳化1分钟，形成预复乳液。然后，将所得预复乳液迅速倒入如图2所示的膜乳化装置中，操作压力根据膜孔径的不同而不同，在2.0MPa的氮气压力下，使其快速通过孔径均一的微孔膜，得到粒径比较均一的O/W/O型复乳液，将所得复乳液作为预复乳液在2.0MPa的氮气压力下再次通过微孔膜，反复乳化3次，最终得到粒径均一的O/W/O型复乳液。乳化完毕后，向乳液中加入一定量戊二醛饱和的甲苯溶液。首先在15℃下交联固化1小时，并缓慢加热（程序升温，5℃/min）至50℃。再恒温交联反应8小时，交联反应的搅拌速率为500rpm。交联反应结束后，在14000rpm下离心，倾去上清液将壳聚糖载药纳米球从油相中分离出来，依次用石油醚和水洗涤。然后将得到的纳米球重新悬浮于溶解有siRNA的水溶液中，利用静电吸附将siRNA负载到装载难溶性药物的壳聚糖-季铵化壳聚糖纳米球表面，经水洗涤后重新包裹一层带正电的季铵化壳聚糖。游离在水溶液中的siRNA用微量核酸检测仪测定，高达96%的siRNA被成功负载于壳聚糖-季铵化壳聚糖纳米球表面。扫描和透射电镜如图4所示，难溶性药物纳米晶体大小为10nm以内，能均匀分散在纳米球中。结果表明壳聚糖及其衍生物纳米球可以联合装载难溶性药物及其他药物，经测定该纳米球对难溶性药物丹参酮ⅡA的载药率为42.7%。平均粒径为342.8纳米，多分散指数为0.057。

实施例8：不同内油相制备装载难溶性药物的壳聚糖-壳聚糖衍生物纳米球

本实施例选取紫杉醇为难溶性药物模型，壳聚糖与巯基化壳聚糖作为载体材料。首先将孔径分别为0.5μm的亲水性膜置于橄榄油与棉子油（3:1）的混合油相中浸泡过夜或利用超声波清洗器超声2小时使膜孔充分被油相湿润。分别称取四份相同量的难溶性药物紫杉醇粉末溶解于不同的内油相中（二氯甲烷、三氯甲烷、二氯乙烷和乙酸乙酯）中，浓度均为20mg/mL，作为内油相备用。称取一定量的壳聚糖-巯基化壳聚糖（质量比4:1）溶于2%柠檬酸水溶液中，得到壳聚糖-巯基化壳聚糖的醋酸水溶液，其浓度为1.0wt%，同时添加8%的水相乳化剂

35。室温下磁力搅拌2小时使乳化剂充分溶解，最后将此溶液在2000rpm下离心除去不溶性杂质，保留上清液作为水相备用。将油溶性乳化剂PO-500加入到100mL的液体石蜡和石油醚的混合物中，其浓度为10wt%，搅拌至完全溶解作为外油相。将1mL的上述紫杉醇溶液与水相（1:3，V/V）混合并用超声乳化5分钟，形成初乳液。再将初乳液与配制好的外油相混合，在均质乳化器在24000rpm下乳化1分钟，形成预复乳液。然后，将所得预复乳液迅速倒入如图2所示的膜乳化装置中，操作压力根据膜孔径的不同而不同，在2.0MPa的氮气压力下，使其快速通过孔径均一的微孔膜，得到粒径比较均一的O/W/O型复乳液，将所得复乳液作为预复乳液在2.0MPa的氮气压力下再次通过微孔膜，反复乳化3次，最终得到粒径均一的O/W/O型复乳液。乳化完毕后，向乳液中加入一定量戊二醛饱和的甲苯溶液。首先在室温（25℃）下交联固化1小时，并缓慢加热（程序升温，1℃/min）至50℃。再恒温交联反应10小时，交联反应的搅拌速率为500rpm。交联反应结束后，在14000rpm下离心，倾去上清液将壳聚糖载药纳米球从油相中分离出来，依次用石油醚和水洗涤。然后利用zeta电位及粒径分析仪测定制得的四种装载难溶性药物的壳聚糖-巯基化壳聚糖纳米球粒径。结果分别为125.0nm、132.5nm、120.1nm、129.2nm，粒径分布指数为0.042、0.037、0.079、0.029。扫描电镜与透射电镜结果与实施例1中结果相似。四种纳米球对难溶性药物紫杉醇的载药率分别为17.8%、18.3%、20.4%。以上结果表明，选用不同的内油相均可以成功制得装载难溶性药物的壳聚糖-壳聚糖衍生物纳米球产品。

实施例9：选用不同水相乳化剂制备装载难溶性药物的壳聚糖-壳聚糖衍生物纳米球产品

本实施例选取齐墩果酸为难溶性药物模型，壳聚糖与巯基化壳聚糖作为载体材料。首先将孔径分别为0.5μm的亲水性膜置于液体石蜡与石油醚（体积比4:1）的混合油相中浸泡过夜或利用超声波清洗器超声1小时使膜孔充分被油相湿润。称取一定量的难溶性药物齐墩果酸粉末溶解于内油相二氯乙烷中，浓度均为80mg/mL，作为内油相备用。称取一定量的壳聚糖溶于1%柠檬酸水溶液中，得到壳聚糖的柠檬酸水溶液，其浓度为1.0wt%，同时添加8%的不同水相乳化剂（吐温-20，吐温-40，吐温-60，Triton-X405,

35）。室温下磁力搅拌2小时使乳化剂充分溶解，最后将此溶液在2000rpm下离心除去不溶性杂质，保留上清液作为水相备用。将油溶性乳化剂司班65加入到100mL的液体石蜡和石油醚的混合物中，其浓度为10wt%，搅拌至完全溶解作为外油相。将1mL的上述齐墩果酸溶液与水相（1:10，V/V）混合并用超声乳化5分钟，形成初乳液。再将初乳液与配制好的外油相混合，在均质乳化器在20000rpm下乳化1分钟，形成预复乳液。然后，将所得预复乳液迅速倒入如图2所示的膜乳化装置中，操作压力根据膜孔径的不同而不同，在2.0MPa的氮气压力下，使其快速通过孔径均一的微孔膜，得到粒径比较均一的O/W/O型复乳液，将所得复乳液作为预复乳液在2.0MPa的氮气压力下再次通过SPG微孔膜，反复乳化4次，最终得到粒径均一的O/W/O型复乳液。乳化完毕后，向乳液中加入一定量戊二醛饱和的甲苯溶液。首先在20℃下交联固化3小时，并缓慢加热（程序升温，4℃/min）至50℃。再恒温交联反应12小时，交联反应的搅拌速率为500rpm。交联反应结束后，在12000rpm下离心，倾去上清液将壳聚糖-羧化壳聚糖载药纳米球从油相中分离出来，依次用石油醚和水洗涤。然后利用扫描电镜与透射电镜对制得的四种装载难溶性药物的纳米球进行观察，结果与实施例1中结果相似。四种纳米球的平均粒径分别为150.3nm、132.7nm、142.9nm，粒径多分散指数分别为0.032、0.053、0.062，纳米球对药物的载药率分别为37.3%、39.5%、42.7%。结果表明，选用不同的水相乳化剂均可以成功制得装载难溶性药物的壳聚糖-壳聚糖衍生物纳米球产品。

比较实施例1：恒温固化法制备装载难溶性药物的壳聚糖纳米球产品

本实施例选取齐墩果酸为难溶性药物模型，壳聚糖作为载体材料。首先将孔径分别为1.4μm的亲水性膜置于液体石蜡与石油醚（体积比4:1）的混合油相中浸泡过夜或利用超声波清洗器或超声1小时使膜孔充分被油相湿润。称取一定量的难溶性药物齐墩果酸粉末溶解于内油相二氯甲烷中，浓度均为20mg/mL，作为内油相备用。称取一定量的壳聚糖溶于1%醋酸水溶液中，得到壳聚糖的醋酸水溶液，其浓度为1.0wt%，同时添加8%的水相乳化剂

35。室温下磁力搅拌2小时使乳化剂充分溶解，最后将此溶液在2000rpm下离心除去不溶性杂质，保留上清液作为水相备用。将油溶性乳化剂Arlacel83加入到100mL的液体石蜡和石油醚的混合物中，其浓度为10wt%，搅拌至完全溶解作为外油相。将1mL的上述齐墩果酸溶液与水相（1:3，V/V）混合并用超声乳化5分钟，形成初乳液。再将初乳液与配制好的外油相混合，在均质乳化器在24000rpm下乳化1分钟，形成预复乳液。然后，将所得预复乳液迅速倒入如图2所示的膜乳化装置中，操作压力根据膜孔径的不同而不同，在2.0MPa的氮气压力下，使其快速通过孔径均一的微孔膜，得到粒径比较均一的O/W/O型复乳液，将所得复乳液作为预复乳液在2.0MPa的氮气压力下再次通过微孔膜，反复乳化3次，最终得到粒径均一的O/W/O型复乳液。乳化完毕后，将乳液分为4批，加入一定量戊二醛饱和的甲苯溶液并恒温固化，固化温度分别为15℃、25℃、40℃、60℃，恒温交联反应时间均为12小时，交联反应的搅拌速率为500rpm。再交联反应结束后，在14000rpm下离心，倾去上清液将壳聚糖载药纳米球从油相中分离出来，依次用石油醚和水洗涤。然后利用透射电镜对制得的四种装载难溶性药物的纳米球进行观察，结果均如图5所示，没有明显的难溶性药物晶体分散在纳米球中，表明恒温固化法不能将难溶性药物成功包埋于壳聚糖纳米球中。经测定四种恒温固化下纳米球对难溶性药物的载药率分别为2.17%、3.18%、3.47%、3.79。

实施例10：装载难溶性药物的壳聚糖-壳聚糖衍生物纳米球释药行为的表征

取实施例1和实施例6制备的HTCC-NP:PTX和CS-NP:PTX考察其释药行为。将上述两种载药纳米球分散于10mL含0.1%Tween-80的磷酸盐缓冲液（PBS缓冲液）中，配制成1mg/mL的悬浊液。将其置于37℃，120r/min的垂直混合仪上混合。在不同的时间点通过离心置换释放液，并利用高效液相色谱（HPLC）测定释放液中的PTX含量，另外，对释放10天后纳米球的降解情况作了考察，相应的结果如图6所示。由实验结果可以看出，壳聚糖衍生物纳米球（HTCC-NP）释放药物的速率明显快于壳聚糖纳米球（CS-NP）。因此，可以通过调节基质中壳聚糖与其衍生物的比例来控制药物的释放速率。

实施例11：壳聚糖-壳聚糖衍生物纳米球生物粘附及透粘膜效果检测

1）Caco-2单层黏膜细胞模型的建立

将Caco-2细胞置于常规培养瓶内，以DMEM为培养液，其中含有4.5g/L D-葡萄糖、L-谷氨酞胺，不含丙酮酸钠和碳酸氢钠。并向培养基中加入1%非必需氨基酸、1%青霉素-链霉素、10%胎牛血清，培养基最终pH值为7.2。细胞在37℃、5%CO2气流下培养。

细胞增殖程度达到80%-90%时，加入预热过的0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA混合消化液润洗一次，然后倒掉消化液，再加入消化液，在37℃下消化2-3min，吸去消化液，加入适量培养液，用吸管轻轻吹打细胞，使其成单细胞悬液。将细胞按50000个/mL，接种到Transwell膜AP侧，接种后每两天换液一次，一周后每日换液，培养至21天后，用跨膜电阻仪测量跨膜电阻，当且仅当电阻值高于800Ω·cm²的模型方可进行后续的实验。

2）CS-NP与HTCC-NP的透粘膜效果表征

按照实施例1和实施例6制备HTCC-NP:PTX和CS-NP:PTX的方法，无需加内油相，直接将水相与外油相混合后经亲水性膜制备得到粒径均一的纳米乳液滴，乳液经进一步固化既得空白的壳聚糖纳米球（CS-NP）及空白的壳聚糖-季铵化壳聚糖纳米球（HTCC-NP）。

Caco-2单层细胞模型成功建立后，吸除上层培养液。在上层加入含有一定浓度（1.0mg/mL）的CS-NP或HTCC-NP 0.5mL，下层加入DMEM培养液1.5mL。于37℃、5%CO2下孵育。在不同的时间点吸取下层培养液0.5mL，并加入新鲜培养液0.5mL。用酶标仪测定吸取培养液的荧光值（激发波长和发射波长分别为450nm和540nm）。根据纳米球荧光值与体积之间关系，计算出纳米球的个数，进而计算出透过Caco-2单层细胞模型的纳米球的百分比，结果如图7A所示。结果显示，具有正电荷的季铵壳聚糖纳米球口服制剂具有良好的透粘膜能力。另外，将上述实验结束后的细胞单层模型用Alexa

635phalloidin标记细胞膜，通过共聚焦显微镜观察其在切面处的图像，结果如图7B所示。结果证实，带有正电荷的壳聚糖-季铵壳聚糖纳米球口服制剂可以打开粘膜细胞间通道，进一步提高了其透粘膜能力。

3）CS-NP与HTCC-NP的粘附效果表征

利用实施例11中步骤1）中的方法，将Caco-2接种于24孔板中，每隔一天更换一次培养液，一周后每天更换一次。培养21天，Caco-2细胞长成单层膜后用于纳米球粘附效果评价。具体如下，吸除上层培养液，在每个孔加入含有一定浓度（1.0mg/mL）的CS-NP或HTCC-NP1.0mL。于4℃下孵育2h后洗除上层，并利用小动物活体成像系统采集各个孔的荧光值，同时采集加入每个孔纳米球总荧光值。根据荧光值换算出粘附于Caco-2细胞单层膜表面的纳米球的百分数，结果如图8所示，带有正电荷的壳聚糖-季铵壳聚糖纳米球口服制剂HTCC-NP对Caco-2对小肠模型具有良好的粘附效果，HTCC-NP在作为难溶性药物口服制剂载体方面具有好的应用前景。

实施例12：肿瘤细胞对CS-NP或HTCC-NP内吞速率的检测

1）肿瘤细胞模型

以Lewis lung carcinoma（LLC）细胞为肿瘤细胞模型，用含100IU/mL青霉素和100IU/mL链霉素及10%新生牛血清的DMEM培养基为培养液，于37℃，5%CO₂培养箱内培养；细胞贴壁大于80%时进行传代。

2）肿瘤细胞对CS-NP或HTCC-NP内吞的检测

LLC细胞按1×105/孔接种于24孔板中，培养24h后将培养液更换为含有一定浓度（100μg/mL）的CS-NP或HTCC-NP培养液，37℃下孵育，孵育不同时间后，吸除上层培养液，用PBS洗掉未被吞噬的壳聚糖纳米球。随后洗脱细胞，垂悬固定后用流式细胞仪测定细胞的平均荧光强度值，根据荧光强度即可计算出细胞随时间的延长对纳米球吞噬速率的变化，结果如图9所示，肿瘤细胞LLC对带有正电荷的壳聚糖-季铵壳聚糖纳米球口服制剂（HTCC-NP）内吞速率较CS-NP快，展示出其作为难溶性药物口服制剂载体的潜在临床应用价值。

将LLC细胞按1×105/孔接种于24孔板中，24h后将培养液更换为含有一定浓度（100μg/mL）CS-NP:PTX或HTCC-NP:PTX的培养液，37℃下孵育24h。用PBS洗掉未被吞噬的载药纳米球，细胞进一步洗脱后，用乙腈萃取24h提取细胞内的药物。最后用HPLC测定细胞内药物含量，结果显示与HTCC-NP:PTX共同孵育的细胞内PTX含量是CS-NP:PTX的四倍。

LLC细胞按1×105/cm²接种于Petri皿中，24h后将培养液更换为含有一定浓度的CS-NP或HTCC-NP培养液（100μg/mL），37℃下孵育24h。细胞经洗涤，固定后染色。细胞膜用Alexa

635phalloidin染色，细胞核用DAPI标记。最后用激光共聚焦观察细胞对纳米球的内吞情况，结果如图9所示，肿瘤细胞对HTCC-NP内吞量明显高于CS-NP，说明阳离子化的壳聚糖-季铵化壳聚糖纳米球更容易进入肿瘤细胞。

实施例13：空白及载药纳米球对肿瘤生长抑制及体内分布的检测

（1）LLC细胞按5×104个/孔接种于96孔板中，37℃下孵育24h后，将实施例1和6中制得CS-NP、HTCC-NP、CS-NP:PTX和HTCC-NP:PTX稀释成不同浓度，添加至平行孔中。48h后，用MTT测定不同给药浓度对细胞杀伤毒性的影响，结果如图10所示，空白球对细胞无明显的杀伤毒性，展示出该口服制剂载体良好生物相容性，而HTCC-NP:PTX对肿瘤细胞有明显的杀伤毒性，说明带有正电荷的季铵化壳聚糖纳米球更容易进入并杀死肿瘤细胞。

（2）CS-NP和HTCC-NP粘附及吸收体内表征

选择C57BL/6小鼠进行体内试验，首先将CS-NP和HTCC-NP通过灌胃方式给药三次。每隔6h给药一次，每次给药剂量为300μL（10mg/mL）。最后一次给药后禁食6h，然后处死小鼠并摘取小鼠的小肠。小肠依次经过洗涤、固定、包埋、切片、脱蜡、染色（DAPI染细胞核）和封片后用共聚焦显微镜进行观察，结果如图7C所示，阳离子化的HTCC-NP对小肠的粘附效果较好，进一步提高了药物的口服生物利用度。

（3）CS-NP:PTX及HTCC-NP:PTX口服后药物分布检测

1）肿瘤模型小鼠的建立

将100μL（1×107个/mL）的LLC细胞接种于C57BL/6小鼠的左腋下，20-25天后肿瘤生长至直径约为15mm。

2）药物分布测定

将制得的CS-NP:PTX及HTCC-NP:PTX（10mg/kg PTX）口服给药24h后，处死小鼠，摘取小鼠的胃、心、肝、脾、肺、肾及肿瘤组织。再用研磨机研磨各组织成匀浆。用二氯甲烷萃取各组织中的药物PTX。二氯甲烷层挥发后，采用HPLC测定各个组织中的药物含量。以临床制剂为对照组，通过尾静脉注射给药，给药量剂量按1mg/kg的PTX给药。结果显示如图11A所示，壳聚糖-季铵化壳聚糖纳米球给药组小鼠肿瘤部位药物浓度明显高于其他给药组，间接证明该口服制剂的在EPR效应的作用下靶向肿瘤部位。通过加和计算各个组织中的总药物含量得，求的两种载药纳米球的口服生物利用度，CS-NP:PTX和HTCC-NP:PTX分别为5.12%和14.7%。用近红外荧光Cy7标记口服纳米载体，给药3、24小时后，用小动物活体成像系统对纳米球在体内的分布进行观察。从小动物活体成像的结果（图11B）可以看出，口服纳米载体能够被动靶向肿瘤部位，展示出其良好的应用前景。

实施例14：CS-NP:PTX及HTCC-NP:PTX经口服后抑瘤效果观察

（1）按照实施例13中的方法构建荷瘤小鼠模型共40只，随机分为四组，PBS、CS-NP:PTX组和HTCC-NP:PTX组。PBS按100μL/只灌胃给药，

按1mg/kg PTX经尾静脉给药，CS-NP:PTX及HTCC-NP:PTX按10mg/kg PTX口服给药。

（2）相对肿瘤生长速率观察

选取接种后第10天为治疗期第0天，每天给药后用游标卡尺测量肿瘤的长（a）和宽（b），并根据公式V=a×b2/2计算肿瘤体积。肿瘤生长速率=第n天实际肿瘤体积/第0天实际肿瘤体积。并以时间（天）为横坐标，肿瘤生长速率为纵坐标作图，结果如图12A所示，HTCC-NP:PTX经口服给药后展示出明显的抑瘤效果，在停止给药后（第15天），HTCC-NP:PTX还能够展示出良好的抑瘤效果，说明纳米球的缓释效果，而给药组小鼠的肿瘤生长明显加速。

（3）荷瘤小鼠体重变化观察

从治疗的第0天开始，每次对荷瘤小鼠给药后称量各组小鼠体重。小鼠体重增长速率=第n天实际小鼠平均体重/第0天实际小鼠平均体重。并以时间（天）为横坐标，小鼠体重生长速率为纵坐标作图，结果显示HTCC-NP:PTX经口服给药后小鼠体重波动较小，未体现出明显的毒副作用。

（4）小鼠生存曲线的绘制

量取每组小鼠肿瘤体积时，当小鼠肿瘤体积达到3000mm³时视为死亡，计算出小鼠在第n天的死亡率，然后以（1-死亡率）为纵坐标，以时间为横坐标作图，结果如图12B所示，口服用HTCC-NP:PTX能够有效地延长小鼠生命周期。

（5）各治疗组在最后一次给药后30min尾静脉取血100μL，用小鼠ELISA试剂盒测IgE水平。IgE是检测1型变态反应最重要的参数之一，随着变态反应的发生IgE水平会显著提高，结果如图13所示，与临床注射制剂相比，HTCC-NP:PTX经口服给药后，小鼠的IgE水平未出现明显的升高，说明该口服制剂无明显的毒副作用。

（6）给药纳米球血液毒性考察

各治疗组连续给药15天，末次给药24h后，取各组小鼠全血（20μL/只），用血细胞计数分析仪测其红细胞、白细胞及血小板的数量变化，结果如图13所示，HTCC-NP:PTX经口服给药后，小鼠白细胞数量未出现明显的降低，说明该口服制剂无较明显的血液毒性，其作为口服制剂具有的临床应用价值。

实施例15：联合装载有难溶性药物及带负电的其他药物的的壳聚糖及其衍生物纳米球复合物产品（HNP:PTX/siRNA⁺）作为口服制剂的应用

本实施例选取实施例7中制备的联合装载有难溶性药物及其他药物的壳聚糖-壳聚糖衍生物纳米球复合物产品作为口服制剂模型，其中选取紫杉醇为难溶性药物模型，同时选择siRNA作为其他药物模型。制得装载有紫杉醇及siRNA的季铵化壳聚糖纳米球复合物产品（HNP:PTX/siRNA⁺）。

端粒酶反转录酶siRNA序列：

正义链：CAGAUCAAGAGCAGUAGUCt

反义链：GACUACUGCUCUUGAUCUGtt；

2#：

正义链：UAUGUCAGACUCCUCAGGUtt

反义链：ACCUGAGGAGUCUGACAUAtt。

（2）HNP:PTX/siRNA⁺复合物的表征

将HP:PTX/siRNA⁺复合物分散在去离子水溶液中，得到浓度约为1.0-2.0mg/L的溶液。纳米球复合物的平均粒径和粒径分布采用具有粒径分析功能的Zeta电位分析仪ZetaPlus测量。扫描电镜照片及透射电镜照片如图4所示，与实施例1中的结果类似。结果表明所制备的装载有难溶性药物紫杉醇的壳聚糖-壳聚糖衍生物纳米球粒径均一。紫杉醇纳米晶以原位析晶的方式均匀分布于纳米球中。

（3）端粒酶反转录酶HNP:PTX/siRNA⁺复合物抑制肿瘤生长

LLC细胞按5×104个/孔接种于96孔板中，37℃下孵育24h。将单独的mTERTsiRNA、MocksiRNA:HNP、mTERTsiRNA:HNP、和mTERTsiRNA:HNP:PTX复合物稀释成不同浓度，添加至平行孔中。48h后用MTT测定不同给药浓度对细胞杀伤毒性的影响，结果如图14所示，在24小时内，对照组细胞、siRNA单独处理及MocksiRNA:HNP对细胞没有明显的杀伤效果。而加入端粒酶反转录酶mTERTsiRNA:HNP:PTX复合物的肿瘤细胞的生长明显受到抑制。

（4）端粒酶反转录酶HNP:PTX/s iRNA⁺复合物经口服后抑瘤效果的观察

1）构建小鼠肿瘤模型

按照实施例13中的方法构建荷瘤小鼠模型共50只，随机分为五组，PBS、mTERTsiRNA、MocksiRNA:HNP、mTERTsiRNA:HNP、和mTERTsiRNA:HNP:PTX。PBS按100μL/只灌胃给药，

按1mg/kg PTX经尾静脉给药，mTERTsiRNA按10nM/kg的浓度灌胃给药100μL，MocksiRNA:HNP、mTERTsiRNA:HNP、和mTERTsiRNA:HNP:PTX按10nM/kg siRNA口服给药。

2）相对肿瘤生长速率观察

选取接种后第10天为第0天，每天给药后量取肿瘤的长（a）和宽（b），并计算肿瘤体积V=a×b2/2。肿瘤生长速率=第n天实际肿瘤体积/第0天实际肿瘤体积。并以时间（天）为横坐标，肿瘤生长速率为纵坐标作图。结果如图15所示，联合装载有难溶性药物PTX及siRNA复合物纳米球产品经口服后的抑瘤效果最佳。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细工艺设备和工艺流程，但本发明并不局限于上述详细工艺设备和工艺流程，即不意味着本发明必须依赖上述详细工艺设备和工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims

1.一种装载难溶性药物的壳聚糖-壳聚糖衍生物纳米球的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

选取羧化壳聚糖为壳聚糖衍生物模型；

首先将孔径为1.0μm的亲水性膜置于豆油与葵花子油按体积比2:1的混合油相中浸泡过夜或利用超声波清洗器超声1小时使膜孔充分被油相湿润；

分别准确称取一定量的丹参酮ⅡA粉末溶解于内油相三氯甲烷中，浓度为80mg/mL，作为内油相备用；

称取一定量的壳聚糖-羧化壳聚糖溶于1%柠檬酸水溶液中，得到壳聚糖-羧化壳聚糖水溶液，其浓度为2.0wt%，同时添加5%的水相乳化剂Tween-20，其中，壳聚糖与羧化壳聚糖的质量比为10:1，室温下磁力搅拌2小时使乳化剂充分溶解，最后将此溶液在5000rpm下离心除去不溶性杂质，保留上清液作为水相备用；

将油溶性乳化剂PO-500加入到100mL的液体石蜡和石油醚的混合物中，其浓度为10wt%，搅拌至完全溶解作为外油相；

将1mL的上述三氯甲烷溶液与水相混合并用超声乳化10分钟，形成初乳液，其中，三氯甲烷溶液与水相的体积比为1:10；

再将初乳液与配制好的外油相混合，在均质乳化器在30000rpm下乳化1分钟，形成预复乳液，然后，将所得预复乳液迅速倒入膜乳化装置中，在2.0MPa的氮气压力下，使其快速通过孔径均一的微孔膜，得到粒径比较均一的O/W/O型复乳液，将所得复乳液作为预复乳液在2.0MPa的氮气压力下再次通过微孔膜，反复乳化3次，最终得到粒径均一的O/W/O型复乳液；

乳化完毕后，向乳液中加入一定量甲醛饱和的甲苯溶液，首先在较低温度下交联固化1小时，并缓慢加热至50℃，再恒温交联反应5小时，交联反应的搅拌速率为500rpm，所述较低温度为10℃，所述缓慢加热为程序升温，升温速率为1℃/min；

交联反应结束后，在14000rpm下离心，倾去上清液将壳聚糖-羧化壳聚糖载药纳米球从油相中分离出来，依次用石油醚和蒸馏水洗涤，并将其保存在蒸馏水中。