CN103435718B - Peg修饰的透明质酸胆固醇酯 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种新型药物载体PEG修饰的透明质酸胆固醇酯及其应用。它是在透明质酸(HA)骨架上引入疏水性基团胆固醇酯以及亲水链聚乙二醇(PEG)而形成的，具有两亲性，在水中可自组装形成聚合物胶束，包载难溶性药物、蛋白质药物、基因类药物。该PEG修饰的透明质酸胆固醇酯安全性好、可生物降解、临界胶束浓度低；载药胶束纳米粒大大提高难溶性药物的水中溶解度，包封率高；制备工艺简单，易于大规模生产。

Description

PEG修饰的透明质酸胆固醇酯

技术领域

本发明涉及一种PEG修饰的透明质酸胆固醇酯以及作为药物载体的应用。

背景技术

现代药物学研究表明，药物发挥药效作用，除了与药物本身的化学成分、分子结构密切相关外，还与药物的存在状态如粒径大小、表面电荷等有关。纳米制剂技术在药物研究中的应用正是基于它能改变药物在制剂中的存在状态而使药物表现出缓控释性、靶向性，从而提高药物生物利用度、降低药物的毒副作用等。纳米技术用于药物的研究是现代医学发展的重要方向之一。

纳米制剂主要分为纳米载体和纳米药物两类。其中纳米载体系指溶解或分散有药物的各种纳米粒，如纳米脂质体、聚合物胶束、固体脂质纳米粒、纳米囊、纳米球等。

聚合物胶束是利用两亲性的聚合物纳米材料在水中自发形成纳米胶束的特性而发展起来的，它具有较低的临界胶束浓度、较大的增溶空间，结构稳定，并且依据聚合物疏水链段的性质可以通过化学、物理以及静电作用等方法包裹药物，对聚合物胶束表面特征的设计，可赋予纳米粒表面以亲水性，以减少体内巨噬细胞吞噬，延长体内循环时间，增强对细胞膜的粘附能力，其中聚乙二醇(PEG)是最广泛的表面修饰材料。

天然多糖修饰得到的接枝聚合物纳米材料是目前常用的聚合物纳米材料之一，具有生物降解性高、生物相容性好、免疫原性低、易于化学改性等特点，具有广泛的应用前景。接枝聚合物胶束由骨架链和支链组成，该接枝共聚物分散在水中就会自组装形成具有核壳结构的纳米粒子，粒子内核由疏水骨架链组成、外壳为亲水支链；或反过来外壳为亲水性骨架链、内核由疏水支链组成。接枝共聚物的种类、构型、支链的长短与数量、接枝位点等，都影响接枝共聚物的性质。

透明质酸(HA)是人等哺乳动物细胞外基质中广泛存在的一种糖胺多糖，在维持细胞外基质结构及调节细胞内活动方面都起着重要的作用。因其具有良好的生物相容性、生物可降解性，HA很早就用于药物载体。近年来研究发现HA与细胞表面HA受体CD44和RHAM以及其他HA结合蛋白，包括hyaladherins和蛋白多糖(proteoglycans，PG)等相互作用，调节细胞的多种生物行为，如细胞粘附、迁移、增殖和分化以及创伤愈合等。其中CD44是细胞表面最重要的HA受体，是与HA结合的主要部位。同时研究发现CD44受体在肿瘤细胞表面过量表达，HA载体通过受体介导的主动靶向作用将药物递送至肿瘤细胞，提高抗肿瘤活性，增加药物对肿瘤细胞有高度亲和性，因此HA接枝形成的两亲性聚合物作为新型药物载体，能形成核壳结构的纳米粒，包裹药物，达到细胞靶向的作用，日益受到瞩目。天然HA的相对分子质量分布范围很广，由1000到1000万不等，其在体内的分布和作用与相对分子质量的大小相关。如高分子HA主要存在于疏松结缔组织中，可维持细胞完整性和细胞外基质中水分含量，在外用制剂中应用较多；而HA寡聚糖片段可诱导受体介导的细胞内信号传导，可作为纳米粒药物传递系统。一般，制备纳米粒所用的HA分子量较低，通过改变接枝HA中疏水片段的种类、取代度和相对分子质量以及疏水性修饰的方式，可调控HA纳米粒的形态、粒径、载药量、包封率、释药行为和靶向性等。

HA化学结构中有羧基和羟基，易于对其进行化学改性，接枝疏水链，制备聚合胶束。现国内外已报道HA接枝PLGA、接枝脱氧胆酸、接枝神经酰胺、接枝长烷基链、接枝紫杉醇等衍生物作为难溶性药物给药载体的应用，具有良好的应用前景。201010228961.X专利是在透明质酸骨架上接枝疏水烷基链和叶酸，制备了一种药物增溶材料。

本发明是在透明质酸羟基上接枝疏水性的胆固醇酯(如胆固醇半琥珀酸酯)和在HA羧基上接枝亲水性的PEG链，发明一种PEG修饰的透明质酸胆固醇酯。它是两亲性聚合物纳米材料，引入的胆固醇酯是疏水基团，有利于形成疏水内核，同时胆固醇酯(如胆固醇半琥珀酸酯，CHS)本身具有一定的抗肿瘤活性(Zora Djuric et a1，1997；Katsuhiko Yamadaet al，2003；Chisato Ishimaru et al，2007)，是一种潜在的抗肿瘤活性药物，且无毒、生物相容性好，引入的PEG链有利于改善材料表面的亲水性，减少体内巨噬细胞吞噬，延长体内循环时间，增强对细胞膜的粘附能力。

发明内容

本发明描述并要求一种新型PEG修饰的透明质酸胆固醇酯，以及它的制备方法和应用，它是一种安全性好、可生物降解、临界胶束浓度低的两亲性聚合物，可在水中自组装形成聚合物胶束，作为纳米药物传递系统。

本发明的目的在于提供一种PEG修饰的透明质酸胆固醇酯及其制备方法。

本发明的目的在于提供PEG修饰的透明质酸胆固醇酯在药物制剂领域的应用。

本发明涉及的PEG修饰的透明质酸胆固醇酯，其特征是在透明质酸骨架上引入疏水性基团胆固醇酯以及亲水链PEG，使其具有两亲性，可在水中自组装形成聚合物胶束。

本发明所述的PEG修饰的透明质酸胆固醇酯，是指疏水性的胆固醇酯(胆固醇半琥珀酸酯、胆固醇半戊酸酯、胆固醇半己酸酯、胆固醇半辛酸酯中的任意一种)取代透明质酸中葡萄糖醛酸-N乙酰葡萄糖胺重复单元上的羟基，亲水性PEG取代透明质酸中重复单元上的羧基。

本发明所述的PEG修饰的透明质酸胆固醇酯，其中接枝的疏水性基团胆固醇酯的总取代度为5％～40％，接枝的PEG的取代度为2～10％。

本发明所述的PEG修饰的透明质酸胆固醇酯，其特征在于选用的HA的分子量为5×10³～5×10⁵Da，优选5×10³Da。

本发明所述的PEG修饰的透明质酸胆固醇酯的制备方法包括以下过程：

胆固醇(CHO)、脂肪烃二酸酐(丁二酸酐、戊二酸酐、己二酸酐、辛二酸酐中的任意一种，优选丁二酸酐)溶于无水吡啶，70℃磁力搅拌24h；反应液冷却至室温，分别用冰稀盐酸200mL、蒸馏水洗涤，沉淀，抽滤；粗产品依次用水/无水乙醇混合液(1/1，V/V)、无水乙醇重结晶，得胆固醇半脂肪酸酯；

透明质酸钠(HA-Na)溶于甲酰胺中，50℃磁力搅拌5h使其溶解；另精密称取一定量胆固醇半脂肪酸酯溶于N，N’-二甲基甲酰胺(DMF)，加定量的N，N’-二环己基碳二亚胺(DDC)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)，冰浴下反应2h，将其逐滴加入HA-Na中，充氮保护，40℃磁力搅拌24h；反应液加入乙醇洗涤、离心两次，沉淀用少量甲酰胺溶解后蒸馏水透析3d，冷冻真空干燥得透明质酸胆固醇酯；

透明质酸胆固醇酯溶于pH6.8的PBS中，室温磁力搅拌2h，分别加入一定量的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)、1-羟基-苯并-三氮唑(HOBt，溶于2mL甲醇滴入)、和单甲氧基聚乙二醇胺(PEG-NH₂)，室温磁力搅拌24h；反应液经甲醇/水(1∶1，V/V)透析1d，蒸馏水透析3d，冷冻真空干燥得PEG修饰的透明质酸胆固醇酯。

本发明所述的PEG修饰的透明质酸胆固醇酯在药物制剂中的应用，是一种载药聚合物纳米粒的组合物，它是用PEG修饰的透明质酸胆固醇酯，包载难溶性药物(如多西紫杉醇等)、蛋白质药物、基因类药物，制成载药聚合物胶束纳米粒，加上医药学上可接受的辅料制备而成的药物组合。

本发明所述的载药聚合物纳米粒是将PEG修饰的透明质酸胆固醇酯溶于蒸馏水制得浓度为1～5mg/mL的空白胶束溶液，将难溶或微溶性药物溶于有机溶剂后，逐滴加入上述的空白胶束溶液中，经超声处理后，置于蒸馏水中透析除去有机溶剂，透析液经离心、过滤后，必要时冻干，制得粒径为1～1000nm的聚合物载药胶束。

上述PEG修饰的透明质酸胆固醇酯，具有临界胶束浓度低，生物相容性好，延长体内循环时间，癌细胞靶向能力强特点。

上述PEG修饰的透明质酸胆固醇酯，且具有易形成载药聚合物纳米粒，制备纳米粒工艺简便，纳米粒胶束稳定性好，包封率高、纳米粒给药途径多等特点。

附图说明

图1：CHS的1H-NMR图

图2 HACS的1H-NMR图谱

图3 PEG-HACS的1H-NMR图谱

图4 HACS和PEG-HACS荧光发射光谱I₁/I₃与聚合物对数浓度关系图。

图5 DTX溶液剂、DTX-HACS NPs和DTX-PEG-HACS NPs的体外释放曲线(n＝3)

具体实施方式

通过下面实施例说明本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围，不局限于此。

实施例1胆固醇半琥珀酸酯的制备

胆固醇(CHO，1.25g)、丁二酸酐(SA，0.90g)溶于5mL无水吡啶，70℃磁力搅拌24h；反应液冷却至室温，分别用冰稀盐酸200mL、蒸馏水洗涤，沉淀，抽滤；粗产品依次用水/无水乙醇混合液(1/1，V/V)、无水乙醇重结晶，得胆固醇半琥珀酸酯(CHS)。1H-NMR图谱(图1)确认其CHS结构。

实施例2透明质酸胆固醇琥珀酸酯(HACS)的制备

透明质酸钠(MW5000，HA-Na，200mg)溶于5mL甲酰胺中，50℃磁力搅拌5h使其溶解；另精密称取实施例1中的CHS(243mg)溶于10mLN，N’-二甲基甲酰胺(DMF)，加入N，N’-二环己基碳二亚胺(DDC，154.5mg)、4-二甲氨基吡啶(DMAP，12.2mg)冰浴反应2h，将其逐滴加入HA-Na中，充氮保护，40℃磁力搅拌24h；反应液加入乙醇洗涤、离心两次，沉淀用少量甲酰胺溶解后蒸馏水透析3d，冷冻真空干燥得透明质酸胆固醇琥珀酸酯(HACS)。HACS1H-NMR图谱(见图2)确认HACS结构，取代度约为20％。

实施例3PEG修饰的透明质酸胆固醇琥珀酸酯(PEG-HACS)的制备

称取实施例2中的HACS(120mg)溶于20mLpH6.8的PBS中，室温磁力搅拌2h，分别加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC，29mg)、1-羟基-苯并-三氮唑(HOBt，21mg，溶于2mL甲醇滴入)、单甲氧基聚乙二醇胺(mPEG-NH₂，250mg)，室温磁力搅拌24h；反应液甲醇/水(1∶1，V/V)透析1d，蒸馏水透析3d，冷冻真空干燥得PEG修饰的透明质酸胆固醇琥珀酸酯(PEG-HACS)，PEG-HACS的1H-NMR图谱(见图3)确认PEG-HACS结构，取代度约为8％。

实施例4HACS以及PEG-HACS临界胶束浓度的测定

精密称定10mgHACS或PEG-HACS，分散于少量蒸馏水中，磁力搅拌24h，冰浴探头超声30min(超声功率95W，工作2s，间歇5s)，定容至10mL得1mg/mL的空白胶束溶液；将1mg/mL的空白胶束溶液稀释至1×10^-3、2×10^-3、5×10^-3、1×10^-2、2.5×10^-2、5×10^-2、7.5×10^-2、1×10^-1、5×10^-1mg/mL的胶束溶液，分别加入到定量的芘(终浓度为5×10^-6mol/L)中，混合液超声30min，40℃水浴1h，静置过夜，利用荧光分光光度计测定芘的荧光强度。激发波长为335nm，发射波长I₁为372nm，I₃为383nm，狭缝宽度Ex为5nm，Em为3nm。

以1gC(g/L)与芘在372nm和383nm处的荧光强度比值(I₁/I₃)作图(图4)，曲线的拐点所对应的聚合物浓度即为该聚合物材料的临界胶束浓度(CMC)。计算得HACS的CMC值为5.6×10^-3g/L，PEG-HACS的CMC值为6.3×10^-3g/L。由此表明所制备的HACS和PEG-HACS的临界胶束浓度都较小，以此制备的载药胶束具有较好的稀释稳定性。

实施例5空白HACS胶束纳米粒制备

按1～5mg/mL的浓度将两亲性HACS溶于蒸馏水中，经超声处理制备成粒径为100～1000nm的空白胶束纳米粒溶液(HACS NP)。

实施例6空白PEG-HACS胶束纳米粒制备

按1～5mg/mL的浓度将两亲性PEG-HACS溶于蒸馏水中，经超声处理制备成粒径为100～1000nm的空白胶束纳米粒溶液(PEG-HACS NP)。

实施7载多西紫杉醇HACS胶束纳米粒的制备

20mgHACS溶于蒸馏水制得浓度5mg/mL的空白胶束溶液，将2.0mg的多西紫杉醇(DTX)溶于400μL甲醇后，逐滴加入到上述空白胶束溶液中，冰浴超声30min(超声功率95W，工作2s，间歇5s)，置于蒸馏水中透析除去甲醇，透析液经离心、过滤后，制得粒径为1～1000nm的载药HACS胶束纳米粒(DTX-HACS NPs)。

实施例8载多西紫杉醇PEG-HACS胶束纳米粒的制备

15mg PEG-HACS溶于蒸馏水制得浓度3mg/mL的空白胶束溶液，将1.5mg的DTX溶于400μL甲醇后，逐滴加入到上述空白胶束溶液中，冰浴探头超声30min(超声功率95W，工作2s，间歇5s)，置于蒸馏水中透析除去甲醇，透析液经离心、过滤后，制得粒径为1～1000nm的载药PEG-HACS胶束纳米粒(DTX-PEG-HACS NPs)。表1是DTX-PEG-HACS胶束纳米粒及相关胶束纳米粒的一些性质。

表1 DTX-PEG-HACS胶束纳米粒及相关胶束纳米粒的一些性质

结果显示，PEG修饰的透明质酸胆固醇琥珀酸酯和透明质酸胆固醇琥珀酸酯两种HA两亲性材料，都能自发在水中形成胶束，两种纳米材料制得的纳米粒粒径小(＜240nm)，药物包封率高(＞98％)，对多西紫杉醇都有明显的增溶作用；而且与未经PEG修饰的透明质酸胆固醇酯，PEG修饰的透明质酸胆固醇酯表现出更好的增溶作用，载药量高，另外PEG链修饰还可延长体内循环时间，有利于纳米粒发挥更好的靶向作用。

实施例9载药聚合物胶束纳米粒体外释放的研究

定量DTX-PEG-HACS NPs或DTX-HACS NPs溶液，置于3500分子量透析袋中，置于100mL释放介质(0.2％吐温80pH7.4PBS)中，37±0.5℃恒温摇床中，50rpm震荡，分别于0.5、1、2、4、6、8、12、24h取出5mL溶液，0.45μm微孔滤膜过滤，同时补充同温同量释放介质，进样记录峰面积。计算各时间点的平均累积释药百分率。以累积释药百分率的平均值对时间绘制释放度曲线(见图5)。

结果显示，DTX-PEG-HACS NPs在24h内释放低于60％，DTX-HACS NPs在24h内释放接近80％，而DTX溶液在24h内释放接近100％，表明纳米粒具有较好的缓释作用，且经PEG修饰后，HA胆固醇酯的纳米粒的缓释作用更好。

实施例10DTX-PEG-HACS NP体外细胞毒性研究

纳米制剂组：DTX-PEG-HACS NP，培养液稀释至浓度为0.41nM～100nM。

阳性对照组：市售制剂多西紫杉醇注射液，培养液稀释至浓度为0.41nM～100nM。

阴性对照组：PEG-HACS聚合物空白纳米胶束，培养液稀释至上述相同浓度。

取处于指数生长期状态良好的人乳腺癌细胞MCF-7、人乳腺导管癌细胞BT-474各一瓶，加入0.25％胰蛋白酶消化液，消化使贴壁细胞脱落，计数制成细胞悬液；分别以6×10³个/孔、1×10⁴个/孔的密度接种于96孔培养板中，置CO₂培养箱中37℃培养24小时；按上述实验方案分别给予所需浓度的制剂组、阳性对照组、阴性对照组药物溶液，每一浓度平行3孔，继续培养。48小时后，每孔加10μLMTS，37℃反应2小时，使用酶标仪检测490nm处吸光度。处理数据，计算半数抑制浓度IC₅₀值(见表2)。

表2 DXT-PEG-HACS NP体外对肿瘤细胞增殖的抑制作用(IC₅₀值)

结果显示，PEG-HACS聚合物空白纳米胶束(阴性对照组)对MCF-7和BT-474细胞均无抑制作用，说明该载体材料毒性低，安全性好。DTX-PEG-HACS NP制剂组的IC₅₀均小于多西紫杉醇注射液(阳性对照组)，说明载药PEG-HACS NP能使多西紫杉醇对乳癌细胞毒性增强，可能是通过CD44受体介导的主动靶向作用将药物递送至肿瘤细胞，提高抗肿瘤活性。

Claims (3)

1.PEG修饰的透明质酸胆固醇酯，其特征是在于(1)它是透明质酸(HA)骨架的羟基上引入疏水性基团胆固醇酯以及在HA的羧基上引入亲水链PEG而形成的，具有两亲性，(2)在水中能自组装形成聚合物胶束，作为难溶性药物、蛋白质药物、基因类药物的纳米载体，其包含n个重复单元并具有以下结构通式(= 1 \* ROMAN I)：

其中HA的分子量为5×10³～5×10⁵Da；

其中在至少一个重复单元中，R1、R2、R3、R4中的一个或多个为具有结构通式(II)的胆固醇酯，m为2～5的整数，胆固醇酯为胆固醇半琥珀酸酯、胆固醇半戊酸酯、胆固醇半已酸酯或胆固醇半辛酸酯，否则R1、R2、R3、R4为羟基，接枝的胆固醇酯的总取代度为5％～40％；

R₅为具有结构通式(III)的单甲氧基聚乙二醇胺基，否则R₅为-ONa，

CH₃O-(CH₂CH₂O)_w-CH₂CH₂NH- (III)

其中单甲氧基聚乙二醇胺基分子量为1×10³～6×10³Da，接枝PEG的取代度为2～10％。

2.根据权利要求1所述的PEG修饰的透明质酸胆固醇酯，其制备方法包括以下过程：

胆固醇和琥珀酸酐、戊二酸酐、己二酸酐、辛二酸酐中的任意一种脂肪烃二酸酐溶于无水吡啶，70℃磁力搅拌24h；反应液冷却至室温，分别用冰稀盐酸200ml、蒸馏水洗涤，沉淀，抽滤；粗产品依次用体积比1∶1的无水乙醇：水的混合液、无水乙醇重结晶，得胆固醇半脂肪酸酯；

透明质酸钠(HA-Na)溶于甲酰胺中，50℃磁力搅拌5h使其溶解；另精密称取一定量胆固醇半脂肪酸酯溶于N，N′-二甲基甲酰胺(DMF)，加定量的N，N′-二环己基碳二亚胺(DDC)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)，冰浴下反应2h，将其逐滴加入HA-Na中，充氮保护，40℃磁力搅拌24h；反应液加入乙醇洗涤、离心两次，沉淀用少量甲酰胺溶解后蒸馏水透析3d，冷冻真空干燥得透明质酸胆固醇酯；

透明质酸胆固醇酯溶于pH6.8的PBS中，室温磁力搅拌2h，分别加入一定量的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)、1-羟基-苯并-三氮唑(HOBt)和单甲氧基聚乙二醇胺(PEG-NH2)，室温磁力搅拌24h；反应液经体积比1∶1的甲醇∶水的混合液透析1d，蒸馏水透析3d，冷冻真空干燥得PEG修饰的透明质酸胆固醇酯。

3.一种载药聚合物胶束纳米粒，其特征在于如权利要求1所述的PEG修饰的透明质酸胆固醇酯，包载难溶性药物，制成载药聚合物胶束纳米粒，其制备方法包括以下过程：将所述的PEG修饰的透明质酸胆固醇酯溶于蒸馏水制得浓度为1～5mg/mL的空白胶束溶液，将难溶药物溶于有机溶剂后，逐滴加入上述的空白胶束溶液中，经超声处理后，置于蒸馏水中透析除去有机溶剂，透析液经离心、过滤，必要时再冻干，制得粒径为1～1000nm的载药聚合物胶束。