CN101254309A

CN101254309A - 叶酸受体介导靶向乙酰普鲁兰多糖纳米粒及制备方法

Info

Publication number: CN101254309A
Application number: CNA2008100527086A
Authority: CN
Inventors: 张其清; 张慧珠; 刘玲蓉; 李学敏
Original assignee: Institute of Biomedical Engineering of CAMS and PUMC
Current assignee: Institute of Biomedical Engineering of CAMS and PUMC
Priority date: 2008-04-11
Filing date: 2008-04-11
Publication date: 2008-09-03

Abstract

本发明公开了一种叶酸偶联乙酰普鲁兰多糖及其纳米粒的制备方法，以该复合物为载体的载药纳米粒的制备以及该载药纳米粒对肿瘤细胞的作用。首先通过乙酰化反应使水溶性普鲁兰多糖转变为疏水性聚合物，以有利于纳米粒的制备及疏水药物的包载，通过酯化反应偶联叶酸后，可靶向叶酸受体高表达的肿瘤组织。以表阿霉素为模型药物采用溶剂扩散法制备载药纳米粒，并通过体外细胞摄取实验评价载药纳米粒对肿瘤细胞的作用。结果表明，溶剂扩散法制备叶酸－乙酰普鲁兰多糖纳米粒方法简单，重复性好，易于扩大生产，载药率高，载药纳米粒可通过叶酸受体途径被摄入肿瘤细胞。

Description

叶酸受体介导靶向乙酰普鲁兰多糖纳米粒及制备方法

技术领域：

本发明涉及一种叶酸受体介导靶向乙酰普鲁兰多糖及其纳米粒及制备方法，即将亲水性普鲁兰多糖进行乙酰化疏水改性，再与叶酸交联形成叶酸-乙酰普鲁兰多糖偶合物，以及该聚合物为载体的载药纳米粒和制备方法及其体外对肿瘤细胞的作用。

背景技术：

药物传递系统(drug delivery system，DDS)是国内外医药领域的重要研究方向，特别是与抗癌药物组成的纳米控缓释系统，将药物转变成稳定的纳米粒子，其突出优点是纳米微粒体积小，可在血液中自由运行，具有穿过靶组织内皮细胞的能力，可被肿瘤细胞摄取进入细胞内，将所包含的化疗药物在细胞和/或亚细胞水平释放，大大提高药物疗效，还可提高难溶性药物的溶解性，增加药物与胃肠道液体的有效接触面积，有利于提高药物利用率，提高药效。

作为药物载体天然高分子材料逐渐受到关注，特别是天然多糖如壳聚糖、葡聚糖、普鲁兰多糖等，其生物相容性好、毒性低，并具有纳米粒载体表面的修饰功能，能明显延长药物在体内的保留时间，减少吞噬细胞的吞噬，增加药物疗效。其中普鲁兰多糖(Pullulan，Pul)是出芽孢梗霉产生的胞外多糖，以α-1，6糖苷键结合麦芽糖构成同型多糖为主，即葡萄糖按α-1，4糖苷键结合成麦芽三糖，两端再以α-1，6糖苷键同另外的麦芽三糖结合，如此反复连接而成高分子多糖。该物质无毒，无致突变作用，无色无味，可以食用，具有良好的生物相容性，能够被体内淀粉酶降解，是一种良好的药物载体材料。研究表明，普鲁兰多糖能够与肝细胞表面的半乳糖受体结合，可为药物肝脏靶向提供新材料(Kaneo Y.et al：JControl Rel，2001，70：365-373)。但是，由于普鲁兰多糖的水溶性极强，制备纳米粒过程较复杂，对疏水性药物的包载有一定限制。近年来，合成的疏水改性普鲁兰多糖衍生物作为药物载体已广泛用于多种化学药物、蛋白药物和基因药物的传递系统(Rekha MR，et al：Trends Biomater Artif Organs，2007，20：116-121)。此外，为提高载体系统的靶向传递效果通常通过化学修饰等方法将载体与配体相连及与特异受体介导载体的传递来实现。在受体介导的药物传递系统中，叶酸受体是比较重要的受体之一。研究表明，叶酸受体在一些上皮细胞系肿瘤，如卵巢癌、肾癌、子宫癌、睾丸癌、脑瘤、结肠癌、肺腺癌及乳腺癌、脑瘤、睾丸癌、头颈部肿瘤、粒系白血病等高水平表达，在正常组织低水平表达。研究结果证明，叶酸受体介导的传递系统主要针对肿瘤细胞可以实现高表达，在抗肿瘤的治疗中叶酸由于无害、免疫原性弱、稳定及与叶酸受体的结合力强对肿瘤有高度的选择性而成为新一代靶向剂。

叶酸作为叶酸受体的配体与放射性核素直接或间接连接形成的复合物在肿瘤影像诊断方面的动物实验结果表明，肿瘤部位靶向效果显著(Carla JM et al：Bioconjugate Chem，2000，11，253-257)。叶酸间接与脂质体表面结合生成的叶酸-PEG-脂质体细胞培养结果表明，其靶向肿瘤细胞效果明显好于PEG-脂质体或普通脂质体(Lee et al：J Biol Chem，1994，269：3198；Biochim Biophys Acta 1995，1233：134)；叶酸间接与高分子物质偶联制成载药纳米胶束可显著增强对肿瘤细胞的毒性(Yoo HS，et al：J Control Rel，2004，100：247-256；Wang YZ，et al：2001，337：63-73)。但是，迄今为止，叶酸与乙酰普鲁兰多糖偶合物，通过溶剂扩散法制备纳米粒作为抗肿瘤药物载体的研究尚未见任何文献或专利报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种叶酸受体介导靶向乙酰普鲁兰多糖纳米粒及制备方法和应用。本发明是一种新型，价廉易得，可大量制备的纳米载体，并可提高纳米载体的靶向性，降低抗肿瘤药物的毒副作用，克服现有载体的一些不足。

本发明提供的一种叶酸受体介导靶向乙酰普鲁兰多糖纳米粒，其组成为：A-X-Y，其中：A是疏水基团乙酰基；X是水溶性多糖普鲁兰；Y是叶酸及其衍生物。

所述的叶酸及其衍生物是叶酸、亚叶酸、二氢叶酸或四氢叶酸。

本发明所涉及的水溶性多糖是普鲁兰多糖，其对动物或人体肿瘤细胞或肿瘤组织生长无明显直接抑制活性，本身也不具备受体的配体性质。分子量范围为4,000～2000,000。

本发明提供的一种叶酸受体介导靶向乙酰普鲁兰多糖纳米粒包括的步骤：

一、乙酰化普鲁兰多糖的合成

1)将普鲁兰多糖在25～54℃、电磁搅拌下溶解于甲酰胺中，加入酸酐，在吡啶存在下，反应3～48h；

2)反应产物中加入蒸馏水使产物沉淀；

3)将反应物沉淀分别用水和甲醇反复洗涤，干燥。

二、叶酸-乙酰普鲁兰多糖偶合物的合成

1)叶酸羰基的活化：将叶酸类化合物溶解于有机溶剂二甲基亚砜中，与亚胺类活化剂进行活化反应，反应温度为5～40℃，反应时间为0.5～3小时。

所说的亚胺类活化剂选自：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(以下简称EDC·HCl)、N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)或N，N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)；

亚胺类活化剂的重量用量为叶酸类化合物的50～70％。

2)叶酸类化合物与乙酰普鲁兰多糖偶联：

将叶酸类化合物与乙酰普鲁兰多糖溶液在催化剂4-二甲氨基吡啶(DMAP)和碳化二亚胺类脱水剂作用下反应，反应温度为5～40℃，反应时间为3～5天，使缩合成叶酸-乙酰普鲁兰多糖偶合物，将反应中生成的1，3-二环己基脲(DCU)沉淀过滤除掉，反应液滴加入过量甲醇中沉淀，3000rpm离心，收集沉淀，用甲醇反复洗至上清液中无黄色。真空干燥或冻干，得黄色粉末。

所述的乙酰普鲁兰多糖溶液为溶解于二甲基亚砜(DMSO)中的溶液。

所述的乙酰普鲁兰多糖∶叶酸类化合物∶DCC∶DMAP＝1∶0.3～0.8∶0.36～1.5∶0.17～0.6(摩尔比)。

三、溶剂扩散法制备叶酸偶联乙酰普鲁兰多糖纳米粒

1)叶酸偶联乙酰普鲁兰多糖完全溶解于与水混溶的有机溶剂中(有机相)，搅拌下用注射器将有机相缓慢注入水溶液(水相)，随着有机溶剂在水中扩散，逐渐形成有乳光的纳米悬液。

有机溶剂为二甲基甲酰胺(DMF)或二甲基亚飒(DMSO)。

所述水相为含有表面活性剂聚乙烯醇(PVA分子量30,000～70,000)的水溶液，PVA溶液的浓度为：0.5％～2％。有机相∶水相＝1∶5～20(体积比)。

叶酸偶联乙酰普鲁兰多糖在有机溶剂中质量浓度为0.1～0.2％。

注射器针头型号为4～6号。

搅拌转速为300～600rpm。

2)将纳米悬液在高速离心机中以15000～20000rpm离心，以除去有机溶剂及PVA。然后将沉淀用吸管在水中吹打分散，3000rpm离心，将沉淀重新分散，即得纳米悬液。

本发明提供了一种叶酸受体介导靶向乙酰普鲁兰多糖包载药物纳米粒，它是以叶酸偶联乙酰普鲁兰多糖纳米粒为载体，包埋抗肿瘤药物，粒径为200～500nmnm。

所述的抗癌药物与叶酸偶联乙酰普鲁兰纳米粒的质量比为：1～10∶50。

所述的包载药物纳米粒的制备方法是：将药物与载体材料于能和水混溶的有机溶剂中，搅拌下注入水相，18000rpm超速离心，分离游离药物、表面活性剂PVA及有机溶剂，将纳米粒沉淀重新分散于水中形成纳米悬液。

所述的有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺或二甲基亚砜。

所述的水相为0.4～2％的聚乙烯醇(PVA)溶液。

所述的包载药物为：表阿霉素、阿霉素、柔红霉素、全反式维甲酸、紫杉醇、甲氨蝶呤、喜树碱等。

其中对抗肿瘤药物的包埋方法包括如下步骤：

载体的浓度为5～20mg/ml；药物浓度为5mg/ml，体积比为：1∶0.1～0.4。搅拌下用注射器注入上述水相中得到纳米悬液。将纳米悬液在高速离心机中以15000～20000rpm离心，以除去游离药物，有机溶剂及PVA。然后将沉淀用PBS或培养基用吸管吹打，重新分散。3000rpm离心20分钟，将沉淀重新分散。可得到载药纳米悬液。连接叶酸后，纳米粒对抗肿瘤药物的包封率增高，可达65％。

本发明所述的叶酸偶联乙酰普鲁兰纳米粒形态呈球形，粒径分布范围小。本载体由叶酸与乙酰普鲁兰多糖经化学结合而成，具有结构稳定，无毒副作用的特点，能够包载双亲性和疏水性的抗肿瘤药物，对药物有缓慢释放的作用，并通过叶酸-叶酸受体介导靶向进入肿瘤细胞，从而实现药物缓释、肿瘤靶向、提高药物的生物利用率、降低药物毒副作用的功效；该材料具有良好的生物相容性、可降解性和无免疫原性，而且各种原料廉价易得，制备工艺简单方便、条件温和，是一种较好的具有肿瘤靶向的载体材料。

附图说明

图1为乙酰化普鲁兰多糖的¹H-NMR谱图。

图2为叶酸偶联乙酰化普鲁兰多糖衍生物的¹H-NMR谱图。

图3为载表阿霉素FPA纳米粒透射电镜照片。

图4为载表阿霉素FPA纳米粒粒径分布图。

图5为KB细胞对载表阿霉素FPA及载表阿霉素PA纳米粒温育不同时间摄取的激光共聚焦照片。

具体实施方式

实施例1：乙酰化普鲁兰(PA)的化学合成

将分子量为200000的普鲁兰多糖2g中加入20ml甲酰胺，54℃电磁搅拌使其完全溶解，然后加入6ml吡啶，7.5ml醋酐，混合物在54℃反应48h。加入500ml蒸馏水使生成黑棕色沉淀，用水、无水甲醇反复洗至沉淀呈白色，真空干燥，得到白色粉末。核磁法测得乙酰基取代度为90.3％。

乙酰普鲁兰衍生物的氢核磁光谱(¹H-NMR)见图1。图1为乙酰化普鲁兰多糖的¹H-NMR谱图(溶剂：氘代二甲基亚砜：DMSO-d₆)；与普鲁兰多糖相比，PA在1.8～2.2ppm出现甲基的质子信号，表明乙酰基的存在。

实施例2：叶酸偶联乙酰化普鲁兰(FPA)的化学合成

将1g(2.27mmol)叶酸用15ml二甲基亚砜(DMSO)溶解，滴加5滴三乙胺，搅拌使完全溶解，加入0.9g(4.4mmol)N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)，0.25g(2.05mmol)4-二甲氨基吡啶(DMAP)，搅拌反应1小时后加入溶解于25ml DMSO中的1.5g乙酰普鲁兰，电磁搅拌下反应5天。过滤除去DCU沉淀，室温静置24h，再次过滤，滤液滴加入400ml甲醇溶液中，搅拌均匀，离心，收集黄色沉淀。用无水甲醇反复洗沉淀至上清液中无黄色，冻干，得黄色粉末，即为叶酸偶联乙酰普鲁兰衍生物。紫外法测得叶酸的取代度为3.1％。

所得叶酸偶联乙酰普鲁兰衍生物的氢核磁光谱(¹H-NMR)见图2。图2为叶酸偶联乙酰化普鲁兰多糖衍生物的¹H-NMR谱图(溶剂：氘代二甲基亚砜：DMSO-d₆)；在FPA¹H-NMR中δ6.75-8.77ppm处出现叶酸的特征峰，说明叶酸与乙酰普鲁兰通过化学键相联。

实施例3：载表阿霉素纳米粒的制备

称取50mg叶酸偶联乙酰普鲁兰多糖溶解于5ml二甲基甲酰胺中，使浓度为10mg/ml。表阿霉素10mg溶解于2ml二甲基甲酰胺使表阿霉素浓度为5mg/ml，加入5μl三乙胺(2倍摩尔量)，25℃避光搅拌12小时使表阿霉素脱盐酸。将药物/材料溶液按1∶0.2体积比混合，采用自动乳化溶剂扩散法制备载药纳米球。即在电磁搅拌下将材料/药物混合溶液1ml用注射器(注射器针头为6号)缓慢注入10ml 0.5％PVA溶液中，有机相∶水相＝10∶1，随着有机溶剂的扩散逐渐形成纳米悬液。将纳米悬液在4℃18000rpm高速离心25分钟去除有机溶剂、表面活性剂及游离药物。沉淀中加入10ml蒸馏水吹打分散，定容。取200μl纳米悬液于10ml容量瓶中加入DMSO使纳米粒溶解，在紫外分光光度计485nm测定吸收度。根据表阿霉素载DMSO中的标准曲线求出表阿霉素浓度，并计算药物的包封率和载药量。FPA纳米粒的载药量可以达到8.9％，最高包封率65％。载表阿霉素FPA纳米粒呈球形，大小较均匀，见图3。图3为载表阿霉素FPA纳米粒透射电镜照片。粒径分布较窄，载药纳米粒平均粒径为281.5nm，见图4。图4为载表阿霉素FPA纳米粒粒径分布图。

实施例4：体外培养KB细胞对载表阿霉素纳米粒的摄取

进行体外肿瘤细胞培养，通过激光共聚焦显微镜观察温育不同时间细胞内荧光物质量的变化及细胞定位，了解肿瘤细胞对叶酸-乙酰化普鲁兰多糖(FPA)纳米粒及乙酰化普鲁兰(PA)纳米粒的摄取量及细胞分布随时间变化的规律；通过测定肿瘤细胞对培养液中含与不含1mM游离叶酸的FPA纳米粒摄取量变化，了解游离叶酸是否能明显竞争性抑制FPA纳米粒的摄取。

具体实施步骤：

用10％胎牛血清/无叶酸RPMI-1640培养液对KB细胞(一种人口腔上皮癌细胞，中国医学科学院血液研究所提供)在激光共聚焦专用培养皿上贴壁预先培养(37℃的CO₂培养箱)24h，含细胞浓度5×10⁴/ml。然后去掉培养液，用冰冷的PBS洗一次，再用含表阿霉素浓度为10μg/ml的载表阿霉素纳米粒悬液0.5ml孵育1h，2h，4h(包含表阿霉素10μg/ml)，相同浓度游离表阿霉素作为对照，用PBS液洗三次，加入普通培养基，在激光共聚焦显微镜下观察表阿霉素的摄取情况。结果见图5。图5为KB细胞对载表阿霉素FPA及载表阿霉素PA纳米粒温育不同时间摄取(表阿霉素浓度10μg/ml)的激光共聚焦照片。

结果表明，FPA纳米粒与PA纳米粒在细胞内的分布不同，特别在温育2小时后，乙酰普鲁兰纳米粒主要分布于细胞浆，细胞核中基本没有表阿霉素药物出现，而在叶酸偶联纳米粒，药物主要分布于细胞核，细胞浆中基本没有药物分布。此结果说明叶酸偶联纳米粒可促进药物向核的转运。FPA纳米粒的摄取可被过量游离叶酸所抑制，证明叶酸偶联纳米粒的摄取主要通过叶酸受体途径。

Claims

1、一种叶酸受体介导靶向乙酰普鲁兰多糖纳米粒，其特征在于它的组成为：A-X-Y，其中：A是乙酰基团；X是普鲁兰多糖；Y是叶酸及其衍生物。

2、按权利要求1所述叶酸受体介导靶向乙酰普鲁兰多糖纳米粒，其特征在于所述的叶酸及其衍生物是叶酸、亚叶酸、二氢叶酸或四氢叶酸。

3、按权利要求1所述叶酸受体介导靶向乙酰普鲁兰多糖纳米粒，其特征在于所述的普鲁兰多糖分子量范围为4,000～2,000,000。

4、权利要求1所述叶酸受体介导靶向乙酰普鲁兰多糖纳米粒的制备方法，其特征在于包括的步骤：

一、普鲁兰多糖的乙酰化改性

1)将普鲁兰多糖在25～54℃、搅拌下溶解于甲酰胺中，加入酸酐，在吡啶存在下反应3～48h；

2)反应产物中加入水使产物沉淀；

3)将反应物沉淀分别用水和甲醇反复洗涤，干燥；

二、叶酸偶联乙酰普鲁兰多糖的合成

1)叶酸羰基的活化：将叶酸类化合物溶解于有机溶剂二甲基亚砜中，与亚胺类活化剂进行活化反应，反应温度为5～40℃，反应时间为0.5～3小时；

所说的亚胺类活化剂选自：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N，N’-二环己基碳二亚胺；或N，N’-二异丙基碳二亚胺；

亚胺类活化剂的重量用量为叶酸类化合物的50～70％；

2)叶酸类化合物与乙酰普鲁兰多糖偶联

将叶酸类化合物与乙酰普鲁兰溶液在催化剂4-二甲氨基吡啶和碳化二亚胺类脱水剂作用下反应，反应温度为5～40℃，反应时间为3～5天，使生成叶酸偶联乙酰普鲁兰多糖，将反应中生成的1，3-二环己基脲沉淀过滤除掉，反应液滴加入过量甲醇中沉淀，3000rpm离心，收集沉淀，用甲醇反复洗至上清液中无黄色；真空干燥或冻干，得黄色粉末。

所述的乙酰普鲁兰多糖溶液为溶解于二甲基亚砜中的溶液；

所述的乙酰普鲁兰多糖∶叶酸类化合物∶DCC∶DMAP＝1∶0.3～0.8∶0.36～1.5∶0.17～0.6，摩尔比；

三、溶剂扩散法制备叶酸偶联乙酰普鲁兰纳米粒

1)叶酸偶联乙酰普鲁兰完全溶解于与水混溶的有机溶剂中，搅拌下用注射器将有机相缓慢注入水溶液，随着有机溶剂在水中扩散，逐渐形成有乳光的纳米悬液；

有机溶剂为二甲基甲酰胺或二甲基亚飒；

所述水相为含有表面活性剂聚乙烯醇的水溶液，PVA溶液的浓度为：0.5％～2％；有机相∶水相＝1∶5～20(体积比)；

叶酸偶联乙酰普鲁兰在有机溶剂中质量浓度为0.1～0.2％；

注射器针头型号为4～6号；

搅拌转速为300～600rpm；

2)将纳米悬液在高速离心机中以15000～20 000rpm离心，以除去有机溶剂及PVA；然后将沉淀用吸管在水中吹打分散，3000rpm离心，将沉淀重新分散，即得纳米悬液。

5、一种叶酸受体介导靶向乙酰普鲁兰多糖包载药物纳米粒，其特征在于它是以叶酸偶联乙酰普鲁兰多糖纳米粒为载体，包埋抗肿瘤药物；

所述的抗肿瘤药物与叶酸偶联乙酰普鲁兰纳米粒质量比为：1～10∶50。

6、权利要求5所述的包载药物纳米粒的制备方法，其特征在于将药物与载体材料于能和水混溶的有机溶剂中，搅拌下注入水相，18000rpm超速离心，分离游离药物、表面活性剂PVA及有机溶剂，将纳米粒沉淀重新分散于水中形成纳米悬液。

7、按权利要求6所述的制备方法，其特征在于所述的有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺或二甲基亚砜。

8、按权利要求6所述的制备方法，其特征在于所述的水相为0.4～2％的聚乙烯醇溶液。

9、按权利要求6所述的制备方法，其特征在于所述的抗肿瘤药物为：表阿霉素、阿霉素、柔红霉素、全反式维甲酸、紫杉醇、甲氨蝶呤、喜树碱。

10、按权利要求6所述的制备方法，其特征在于所述的载体的浓度为5～20mg/ml；所述的药物浓度为5mg/ml，体积比为：1∶0.1～0.4；搅拌下用注射器注入上述水相中得到纳米悬液；将纳米悬液在高速离心机中以15 000～20 000rpm离心，以除去游离药物，有机溶剂及PVA；然后将沉淀用PBS或培养基用吸管吹打，重新分散；3000rpm离心20分钟，将沉淀重新分散，可得到载药纳米悬液。