CN103965278B

CN103965278B - 一种水溶性植物甾醇有机二元酸糖酯的制备方法

Info

Publication number: CN103965278B
Application number: CN201410160200.3A
Authority: CN
Inventors: 贾承胜; 任明星; 林蔚婷; 张晓鸣
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Hunan heyiyuan Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2014-04-16
Filing date: 2014-04-16
Publication date: 2016-08-03
Anticipated expiration: 2034-04-16
Also published as: CN103965278A

Abstract

本发明涉及一种植物甾醇有机二元酸糖酯的制备方法。本发明采用的技术方案为：使用二环己基碳酰亚胺(DCC)、4‑二甲氨基吡啶(DMAP)和对甲基苯磺酸(p‑TsOH)复合催化剂催化植物甾醇有机二元酸单酯与功能性糖发生酯化，首先在室温条件下使用DCC和DMAP活化植物甾醇有机二元酸单酯1小时，再加入功能性糖和p‑TsOH，在室温下于超声仪中超声反应至总反应时间为10小时，反应结束后经硅胶柱层析分离得到植物甾醇有机二元酸糖酯。本方法制得的植物甾醇有机二元酸糖酯兼具植物甾醇和功能糖两者的生物活性并且操作简单、反应条件温和、能耗低、产率高，植物甾醇有机二元酸糖酯性质稳定，易于保存。

Description

一种水溶性植物甾醇有机二元酸糖酯的制备方法

技术领域

本发明涉及一种制备植物甾醇衍生物的方法，特别涉及一种水溶性植物甾醇有机二元酸糖酯的制备方法。本产品的应用开发涉及到食品、医药、化工和化妆品等技术领域。

背景技术

植物甾醇是一种存在于植物中的天然活性物质，广泛分布于自然界，在植物油、种子和坚果、谷类以及豆类中含量最为丰富。天然植物甾醇种类繁多，以β-谷甾醇、豆甾醇和菜油甾醇为主，它们都属于4-无甲基甾醇，结构与胆固醇相似，以环戊烷多氢菲为甾核主体骨架，其C-3位连着一个羟基。近年来，对植物甾醇的研究表明，它是一类对人体无毒副作用、具有高生理活性的天然活性物质，被誉为“生命的钥匙”。

植物甾醇具有非常好的降胆固醇作用，主要通过抑制胆固醇在小肠内的吸收，可以有效降低血液总胆固醇及低密度脂蛋白胆固醇含量，而对人体有益的高密度脂蛋白胆固醇含量却没有影响。在动物和人体内已经应用半个多世纪，美国FDA已批准添加植物甾醇或甾烷醇酯的食品可使用“有益健康”的标签，其安全性已毋庸置疑。特别是近年来的研究发现，植物甾醇还有抗癌、抗炎、抗病毒和提高免疫力等作用。

植物甾醇具有水不溶和油溶低等特点，所以植物甾醇一般只添加于高脂肪食品中，限制了植物甾醇在低脂肪食品、减肥食品和饮料中的实际应用。天然的植物甾醇熔点高(130-180℃)，它们很容易在食品体系中的油相中结晶出来，而这种结晶将导致食品体系产生不可接受的质感，严重影响食品品质。由于植物甾醇对人体无毒副作用、具有上述多种重要生理功能和特点，这就要求在不影响植物甾醇的生理功能前提下改变植物甾醇的形式，使其便于在食品加工中应用。

研究发现，酯化型的植物甾醇溶解性得到很大改善，其吸收利用率与游离型相比约提高5倍，其功能作用也更加广泛。植物甾醇酯化制得的植物甾醇酯由于具有比植物甾醇更好的溶解性、分散性和更高的降胆固醇效果，可作为喷雾和口服药物中的吸收载体及营养补充剂，以及皮肤细胞促进剂、抗炎剂、伤口愈合剂和非离子乳化剂。

目前植物甾醇的改性研究和产品开发大多围绕改善植物甾醇的油溶性为目的，主要集中在饱和脂肪酸植物甾醇酯和不饱和脂肪酸植物甾醇酯的研究。而改善植物甾醇水溶性的方法多集中在制造微乳体系或者微胶囊包埋，但这两种方法具有稳定性差、产品货架期短等缺点，在实际应用中受到极大限制。目前植物甾醇在化妆品工业中作为乳化剂受到了越来越多的重视，为提高其乳化性，也需要增加植物甾醇水溶性。而通过对植物甾醇的结构改性以改善其水溶性的研究鲜有报道，因此开发一种新型的水溶性植物甾醇衍生物的制备方法，有助于拓宽其在水溶性食品中的应用，具有重要的意义。

发明内容

本发明提供一种水溶性植物甾醇二元酸糖酯的制备方法。本方法分两步完成，第一步使用4-二甲氨基吡啶(DMAP)催化有机二元酸(或酸酐)与植物甾醇进行酯化反应生成中间产物植物甾醇有机二元酸单酯，第二步使用N，N′-二环己基碳酰亚胺/4-二甲氨基吡啶/对甲基苯磺酸(DCC/DMAP/p-TsOH)复合催化剂催化中间产物与功能性糖的酯化得到目标产物植物甾醇有机二元酸糖酯，两步方法都操作简单、反应时间短且产率高，适合用于食品工业生产。

本发明采用以下技术方案：

使用DMAP在甲苯中催化植物甾醇与有机二元酸(或酸酐)进行酯化，得到中间产物植物甾醇有机二元酸单酯，再用DCC/DMAP/p-TsOH复合催化剂在二甲亚砜中催化中间产物与功能糖进行酯化反应，得到植物甾醇有机二元酸糖酯。两步反应都间隔一定时间取样，并采用薄层层析法(TLC)检测反应进程，硅胶柱层析分离纯化中间产物和目标产物，利用高效液相法(HPLC)测定纯度和产率，红外光谱(FT-IR)和质谱(MS)鉴定结构。

本发明所述的植物甾醇为β-谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇和菜籽甾醇中一种或几种的任意比例的混合物。

本发明所述的有机二元酸或酸酐为酒石酸、丁二酸、戊二酸、己二酸和其对应酸酐中的一种。

本发明所述的功能性糖为葡萄糖、乳果糖、海藻糖、水苏糖、棉籽糖和纤维二糖。

本发明所述的制备植物甾醇有机二元酸单酯的方法，反应物有机二元酸(酸酐)、植物甾醇与4-二甲氨基吡啶的物质的量之比为1∶1.05∶0.2。

本发明所述的制备植物甾醇有机二元酸单酯的方法，反应温度为110℃，总反应时间为6小时。

本发明所述的植物甾醇有机二元酸糖酯的制备方法，反应溶剂为无水二甲亚砜(DMSO)，先将DCC、DMAP和植物甾醇有机二元酸单酯中间产物溶解在无水DMSO中，活化羧基1小时，再加入功能性糖和对甲基苯磺酸(p-TsOH)室温条件下于超声仪中超声反应至总时间为10小时。

本发明所述的植物甾醇有机二元酸糖酯的制备方法，植物甾醇有机二元酸单酯、DCC、DMAP、p-TsOH和功能性糖的物质的量比为1∶1.0～1.2∶0.05～0.5∶0.10～0.20∶1.0～1.2，优选1∶1.1∶0.1∶0.14∶1.1，植物甾醇有机二元酸单酯在DMSO中的浓度为0.01～0.1g/ml，优选0.05g/ml。

本发明所述的植物甾醇有机二元酸糖酯的制备方法，反应温度为室温，并采用超声辅助促进反应。

本发明所述的硅胶柱层析分离纯化方法，其步骤为：将植物甾醇酯有机二元酸单酯或植物甾醇酯有机二元酸糖酯样品分别溶解在洗脱剂石油醚/乙酸乙酯/甲酸(13∶7∶0.02)和三氯甲烷/甲醇/甲酸混合溶液(75∶15∶0.5，v/v/v)中，对收集到的组分进行HPLC分析，将同一组分合并，真空旋转蒸发除去溶剂，得到植物甾醇有机二元酸单酯和糖酯纯品。

本发明采用HPLC测定植物甾醇有机二元酸单酯和植物甾醇有机二元酸糖酯的纯度和产率，HPLC-ELSD分析系统包括Waters1525高效液相色谱仪、Alltech3300蒸发光散射检测器(ELSD)和Empower数据处理软件。色谱柱为Waters symmetry C18反相柱(4.6×250mm，5μm)，柱温：35℃，流动相∶甲醇/甲酸＝1000∶1，流速：1mL/min，等速洗脱，进样量：10μL；ELSD参数：温度为55℃，载气为氮气，流速为1.5L/min，增益为1。

本发明采用傅里叶变换红外光谱和质谱鉴定植物甾醇有机二元酸单酯和植物甾醇有机二元酸糖酯的结构，FT-IR分析采用Thermo Scientific Nicolet iS10傅里叶变换红外光谱仪，选用KBr压片法，扫描次数：32次(植物甾醇有机二元酸单酯)和64次(植物甾醇有机二元酸糖酯)，分辨率：4cm^-1。质谱分析采用Waters UPLC-TQD质谱仪，将分离纯化的样品直接进样，离子源为电喷雾(ESI)离子源，毛细管电压3.5kV，离子源温度100℃，脱溶剂温度250℃，脱溶剂气流速500L/h，锥孔气流速50L/h，锥孔电压20V，碰撞能量6V，检测器电压1700V，质量范围50～1000m/z。

以植物甾醇丁二酸单酯和葡萄糖酯为例，结果分析如下：

植物甾醇丁二酸单酯FT-IR：2370-3700cm^-1之间的宽峰为游离羧基-COOH的伸缩振动吸收(γCOOH)，2956cm^-1为-CH₃的非对称伸缩振动吸收(γ-CH₃)，2933cm^-1为-CH₂-的非对称伸缩振动吸收(γ-CH₂-)，2860cm^-1为-CH₂-的对称伸缩振动吸收(γ-CH₂-)，1735和1708cm^-1强吸收峰分别为游离羧基和酯基官能团上C＝O的伸缩振动吸收(γC＝O)，1377cm^-1为-CH₃的弯曲振动吸收(δ-CH₃)，1175和1028cm^-1为C-O的伸缩振动吸收(γC-O)；MS：植物甾醇丁二酸单酯包括谷甾醇丁二酸单酯、豆甾醇丁二酸单酯、菜油甾醇丁二酸单酯和菜籽甾醇丁二酸单酯，四者的相对分子质量分别为514、512、500和498。植物甾醇丁二酸单酯在ES^-电离下，存在β-谷甾醇丁二酸单酯、菜油甾醇丁二酸单酯和豆甾醇丁二酸单酯的[M-H]⁺分子离子峰，它们分别为513(即514-1)、499(即500-1)和511(即512-1)。因此，产物为植物甾醇丁二酸单酯。

植物甾醇丁二酸葡萄糖酯FT-IR：3380cm^-1宽峰为游离羟基-OH的伸缩振动吸收(γO-H)，2956cm^-1为-CH₃的非对称伸缩振动吸收(γ-CH₃)，2868cm^-1为-CH₂-的对称伸缩振动吸收(γ-CH₂-)，1731cm^-1强吸收峰为酯基官能团上C＝O的伸缩振动吸收(γC＝O)，1377cm^-1为-CH₃的弯曲振动吸收(δ-CH₃)，1167和1029cm^-1为C-O的伸缩振动吸收(γC-O)；MS：植物甾醇丁二酸葡萄糖酯的主要成分包括β-谷甾醇丁二酸葡萄糖酯、菜油甾醇丁二酸葡萄糖酯和豆甾醇丁二酸葡萄糖酯，它们的分子量为677、663和675。在ES^-电离下，存在β-谷甾醇丁二酸葡萄糖酯、菜油甾醇丁二酸葡萄糖酯和豆甾醇丁二酸葡萄糖酯的[M+Cl]⁺质谱信号，它们分别为712(即677+35)、698(即663+35)和710(即675+35)。因此，产物确定为植物甾醇丁二酸葡萄糖酯。

本发明的有益效果：

1.本发明首次制备了植物甾醇的糖酯衍生物，改善了植物甾醇的水溶性，拓宽了植物甾醇的应用范围；

2.植物甾醇有机二元酸糖酯的合成反应在室温下即可进行，操作简单，反应条件温和，能耗低；

3.有机二元酸(酸酐)与植物甾醇可定量反应，酯化率达到95％以上，且反应中不需要添加除水剂；

4.植物甾醇有机二元酸糖酯的产率达到88％以上，并且植物甾醇二元酸糖酯性质稳定，易于保存。

具体实施方式

下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明所保护的内容不仅仅局限于下面的实施例，本领域内技术人员可以适当修改本发明参数。

实施例1：

在圆底烧瓶中加入植物甾醇2.0750g，丁二酸酐0.7500g，溶于10ml甲苯中，向其中加入DMAP0.1250g，在110℃回流6h。TLC检测反应进程，采用高效液相法测定酯化率，反应结束后，得到植物甾醇丁二酸酯粗产品，用流动相为石油醚/乙酸乙酯/甲酸(13∶7∶0.02)的硅胶柱层析分离纯化，得到纯品，采用红外和质谱分析进行结构鉴定，确定产物为植物甾醇丁二酸单酯。

将植物甾醇丁二酸单酯纯品0.5000g，溶于10ml DMSO中，向其中加入DCC0.2270g，DMAP0.0122g，室温下搅拌1h。然后再向其中加入5ml溶有葡萄糖0.1980g和对甲基苯磺酸0.0266g的DMSO溶液，并在室温下于超声仪中超声反应至总时间为10h。旋蒸得到植物甾醇丁二酸葡萄糖酯粗品，用流动性为三氯甲烷/甲醇/甲酸(75∶15∶0.5)的硅胶柱层析分离纯化，得到植物甾醇丁二酸葡萄糖酯纯品，经高效液相色谱分析其纯度为98.8％，产率为88.5％，采用红外和质谱分析进行结构鉴定，确定产物为目标产物。

实施例2：

在圆底烧瓶中加入植物甾醇2.0750g，戊二酸0.9700g，溶于10ml甲苯中，向其中加入DMAP0.1250g，110℃回流6h。TLC检测反应进程，采用高效液相法测定酯化率，反应结束后，得到植物甾醇戊二酸酯粗产品，用流动相为石油醚/乙酸乙酯/甲酸(13∶7∶0.02)的硅胶柱层析分离纯化，得到纯品，采用红外和质谱分析进行结构鉴定，确定产物为植物甾醇戊二酸单酯。

将植物甾醇戊二酸单酯纯品0.5140g，溶于10ml DMSO中，向其中加入DCC0.2270g，DMAP0.0122g，室温下搅拌1h。然后再向其中加入5ml溶有乳果糖0.3760g和对甲基苯磺酸0.0266g的DMSO溶液，并在室温下于超声仪中反应至总时间为10h。旋蒸得到植物甾醇戊二酸乳果糖酯粗品，用流动相为三氯甲烷/甲醇/甲酸(75∶15∶0.5)的硅胶柱层析分离纯化，得到植物甾醇戊二酸乳果糖酯纯品，经高效液相色谱分析其纯度为98.6％以上，产率为89.2％，采用红外和质谱分析进行结构鉴定，确定产物为目标产物。

实施例3：

在圆底烧瓶中加入植物甾醇2.0750g，己二酸1.1000g，溶入10ml甲苯中，向其中加入DMAP0.1250g，110℃回流6h。TLC检测植物甾醇消失即终止反应，采用高效液相法测定酯化率，反应结束后，得到植物甾醇己二酸酯粗产品，用流动相为石油醚/乙酸乙酯/甲酸(13∶7∶0.02)的硅胶柱层析分离纯化，得到纯品，采用红外和质谱分析进行结构鉴定，确定为植物甾醇己二酸单酯。

将植物甾醇己二酸单酯纯品0.5280g，溶于10ml DMSO中后，向其中加入DCC0.2270g，DMAP0.0122g，室温下搅拌1h。然后再向其中加入5ml溶有海藻糖0.3760g，对甲基苯磺酸0.0266g的DMSO溶液。并在室温下于超声仪中反应至总时间为10h。旋蒸得到植物甾醇己二酸海藻糖酯粗品，通过以流动性为三氯甲烷/甲醇/甲酸(75∶15∶0.5)的硅胶柱层析分离纯化，得到植物甾醇己二酸海藻糖酯纯品，经高效液相色谱分析其纯度为99.1％，产率为88.3％，采用红外和质谱分析进行结构鉴定，确定产物为目标产物。

Claims

1.一种水溶性植物甾醇有机二元酸糖酯的制备方法，其特征在于所述的方法为二步法：第一步使用4-二甲氨基吡啶催化植物甾醇与有机二元酸或酸酐，在110℃条件下于甲苯中反应6小时，生成中间产物植物甾醇有机二元酸单酯并分离纯化；第二步将植物甾醇有机二元酸单酯与催化剂4-二甲氨基吡啶和N，N′-二环己基碳酰亚胺溶于二甲基亚砜，在室温下活化1小时，然后将功能性糖和对甲基苯磺酸加入上述已活化的混合液中，在室温下超声辅助反应至总反应时间10小时，将反应液旋转蒸发得粗品，并将粗品经硅胶柱层析分离纯化得到水溶性植物甾醇有机二元酸糖酯。

2.根据权利要求1所述的植物甾醇有机二元酸糖酯的制备方法，其特征在于所述的有机二元酸或酸酐为酒石酸、丁二酸、戊二酸、己二酸和其对应酸酐中的一种。

3.根据权利要求1所述的植物甾醇有机二元酸糖酯的制备方法，其特征在于所述的功能性糖为葡萄糖、乳果糖、海藻糖、水苏糖、棉籽糖和纤维二糖。

4.根据权利要求1所述的植物甾醇有机二元酸糖酯的制备方法，其特征在于所述的植物甾醇有机二元酸单酯、N，N′-二环己基碳酰亚胺、4-二甲氨基吡啶、对甲基苯磺酸和功能性糖的物质的量比为1∶1.1∶0.1∶0.14∶1.1，植物甾醇有机二元酸单酯的浓度为0.05g/ml。