CN110478318B - 一种芬顿试剂和阿霉素共转运靶向纳米载体及其制备方法 - Google Patents

一种芬顿试剂和阿霉素共转运靶向纳米载体及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种芬顿试剂和阿霉素共转运靶向纳米载体及其制备方法，包括CA‑OH和Fc‑OH的制备、CA‑SA‑COOH和Fc‑SA‑COOH的制备、FA‑PEG‑COOH的制备、CA,Fc‑g‑Pullulan的制备、CA,Fc,FA‑g‑Pullulan的制备、DOX‑loaded CFFP NPs的制备步骤。该制备方法利用含芬顿试剂的疏水性链段和起靶向作用的亲水性叶酸链段修饰的普鲁兰多糖接枝共聚物自组装包载抗肿瘤治疗药物阿霉素，制备得到芬顿试剂和阿霉素共转运的靶向纳米载体。本发明解决了现有技术中存在的活性氧生成剂的靶向性和单一的活性氧高效治疗方面的局限性。

Description

一种芬顿试剂和阿霉素共转运靶向纳米载体及其制备方法
技术领域
本发明属于医用高分子药物传输与释放技术领域，具体涉及一种芬顿试剂和阿霉素共转运靶向纳米载体及其制备方法。
背景技术
恶性肿瘤是目前危害人类健康的重大疾病之一，目前化疗及与其他疗法联合治疗是目前临床治疗肿瘤的主要手段。
化疗是临床治疗肿瘤的重要方法，但化疗药物的毒副作用大，且易引起耐药性。因此如何在提高肿瘤治疗效果的同时，降低药物的毒副作用，已成为重大的研究课题。
活性氧（ROS）在人体中广泛存在并具有较高的氧化能力，ROS富集后可快速氧化细胞中与生命活动相关的酶、蛋白质和DNA，从而引发细胞凋亡。将活性氧准确递送至肿瘤细胞可为肿瘤的无毒副作用治疗提供一种新途径，但活性氧稳定性差和作用距离短等缺点严重限制了其在临床中的应用，随着功能性纳米载体的发展，使用纳米载体将活性氧生成剂递送至肿瘤组织，在肿瘤组织原位生成活性氧杀死癌细胞可改善上述治疗缺陷。然而，如何提高活性氧生成剂的靶向性和单一的活性氧治疗局限性仍然是一个具有挑战性的课题。因此，开发新型的靶向药物高效输送体系具有重要的科学意义。
亚铁离子催化双氧水反应，可生成大量的高毒性羟基自由基，该反应称为芬顿反应。在环境科学中人们利用芬顿反应生成的羟基自由基氧化降解有机污染物，净化污水。生物学研究发现磁性氧化铁纳米粒和MRI显影剂的生物毒性也是由于芬顿反应生成的羟基自由基引起的。但肿瘤细胞内的H2O2浓度较低，不足以有效启动芬顿反应。根据报道，肉桂醛及其衍生物对细胞具有一定的抗增殖活性，进入细胞后可产生大量的过氧化氢，且二茂铁在酸性环境下可催化过氧化氢产生羟基自由基。因此，利用功能纳米载体，将芬顿试剂靶向递送至肿瘤细胞，在细胞内原位生成羟基自由基杀死癌细胞具有重要的研究意义，但是目前利用芬顿反应用于肿瘤治疗的尚处在研究阶段。另外，为了提高纳米载体的靶向性，通常人们将特定的靶向分子（多肽、抗体及某些小分子等）修饰在载体表面，通过受体-介导的主动靶向作用，使药物载体能够准确与细胞表面靶标作用，实现肿瘤的靶向治疗。
阿霉素，又称1，4-羟基柔红霉素等，因其抗瘤谱广,对乏氧细胞有效,又为放射增敏剂,故在肿瘤治疗中占有重要地位。由很多研究者将其作为疏水性药物引入纳米载体中实现肿瘤治疗，但目前利用阿霉素与羟基自由基等其他治疗因素相结合实现对肿瘤协同治疗的研究很少，还很不成熟。
目前尚未有有效的芬顿试剂和阿霉素共转运靶向纳米载体以及较好的制备方法。
发明内容
针对以上现有技术存在的问题，为解决目前高分子药物传输与释放载体领域存在的上述治疗局限性，提供了一种芬顿试剂和阿霉素共转运靶向纳米载体，要达到以下发明目的：提高芬顿试剂和阿霉素共转运靶向纳米载体的pH响应性、包封率和载药率；提高在酸性环境中药物释放稳定性以及累释放率；本发明的另一目的是提供一种芬顿试剂和阿霉素共转运靶向纳米载体的制备方法。
为实现以上发明目的，本发明所采用的技术方案是：
一种芬顿试剂和阿霉素共转运靶向纳米载体的制备方法，包括CA-OH和Fc-OH的制备、CA-SA-COOH和Fc-SA-COOH的制备、FA-PEG-COOH的制备、CA,Fc-g-Pullulan的制备、CA,Fc,FA-g-Pullulan的制备、DOX-loaded CFFP NPs的制备步骤。
所述的CA-OH和Fc-OH的制备：将肉桂醛和二茂铁甲醛分别与三羟甲基乙烷混合溶于甲苯中，并在对甲苯磺酸一水合物的催化下反应；得到的反应液分别经柱层析分离、干燥，分别得到CA-OH和Fc-OH。所述的反应：反应温度为88-93℃，反应时间为8-12 h；所述的柱层析分离：压柱剂为石油醚、三乙胺按体积比60:1复配而成，洗脱剂为石油醚、乙酸乙酯按体积比8:1复配而成。
所述的CA-SA-COOH和Fc-SA-COOH的制备：将CA-OH和Fc-OH分别与丁二酸酐（SA）在丁酮中发生开环反应，以三乙胺作缚酸剂，得到的反应液分别经柱层析分离、干燥，分别得到CA-SA-COOH和Fc-SA-COOH。
所述的FA-PEG-COOH的制备：经1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺·盐酸盐活化后的叶酸水合物与NH2-PEG-COOH在二甲基亚砜中发生反应，得到的反应液经透析、冷冻干燥得到黄色固体产物FA-PEG-COOH。所述的反应：反应温度为62-66℃，反应时间为23-25h。
所述的CA,Fc-g-Pullulan的制备：将合成的CA-SA-COOH和Fc-SA-COOH与普鲁兰多糖（Pullulan）在DMSO中发生酯化反应，得到的反应液经透析、冷冻干燥得到淡黄色固体产物CA,Fc-g-Pullulan。所述的酯化反应：以4-二甲氨基吡啶为催化剂、以N，N’-二环己基碳二亚胺为脱水剂，反应温度为75-90℃，反应时间为22-26h。
所述的CA,Fc,FA-g-Pullulan的制备：将合成的CA,Fc-g-Pullulan与合成的FA-PEG-COOH进行酯化反应，固定FA-PEG-COOH的取代度为2%，得到黄色固体产物CA,Fc,FA-g-Pullulan。
所述的DOX-loaded CFFP NPs的制备：合成的CA,Fc,FA-g-Pullulan用DMSO溶解后，加入到用三乙胺中和后的盐酸阿霉素（DOX·HCl）DMSO溶液中反应，将得到的反应液逐滴加入去离子水中进行自组装，得到的溶液经透析、冷冻干燥得到紫红色固体产物，即芬顿试剂和阿霉素共转运的靶向纳米载体。
作为优选的，一种芬顿试剂和阿霉素共转运靶向纳米载体的制备方法，如下：
1）CA-OH和Fc-OH的制备
CA-OH的制备：将肉桂醛与三羟甲基乙烷混合溶于甲苯中，在对甲苯磺酸一水合物（p-TsOH）的催化下反应，90℃磁力搅拌反应10 h。反应液经柱层析分离，压柱剂为石油醚、三乙胺按体积比60:1复配而成，洗脱剂为石油醚、乙酸乙酯按体积比8:1复配而成，在40 ℃下旋蒸出溶剂后经40 ℃真空干燥得到固体粉末肉桂醛缩醛（CA-OH）。
Fc-OH的制备：将二茂铁甲醛与三羟甲基乙烷混合溶于甲苯中，在对甲苯磺酸一水合物（p-TsOH）的催化下反应，90℃磁力搅拌反应10 h。反应液经柱层析分离，压柱剂为石油醚、三乙胺按体积比60:1复配而成，洗脱剂为石油醚、乙酸乙酯按体积比8:1复配而成，在40℃下旋蒸出溶剂后经40 ℃真空干燥得到固体二茂铁缩醛（Fc-OH）。
2）CA-SA-COOH和Fc-SA-COOH的制备
步骤1）合成的CA-OH和Fc-OH与丁二酸酐（SA）在丁酮中发生开环反应，以三乙胺作缚酸剂，80℃磁力搅拌反应12 h。反应液经柱层析分离、真空干燥得到粘稠状产物CA-SA-COOH和Fc-SA-COOH。
3) FA-PEG-COOH的制备
经1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺·盐酸盐（EDC·HCl）活化后的叶酸水合物（FA·H2O）与NH2-PEG-COOH在二甲基亚砜（DMSO）中发生取代反应，65℃的磁力搅拌反应24h。反应液经透析、冷冻干燥得到黄色固体产物（FA-PEG-COOH）。
4）CA,Fc-g-Pullulan的制备
步骤2）合成的CA-SA-COOH和Fc-SA-COOH与普鲁兰多糖（Pullulan）在DMSO中发生酯化反应，以4-二甲氨基吡啶（DMAP）为催化剂、以N，N’-二环己基碳二亚胺（DCC）为脱水剂，80℃的磁力搅拌反应24 h。反应液经透析、冷冻干燥得到淡黄色固体产物（CA,Fc-g-Pullulan）。
5）CA,Fc,FA-g-Pullulan的制备
步骤4）合成的CA,Fc-g-Pullulan与步骤3）合成的FA-PEG-COOH再进行一次酯化反应，固定FA-PEG-COOH的取代度为2%，反应条件及处理过程与步骤4）相同，最终得到黄色固体产物（CA,Fc,FA-g-Pullulan）。
6）DOX-loaded CFFP NPs的制备
步骤5）合成的CA,Fc,FA-g-Pullulan用DMSO溶解后，加入到用三乙胺中和后的盐酸阿霉素（DOX·HCl）DMSO溶液中充分搅拌12 h,将反应液逐滴加入去离子水中进行自组装。最后，溶液经透析、冷冻干燥得到紫红色固体产物，即芬顿试剂和阿霉素共转运的靶向纳米载体。
本发明具有的有益效果如下：
（1）本发明制备得到芬顿试剂和阿霉素共转运的靶向纳米载体，完善了制备药物传输与释放载体的技术体系。
（2）经测试，本发明合成的芬顿试剂和阿霉素共转运的靶向纳米载体，粒径在400nm左右，临界胶束浓度符合标准，载体的pH响应性较好，包封率和载药率较高，发明所合成的DOX-loaded CFFP NPs包封率和载药率较高，取代度为15%、30%、50%的DOX-loadedCFFP NPs的包封率分别为76.78%、99.41%、92.72%；取代度为15%、30%、50%的DOX-loadedCFFP NPs的载药率分别为4.99%、5.72%、5.10%。
（3）经测试，本发明合成的芬顿试剂和阿霉素共转运的靶向纳米载体，在酸性环境中药物释放稳定且累释放率较高，取代度为15%、30%、50%的DOX-loaded CFFP NPs在pH=7.4的环境中最终累积释放率分别为45.8%、80%、90.3%；取代度为15%、30%、50%的DOX-loadedCFFP NPs在pH=6.6的环境中最终累积释放率分别为31.9%、76.1%、83.6%；取代度为15%、30%、50%的DOX-loaded CFFP NPs在pH=5.8的环境中最终累积释放率分别为27.1%、63%、74.1%。前10h释放速度较快，10h后释放速度平稳，表现出很好的缓释效果。
（3）本发明通过酸敏缩醛键将芬顿反应试剂键合在靶向聚合物载体中，只在肿瘤细胞内响应环境变化才能被活化，在原位生成羟基自由基，氧化细胞中生物大分子从而杀死癌细胞。
（4）本发明把功能高分子的合成、肿瘤靶向治疗和原位活性氧治疗等技术整合起来，将高分子学科和生物学科的交叉融合，对聚合物功能纳米载体在生命科学中的应用具有十分重要的科学意义和实用价值。
附图说明
附图1为本发明一种芬顿试剂和阿霉素共转运的靶向纳米载体的技术路线图。
附图2为合成CA-OH和Fc-OH的反应方程式。
附图3为CA-OH和肉桂醛的红外光谱对比图。
附图4为CA-OH的1H NMR谱图。
附图5为Fc-OH和二茂铁甲醛的红外光谱对比图。
附图6为Fc-OH的1H NMR谱图。
附图7为合成CA-SA-COOH和Fc-SA-COOH的反应方程式。
附图8为CA-SA-COOH和CA-OH的红外光谱对比图。
附图9为CA-SA-COOH的1H NMR谱图。
附图10为Fc-SA-COOH和Fc-OH的红外光谱对比图。
附图11为Fc-SA-COOH的1H NMR谱图。
附图12为合成FA-PEG-COOH的反应方程式。
附图13为FA-PEG-COOH的1H NMR谱图。
附图14为合成CA,Fc-g-Pullulan的反应方程式。
附图15为合成CA,Fc,FA-g-Pullulan的反应方程式。
附图16为CA,Fc,FA-g-Pullulan和Pullulan的红外光谱对比图。
附图17为CA,Fc,FA-g-Pullulan的1H NMR谱图。
附图18为取代度为15%的CFFP NPs胶束加酸前后的粒径对比图。
附图19为取代度为30%的CFFP NPs胶束加酸前后的粒径对比图。
附图20为取代度为50%的CFFP NPs胶束加酸前后的粒径对比图。
附图21为取代度为15%、30%、50%的CFFP NPs胶束临界胶束浓度测试图。
附图22为取代度为15%的DOX-loaded CFFP NPs体外药物释放曲线。
附图23为取代度为30%的DOX-loaded CFFP NPs体外药物释放曲线。
附图24为取代度为50%的DOX-loaded CFFP NPs体外药物释放曲线。
具体实施方式
下面结合上述的技术路线和附图对本发明作出详细说明，仅用来对本发明进行具体描述，而不是对本发明保护范围的限制，该领域熟练人员根据上述本发明内容对本发明做出一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1 CA-OH和Fc-OH的制备
CA-OH的制备：
1）在100 mL茄形瓶中，将12 mmol肉桂醛与15.6 mmol三羟甲基乙烷溶于12 mL甲苯中，在磁力搅拌油浴锅中将上述原料溶解。
2）原料溶解完全后，加入0.12 mmol催化剂p-TsOH，在90℃条件下搅拌反应10h。
3) 反应结束后，45 ℃下旋蒸除去甲苯，得到黄色粘稠物，即产物缩醛；
用二氯甲烷（CH2Cl2）将黄色粘稠物溶解完全后加入适量的200-300目的层析硅胶粉拌样，在拌样过程中加入3滴三乙胺，防止产物缩醛分解。
4）进行柱层析分离纯化
压柱剂为石油醚、三乙胺按体积比60:1复配而成，洗脱剂为石油醚、乙酸乙酯按体积比8:1复配而成，在40 ℃下旋蒸出溶剂后经40 ℃真空干燥得2.2769 g白色固体，即CA-OH，产率80%。
Fc-OH的制备：
1）在100 mL茄形瓶中，将12 mmol二茂铁甲醛与15.6 mmol三羟甲基乙烷溶于12mL甲苯中，在磁力搅拌油浴锅中将上述原料溶解。
2）原料溶解完全后，加入0.12 mmol催化剂p-TsOH，在90℃条件下搅拌反应10h。
3) 反应结束后，45 ℃下旋蒸除去甲苯，得到粘稠产物；用二氯甲烷（CH2Cl2）将粘稠产物溶解完全后加入适量的200-300目的层析硅胶粉拌样，在拌样过程中加入3滴三乙胺，防止产物分解。
4）进行柱层析分离纯化
压柱剂为石油醚、三乙胺按体积比60:1复配而成，洗脱剂为石油醚、乙酸乙酯按体积比8:1复配而成，在40 ℃下旋蒸出溶剂后经40 ℃真空干燥得固体二茂铁缩醛（Fc-OH），产率87%。
实施例1合成CA-OH和Fc-OH的反应方程式如附图2所示。
对CA-OH和肉桂醛进行红外光谱对比，CA-OH和肉桂醛的红外光谱对比图如附图3所示。
对Fc-OH和二茂铁甲醛进行红外光谱对比，Fc-OH和二茂铁甲醛的红外光谱对比图如附图5所示。
对产物CA-OH进行核磁氢谱分析，CA-OH的1H NMR谱图如附图4所示。
对产物Fc-OH进行核磁氢谱分析，Fc-OH的1H NMR谱图如附图6所示。
经过分析附图2-6给出的合成CA-OH和Fc-OH的反应方程式、产物与原料的红外光谱对比图、产物的核磁氢谱图，谱图与反应式中产物的结构相符。
实施例2CA-SA-COOH和Fc-SA-COOH的制备
CA-SA-COOH的制备：
1）在100 mL茄形瓶中，将2.15 mmol实施例1合成的CA-OH与3.23 mmol干燥状态的丁二酸酐溶于5 mL丁酮中，在磁力搅拌油浴锅中将原料溶解。
2）原料溶解完全后，加入0.5 mL缚酸剂三乙胺（TEA），冷凝回流，在80℃条件下搅拌反应12h。
3)反应结束后，40 ℃下旋蒸除去丁酮，将反应液用硅胶粉拌成粉状，在拌样过程中加入3滴三乙胺。
4）进行柱层析分离纯化
压柱剂为石油醚、三乙胺按体积比60:1复配而成，洗脱剂为CH2Cl2、CH3OH按体积比60:1复配而成，在50 ℃下旋蒸出溶剂后经40 ℃真空干燥得0.6698 g深黄色粘稠物CA-SA-COOH，产率为93%。
Fc-SA-COOH的制备：
1）在100 mL茄形瓶中，将2.15 mmol实施例1合成的Fe-OH与3.23 mmol干燥状态的丁二酸酐溶于5 mL丁酮中，在磁力搅拌油浴锅中将原料溶解。
2）原料溶解完全后，加入0.5 mL缚酸剂三乙胺（TEA），冷凝回流，在80℃条件下搅拌反应12h。
3)反应结束后，40 ℃下旋蒸除去丁酮，将反应液用硅胶粉拌成粉状，在拌样过程中加入3滴三乙胺。
4）进行柱层析分离纯化
压柱剂为石油醚、三乙胺按体积比60:1复配而成，洗脱剂为CH2Cl2、CH3OH按体积比60:1复配而成，在50 ℃下旋蒸出溶剂后经40 ℃真空干燥得固体产物Fc-SA-COOH，产率为89%。
实施例2合成CA-SA-COOH和Fc-SA-COOH的反应方程式，如附图7所示。
对CA-SA-COOH和CA-OH进行红外光谱对比，CA-SA-COOH和CA-OH的红外光谱对比图如附图8所示。
对Fc-SA-COOH和Fc-OH进行红外光谱对比，Fc-SA-COOH和Fc-OH的红外光谱对比图如附图10所示。
对产物CA-SA-COOH进行核磁氢谱分析，CA-SA-COOH的1H NMR谱图如附图9所示。
对产物Fc-SA-COOH进行核磁氢谱分析，Fc-SA-COOH的1H NMR谱图如附图11所示。
经过分析附图7-11给出的合成CA-SA-COOH和Fc-SA-COOH的反应方程式、产物与原料的红外光谱对比图、产物的核磁氢谱图，谱图与反应式中产物的结构相符。
实施例3FA-PEG-COOH的制备
1）在50 mL茄形瓶中，将0.258 mmol FA·H2O和0.258 mmol EDC·HCl，溶于10 mLDMSO，置于磁力搅拌器上搅拌3 h，用于活化FA分子的g-羧基。
2）将活化后的FA溶液逐滴加入到含有0.172 mmol NH2-PEG-COOH的5 mLDMSO溶液中，随滴随进行强磁搅拌，在65℃条件下搅拌反应24 h。
3）反应结束后，反应液用平均截留分子量为300的透析袋在DMSO中透析12h除去过量的FA分子，再用蒸馏水透析一天（换水多次），除去活化剂EDC的产物和DMSO。
4）最后冷冻干燥得到0.3543 g黄色固体FA-PEG-COOH，产率为85%。
实施例3合成FA-PEG-COOH的反应方程式如附图12所示。
对产物FA-PEG-COOH进行核磁氢谱图分析，FA-PEG-COOH的1H NMR谱图如附图13所示。
经分析附图12-13，实施例3合成FA-PEG-COOH的反应方程式、产物的核磁氢谱图，谱图与反应式中产物的结构相符。
实施例4 CA,Fc-g-Pullulan接枝物的制备
制备取代度为30%的CA,Fc-g-Pullulan接枝物：
1）在100 mL茄形瓶中，加入6.17mmolPullulan单元（M=162.16），根据所设计的单元取代度为30%计算出Pullulan：CA-SA-COOH：Fc-SA-COOH（n/n/n）=1:0.15:0.15，按上述比例加入CA-SA-COOH和Fc-SA-COOH各0.92mmol。本发明设计催化剂和脱水剂的用量如下：
0.617 mmol-COOH、0.0614mmolDMAP、0.8021 mmolDCC，按上述比例加入0.1842mmolDMAP和2.4052mmolDCC。最后加入14 mLDMSO，在80℃的磁力搅拌油浴锅中搅拌反应24 h。
2）反应结束后，反应液用平均截留分子量为300的透析袋在DMSO中透析12h，除去未反应完的原料及DCC吸水后生成的DCU，再用蒸馏水中透析一天（中间换水多次），除去溶剂DMSO。
3）最后冷冻干燥得1.5249 g淡黄色固体CA,Fc-g-Pullulan-30，产率为90%。
实施例4合成CA,Fc-g-Pullulan接枝物的反应方程式如图14所示。
采用实施例4合成CA,Fc-g-Pullulan-30的制备过程，改变接枝物的取代度分别为15%、50%、70%。合成不同取代度CA,Fc-g-Pullulan接枝物的原料用量、反应条件参数、产物实际产量汇总如表1所示：
表1制备四种CA,Fc-g-Pullulan的各原料用量、各条件以及实际产量汇总表
Figure 902950DEST_PATH_IMAGE001
制备的取代度为15%、30%、50%、70%的CA,Fc-g-Pullulan接枝物，分别标记为CA,Fc-g-Pullulan-15、CA,Fc-g-Pullulan-30、CA,Fc-g-Pullulan-50、CA,Fc-g-Pullulan-70，产率分别为81%、90%、91%、85%。
实施例5 CA,Fc,FA-g-Pullulan接枝物的制备
CA,Fc-g-Pullulan接枝物再进行一次酯化反应，将起主动靶向作用的FA-PEG-COOH接入CA,Fc-g-Pullulan中，合成CA,Fc,FA-g-Pullulan接枝物；并设定FA-PEG-COOH对CA,Fc-g-Pullulan接枝物单元的取代度为2%。
在CA,Fc-g-Pullulan-30的基础上继续接枝制备CA,Fc,FA-g-Pullulan接枝物的方法：
通过实施例4的第一次酯化反应，得到的CA,Fc-g-Pullulan-30接枝物单元的理论M为274.756。
1）取1.1839g实施例4合成的CA,Fc-g-Pullulan-30、0.2088g实施例3合成的FA-PEG-COOH、0.0011gDMAP、0.0231gDCC投入到100 mL茄形瓶中，最后加入9 mLDMSO，在80℃的磁力搅拌油浴锅中搅拌反应24 h。
2）反应结束后，反应液用平均截留分子量为1000的透析袋在DMSO中透析12h，除去未反应完的原料及DCC吸水后生成的DCU，再用蒸馏水中透析一天（中间换水多次），除去溶剂DMSO。
3）最后冷冻干燥得到黄色固体CA,Fc,FA-g-Pullulan-30接枝物1.2752g，产率为91.6%。
采用上述合成CA,Fc,FA-g-Pullulan-30的制备过程，固定FA-PEG-COOH对CA,Fc-g-Pullulan接枝物单元的取代度2%不变，分别用CA,Fc-g-Pullulan-15、CA,Fc-g-Pullulan-50、CA,Fc-g-Pullulan-70制备出CA,Fc,FA-g-Pullulan-15、CA,Fc,FA-g-Pullulan-50、CA,Fc,FA-g-Pullulan-70接枝物。合成CA,Fc,FA-g-Pullulan接枝物的原料用量、反应条件参数、产物实际产量如表2所示：
表2 制备 CA,Fc,FA-g-Pullulan的各原料用量、各条件以及实际产量汇总表
Figure 757774DEST_PATH_IMAGE002
附图15-17给出了实施例5合成CA,Fc,FA-g-Pullulan的反应方程式、产物与原料的红外光谱对比图、产物的核磁氢谱图，经分析，谱图符合所附反应式中产物的结构特点。
附图18-20是以取代度为15%、30%、50%的CA,Fc,FA-g-Pullulan接枝物为对象，对其制成的CFFP NPs胶束溶液加酸前后的粒径进行测试得到的对比图，测试结果显示取代度为15%、30%、50%的CA,Fc,FA-g-Pullulan接枝物的纳米胶束尺寸分别在635.7 nm、388.9nm、418.5 nm左右，均在药物载体的所需范围内，取代度为30%的CA,Fc,FA-g-Pullulan接枝物的纳米粒度最优，当施加酸条件后，各取代度的胶束粒径都有所减小，平均减幅约在250nm左右，且取代度为50%的CA,Fc,FA-g-Pullulan接枝物的胶束还分解出了小分子物质，表明本发明制备的药物载体具有很好的pH响应特性。
附图21为以上三个取代度的CFFP NPs临界胶束浓度测试图，测试结果显示取代度为15%、30%、50%的CA,Fc,FA-g-Pullulan接枝物的纳米载体能够形成稳定胶束的临界胶束浓度分别为0.089mg/ml、0.071mg/ml、0.047mg/ml，该值均在药物给药系统稳定存在范围内，取代度为50%的CA,Fc,FA-g-Pullulan接枝物的临界胶束浓度最优。
实施例6 DOX-loaded CFFP NPs的制备
1）在50 mL茄形瓶中，将0.0205g盐酸阿霉素（DOX·HCL）与0.01 mL三乙胺溶于1.5mLDMSO中，置于磁力搅拌器上避光搅拌6h，用于中和DOX·HCL。
2）取0.4091 g实施例5合成的Pullulan-CA-Fe-FA接枝物作为空白载体完全溶于6mLDMSO中。然后加入步骤1）的反应液中避光搅拌12h。
3）将步骤2）获得的反应液逐滴加入20mL蒸馏水中，得到的液体用平均截留分子量为1000的透析袋在蒸馏水中透析24h，最终经冷冻干燥得到0.3903g紫红色固体，即本发明的最终产物芬顿试剂和阿霉素共转运的靶向纳米载体（DOX-loaded CFFP NPs）。
四种取代度的CA,Fc,FA-g-Pullulan空白载体的载药步骤都按上述过程进行。
附图22-24给出了采用实施例6的制备方法合成的15%、30%、50%三种取代度的DOX-loaded CFFP NPs的体外释药曲线。测试图显示，15%、30%、50%三种取代度DOX-loaded CFFPNPs在不同环境中前10h释放速度较快，10h后释放速度平稳，表现出很好的缓释效果；在附图22中，取代度为15%的DOX-loaded CFFP NPs在pH=5.8、6.6、7.4的环境中最终累积释放率分别为90.3%、80.0%、45.8%；在附图23中，取代度为30%的DOX-loaded CFFP NPs在pH=5.8、6.6、7.4的环境中最终累积释放率分别为83.6%、76.1%、31.9%；在附图24中，取代度为50%的DOX-loaded CFFP NPs在pH=5.8、6.6、7.4的环境中最终累积释放率分别为74.1%、63.0%、27.1%。且在任一时刻的累积释放率随着释药环境pH值的降低而增大，最终药物的累释放率较高，取代度为15%的DOX-loaded CFFP NPs在各pH环境中累积释放率最高，表现出一种很好的酸敏感性；另外，本发明所合成的DOX-loaded CFFP NPs包封率和载药率较高，取代度为15%、30%、50%的DOX-loaded CFFP NPs的包封率分别为76.78%、99.41%、92.72%；取代度为15%、30%、50%的DOX-loaded CFFP NPs的载药率分别为4.99%、5.72%、5.10%。
综上可见，本发明所合成的芬顿试剂和阿霉素共转运的靶向纳米载体（DOX-loaded CFFP NPs）pH响应性较好，包封率和载药率较高，在酸性环境中药物释放稳定且累释放率较高，表现出较好的缓释效果。
除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为重量百分数，本发明所述的比例，均为质量比例。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种芬顿试剂和阿霉素共转运靶向纳米载体的制备方法，其特征在于：包括CA-OH和Fc-OH的制备、CA-SA-COOH和Fc-SA-COOH的制备、FA-PEG-COOH的制备、CA,Fc-g-Pullulan的制备、CA,Fc,FA-g-Pullulan的制备、DOX-loaded CFFP NPs的制备步骤；
其中CA-OH是2-羟甲基-2-甲基-丙二醇肉桂缩醛的简称；
Fc-OH是2-羟甲基-2-甲基-丙二醇缩二茂铁甲醛的简称；
CA-SA-COOH是丁二酸(2-羟甲基-2-甲基-丙二醇肉桂缩醛)单酯的简称；
Fc-SA-COOH是丁二酸(2-羟甲基-2-甲基-丙二醇缩二茂铁甲醛)单酯的简称；
FA-PEG-COOH的结构式为：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
；
CA,Fc-g-Pullulan的结构式为：
Figure 611630DEST_PATH_IMAGE002
CA,Fc,FA-g-Pullulan的结构式为：
Figure 981300DEST_PATH_IMAGE003
。
2.根据权利要求1所述的一种芬顿试剂和阿霉素共转运靶向纳米载体的制备方法，其特征在于：所述的CA-OH和Fc-OH的制备：将肉桂醛和二茂铁甲醛分别与三羟甲基乙烷混合溶于甲苯中，并在对甲苯磺酸一水合物的催化下反应；得到的反应液分别经柱层析分离、干燥，分别得到CA-OH和Fc-OH。
3.根据权利要求1所述的一种芬顿试剂和阿霉素共转运靶向纳米载体的制备方法，其特征在于：所述的CA-SA-COOH和Fc-SA-COOH的制备：将CA-OH和Fc-OH分别与丁二酸酐（SA）在丁酮中发生开环反应，以三乙胺作缚酸剂，得到的反应液分别经柱层析分离、干燥，分别得到CA-SA-COOH和Fc-SA-COOH。
4.根据权利要求1所述的一种芬顿试剂和阿霉素共转运靶向纳米载体的制备方法，其特征在于：所述的FA-PEG-COOH的制备：经1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺·盐酸盐活化后的叶酸水合物与NH2-PEG-COOH在二甲基亚砜中发生反应，得到的反应液经透析、冷冻干燥得到黄色固体产物FA-PEG-COOH。
5.根据权利要求1所述的一种芬顿试剂和阿霉素共转运靶向纳米载体的制备方法，其特征在于：所述的CA,Fc-g-Pullulan的制备：将合成的CA-SA-COOH和Fc-SA-COOH与普鲁兰多糖（Pullulan）在DMSO中发生酯化反应，得到的反应液经透析、冷冻干燥得到淡黄色固体产物CA,Fc-g-Pullulan。
6.根据权利要求1所述的一种芬顿试剂和阿霉素共转运靶向纳米载体的制备方法，其特征在于：所述的CA,Fc,FA-g-Pullulan的制备：将合成的CA,Fc-g-Pullulan与合成的FA-PEG-COOH进行酯化反应，固定FA-PEG-COOH的取代度为2%，得到黄色固体产物CA,Fc,FA-g-Pullulan。
7.根据权利要求1所述的一种芬顿试剂和阿霉素共转运靶向纳米载体的制备方法，其特征在于：所述的DOX-loaded CFFP NPs的制备：合成的CA,Fc,FA-g-Pullulan用DMSO溶解后，加入到用三乙胺中和后的盐酸阿霉素（DOX·HCl）DMSO溶液中反应，将得到的反应液逐滴加入去离子水中进行自组装，得到的溶液经透析、冷冻干燥得到紫红色固体产物，即芬顿试剂和阿霉素共转运的靶向纳米载体。
8.根据权利要求2所述的一种芬顿试剂和阿霉素共转运靶向纳米载体的制备方法，其特征在于：所述的反应：反应温度为88-93℃，反应时间为8-12h；所述的柱层析分离：压柱剂为石油醚、三乙胺按体积比60:1复配而成，洗脱剂为石油醚、乙酸乙酯按体积比8:1复配而成。
9.根据权利要求4所述的一种芬顿试剂和阿霉素共转运靶向纳米载体的制备方法，其特征在于：所述的反应：反应温度为62-66℃，反应时间为23-25h。
10.根据权利要求5所述的一种芬顿试剂和阿霉素共转运靶向纳米载体的制备方法，其特征在于：所述的酯化反应：以4-二甲氨基吡啶为催化剂、以N，N’-二环己基碳二亚胺为脱水剂，反应温度为75-90℃，反应时间为22-26h。
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