CN110585169B - 一种葡萄糖氧化酶修饰的金属有机框架药物组合物的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明一种葡萄糖氧化酶修饰的金属有机框架药物组合物的制备方法,所述的金属有机框架为铈基MOF(Ce‑MOF),合成的Ce‑MOF在氮气保护煅烧的条件下进行碳化,将葡萄糖氧化酶通过酰胺键反应修饰在Ce‑MOF的表面,最后在Ce‑MOF的内部物理负载抗肿瘤药物,得粒径为150‑250nm葡萄糖氧化酶修饰的金属有机框架药物组合物,本发明制备方法稳定可靠,成本低,制得的葡萄糖氧化酶修饰的金属有机框架药物组合物在制备抗肿瘤药物方面可发挥三重打击交互综合治疗肿瘤的作用,增强抗肿瘤效果,是肿瘤治疗药物上的创新,经济和社会效益巨大。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域,特别是一种葡萄糖氧化酶修饰的金属有机框架药物组合物的制备方法。
背景技术
近些年来,金属有机框架(Metal organic frameworks, MOF)不仅被应用在传统的储存、分离和催化领域,也被深入研究在生物医学应用,比如成像和癌症治疗或作为生物传感器材料的用途,MOF具有可调尺寸、高表面积、大内部孔体积的优点,可成为优异的药物载体,且表面具有功能化官能团进而利于修饰大分子;其中,铈基MOF(Ce-MOF)中含有过氧化物酶活性的氧化铈(CeO2)纳米颗粒,故在肿瘤弱酸性环境中可与过氧化氢(H2O2)发生类芬顿反应产生活性氧(Reactive oxygen species, ROS);然而,肿瘤部位的H2O2含量较低,使得ROS的产量较低,抗肿瘤活性较差,因此,提高内源性H2O2的含量是解决该问题的关键因素。
与正常分化细胞依靠氧化磷酸化产能不同,肿瘤细胞在氧气充足的情况下优先利用糖酵解产能,该特殊代谢被称为“Warburg效应”;葡萄糖氧化酶(GOx)作为一种内源性氧化还原酶,对β-D-葡萄糖具有独特的催化作用,可将葡萄糖高效氧化成葡萄糖酸和H2O2,该反应一方面消耗葡萄糖对肿瘤细胞进行“饥饿”,另一方面增加内源性H2O2的含量,提高 Ce-MOF 发生类芬顿反应的效率,因此,将葡萄糖氧化酶修饰在铈基MOF(Ce-MOF)的表面,并在铈基MOF(Ce-MOF)内部物理负载化疗药物,有望提高肿瘤的治疗效果,但至今未见公开报导。
发明内容
针对上述情况,为解决现有技术之缺陷,本发明之目的就是提供一种葡萄糖氧化酶修饰的金属有机框架药物组合物的制备方法,可有效解决针对肿瘤进行三重打击交互综合治疗的问题,促进肿瘤细胞凋亡。
为实现上述目的,本发明的技术方案是,一种葡萄糖氧化酶修饰的金属有机框架药物组合物的制备方法,所述的金属有机框架为铈基MOF(Ce-MOF),合成的Ce-MOF在氮气保护煅烧的条件下进行碳化,将葡萄糖氧化酶通过酰胺键反应修饰在Ce-MOF的表面,最后在Ce-MOF的内部物理负载抗肿瘤药物,得粒径为150-250nm葡萄糖氧化酶修饰的金属有机框架药物组合物,具体包括以下步骤:
(1)将280-290 mg的对苯二甲酸溶解到5-10 mL的N,N-二甲基甲酰胺溶剂中,称取930-940mg的硝酸铈铵溶于5-10 mL的超纯水中成硝酸铈铵水溶液,密封,将对苯二甲酸的N,N-二甲基甲酰胺溶液与硝酸铈铵水溶液混合,于90-110℃ 油浴下搅拌15-20 min,10000-15000 rpm离心10 min取沉淀,沉淀先用N,N-二甲基甲酰胺洗3-5次,除去多余的对苯二甲酸,再用丙酮洗3-5次,除去残留的N,N-二甲基甲酰胺,70℃下烘干24h,研磨成过100-120目筛的白色粉末,得Ce-MOF;
(2)将步骤(1)所制备的Ce-MOF在氮气保护下煅烧,以4-6℃/min升温至390-410℃,煅烧 3-5 h,冷却至20 ℃以下,得煅烧后碳化的Ce-MOF;
(3)将10-20 mg煅烧后碳化的Ce-MOF溶于10-15 mL的溶剂中,探头超声使分散均匀,得白色混悬液;另取1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐15-20mg、N-羟基琥珀酰亚胺10-15 mg 分别溶于3 mL的溶剂中,再取葡萄糖氧化酶(GOx)5-10mg溶于4 mL的溶剂中,配好溶液;将Ce-MOF溶液、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液、N-羟基琥珀酰亚胺溶液依次加入到100 mL圆底烧瓶中,再加2-4 mL 溶剂,室温搅拌20-40 min,加入葡萄糖氧化酶溶液,再加5-10 mL 的溶剂,室温搅拌反应24 h,反应结束后,10000-15000rpm离心10 min,弃去上清液,用PH为7.2-7.4的PBS洗涤沉淀,重复离心洗涤3-5次,将沉淀洗至中性,于30-40 ℃烘干,研磨成过100-120目筛的粉末,得Ce-MOF-GOx;
所述的溶剂为N,N-二甲基甲酰胺、PH为7.2-7.4的PBS或MES的一种;
(4)将0.5-2 mg的Ce-MOF-GOx与1 mg的小分子化疗药物分散于3-5 mL甲醇和水的混合液中,甲醇与水的体积比为1:1,室温、避光下,2000-2400 rpm搅拌24 h,反应结束后,10000-15000 rpm离心10min弃去上清液,得沉淀,沉淀用3-5 mL甲醇与水的体积比为1:1的混合液洗三次,随后用超纯水洗四次,烘干,即得葡萄糖氧化酶修饰的负载小分子化疗药物的Ce-MOF药物组合物,所述的小分子化疗药物为阿霉素、紫杉醇、多烯紫杉醇、羟基喜树碱或米托蒽醌。
所述的Ce-MOF药物组合物的载药量为15%~45%。
所述的葡萄糖氧化酶修饰的金属有机框架药物组合物将药学活性或药理活性分子相结合在制备抗肿瘤药物中的应用,所述药学活性或药理活性分子为阿霉素、紫杉醇、多烯紫杉醇、羟基喜树碱或米托蒽醌。
所述方法制备的葡萄糖氧化酶修饰的金属有机框架药物组合物在制备抗肿瘤的注射剂、口服剂或植入给药剂中的应用。
所述方法制备的葡萄糖氧化酶修饰的金属有机框架药物组合物在化疗、类芬顿催化氧化效应、饥饿疗法的三重打击交互综合治疗药物中的应用。
本发明制备方法稳定可靠,成本低,制得的葡萄糖氧化酶修饰的金属有机框架药物组合物在制备抗肿瘤药物方面可发挥三重打击交互综合治疗肿瘤的作用,增强抗肿瘤效果,是肿瘤治疗药物上的创新,经济和社会效益巨大。
具体实施方式
以下结合实施例和具体情况对本发明的具体实施方式作详细说明。
本发明在具体实施中,由以下实施例给出。
实施例1:
一种葡萄糖氧化酶修饰的金属有机框架药物组合物的制备方法,包括以下步骤:
(1)将285 mg的对苯二甲酸溶解到7 mL的N,N-二甲基甲酰胺溶剂中,称取935mg的硝酸铈铵溶于7 mL的超纯水中成硝酸铈铵水溶液,密封,将对苯二甲酸的N,N-二甲基甲酰胺溶液与硝酸铈铵水溶液混合,于100℃ 油浴下搅拌17 min,12500 rpm离心10 min取沉淀,沉淀先用N,N-二甲基甲酰胺洗4次,除去多余的对苯二甲酸,再用丙酮洗4次,除去残留的N,N-二甲基甲酰胺,70℃下烘干24h,研磨成过110目筛的白色粉末,得Ce-MOF;
(2)将步骤(1)所制备的Ce-MOF在氮气保护下煅烧,以5℃/min升温至400 ℃,煅烧4 h,冷却至20 ℃,得煅烧后碳化的Ce-MOF;
(3)将15mg煅烧后碳化的Ce-MOF溶于12.5 mL的N,N-二甲基甲酰胺中,探头超声使分散均匀,得白色混悬液;另取1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐17.5mg、N-羟基琥珀酰亚胺12.5 mg 分别溶于3 mL的N,N-二甲基甲酰胺中,再取葡萄糖氧化酶(GOx)7.5mg溶于4 mL的N,N-二甲基甲酰胺中,配好溶液;将Ce-MOF溶液、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液、N-羟基琥珀酰亚胺溶液依次加入到100 mL圆底烧瓶中,再加3mL N,N-二甲基甲酰胺,室温搅拌30 min,加入葡萄糖氧化酶溶液,再加7.5 mL 的N,N-二甲基甲酰胺,室温搅拌反应24 h,反应结束后,12500 rpm离心10 min,弃去上清液,用PH为7.3的PBS洗涤沉淀,重复离心洗涤4次,将沉淀洗至中性,于35 ℃烘干,研磨成过110目筛的粉末,即得Ce-MOF-GOx;
(4)将1.25 mg的Ce-MOF-GOx与1 mg的阿霉素分散于4 mL甲醇和水的混合液中,甲醇与水的体积比为1:1,室温、避光下,2200rpm搅拌24 h,反应结束后,12500 rpm离心10min得沉淀,沉淀用4 mL甲醇与水的体积比为1:1的混合液洗三次,随后用超纯水洗四次,烘干,即得葡萄糖氧化酶修饰的负载阿霉素的Ce-MOF药物组合物。
实施例2:
一种葡萄糖氧化酶修饰的金属有机框架药物组合物的制备方法,包括以下步骤:
(1)将280 mg的对苯二甲酸溶解到5 mL的N,N-二甲基甲酰胺溶剂中,称取930mg的硝酸铈铵溶于5 mL的超纯水中成硝酸铈铵水溶液,密封,将对苯二甲酸的N,N-二甲基甲酰胺溶液与硝酸铈铵水溶液混合,于90℃ 油浴下搅拌15 min,10000 rpm离心10 min取沉淀,沉淀先用N,N-二甲基甲酰胺洗3次,除去多余的对苯二甲酸,再用丙酮洗3次,除去残留的N,N-二甲基甲酰胺,70℃下烘干24h,研磨成过100目筛的白色粉末,得Ce-MOF;
(2)将步骤(1)所制备的Ce-MOF在氮气保护下煅烧,以4℃/min升温至390℃,煅烧5h,冷却至20 ℃,得煅烧后碳化的Ce-MOF;
(3)将10mg煅烧后碳化的Ce-MOF溶于10 mL的PH为7.3的PBS中,探头超声使分散均匀,得白色混悬液;另取1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐15mg、N-羟基琥珀酰亚胺10 mg 分别溶于3 mL的PH为7.3的PBS中,再取葡萄糖氧化酶(GOx)5mg溶于4 mL的PH为7.3的PBS中,配好溶液;将Ce-MOF溶液、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液、N-羟基琥珀酰亚胺溶液依次加入到100 mL圆底烧瓶中,再加2 mL的 PH为7.2的PBS,室温搅拌20min,加入葡萄糖氧化酶溶液,再加5mL 的PH为7.3的PBS,室温搅拌反应24 h,反应结束后,10000 rpm离心10 min,弃去上清液,用PH为7.2的PBS洗涤沉淀,重复离心洗涤4次,将沉淀洗至中性,于30 ℃烘干,研磨成过100目筛的粉末,即得Ce-MOF-GOx;
(4)将0.5 mg的Ce-MOF-GOx与1 mg的紫杉醇和米托蒽醌分散于3 mL甲醇和水的混合液中,甲醇与水的体积比为1:1,室温、避光条件下2000rpm搅拌24 h,反应结束后,10000rpm离心10min取沉淀,沉淀用3 mL甲醇与水的体积比为1:1的混合液洗三次,随后用超纯水洗四次,烘干,即得葡萄糖氧化酶修饰的负载紫杉醇和米托蒽醌的Ce-MOF药物组合物。
实施例3:
一种葡萄糖氧化酶修饰的金属有机框架药物组合物的制备方法,包括以下步骤:
(1)将290mg的对苯二甲酸溶解到10 mL的N,N-二甲基甲酰胺溶剂中,称取940mg的硝酸铈铵溶于10mL的超纯水中成硝酸铈铵水溶液,密封,将对苯二甲酸的N,N-二甲基甲酰胺溶液与硝酸铈铵水溶液混合,于110℃ 油浴下搅拌20min,15000 rpm离心10 min取沉淀,沉淀先用N,N-二甲基甲酰胺洗5次,除去多余的对苯二甲酸,再用丙酮洗5次,除去残留的N,N-二甲基甲酰胺,70℃下烘干24h,研磨成过120目筛的白色粉末,得Ce-MOF;
(2)将步骤(1)所制备的Ce-MOF在氮气保护下煅烧,以6℃/min升温至410℃,煅烧3h,冷却至20 ℃,得煅烧后碳化的Ce-MOF;
(3)将20mg煅烧后碳化的Ce-MOF溶于15mL的MES中,探头超声使分散均匀,得白色混悬液;另取1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐20mg、N-羟基琥珀酰亚胺15 mg分别溶于3 mL的MES中,再取葡萄糖氧化酶(GOx)10mg溶于4 mL的MES中,配好溶液;将Ce-MOF溶液、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液、N-羟基琥珀酰亚胺溶液依次加入到100 mL圆底烧瓶中,再加4 mL 的MES,室温搅拌40min,加入葡萄糖氧化酶溶液,再加10mL 的MES,室温搅拌反应24 h,反应结束后,15000 rpm离心10 min,弃去上清液,用PH为7.4的PBS洗涤沉淀,重复离心洗涤5次,将沉淀洗至中性,于40 ℃烘干,研磨成过120目筛的粉末,即得Ce-MOF-GOx;
(4)将2 mg的Ce-MOF-GOx与1 mg的多烯紫杉醇和羟基喜树碱分散于5 mL甲醇和水的混合液中,甲醇与水的体积比为1:1,室温、避光条件下2400rpm搅拌24 h,反应结束后,15000 rpm离心10min取沉淀,沉淀用5 mL甲醇与水的体积比为1:1的混合液洗三次,随后用超纯水洗四次,烘干,即得葡萄糖氧化酶修饰的负载多烯紫杉醇和羟基喜树碱的Ce-MOF药物组合物。
经科学试验,本发明所制得的葡萄糖氧化酶修饰的金属有机框架药物组合物的制备方法稳定可靠,葡萄糖氧化酶提供H2O2增强类芬顿反应产生活性氧,同时进行肿瘤细胞的饥饿,而小分子化疗药的加入极大增强了抗肿瘤效果。制备抗肿瘤药物方面可发挥三重打击交互综合治疗肿瘤的作用,与传统化疗相比具有高效、毒副作用小的优势,有关实验资料如下(以实施例1为例)。
一、葡萄糖氧化酶修饰的金属有机框架药物组合物的表征
1、葡萄糖氧化酶修饰的金属有机框架药物组合物中阿霉素含量的测定:
采用紫外分光光度法,于482 nm波长处测定阿霉素的含量,以公式(1)计算样品的载药量,载药量达到40%左右,最高可达45%;
2、葡萄糖氧化酶修饰的金属有机框架药物组合物的粒径和电位的测定:
取适量负载阿霉素的葡萄糖氧化酶修饰的金属有机框架药物组合物分散于水中,用Nano-ZS90 型激光纳米粒度分析仪测得其粒径和电位分别为203nm和-25.1 ±1.3 mV。
二、葡萄糖氧化酶修饰的金属有机框架药物组合物在体外产生活性氧实验
选择对数生长期的4T1鼠乳腺癌细胞,调整细胞数为3×105/ml接种于6孔培养板,每孔2ml,细胞贴壁生长24h后加药,依次为空白组、Ce-MOF组、Ce-MOF-GOx组、DOX/Ce-MOF-GOx组,其中Ce-MOF终浓度设为100μg/ml,培养24 h后,弃去旧培养液,每孔用新鲜的PBS洗2~3遍,每孔加1ml 含DCFH-DA的活性氧探针培养基,37℃培养30min后,用新鲜的PBS洗2~3遍,在显微镜下观察,结果发现除空白组和Ce-MOF组外,其余组均检测到绿色的DCFH-DA荧光信号,该结果与文献报道一致,Ce-MOF可与葡萄糖氧化酶产生的H2O2发生类芬顿反应产生大量的活性氧。
三、葡萄糖氧化酶修饰的金属有机框架药物组合物的细胞摄取实验
选择对数生长期的4T1鼠乳腺癌细胞,调整细胞数为3×105/ml接种于6孔培养板,每孔2ml,贴壁生长24h后加药,依次为DOX组、DOX/Ce-MOF-GOx组,药物终浓度设为4μg/ml,孵育时间设为0.5h,1h,2h,加药后在37℃,5% CO2条件下培养后,将孔内含药培养基弃去,每孔用1ml PBS洗2~3遍,加入500μl不含EDTA的胰酶消化细胞,加1ml新鲜培养基终止消化,吹打,直至细胞与壁分离,将细胞悬液移入10ml离心管中,离心弃去上清,加PBS重悬,用流式细胞仪测定,发现4T1鼠乳腺癌细胞0.5h对DOX、DOX/Ce-MOF-GOx的摄取量分别为:40.6%、25.8%;1h时的摄取量分别为:86.6%、43.8%;2h时的摄取量分别为:98.8%、97.5%。结果表明,水溶性小分子原料药DOX细胞摄取最快,1h 时细胞对其摄取量几近饱和;而DOX/Ce-MOF-GOx纳米制剂的分子量较大,细胞摄取较慢,2h时4T1鼠乳腺癌细胞对DOX和DOX/Ce-MOF-GOx摄取量基本相同。
四、葡萄糖氧化酶修饰的金属有机框架药物组合物的细胞增殖抑制实验
采用MTT法,选择对数生长期的4T1鼠乳腺癌细胞,调整细胞数为5×104/ml接种于96孔培养板,细胞贴壁生长24h后加药,依次为空白组、Ce-MOF组、GOx组、DOX组、Ce-MOF-GOx组、DOX/Ce-MOF-GOx组,在以上几组的基础上加入葡萄糖浓度为变量,葡萄糖浓度分别为:0、2、5 mM,其中药物终浓度设为75μg/ml;加过药的细胞在37℃,5% CO2的环境中孵育24 h后,每孔加入25μl 新鲜配制并过滤后的5mg/mL的MTT,放入培养箱避光孵育4h后取出,吸出孔内全部液体甩干,每孔加入150μl的DMSO,放入摇床微振荡,在37℃以100rpm微震荡10min后,于酶标仪490 nm波长处测每个小孔的OD值,计算肿瘤细胞生长抑制率(% )= (1-实验组OD值/对照组OD值)×100%,计算得到5mM的葡萄糖存在的情况下Ce-MOF组、GOx组、DOX组、Ce-MOF-GOx组、DOX/Ce-MOF-GOx组细胞生长抑制率分别为:20.5%,25.9%,29.5%,67.8%,78.2%。结果表明,Ce-MOF、GOx、DOX组对细胞有一定的毒性,但在Ce-MOF连葡萄糖氧化酶以及载上DOX后增加抗肿瘤效应,不仅如此,随着葡萄糖浓度的增加,抗肿瘤效应也更强,该实验说明DOX/Ce-MOF-GOx组在葡萄糖给与的条件下可极大的发挥抗肿瘤效应,是级联反应,饥饿疗法,化疗作用的协同治疗结果。
五、葡萄糖氧化酶修饰的金属有机框架药物组合物的药效学研究
购买4-6周龄的雌性Balb/c小鼠,在小鼠的右上肢背部皮下接种4T1鼠乳腺癌细胞,7天后测量肿瘤体积,取肿瘤体积≥100 mm3 且肿瘤体积和体重相似的小鼠,将其随机分为6组,每组6只,具体分组如下:生理盐水组、Ce-MOF组、GOx组、DOX组、Ce-MOF-GOx组、DOX/Ce-MOF-GOx组;各组小鼠的给药方式均采用尾静脉注射,每两天一次,共给药7 次,整个实验过程中保证小鼠每日正常饮食,每两天称量每只小鼠的体重,并使用数显游标卡尺测量荷瘤小鼠肉瘤的长径(A)与短径(B),按公式肿瘤体积V=A× B2/2计算肿瘤体积。记录的数据显示,Ce-MOF组、GOx组、DOX组、Ce-MOF-GOx组、DOX/Ce-MOF-GOx组的抑瘤率分别为22.82%,21.76%,25.25%,66.48%,87.71%。结果表明,DOX/Ce-MOF-GOx组的药效显著,可极大抑制肿瘤生长。该实验证明了该肿瘤靶向给药系统的基于级联催化,饥饿疗法和化疗相结合协同治疗效果。
按上述方法,对本发明实施例2-3进行了实验,均取得了相同或相近似的结果,这里不再一一列举。
实验表明,本发明方法稳定可靠,产品质量好,载药量高达45%,与现有技术相比,具有以下突出的有益技术效果:
(1)本发明提供的葡萄糖氧化酶修饰的金属有机框架药物组合物,选择氮气保护煅烧进行碳化,提高了Ce-MOF的活性,产品质量好,载药量高达45%,粒径小,仅有150-250nm(纳米),利于药物吸收,提高利用率和疗效;
(2)本发明提供的葡萄糖氧化酶修饰的金属有机框架药物组合物,选择金属有机框架有利于固定葡萄糖氧化酶,保持葡萄糖氧化酶的活性,并与葡萄糖氧化酶产生的过氧化氢发生类芬顿反应提高活性氧的含量,同时葡萄糖氧化酶消耗葡萄糖进行饥饿治疗;
(3)本发明提供的葡萄糖氧化酶修饰的金属有机框架药物组合物将化疗、Ce-MOF的类芬顿催化氧化效应、以及葡萄糖氧化酶的饥饿疗法集合在一起,针对肿瘤进行三重打击交互综合治疗,增强抗肿瘤治疗效果,是肿瘤治疗药物上的创新,经济和社会效益巨大。
Claims (8)
1.一种葡萄糖氧化酶修饰的金属有机框架药物组合物的制备方法,其特征在于,所述的金属有机框架为铈基MOF(Ce-MOF),合成的Ce-MOF在氮气保护煅烧的条件下进行碳化,将葡萄糖氧化酶通过酰胺键反应修饰在Ce-MOF的表面,最后在Ce-MOF的内部物理负载抗肿瘤药物,得粒径为150-250nm葡萄糖氧化酶修饰的金属有机框架药物组合物,具体包括以下步骤:
(1)将280-290 mg的对苯二甲酸溶解到5-10 mL的N,N-二甲基甲酰胺溶剂中,称取930-940mg的硝酸铈铵溶于5-10 mL的超纯水中成硝酸铈铵水溶液,密封,将对苯二甲酸的N,N-二甲基甲酰胺溶液与硝酸铈铵水溶液混合,于90-110℃ 油浴下搅拌15-20 min,10000-15000 rpm离心10 min取沉淀,沉淀先用N,N-二甲基甲酰胺洗3-5次,除去多余的对苯二甲酸,再用丙酮洗3-5次,除去残留的N,N-二甲基甲酰胺,70℃下烘干24h,研磨成过100-120目筛的白色粉末,得Ce-MOF;
(2)将步骤(1)所制备的Ce-MOF在氮气保护下煅烧,以4-6℃/min升温至390-410 ℃,煅烧 3-5 h,冷却至20 ℃以下,得煅烧后碳化的Ce-MOF;
(3)将10-20 mg煅烧后碳化的Ce-MOF溶于10-15 mL的溶剂中,探头超声使分散均匀,得白色混悬液;另取1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐15-20mg、N-羟基琥珀酰亚胺10-15 mg 分别溶于3 mL的溶剂中,再取葡萄糖氧化酶(GOx)5-10mg溶于4 mL的溶剂中,配好溶液;将Ce-MOF溶液、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液、N-羟基琥珀酰亚胺溶液依次加入到100 mL圆底烧瓶中,再加2-4 mL 溶剂,室温搅拌20-40 min,加入葡萄糖氧化酶溶液,再加5-10 mL 的溶剂,室温搅拌反应24 h,反应结束后,10000-15000 rpm离心10 min,弃去上清液,用PH为7.2-7.4的PBS洗涤沉淀,重复离心洗涤3-5次,将沉淀洗至中性,于30-40 ℃烘干,研磨成过100-120目筛的粉末,得Ce-MOF-GOx;
所述的溶剂为N,N-二甲基甲酰胺、PH为7.2-7.4的PBS或MES的一种;
(4)将0.5-2 mg的Ce-MOF-GOx与1 mg的小分子化疗药物分散于3-5 mL甲醇和水的混合液中,甲醇与水的体积比为1:1,室温、避光下,2000-2400 rpm搅拌24 h,反应结束后,10000-15000 rpm离心10min弃去上清液,得沉淀,沉淀用3-5 mL甲醇与水的体积比为1:1的混合液洗三次,随后用超纯水洗四次,烘干,即得葡萄糖氧化酶修饰的负载小分子化疗药物的Ce-MOF药物组合物,所述的小分子化疗药物为阿霉素、紫杉醇、多烯紫杉醇、羟基喜树碱或米托蒽醌。
2.根据权利要求1所述的葡萄糖氧化酶修饰的金属有机框架药物组合物的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)将285 mg的对苯二甲酸溶解到7 mL的N,N-二甲基甲酰胺溶剂中,称取935mg的硝酸铈铵溶于7 mL的超纯水中成硝酸铈铵水溶液,密封,将对苯二甲酸的N,N-二甲基甲酰胺溶液与硝酸铈铵水溶液混合,于100℃ 油浴下搅拌17 min,12500 rpm离心10 min取沉淀,沉淀先用N,N-二甲基甲酰胺洗4次,除去多余的对苯二甲酸,再用丙酮洗4次,除去残留的N,N-二甲基甲酰胺,70℃下烘干24h,研磨成过110目筛的白色粉末,得Ce-MOF;
(2)将步骤(1)所制备的Ce-MOF在氮气保护下煅烧,以5℃/min升温至400 ℃,煅烧4 h,冷却至20 ℃,得煅烧后碳化的Ce-MOF;
(3)将15mg煅烧后碳化的Ce-MOF溶于12.5 mL的N,N-二甲基甲酰胺中,探头超声使分散均匀,得白色混悬液;另取1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐17.5mg、N-羟基琥珀酰亚胺12.5 mg 分别溶于3 mL的N,N-二甲基甲酰胺中,再取葡萄糖氧化酶(GOx)7.5mg溶于4 mL的N,N-二甲基甲酰胺中,配好溶液;将Ce-MOF溶液、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液、N-羟基琥珀酰亚胺溶液依次加入到100 mL圆底烧瓶中,再加3 mL N,N-二甲基甲酰胺,室温搅拌30 min,加入葡萄糖氧化酶溶液,再加7.5 mL 的N,N-二甲基甲酰胺,室温搅拌反应24 h,反应结束后,12500 rpm离心10 min,弃去上清液,用PH为7.3的PBS洗涤沉淀,重复离心洗涤4次,将沉淀洗至中性,于35 ℃烘干,研磨成过110目筛的粉末,即得Ce-MOF-GOx;
(4)将1.25 mg的Ce-MOF-GOx与1 mg的阿霉素分散于4 mL甲醇和水的混合液中,甲醇与水的体积比为1:1,室温、避光下,2200rpm搅拌24 h,反应结束后,12500 rpm离心10min得沉淀,沉淀用4 mL甲醇与水的体积比为1:1的混合液洗三次,随后用超纯水洗四次,烘干,即得葡萄糖氧化酶修饰的负载阿霉素的Ce-MOF药物组合物。
3.根据权利要求1所述的葡萄糖氧化酶修饰的金属有机框架药物组合物的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)将280 mg的对苯二甲酸溶解到5 mL的N,N-二甲基甲酰胺溶剂中,称取930mg的硝酸铈铵溶于5 mL的超纯水中成硝酸铈铵水溶液,密封,将对苯二甲酸的N,N-二甲基甲酰胺溶液与硝酸铈铵水溶液混合,于90℃ 油浴下搅拌15 min,10000 rpm离心10 min取沉淀,沉淀先用N,N-二甲基甲酰胺洗3次,除去多余的对苯二甲酸,再用丙酮洗3次,除去残留的N,N-二甲基甲酰胺,70℃下烘干24h,研磨成过100目筛的白色粉末,得Ce-MOF;
(2)将步骤(1)所制备的Ce-MOF在氮气保护下煅烧,以4℃/min升温至390℃,煅烧5 h,冷却至20 ℃,得煅烧后碳化的Ce-MOF;
(3)将10mg煅烧后碳化的Ce-MOF溶于10 mL的PH为7.2-7.4的PBS中,探头超声使分散均匀,得白色混悬液;另取1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐15mg、N-羟基琥珀酰亚胺10 mg 分别溶于3 mL的PH为7.2-7.4的PBS中,再取葡萄糖氧化酶(GOx)5mg溶于4 mL的PH为7.2-7.4的PBS中,配好溶液;将Ce-MOF溶液、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液、N-羟基琥珀酰亚胺溶液依次加入到100 mL圆底烧瓶中,再加2 mL的 PH为7.2-7.4的PBS,室温搅拌20min,加入葡萄糖氧化酶溶液,再加5mL 的PH为7.2-7.4的PBS,室温搅拌反应24 h,反应结束后,10000 rpm离心10 min,弃去上清液,用PH为7.2的PBS洗涤沉淀,重复离心洗涤4次,将沉淀洗至中性,于30 ℃烘干,研磨成过100目筛的粉末,即得Ce-MOF-GOx;
(4)将0.5 mg的Ce-MOF-GOx与1 mg的紫杉醇和米托蒽醌分散于3 mL甲醇和水的混合液中,甲醇与水的体积比为1:1,室温、避光条件下2000rpm搅拌24 h,反应结束后,10000 rpm离心10min取沉淀,沉淀用3 mL甲醇与水的体积比为1:1的混合液洗三次,随后用超纯水洗四次,烘干,即得葡萄糖氧化酶修饰的负载紫杉醇和米托蒽醌的Ce-MOF药物组合物。
4.根据权利要求1所述的葡萄糖氧化酶修饰的金属有机框架药物组合物的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)将290mg的对苯二甲酸溶解到10 mL的N,N-二甲基甲酰胺溶剂中,称取940mg的硝酸铈铵溶于10mL的超纯水中成硝酸铈铵水溶液,密封,将对苯二甲酸的N,N-二甲基甲酰胺溶液与硝酸铈铵水溶液混合,于110℃ 油浴下搅拌20min,15000 rpm离心10 min取沉淀,沉淀先用N,N-二甲基甲酰胺洗5次,除去多余的对苯二甲酸,再用丙酮洗5次,除去残留的N,N-二甲基甲酰胺,70℃下烘干24h,研磨成过120目筛的白色粉末,得Ce-MOF;
(2)将步骤(1)所制备的Ce-MOF在氮气保护下煅烧,以6℃/min升温至410℃,煅烧3 h,冷却至20 ℃,得煅烧后碳化的Ce-MOF;
(3)将20mg煅烧后碳化的Ce-MOF溶于15mL的MES中,探头超声使分散均匀,得白色混悬液;另取1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐20mg、N-羟基琥珀酰亚胺15 mg 分别溶于3 mL的MES中,再取葡萄糖氧化酶(GOx)10mg溶于4 mL的MES中,配好溶液;将Ce-MOF溶液、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液、N-羟基琥珀酰亚胺溶液依次加入到100 mL圆底烧瓶中,再加4 mL 的MES,室温搅拌40min,加入葡萄糖氧化酶溶液,再加10mL的MES,室温搅拌反应24 h,反应结束后,15000 rpm离心10 min,弃去上清液,用PH为7.4的PBS洗涤沉淀,重复离心洗涤5次,将沉淀洗至中性,于40 ℃烘干,研磨成过120目筛的粉末,即得Ce-MOF-GOx;
(4)将2 mg的Ce-MOF-GOx与1 mg的多烯紫杉醇和羟基喜树碱分散于5 mL甲醇和水的混合液中,甲醇与水的体积比为1:1,室温、避光条件下2400rpm搅拌24 h,反应结束后,15000rpm离心10min取沉淀,沉淀用5 mL甲醇与水的体积比为1:1的混合液洗三次,随后用超纯水洗四次,烘干,即得葡萄糖氧化酶修饰的负载多烯紫杉醇和羟基喜树碱的Ce-MOF药物组合物。
5.根据权利要求1-4任一项所述的葡萄糖氧化酶修饰的金属有机框架药物组合物的制备方法,其特征在于,所述的Ce-MOF药物组合物的载药量为15%~45%。
6.权利要求1-4任一项所述方法制备的葡萄糖氧化酶修饰的金属有机框架药物组合物与药学活性或药理活性分子相结合在制备抗肿瘤药物中的应用,所述药学活性或药理活性分子为阿霉素、紫杉醇、多烯紫杉醇、羟基喜树碱或米托蒽醌。
7.权利要求1-4任一项所述方法制备的葡萄糖氧化酶修饰的金属有机框架药物组合物在制备抗肿瘤的注射剂、口服剂或植入给药剂中的应用。
8.权利要求1-4任一项所述方法制备的葡萄糖氧化酶修饰的金属有机框架药物组合物在制备化疗、类芬顿催化氧化效应、饥饿疗法的三重打击交互综合治疗药物中的应用。
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