CN110897998B - 一种同时载有疏水性药物和亲水性药物的基因工程多肽纳米水凝胶及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于纳米生物医药技术领域，具体涉及一种同时载有疏水性药物和亲水性药物的基因工程多肽纳米水凝胶及其制备方法。所述纳米水凝胶是由PC10ARGD多肽水凝胶同时负载紫杉醇和盐酸阿霉素制备形成纳米水凝胶颗粒。本发明通过基因重组方法制得PC10ARGD多肽纳米水凝胶，利用PC10ARGD多肽纳米水凝胶同时负载憎水性药物紫杉醇和亲水性药物盐酸阿霉素，负载有紫杉醇和盐酸阿霉素的纳米水凝胶颗粒不仅具有药物缓释作用、靶向作用，而且载药的纳米水凝胶颗粒在肿瘤内滞留时间更长，有利于紫杉醇和盐酸阿霉素发挥协同作用，达到1+1>2的药效，相比于单独给药，紫杉醇和盐酸阿霉素的联合给药可以有效避免耐药性的发生。

Description

一种同时载有疏水性药物和亲水性药物的基因工程多肽纳米 水凝胶及其制备方法
技术领域
本发明属于纳米生物医药技术领域，具体涉及一种同时载有疏水性药物和亲水性药物的基因工程多肽纳米水凝胶及其制备方法。
背景技术
大量研究表明，阿霉素可抑制DNA和RNA的合成，对各种生长周期的的肿瘤细胞都有杀灭作用。PTX(紫杉醇)可以促进微管聚合和稳定已聚合微管，阻断了肿瘤细胞的分裂。但是无论哪一种药物，长期的单一用药都会导致肿瘤产生耐药性。同时，直接注射的药液，由于缺乏靶向性只有很少部分到达肿瘤部位，对其他正常组织和器官带来严重伤害。目前，已有很多研究探索能够作为肿瘤药物的载体，降低肿瘤耐药性和副作用的产生。这些载体包括纳米粒子、纳米胶束、纳米水凝胶等。
在各种药物载体中，纳米水凝胶是一种理想的药物载体。水凝胶由于其丰富的含水量，高度的生物安全性，优异的组织亲和力，以及可被生物降解的性质，使得水凝胶成为一种理想的药物运输载体。
对于双药联合的靶向药物载体，其疏水空间、亲水性区域以及特异的肿瘤靶向性尤其重要。由于人体内血液环境要求，药物必须溶于水，才能在血液中循环到达肿瘤部位。而许多憎水性药物不能直接溶水，这就要求药物载体需要同时具备疏水空间和亲水区域。靶向性则使得纳米粒子能够特异识别肿瘤细胞，定向给药，减少对其他正常组织细胞的损害。
因此，设计一种能载疏水性药物和亲水性药物，并且具有特异肿瘤靶向性的纳米水凝胶是一次十分有意义的探索。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，目的在于提供一种同时载有疏水性药物和亲水性药物的基因工程多肽纳米水凝胶及其制备方法。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
一种同时载有疏水性药物和亲水性药物的基因工程多肽纳米水凝胶，是由PC10ARGD多肽水凝胶同时负载紫杉醇和盐酸阿霉素制备形成纳米水凝胶颗粒，所述紫杉醇的载药量为50μg～100μg PTX/1mg PC10ARGD多肽，所述盐酸阿霉素的载药量为100μg～150μg DOX/1mg PC10ARGD。
上述方案中，所述纳米水凝胶颗粒的粒径大小为50～250nm。
一种同时载有疏水性药物和亲水性药物的基因工程多肽纳米水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
(1)构建含有目的基因PC10ARGD多肽片段的工程态大肠杆菌，表达出目的基因多肽，纯化、冻干得到PC10ARGD多肽；
(2)称取一定质量的PC10ARGD多肽，加入水溶液，煮沸5～10分钟，使其变性；再调解溶液pH值至多肽完全溶解，PC10ARGD多肽自组装形成纳米水凝胶溶液；
(3)称取一定质量的憎水性药物紫杉醇颗粒和亲水性药物盐酸阿霉素颗粒，将它们分别溶于有机挥发性溶剂和水溶液中；然后，同时滴加到纳米水凝胶溶液中，超声处理一段时间，得到同时包覆疏水性药物颗粒和亲水性药物颗粒的纳米水凝胶，离心除去过量的紫杉醇，超滤管离心除去过量的盐酸阿霉素，即得到同时载有疏水性药物颗粒和亲水性药物颗粒的纳米水凝胶。
上述方案中，所述纳米水凝胶溶液中PC10ARGD多肽的浓度为0.5mg～3mg PC10ARGD多肽/1mL超纯水。
上述方案中，所述纳米水凝胶中PC10ARGD多肽、紫杉醇、盐酸阿霉素的质量比为100:5～10:10～15。
上述方案中，所述pH为7～8。
上述方案中，所述有机挥发性溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、或甲苯。
上述方案中，所述超声处理的超声频率为40kHZ～80kHZ，超声时间为1～3h。
上述方案中，所述紫杉醇的包封率达到70％～90％，所述盐酸阿霉素的包封率达到80％～90％。
本发明的有益效果如下：
(1)本发明通过基因重组方法制得PC10ARGD多肽纳米水凝胶，利用PC10ARGD多肽纳米水凝胶同时负载憎水性药物紫杉醇和亲水性药物盐酸阿霉素，疏水性药物进入憎水空腔，亲水性药物靠电子作用力与纳米水凝胶结合，有效解决了疏水性药物不溶于水导致难给药的问题，实现了紫杉醇和盐酸阿霉素联合用药。
(2)本发明通过控制PC10ARGD多肽纳米水凝胶的质量浓度、调节纳米水凝胶颗粒的大小、优化工艺参数，提高了PC10ARGD多肽纳米水凝胶对紫杉醇和盐酸阿霉素负载率和包封率。
(3)本发明所述负载有紫杉醇和盐酸阿霉素的纳米水凝胶颗粒不仅具有药物缓释作用、靶向作用，而且载药的纳米水凝胶颗粒在肿瘤内滞留时间更长，有利于紫杉醇和盐酸阿霉素发挥协同作用，达到1+1>2的药效，相比于单独给药，紫杉醇和盐酸阿霉素的联合给药可以有效避免耐药性的发生。
附图说明
图1为生物安全性MTT图。
图2为载两种药物的纳米水凝胶与Hela细胞共孵育图。
图3为载两种药物的纳米水凝胶的药物缓慢释放图。
图4为载两种药物的纳米水凝胶的对荷载Hela肿瘤的Balb/c小鼠治疗效果。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
实施例1
PC10ARGD的制备：用限制性内切酶BamHI、NheI和SpeI切取含有目的基因片段PC10A和RGD片段，再用T4 DNA连接酶重组目的基因片段，得到PC10ARGD片段，导入大肠杆菌进行表达，然后用脲素变性裂解，离心获取蛋白，并用镍柱纯化蛋白，透析冻干，获取海绵状蛋白。
对PC10ARGD的生物安全性进行验证：分别称量不同重量的PC10ARGD多肽，溶于1毫细胞培养液DMEM，调节溶液pH至7～8，即得到含有不同浓度纳米水凝胶的细胞培养液。用该水凝胶在不同浓度下孵育Hela 24小时之后，用MTT法考察细胞存活率，结果如图1所示：细胞仍然保持80％以上的存活率，表明该水凝胶对生物体安全无毒。
PC10ARGD/PTX/DOX·HCL纳米水凝胶的制备：称量1毫克冻干的PC10ARGD多肽，溶于1毫升超纯水，煮沸5～10分钟，使其变性，再调解溶液pH值至7～8使多肽完全溶解，PC10ARGD多肽自组装形成纳米水凝胶溶液；称取100μg憎水性药物PTX溶于50μL二氯甲烷，称取120μg亲水性DOX·HCL溶于100μL水，同时把两种药物滴加到0.1％的纳米水凝胶溶液中，超声处理(频率40KHZ)2小时，得到均一透明的液体，离心除去过量的紫杉醇，再用超滤管滤掉多余的紫杉醇，即得到同时包覆两种药物的纳米水凝胶。通过包封率＝装载药物质量/投入药物质量计算，得到所述紫杉醇的包封率为0.7，所述盐酸阿霉素的包封率为0.83，最终PC10ARGD/PTX/DOX·HCL纳米水凝胶中PC10ARGD多肽、紫杉醇、盐酸阿霉素的质量比100:7:10。
实施例2
PC10ARGD/PTX/DOX·HCL纳米水凝胶的应用：将PC10ARGD多肽、DOX、PC10ARGD多肽/DOX、PC10ARGD多肽/PTX/DOX·HCL溶解在DMMEM细胞培养液中，与hela细胞共孵育4小时，结果如图2所示：在共聚焦显微镜下可以看到：单独的DOX通过分子扩散进入了细胞质和细胞核，而PC10ARGD多肽/DOX·HCL纳米水凝胶和PC10ARGD多肽/PTX/DOX·HCL纳米水凝胶只进入了细胞质，表明PC10ARGD多肽/DOX·HCL纳米水凝胶和PC10ARGD多肽/PTX/DOX·HCL纳米水凝胶是通过吞噬作用进入了Hela细胞。
实施例3
PC10ARGD/PTX/DOX·HCL纳米水凝胶的药物缓慢释放：将PC10ARGD/PTX/DOX·HCL纳米水凝胶分别置于不同pH(pH 7.4PBS磷酸盐缓冲液，pH 5.0醋酸盐缓冲液)的缓冲液中。通过紫外光谱吸收和高效液相色谱分析，分别检测DOX·HCL和PTX在不同pH缓冲液中的释放行为。由实验结果可以看出，DOX·HCL和PTX在pH 5.0的醋酸盐缓冲液中释放比在中性pH7.4PBS磷酸盐缓冲液快，而肿瘤环境也是偏酸性，这有利于其在酸性肿瘤环境中的释放，并且药物释放时间持续48小时以上，达到明显的缓慢释放效果。
实施例4
PC10ARGD/PTX/DOX·HCL纳米水凝胶对荷载Hela肿瘤的Balb/c小鼠的治疗效果：取35只荷载150～200mm3 Hela肿瘤的Balb/c小鼠，在肿瘤部位分别注射150微升不同溶液进行治疗。由于Hela肿瘤细胞对PC10ARGD/PTX/DOX·HCL纳米水凝胶的良好吞噬和PC10ARGD/PTX/DOX·HCL纳米水凝胶的药物缓释作用。经过24天治疗之后，相比PBS溶液组、对照组以及单独的药物组合组，PC10ARGD/PTX/DOX·HCL纳米水凝胶组小鼠肿瘤体积增长明显得到抑制，表明PC10ARGD/PTX/DOX·HCL纳米水凝胶对Hela肿瘤具有很好的抑制作用，实现了1+1＞2的抑制效果。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种同时载有疏水性药物和亲水性药物的基因工程多肽纳米水凝胶，其特征在于，是由PC10ARGD多肽水凝胶同时负载紫杉醇和盐酸阿霉素制备形成纳米水凝胶颗粒，所述紫杉醇的载药量为50μg~100μg PTX / 1 mg PC10ARGD多肽 ，所述盐酸阿霉素的载药量为100μg ~150μg DOX / 1 mg PC10ARGD；所述纳米水凝胶颗粒的粒径大小为50~250 nm。
2.权利要求1任一所述同时载有疏水性药物和亲水性药物的基因工程多肽纳米水凝胶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）构建含有目的基因PC10ARGD多肽片段的工程态大肠杆菌，表达出目的基因多肽，纯化、冻干得到PC10ARGD多肽；
（2）称取一定质量的PC10ARGD多肽，加入水溶液，煮沸5~10分钟，使其变性；再调解溶液pH值至多肽完全溶解，PC10ARGD多肽自组装形成纳米水凝胶溶液；
（3）称取一定质量的憎水性药物紫杉醇颗粒和亲水性药物盐酸阿霉素颗粒，将它们分别溶于有机挥发性溶剂和水溶液中；然后，同时滴加到纳米水凝胶溶液中，超声处理一段时间，得到同时包覆疏水性药物颗粒和亲水性药物颗粒的纳米水凝胶，离心除去过量的紫杉醇，超滤管离心除去过量的盐酸阿霉素，即得到同时载有疏水性药物颗粒和亲水性药物颗粒的纳米水凝胶。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述纳米水凝胶溶液中PC10ARGD多肽的浓度为0.5mg~3mg PC10ARGD多肽/ 1 mL超纯水。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述纳米水凝胶中PC10ARGD多肽、紫杉醇、盐酸阿霉素的质量比为100:5~10:10~15。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述pH为7~8。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述有机挥发性溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、或甲苯。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述超声处理的超声频率为40 kHZ~80 kHZ，超声时间为1~3h。
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