CN114869858B

CN114869858B - 同源性癌细胞膜包被的核酸-化疗药物复合物纳米粒子

Info

Publication number: CN114869858B
Application number: CN202210343708.1A
Authority: CN
Inventors: 颜德岳; 朱利娟; 陈天保; 徐杰; 黄卫
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2022-04-02
Filing date: 2022-04-02
Publication date: 2023-05-26
Anticipated expiration: 2042-04-02
Also published as: CN114869858A

Abstract

本发明涉及纳米医药技术领域，特别地涉及寡核苷酸药物(反义核苷酸：ASO；小干扰核酸：siRNA)和化疗药物共组装的纳米粒子制备技术、同源性癌细胞膜包被及其在主动靶向肿瘤联合治疗和逆转肿瘤耐药性方面应用。本发明涉及的同源癌细胞膜包被的寡核苷酸和化疗药物共输送纳米药物体系是由寡核苷酸‑化疗药物复合物纳米粒子作为内核和同源性癌细胞膜作为外壳构成。与现有技术相比，该方法制备过程简单，且本发明采用正电性的化疗药物负载ASO或siRNA，既避免外源性载体带来的生物安全性问题，又减少化疗药物的毒副作用。

Description

同源性癌细胞膜包被的核酸-化疗药物复合物纳米粒子

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种同源性癌细胞膜包被的核酸-化疗药物复合物纳米粒子，特别地涉及用于肿瘤靶向联合治疗及逆转肿瘤耐药性的无载体核酸-化疗药物复合物纳米粒子的制备方法以及该纳米粒子的同源性癌细胞膜包被的方法。

背景技术

恶性肿瘤是目前影响人类生存和健康的最主要疾病之一，由于肿瘤发生发展、迁移及耐药机制的复杂性，单一的化学药物治疗(化疗)或寡核苷酸治疗均存在较多缺陷，难以满足治疗的需求。近年来，化学治疗与寡核苷酸治疗联合治疗可以降低给药剂量及药物的毒副作用，增强抗肿瘤效果，成为研究热点(Adv.Drug Deliver.Rev.2016,98,3-18；Adv.Drug Deliver.Rev.2016,98,41-63)。然而，一般化疗药物由于水溶性差、无靶向性及耐药性等问题；寡核苷酸药物则存在入胞难、肾清除率高及易被核酸酶降解等问题，制约其临床应用(Chem.Rev.2015,115,11043-11078)。

因此，如何突破生理屏障(Acc.Chem.Res.2019,52,1750-1762)，解决抗癌药物及核酸的实体瘤靶向富集，降低药物的毒副作用，实现联合治疗，逆转肿瘤耐药性，是临床亟需解决的问题。随着纳米科技的发展，在过去的几十年里，智能响应性药物输送体系的研究报道层出不穷，如有机-无机纳米粒子、胶束、囊泡、脂质体、介孔无机材料(Biomater.Sci.,2015,3,1035-1049；Angew.Chem.Int.Ed.2019,58,8804-8808)等载体共负载核酸和化疗药物，用于肿瘤的联合治疗。通过共输送的策略，可以增强化疗药物在肿瘤部位富集，减少化疗药物的剂量及毒副作用，提高核酸在体内运输过程中的稳定性，并提高抗肿瘤效果，达到协同治疗的目的。然而，由于小分子化疗药物与大分子核酸存在显著的理化性质差异，同时，外源性载体的引入，在代谢过程中容易引起器官毒性和炎症，如何构建有效的精准共递送体系成为两者联合应用的重要挑战之一，也是制约其临床应用的关键因素之一。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用同源癌细胞膜包膜的方法包裹核酸-化疗药物复合物纳米粒子，尤其是一种利用静电复合的方法无载体化制备核酸和化疗药物复合物纳米粒子，并通过调控复合物纳米粒子的尺寸和分散度的方法，提高核酸和化疗药物的递送效率，增强联合治疗效果，实现核酸和化疗药物的肿瘤靶向治疗。

本发明的目的之二在于提供一种基于同源性癌细胞膜包被的核酸-化疗药物复合物纳米粒子的制备方法，以解决现有技术中核酸与化疗药物共输送中的外源性载体带来的生物毒性及缺乏肿瘤病灶部位的靶向富集性的问题。

本发明的第三个目的是提供一种基于癌细胞膜包裹的核酸-化疗药物的复合物纳米粒子在肿瘤联合治疗及逆转肿瘤耐药性方面的用途。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种同源性癌细胞膜包被的核酸-化疗药物复合物纳米粒子，包括内核和外壳，所述内核为核酸-化疗药物构建的复合物纳米粒子，所述外壳由同源性癌细胞膜组成，其中，所述内核是由带负电荷的寡核苷酸和具有共轭刚性结构并带正电荷的化疗药物通过静电相互作用组装而成。

所述化疗药物包括阿霉素(DOX)、米托蒽醌(Mito)、阿美蒽醌、匹杉琼、拓扑替康、埃克替尼、阿贝西利、来那替尼、阿法替尼中的一种或多种。

所述寡核苷酸包括siRNA、ASO。

所述的寡核苷酸酸是长度为19-25个碱基对的siRNA或长度为30个碱基以内的ASO。

所述的ASO包括如下序列中的一种：

所述siRNA包括如下序列中的一种：

所述的癌细胞膜来源于人源性癌细胞，所述人源性癌细胞包括胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肾癌、肺癌、肝癌、宫颈癌或结直肠癌。

本发明还提供一种如上所述的同源性癌细胞膜包被的核酸-化疗药物复合物纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：

步骤1、制备复合药物纳米粒子内核：将寡核苷酸药物制备成寡核苷酸药物溶液，将化疗药物制备成化疗药物溶液；将寡核苷酸药物溶液滴加到化疗药物溶液中，制备得到核酸-化疗药物复合物纳米粒子；

步骤2、提取癌细胞膜：癌细胞通过胰酶消化，加入带有血清的培养基中离心，PBS重悬洗涤离心；加入蛋白酶抑制剂裂解；上清液在细胞破碎仪上超声至澄清为止，再离心弃沉淀，上清液进一步高速离心后弃上清，PBS重悬，收集的沉淀即为癌细胞膜；

步骤3、将步骤2制备的癌细胞膜与步骤1制备的核酸-化疗药物复合物纳米粒子混合溶于水中，涡旋处理，通过过滤膜反复挤压，制得同源性癌细胞膜包被的核酸-化疗药物复合物纳米粒子。

所述的同源性癌细胞膜包被的核酸-化疗药物复合物纳米粒子在制备抗肿瘤药物中的用途也属于本发明的保护范围

所述的同源性癌细胞膜包被的核酸-化疗药物复合物纳米粒子在制备化疗联合免疫治疗抗肿瘤药物中的应用也属于本发明的保护范围。

所述的同源性癌细胞膜包被的核酸-化疗药物复合物纳米粒子在逆转肿瘤耐药性中的应用也属于本发明的保护范围。

所述核酸-化疗药物复合物纳米粒子的粒径小于200nm。

所述癌细胞膜为同源性癌细胞膜，可以提供复合物纳米粒子同源归巢靶向功能。

上述的基于同源癌细胞膜包被的核酸-化疗药物复合物纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：

本发明所制备的基于同源癌细胞膜包被的核酸-化疗药物复合物纳米粒子具有化疗与基因治疗双重治疗作用，可以实现肿瘤联合治疗及逆转肿瘤耐药性，外壳的同源性癌细胞膜，具有良好的肿瘤归巢靶向性能，实现肿瘤的靶向富集。

本发明利用正电性的药物分子负载寡核苷酸构建核酸-化疗药物复合物纳米粒子，为提高纳米粒子的稳定性及靶向性，利用内源性的同源癌细胞膜包裹复合物纳米粒子，实现其在肿瘤的靶向核酸和化疗药物联合治疗及逆转肿瘤耐药性领域的应用。

本发明涉及纳米医药技术领域，特别地涉及寡核苷酸药物(反义核苷酸：ASO；小干扰核酸：siRNA)和化疗药物共组装的纳米粒子制备技术、同源性癌细胞膜包被及其在主动靶向肿瘤联合治疗和逆转肿瘤耐药性方面应用。本发明涉及的同源癌细胞膜包被的寡核苷酸和化疗药物共输送纳米药物体系是由寡核苷酸-化疗药物复合物纳米粒子作为内核和同源性癌细胞膜作为外壳构成。与现有技术相比，该方法制备过程简单，且本发明采用正电性的化疗药物负载ASO或siRNA，既避免外源性载体带来的生物安全性问题，又减少化疗药物的毒副作用。同源性癌细胞膜可以提高纳米粒子的稳定性及肿瘤靶向性，在肿瘤的靶向联合治疗及逆转肿瘤耐药性领域具有重要的临床应用前景。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明提供了一种ASO/siRNA和化疗药物共输送的新方法，从而实现无载体化的ASO/siRNA和化疗药物的有效运输，既可以提高ASO/siRNA的稳定性，避免ASO/siRNA被体内的酶降解，又可以增加化疗药物的水溶性，降低其毒副作用。

(2)利用负电性的ASO/siRNA和正电性的化疗药物静电相互作用制备复合物纳米粒子，大大减少了化疗药物的毒副作用及外源性载体带来的生物毒性问题。

(3)本发明采用同源癌细胞膜对纳米粒子进行包裹，可以提高对目标癌细胞的靶向性。

(4)制备过程简单，可以通过改变核酸和化疗药物分子的组合，实现不同的大分子核酸和不同的小分子化疗药物的共输送，达到联合治疗和逆转肿瘤耐药的目的。

(5)分别采用各种不同癌细胞膜对纳米粒子进行包裹，可以分别实现对相应同源癌细胞的归巢作用，进行靶向治疗。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1核酸-化疗药物复合物纳米粒子包膜前(A)及包膜后(B)的TEM照片和(C)包膜前后的DLS数据。

图2同源癌细胞膜包被的核酸-化疗药物复合物纳米粒子细胞靶向内摄图。

图3同源癌细胞膜包被的核酸-化疗药物复合物纳米粒子对耐药乳腺癌细胞的抗肿瘤效果评估。

图4同源癌细胞膜包被的核酸-化疗药物复合物纳米粒子活体成像图。

图5荷瘤小鼠尾静脉注射同源癌细胞膜包被的核酸-化疗药物复合物纳米粒子后肿瘤体积大小变化、抑瘤率、老鼠体重变化、肿瘤部位相关耐药基因和蛋白表达情况。其中1-6分别为1.未给药组(PBS)；2.游离药物组(Mito)；3.未包膜的核酸-化疗药物复合物纳米粒子组(NP[Bcl-2&Mito])；4.癌细胞膜包被的无序核酸-化疗药物复合物纳米粒子组(NP[Bcl-2scr&Mito]@CCM)；5.红细胞膜包被的核酸-化疗药物复合物纳米粒子组；(NP[Bcl-2&Mito]@RBCM)6.同源癌细胞膜包被的核酸-化疗药物复合物纳米粒子组(NP[Bcl-2&Mito]@CCM)。

图6为本发明同源癌细胞膜包被的核酸-化疗药物复合物纳米粒子制备方法的流程图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。

如图1所示，本发明提供一种同源性癌细胞膜包被的核酸-化疗药物复合物纳米粒子，由药物复合物纳米粒子作为内核和癌细胞膜作为外壳构成，其中，纳米粒子内核是由带负电荷的寡核苷酸和具有共轭刚性结构并带正电荷的化疗药物通过静电相互作用组装而成，外壳是由同源性癌细胞膜组成。

下述实施例中，各物质来源如下：

米托蒽醌(Mito)：上海麦克林生化科技有限公司

涉及的ASO和siRNA：生工生物工程(上海)有限公司

阿霉素(DOX)：毕得医药

匹杉琼：毕得医药

来那替尼：毕得医药

阿贝西利：上海麦克林生化科技有限公司

阿法替尼：毕得医药涉及的细胞：中科院上海细胞库

实施例1

所述一种基于同源癌细胞膜包被的核酸-化疗药物复合物纳米粒子及其制备方法，包括以下步骤：

1、复合物纳米粒子内核的制备

1.1米托蒽醌Mito与抗凋亡ASO(Bcl-2)复合物纳米粒子的制备(NP[Bcl-2&Mito])

步骤1，将100μL的米托蒽醌Mito(250g/mL)充分溶于400μL水中，制备成Mito溶液；

步骤2，将40μL的抗凋亡ASO(Bcl-2)(100μM)充分溶解于460μL的水中，制备成Bcl-2溶液；我看后面上面的好像没有用他。

其中，抗凋亡ASO(Bcl-2)的具体序列是：5’-TTT TCT CCC AGC GTG CGC CAT-3’(SEQ ID NO:2)

步骤3，将Bcl-2溶液缓慢滴加到Mito溶液中，涡旋2-3分钟，静置过夜，得到复合药物纳米粒子内核(NP[Bcl-2&Mito])。

1.2匹杉琼Pix与抗KRAS的ASO复合物纳米粒子的制备(NP[KRAS&Pix])

步骤1，将匹杉琼Pix充分溶于双蒸水中配置成100μM的匹杉琼Pix溶液；

步骤2，将抗KRAS的ASO溶于双蒸水中配置成10μM的溶液；

其中，抗KRAS的ASO的具体序列是：5’-CUA CGC CAU CAG CUC CAA C-3’(SEQ IDNO:26)

步骤3，将ASO(KRAS)的溶液缓慢滴加到等体积的Pix溶液中，涡旋2-3分钟，静置过夜，得到复合药物纳米粒子内核(NP[KRAS&Pix])。

1.3阿西贝利Abe与抗Her2的ASO复合物纳米粒子的制备(NP[Her2&Abe])

步骤1，将阿西贝利Abe充分溶于双蒸水中配置成100μM的阿西贝利Abe溶液；

步骤2，将抗Her2的ASO溶于双蒸水中配置成10μM的溶液；

其中，抗Her2的ASO的具体序列是：5’-CTC CAT GGT GCT CAC-3’(SEQ ID NO:1)

步骤3，将ASO(Her2)的溶液缓慢滴加到等体积的Pix溶液中，涡旋2-3分钟，静置过夜，得到复合药物纳米粒子内核(NP[Her2&Abe])。

1.4米托蒽醌Mito与Bcl-2scr复合物纳米粒子的制备(NP[Bcl-2Scr&Mito])

步骤2，将40μL的Bcl-2scr(100μM)充分溶解于460μL的水中，制备成Bcl-2scr溶液；

其中，Bcl-2scr的具体序列是：5’-TTT TCT CCC CGC GTG AGC CAT-3’(SEQ IDNO:28)

步骤3，将Bcl-2scr溶液缓慢滴加到Mito溶液中，涡旋2-3分钟，静置过夜，得到复合药物纳米粒子内核(NP[Bcl-2scr&Mito])。

本步骤制备得到的为无序核酸-化疗药物复合物纳米粒子，作为对照无效寡核酸组。

1.5阿霉素DOX与siRNA复合物纳米粒子的制备(NP[siPgp&DOX])

步骤1，将阿霉素DOX充分溶于1×TAE/Mg²⁺缓冲中配置成200μM的阿霉素DOX溶液；

步骤2，将抗P-糖蛋白siRNA(siPgp)溶于1×TAE/Mg²⁺缓冲液中配置成10μM的溶液；

其中，抗P-糖蛋白siRNA(siPgp)的具体序列是：5’-UAC ACU GAC AGU UGG UUU CTT-3’(SEQ ID NO:23)

步骤3，将siPgp的溶液缓慢滴加到等体积的DOX溶液中，涡旋2-3分钟，静置过夜，得到复合药物纳米粒子内核(NP[siPgp&DOX])。

1.6来那替尼NRT与siRNA复合物纳米粒子的制备(NP[siPlk1&NRT])

步骤1，将来那替尼NRT充分溶于1×TAE/Mg²⁺缓冲中配置成100μM的来那替尼NRT溶液；

步骤2，将抗Plk1的siRNA(siPlk1)溶于1×TAE/Mg²⁺缓冲液中配置成10μM的溶液；

其中，抗Plk1的siRNA(siPlk1)的具体序列是：5’-UAA GGA GGG UGA UCU UCU UCATT-3’(SEQ ID NO:25)

步骤3，将siPlk1的溶液缓慢滴加到等体积的NRT溶液中，涡旋2-3分钟，静置过夜，得到复合药物纳米粒子内核(NP[siPlk1&NRT])。

1.7阿法替尼Afa与siRNA复合物纳米粒子的制备(NP[siPDL1&Afa])

步骤1，将阿法替尼Afa充分溶于1×TAE/Mg²⁺缓冲中配置成100μM的阿法替尼Afa溶液；

步骤2，将抗PD-L1的siRNA(siPDL1)溶于1×TAE/Mg²⁺缓冲液中配置成10μM的溶液；

其中，抗PD-L1的siRNA(siPDL1)的具体序列是：5’-AAU GCG UUC AGC AAA UGCCAG UAG G-3’(SEQ ID NO:27)

步骤3，将siPDL1的溶液缓慢滴加到等体积的Afa溶液中，涡旋2-3分钟，静置过夜，得到复合药物纳米粒子内核(NP[siPDL1&Afa])。

2、癌细胞膜提取

1)癌细胞培养：癌细胞于含10％胎牛血清的DMEM培养基中并置于细胞培养箱中(5％CO₂，37℃)培养，待细胞长满后传代。

2)培养的癌细胞加入2mL胰酶消化待细胞变圆后，加入带有血清的培养基中和吹打并收集细胞；离心机离心后(800rpm，5min)，PBS洗涤重悬，加入蛋白酶抑制剂，4℃冰箱裂解30分钟。上清液在细胞破碎仪上超声2-3分钟至低渗液澄清为止，再离心，弃沉淀，上清液进一步高速离心，弃上清，PBS重悬，收集的沉淀即为癌细胞膜，-20℃保存。

3、同源癌细胞膜包被的核酸-化疗药物复合物纳米粒子的制备

将步骤2得到的癌细胞膜分别与步骤1.1-1.6制得的各复合物纳米离子NP[Bcl-2&Mito]、NP[KRAS&Pix]、NP[Her2&Abe]、NP[siPgp&DOX]、NP[siPlk1&NRT]、NP[siPDL1&Afa](NP[ASO&drug]、NP[siRNA&drug])混合溶于水中，涡旋2-3分钟，依次通过0.8μm、0.4μm及0.2μm的过滤膜反复挤压，分别制得癌细胞膜包被的核酸-化疗药物复合物纳米粒子NP[Bcl-2&Mito]@CMM、NP[KRAS&Pix]@CMM、NP[Her2&Abe]@CMM、NP[siPgp&DOX]@CMM、NP[siPlk1&NRT]@CMM、NP[siPDL1&Afa]@CMM)。所述癌细胞膜包被的核酸-化疗药物复合物纳米粒子的结构为，由药物复合物纳米粒子作为内核和癌细胞膜作为外壳构成，其中，纳米粒子内核是由带负电荷的寡核苷酸和具有共轭刚性结构并带正电荷的化疗药物通过静电相互作用组装而成，外壳是由同源性癌细胞膜组成。

NP[Bcl-2&Mito]@CMM纳米粒子的形貌表征如图1所示，TEM和DLS结果表明上述方法制得的NP[Bcl-2&Mito]@CMM纳米粒子具有规整的球形结构，平均粒径为150～200nm。

对照例1

对照例1提供一种红细胞膜包被的核酸-化疗药物复合物纳米粒子及其制备方法，包括以下步骤：

1、红细胞膜提取：

将小鼠红细胞在4℃，3500rpm转速下离心5分钟取沉淀。加入0.25×PBS，混匀，在4℃冰箱放置2小时低渗，使红细胞膜破裂释放出血红蛋白。再将其在4℃，8000rpm转速下离心10分钟取沉淀弃上清。重复该操作2次，获得红细胞膜。

2红细胞膜包被的核酸-化疗药物复合物纳米粒子的制备

将步骤1的红细胞膜与实施例1的1.1制得的NP[Bcl-2&Mito]混合溶于水中，涡旋2-3分钟，依次通过0.8μm、0.4μm及0.2μm的过滤膜反复挤压，制得红细胞膜包被的核酸-化疗药物复合物纳米粒子(NP[Bcl-2&Mito]@RBCM)。

性能测试例1

NP[Bcl-2&Mito]@CMM纳米粒子的癌细胞靶向内吞

将MCF-7/ADR细胞以每孔5×10⁴个的数量铺在24孔板上。过夜后，分别加入实施例1的步骤1.1制备的NP[Bcl-2&Mito]、实施例1步骤3制备的NP[Bcl-2&Mito]@CCM、及对照例1制备的NP[Bcl-2&Mito]@CCM。孵育2小时后吸出所有培养基后，加入100-200μL胰酶消化，300μL血清终止消化，离心，弃上清，无菌PBS洗涤两次后重悬，上机检测。

该实验结果表明NP[Bcl-2&Mito]@CCM具有较好的进MCF-7/ADR细胞的效果，验证了同源癌细胞膜的归巢靶向性(如图2所示)。

性能测试例2

NP[Bcl-2&Mito]@CCM对MCF-7/ADR细胞的毒性

将MCF-7/ADR细胞按照每孔细胞密度为5×10³个接种到96孔板中，孵育过夜后分别加入(0.1625μg/mL、0.325μg/mL、0.75μg/mL、1.5g/mL、3μg/mL、6μg/mL、12μg/mL、24μg/mL)的Mito及相应浓度梯度的实施例1的步骤1.1制备的NP[Bcl-2&Mito]、实施例1步骤3制备的NP[Bcl-2&Mito]@CCM、及对照例1制备的NP[Bcl-2&Mito]@CCM孵育48小时后，加入20μL的MTT继续孵育4小时，弃掉96孔板中的溶液，并加入200μL的DMSO，震荡均匀后，用酶标仪测定其在490nm处的吸光度。

MTT实验结果表明相比于Mito、NP[Bcl-2&Mito]及NP[Bcl-2&Mito]@RBCM组；所述的NP[Bcl-2&Mito]@CCM对MCF-7/ADR细胞具有更优异的抗肿瘤活性(如图3所示)。

性能测试例3

NP[Bcl-2&Mito]@CCM的体内分布及肿瘤富集

本测试例采用Cy5.5作为荧光探针分子，将Cy5.5-DSPE-PEG和癌细胞膜混匀，加入实施例1制备好的NP[Bcl-2&Mito]溶液中，依次通过0.8μm、0.4μm及0.2μm的过滤膜反复挤压，制得荧光标记的癌细胞膜包被的核酸-化疗药物复合物纳米粒子。建立荷瘤MCF-7/ADR皮下瘤小鼠，待肿瘤体积长到约300mm³，以游离Cy5.5代替Mito，将Cy5.5，标记Cy5.5的NP[Bcl-2&Mito]@RBCM及NP[Bcl-2&Mito]@CCM以Cy5.5为100μg/kg的剂量通过尾静脉注射到小鼠体内，分别在1小时、2小时、4小时、8小时和24小时进行活体荧光成像(如图4所示)。

成像结果表明注射NP[Bcl-2&Mito]@CCM小鼠的肿瘤部位荧光强度明显增强，证实了同源癌细胞膜归巢靶向作用，能够实现肿瘤部位靶向富集的目的。

性能测试例4

NP[Bcl-2&Mito]@CCM的裸鼠体内药效学评价

建立荷瘤MCF-7/ADR皮下瘤小鼠并随机分成6组，每组3只，第一组：未给药组(PBS)；第二组：游离药物组(Mito)；第三组：未包膜的核酸-化疗药物复合物纳米粒子组(NP[Bcl-2&Mito])；第四组：癌细胞膜包被的无序核酸-化疗药物复合物纳米粒子组(NP[Bcl-2scr&Mito]@CCM)；第五组：红细胞膜包被的核酸-化疗药物复合物纳米粒子组；(NP[Bcl-2&Mito]@RBCM)；第六组：同源癌细胞膜包被的核酸-化疗药物复合物纳米粒子组(NP[Bcl-2&Mito]@CCM)。待肿瘤长到约50mm³大小后，通过尾静脉给药，频率为每三天一次，每组Mito给药剂量为：2mg/kg。每次给药之后测量不同组肿瘤的长和宽，并称量裸鼠的体重。给药6次后处死老鼠并解剖取出肿瘤。肿瘤体积、肿瘤抑制率按以下公式1，2计算：

(1)肿瘤体积(mm³)＝1/2×长(mm)×宽(mm)×宽(mm)

(2)肿瘤抑制率(TIR，％)＝(对照组平均肿瘤重量-实验组平均肿瘤重量)/对照组平均肿瘤重量×100％

实验结果来看，相比于NP[Bcl-2&Mito]@RBCM组，NP[Bcl-2&Mito]@CCM具有更优异的肿瘤抑制率。通过肿瘤部位的Bcl-2基因及蛋白质印迹实验发现NP[Bcl-2&Mito]@CCM可以有效抑制抗凋亡基因Bcl-2的mRNA及蛋白表达(如图5所示)。从小鼠体重变化曲线来看，治疗过程中NP[Bcl-2&Mito]@CCM给药组的小鼠的体重没有变化而游离Mito组老鼠体重明显下降，说明NP[Bcl-2&Mito]@CCM明显降低了化疗药物的毒副作用。

本发明化疗药物包括但不限于阿霉素(DOX)、米托蒽醌(Mito)、阿美蒽醌、匹杉琼、拓扑替康、埃克替尼、阿贝西利、来那替尼、阿法替尼等。

本发明利用透射电子显微镜(TEM)、动态光散射(DLS)研究siRNA/ASO-化疗药物纳米粒子复合物和膜包被的siRNA/ASO-化疗药物复合物纳米粒子的形貌、尺寸和稳定性。利用流式细胞仪研究癌细胞膜包被的siRNA/ASO-化疗药物纳米粒子复合物进同源细胞的情况，利用MTT法研究同源癌细胞膜包被的siRNA/ASO-化疗药物复合物纳米粒子对耐药癌细胞的抑制效果。研究癌细胞膜包被的siRNA/ASO-化疗药物复合物纳米粒子在活体小动物的同源肿瘤富集和生物体代谢。利用MCF-7/ADR裸鼠皮下瘤模型研究同源癌细胞膜包被的siRNA/ASO-化疗药物复合物纳米粒子的逆转肿瘤耐药性和抗肿瘤效果。

以上结合附图对本发明做了示例性的描述，其描述较为详细，但本发明并不局限于上述实施方式。对于所属领域的技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施例来举例说明。而由此方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 上海交通大学

<120> 一种同源癌细胞膜包被的核酸-化疗药物复合物纳米粒子的制备及应用

<130> KAG48489

<160> 28

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctccatggtg ctcac 15

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttttctccca gcgtgcgcca t 21

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cagcgtgcgc catccttccc 20

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tctcccagcg tgcgccat 18

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aaggcatccc agcctccgtt cctcctccta 30

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ttcaagatcc atcccgacct cgcg 24

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tcctccattg cggtccct 18

<210> 8

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gctattagga gtcttt 16

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tttcttttcc tccagagccc g 21

<210> 10

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cggagggtcg atcgctg 17

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ctcggctgac attccggcaa 20

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atcgaggcaa gagccacctg a 21

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ccccagcagc tcccattggg 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

cgcccggagc actgctgggc 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gaggcgttct cctttctcca 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

tgtcggcccc acaggctcgg 20

<210> 17

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

agcctgtcac ttctc 15

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

ccctgctccc ccctggctcc 20

<210> 19

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

cggctcctcc atggcagt 18

<210> 20

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

ggctgccatg gtccc 15

<210> 21

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

tagcttgatg tgagg 15

<210> 22

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

acatttagaa gccag 15

<210> 23

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

uacacugaca guugguuuct t 21

<210> 24

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

cagcuuauaa uggauguact t 21

<210> 25

<211> 23

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

uaaggagggu gaucuucuuc att 23

<210> 26

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

cuacgccauc agcuccaac 19

<210> 27

<211> 25

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

aaugcguuca gcaaaugcca guagg 25

<210> 28

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

ttttctcccc gcgtgagcca t 21

Claims

1.一种同源性癌细胞膜包被的核酸-化疗药物复合物纳米粒子，其特征在于，所述同源性癌细胞膜包被的核酸-化疗药物复合物纳米粒子包括内核和外壳，所述内核为核酸-化疗药物构建的复合物纳米粒子，所述外壳由同源性癌细胞膜组成，其中，所述内核是由带负电荷的寡核苷酸和具有共轭刚性结构并带正电荷的化疗药物通过静电相互作用组装而成；

所述化疗药物米托蒽醌(Mito)；

所述寡核苷酸是ASO；所述ASO的序列为Bcl-2antisense：SEQ ID NO:2。

2.根据权利要求1所述的同源性癌细胞膜包被的核酸-化疗药物复合物纳米粒子，其特征在于，所述的寡核苷酸是长度为30个碱基以内的ASO。

3.根据权利要求1所述的同源性癌细胞膜包被的核酸-化疗药物复合物纳米粒子，其特征在于，所述的癌细胞膜来源于人源性癌细胞，所述人源性癌细胞包括胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肾癌、肺癌、肝癌、宫颈癌或结直肠癌。

4.一种如权利要求1或2所述的同源性癌细胞膜包被的核酸-化疗药物复合物纳米粒子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

5.一种如权利要求1或2所述的同源性癌细胞膜包被的核酸-化疗药物复合物纳米粒子在制备抗肿瘤药物中的用途。

6.一种如权利要求1或2所述的同源性癌细胞膜包被的核酸-化疗药物复合物纳米粒子在制备化疗联合免疫治疗抗肿瘤药物中的应用。

7.一种如权利要求1或2所述的同源性癌细胞膜包被的核酸-化疗药物复合物纳米粒子在制备逆转肿瘤耐药性药物中的应用。