CN115920070A - 多重细胞膜介导的仿生纳米/基因递送平台及其制备方法和靶向结肠癌的制药应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了多重细胞膜介导的仿生纳米/基因递送平台及其制备方法和靶向结肠癌的制药应用，属于生物医药技术领域。通过将氧化锌纳米粒与miR21拮抗剂在体外自组装制备NPs纳米复合物，再将NPs纳米复合物与结肠癌细胞膜和巨噬细胞膜进行组装，构建双膜伪装的仿生纳米/基因递送平台M@NPs。该递送平台无需病毒载体的介导，即可用于基因药物的活体递送，基于肿瘤细胞膜介导的同源靶向性原理和巨噬细胞膜介导的免疫逃逸原理，实现对纳米/基因药物的靶向递送，用于结肠癌治疗。

Description

多重细胞膜介导的仿生纳米/基因递送平台及其制备方法和靶向结肠癌的制药应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及多重细胞膜介导的仿生纳米/基因递送平台及其制备方法和靶向结肠癌的制药应用。

背景技术

基因治疗(Gene Therapy)是指利用基因工程方法将外源性基因如siRNA、shRNA，miRNA或DNA载体等转入病变细胞中，以期通过基因编辑，基因干扰或基因修饰等方式实现对致病基因的纠正改造，进而完成疾病治疗的方法。实现基因治疗的前提首先是将基因药物递送到细胞，不同的递送工具表现出不同的效率，并直接影响基因治疗的效果。病毒具有将遗传物质输送到细胞中的天然能力，病毒经过修饰以消除其引起传染病的能力，这些修饰过的病毒可以用作基因递送工具将治疗性基因(药物)携带到细胞中。除病毒外，细菌载体作为另一种常用的基因递送工具，被广泛的应用于小RNA的活体递送，通过将治疗性基因(药物)体外包被到经修饰后的细菌中，进而实现基因药物的活体递送。尽管病毒和细菌经过工程化处理，并且具有良好的基因递送能力，但由于病毒或细菌带来的安全性问题仍有待解决，这大大限制了其在临床研究中的应用。近些年，随着纳米技术的发展，越来越多的纳米生物材料如壳聚糖、PEI、PEG等聚阳离子材料可用于基因药物的递送。尽管这些纳米材料具有更高的基因递送能力，但由于聚阳离子复合物的毒副作用，并且单一功能的纳米材料在肿瘤治疗应用中存在一定的限制，因此开发既具有高效基因递送能力，又能够有效促进肿瘤细胞凋亡的多功能纳米材料用于肿瘤的治疗亟需解决。

氧化锌(ZnO)纳米颗粒由于其具有体积小、比表面积大等优点被广泛应用于肿瘤治疗研究。由于其锌离子能够诱导ROS产生，引起肿瘤细胞氧化应激，促进肿瘤细胞凋亡，但其对非肿瘤细胞表现出较好的生物相容性。因此通过将自身具有肿瘤杀伤能力的氧化锌纳米颗粒与能够促进肿瘤细胞凋亡的miRNA相结合，组装构建多功能的抗肿瘤纳米平台，用于结肠癌的治疗应用具有重要的临床应用价值。

基因治疗的活体应用首先要克服体内的生物屏障。由于机体内的各种降解酶和免疫细胞对外源性物质的清除，降低了纳米给药系统的作用效率。科研工作者尝试通过各种方法对纳米给药系统进行物理化学修饰，以期提高其体内工作效率。基于自身细胞能够免于机体的免疫清除的启发，开发由细胞膜包被的伪“细胞”纳米平台用于基因药物的活体递送具有一定的应用前景。由于癌细胞膜表面的相关抗原和免疫佐剂使得癌细胞具有免疫逃逸能力。同时，基于肿瘤细胞的同源靶向性原理和巨噬细胞膜介导的免疫逃逸原理，开发由结肠癌细胞膜和免疫细胞膜双膜伪装的纳米/基因药物递送系统，不仅能够有效地避免机体的清除，而且能够实现对药物的靶向递送，促进给药系统的药物递送效率，最终实现对结肠癌的治疗应用。研究表明，miR21的表达在多种实体恶性肿瘤和血液肿瘤中都被上调。许多的研究已经证实了高表达的miR21与肿瘤的不良预后有相关性。miR21对于肿瘤发生的机制的已经被广泛研究，它调节多种肿瘤发病机制相关的各种基因，包括细胞增殖、侵袭、迁移、凋亡，以及对于化疗的抗药性等。

但是，目前常见的报道多为单一细胞膜伪装的给药平台，如红细胞膜增加药物缓释、肿瘤细胞膜增加同源靶向性，免疫细胞膜增加免疫逃逸。但这些单一性的给药平台往往只能满足其中一项指标，无法兼顾既能增强同源靶向又能提高免疫逃逸的双功能或多功能作用，大大限制了仿生纳米给药平台的应用。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种多重细胞膜介导的仿生纳米/基因递送平台及其制备方法和靶向结肠癌的制药应用，能够解决现有技术的给药平台无法兼顾既能同源靶向又能提高免疫逃逸的双功能的技术困难。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明公开了一种多重细胞膜介导的仿生纳米/基因递送平台，由纳米氧化锌颗粒、miRNA21拮抗剂、结肠癌细胞膜和巨噬细胞(Raw264.7)膜组装而成。

优选地，由纳米氧化锌颗粒与miRNA21拮抗剂体外自组装构成NPs纳米复合物，然后将NPs纳米复合物与结肠癌细胞膜及巨噬细胞膜组装，构建得到多重细胞膜介导的仿生纳米/基因递送平台M@NPs。

优选地，所述结肠癌细胞膜为MC38肿瘤细胞膜。

优选地，所述miRNA21拮抗剂为mmu-miR-21a-5p antagomir，由锐博生物公司合成，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，是一种具有较强稳定性的miR21抑制剂。

优选地，结肠癌细胞膜和巨噬细胞膜的体积比为2:1。

优选地，纳米氧化锌颗粒与miRNA21拮抗剂的体积比为4:1。

具体配制时：12μL的ZnO(2μg/μL)与3μL的miRNA21(25μM)按照体积比(v/v＝4:1)混合，t 100振幅超声30秒(Q700,Qsonica,USA).室温静置5min后加入15μL(300μg/mL)细胞膜室温静置20min

本发明还公开了上述的多重细胞膜介导的仿生纳米/基因递送平台的制备方法，包括：

1)合成ZnO纳米颗粒；

2)将ZnO纳米颗粒与miRNA21拮抗剂在体外自组装，构成NPs纳米复合物；

3)将NPs纳米复合物与结肠癌细胞膜及巨噬细胞膜进行组装，构建得到多重细胞膜介导的仿生纳米/基因递送平台。

优选地，步骤1)中，合成ZnO NPs纳米颗粒，具体操作如下：

将Zn(OAc)₂·2H₂O与NaOH分别溶于去离子水中，分别得到Zn(OAc)₂·2H₂O溶液和NaOH溶液，将Zn(OAc)₂·2H₂O溶液和NaOH溶液充分混匀，收集沉淀物，洗涤、干燥，得到ZnO前驱体；

将ZnO前驱体于250℃下持续加热处理3h，得到粒径均一的ZnO纳米颗粒，采用PEI修饰ZnO纳米颗粒，制得ZnO NPs纳米颗粒。

优选地，步骤2)中，ZnO纳米颗粒与miRNA21拮抗剂按照体积比为4:1混合后，在100振幅下超声处理90s(Q700,Qsonica,USA)，组装成ZnO/miR21即NPs，室温静置5min后，然后按照NPs与细胞膜为1:1的体积比，加入细胞膜室温静置20min。

本发明还公开了上述的多重细胞膜介导的仿生纳米/基因递送平台在制备抗结肠癌的药物中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明公开的多重细胞膜介导的仿生纳米/基因递送平台，通过将生物材料氧化锌纳米粒与miR21拮抗剂体外自组装制备NPs纳米复合物，再将NPs纳米复合物与结肠癌细胞膜和巨噬细胞膜进行组装，构建双膜伪装的仿生纳米/基因递送平台M@NPs。该递送平台无需病毒载体的介导，即可用于基因药物的活体递送，并且基于肿瘤细胞膜介导的同源靶向性原理和巨噬细胞膜介导的免疫逃逸原理，实现对纳米/基因药物的靶向递送，用于结肠癌治疗。本发明选择自身肿瘤细胞和巨噬细胞(免疫细胞)双膜伪装，一方面降低纳米给药平台带来的机体免疫清除，另一方面通过利用肿瘤细胞的同源靶向和免疫细胞免疫逃逸特性，增强了药物利用，降低机体免疫清除。

通过实验验证，本发明的仿生纳米/基因递送平台M@NPs可以有效的促进基因药物靶向肿瘤组织，同时还能够高效的抑制肿瘤细胞的生长，促进肿瘤细胞凋亡。此外，基于双膜伪装的“假肿瘤药物”能够有效的逃逸机体免疫清除，增加药物在机体的循环周期，不仅可以降低给药频率，同时加大了药物的生物利用度。通过选择皮下结肠癌和肺转移两种动物模型检测该给药系统的作用，结果表明，双膜伪装的仿生纳米/基因递送平台M@NPs均能够有效地抑制肿瘤的发展。因此，双膜伪装的仿生纳米/基因递送平台M@NPs有望为被开发为治疗结肠癌等癌症的有效手段。

附图说明

图1为miR21在结直肠癌组织样本及相对应的癌旁正常组织和结肠癌细胞系中的表达水平；其中，A为结肠癌患者肿瘤组织和癌旁组织中miR21RT-qPCR检测；B为结肠癌患者肿瘤组织和癌旁组织中miR21原位杂交检测；C为人源结肠癌细胞系找那个miR21表达检测；D为鼠源细胞系中miR21表达检测(**P<0.01，***P<0.001)；

图2为ZnO纳米材料细胞毒性检测结果图，n.s无显著性差异，**P<0.01，***P<0.001；其中，A为L929cell；B为MC38cell；

图3为Live-Dead染色实验检测ZnO纳米材料对MC38和L929细胞凋亡检测结果图；

图4为纳米ZnO材料与miRNA的结合与释放检测；其中，A：不同体积比的ZnO与miRNA的结合后的琼脂糖凝胶电泳检测；B：是A的RNA半定量分析统计；C：不同浓度肝素处理ZnO/miRNA基因复合物后，琼脂糖凝胶电泳检测纳米复合物对miRNA的释放；D:是C的半定量分析统计结果；

图5为ZnO在哺乳动物细胞中miRNA基因递送能力检测结果图；

图6为Live/Dead染色和CCK-8检测结果；其中，A为NPs/miR21对MC38细胞凋亡live/dead染色；B为NPs/miR21对MC38细胞CCK-8检测(**P<0.01，***P<0.001)；

图7为NPs/miR21在小鼠肠癌细胞MC38中抑制Ki67和Bcl2表达结果；

图8为混合细胞膜碎片透射电镜成像图和M@NPs透射电镜成像图；

图9为荧光成像检测M@NPs肿瘤组织富集与机体清除；其中，A为近红外标记的细胞膜与cy5荧光标记的cy5NPs组装后静脉注射肿瘤小鼠10h后荧光成像结果；B为分别比较不同时间点后，机体对M@NPs的清除情况；

图10为皮下结肠癌肿瘤模型小鼠治疗；其中，A为皮下注射实验流程图；B为结肠癌肿瘤组织照片；C为体重情况；D为肿瘤体积；E为肿瘤重量；

图11为肿瘤组织HE染色和免疫荧光；其中，A为肿瘤组织HE染色结果；B为肿瘤组织Bcl2和Ki67免疫荧光染色结果；

图12为M@NPs在肺部肿瘤组织的富集及抑制肺部肿瘤生长情况；其中，A为近红外标记的荧光成像结果图；B为肺部肿瘤组织生长的照片；

图13为M@NPs在肺转移小鼠模型的肺部HE染色；

图14为肺部Bcl2和Ki67免疫荧光染色。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。

下面结合附图对本发明做进一步详细描述：

一、结直肠癌患者标本收集及miR21原位杂交实验

实验材料：西安交通大学第一附属医院普通外科术前病理诊断为结直肠癌患者行根治性手术时，标本取自切下的肿瘤组织，癌旁正常组织由术中冰冻切片确定。

实验方法：应用10％中性福尔马林室温下固定肿瘤组织、癌旁正常组织至少48h。将组织块置于脱水篮中，依次梯度酒精脱水。应用Leica全自动包埋机对组织块进行包埋，将包埋好的组织块固定于Leica石蜡切片机，进行切片，厚度6μm。切片置于37℃水中展开，应用粘附载玻片捞起，常温下风干。依次将切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min，风干，DEPC水浸泡。将风干后切片置于充满抗原修复液的修复盒中，煮沸15min。用22ug/mL蛋白酶K在预热的50mM Tris溶液中消化15min。在组织处滴加3％过氧化氢溶液，室温下封闭10min，以去除内源性过氧化氢酶。滴加核酸预杂交液，37℃，封闭15min。倾去预杂交液，滴加含探针has-mir-21-5p杂交液,浓度1uM，恒温箱37℃杂交过夜。倒去杂交液，应用2×柠檬酸钠缓冲溶液清洗3min，应用柠檬酸钠缓冲溶液清洗3次，每次3min。滴加封闭血清兔血清室温30min。倾去封闭液，滴加anti-DIG-HRP，37℃，孵育80min。PBS洗3次，每次3min。在组织处滴加DAB显色液，显微镜下观察显色情况，当出现棕色阳性细胞时，终止显色。应用苏木素染色液染色5min，流动的自来水冲洗干净。将切片依次放入75％酒精5min-85％酒精5min-100％酒精I 5min-100％酒精II 5min-正丁醇5min-二甲苯5min，滴加封片剂封片。显微镜镜检阳性细胞，记数、统计，结果见图5。

二、miR21表达含量检测

(1)对于贴壁细胞：HCT-116、SW480、SW620、HT29、CCD-18Co、MC38、CT26细胞系，细胞种于10cm的培养皿中，每隔一天换液一次。待细胞长至80％倒出培养基，PBS洗一次，加入1mL RNAiso Plus，水平放置，使裂解液均匀分布于细胞表面并裂解细胞，然后使用移液枪吹打细胞使其脱落。将RNAiso Plus转移至1.5mL离心管中，室温下静置10min。

对于人或小鼠组织样品：将组织至于液氮提前预冷的研钵中，加入液氮进行研磨，至样品成粉末状。12500g 4℃，离心10min，吸取上清液，移入新的1.5mL离心管中。(见图5)

(2)向上述步骤(1)的裂解液中加入1/5RNAiso Plus体积的氯仿，用涡旋振荡器剧烈震荡15s，待溶液充分乳化后，室温静置5min。

(3)12500g 4℃，离心20min。

(4)小心轻柔地取出离心管，此时溶液分为三层：无色的上层水相、白色蛋白层、带有颜色的下层有机溶液。吸取上层水相转移至另一新的1.5mL离心管中。

(5)向1.5mL离心管中加入相同体积的异丙醇，颠倒混匀后静置15min。

(6)12500g 4℃，离心15min，离心管底部出现白色沉淀。

(7)小心弃去上清，缓慢地加入75％乙醇，轻柔缓慢地上下颠倒洗涤白色沉淀，12500g 4℃，离心5min后小心倒去75％乙醇。

(8)依照(7)的步骤，再次重复。

(9)将洗涤过的RNA置于通风橱中，室温干燥5min，加入适量的RNase-free水溶解。

(10)利用Nanodrop紫外分光光度计对溶解的RNA进行浓度、OD值测定，保存于-80℃。

(11)应用广州锐博生物Bulge-Loop miRNAqRT-PCR进行miR21成熟链检测方法，10μL的反应体系如下表1所示；

表1 miR21反转录所用主要试剂

(12)以上反应体系混匀后，瞬时离心，反转录程序为：42℃60min，70℃10min。反应结束后-20℃保存产物。

qPCR检测miR21在结直肠癌细胞系及组织中的表达

(13)用DEPC水将步骤2)得到的反转录产物稀释20倍。

(14)在冰上配制qPCR 10μL表2所示的反应体系：

表2 qRT-PCR反应体系

(15)轻轻混匀上述反应体系，应用以下表3所示的反应程序进行qPCR反应

表3 qRT-PCR反应程序

(16)应用ΔΔCT法对数据进行分析，得出miR21相对表达含量。

三、ZnO NPs纳米颗粒合成

将0.005mol Zn(OAc)₂2H₂O与0.01mol NaOH分别溶于去离子水中，分别配制得到Zn(OAc)₂2H₂O溶液和NaOH溶液，室温下将25mL Zn(OAc)₂2H₂O溶液缓慢加到50mL的NaOH溶液中，并剧烈搅拌以形成透明的白色溶液。待溶液中产生大量白色沉淀后，收集沉淀，用无水乙醇洗涤三次。将沉淀物干燥以形成ZnO前驱体。将ZnO前驱体加热至250℃，持续3h，得到粒径均一的ZnO纳米颗粒。应用PEI修饰得到的ZnO纳米颗粒，得到ZnO-PEI纳米复合体(ZnONPs)，将ZnO NPs纳米材料悬液，用移液枪吸取20μL样本滴在碳膜铜网放置3-5min，然后用滤纸吸去多余液体。将2％磷钨酸滴在碳支持膜铜网放置1-2min，用滤纸吸去多余液体，室温干燥。透射电子显微镜下观察，采集图像分析。

四、NPs/miR21 antagomir纳米复合物自组装与结构分析

本实施例所用的miR21 antagomir由锐博生物公司合成，其核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示(5-UCAACAUCAGUCUGAUAAGCUA-3)，是一种具有较强稳定性的miR21抑制剂。其拮抗的mmu-miR-21a-5p成熟体(靶基因)序列：为5-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3。

保持使用miR21 antagomir量不变(1μL,25μM),分别将1μL miR21antagomir与不同体积的ZnO NPs(0,1,2,4,6,8,10,15,20μL,2μg/mL)混合，涡旋震荡20s，进行混匀。使用QSONICA超声波破碎仪在提前预冷的4℃水中将上述混合物进行破碎，组装，振幅100，破碎时间30s，破碎时密切关注水温，水温过高会影响miRNA与ZnO NPs的组装效果。将得到的包含不同浓度的NPs/miR21 antagomir在2％的琼脂糖上进行凝胶电泳实验，依据条带的亮度及位置判断RNA与ZnO NPs的最佳结合比例。将根据上述得到的最佳结合比例进行后续实验，制备新的NPs/miR21 antagomir用于后续释放实验。

将上述制备好的NPs/miR21 antagomir与不同浓度的肝素钠溶液进行混合(0,0.5,1,2.5,5,10,20mg/mL)37℃水浴30min。将上述水浴后的产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，检测是否能顺利释放miR21 antagomir，1μL，25μM的miR21 antagomir作为阳性对照检测NPs/miR21 antagomir释放RNA的最大效能。(见图3)

将1μL，25μM的miR21 antagomir与4μL，2mg/mL的ZnO NPs进行混合，涡旋震荡20s，进行混匀。使用QSONICA超声波破碎仪在提前预冷的4℃水中将上述混合物进行破碎，组装，振幅100，破碎时间30s，将得到的产物置于冰上，进行透射电镜检测。

五、NPs/miR21 antagomir纳米复合物体外功能评价

miR21在小鼠结肠癌细胞系中表达水平显著升高，为了检验NPs/miR21antagomir纳米复合物的生物学功能，首先在体外使用小鼠MC38结肠癌细胞系检验该纳米复合物是否可在体外抑制肿瘤细胞的增殖，促进凋亡。同时，本研究应用小鼠成纤维细胞系L929验证该纳米复合物对于正常体细胞的毒性。

1)MC38和L929细胞复苏

将含有培养基的容器放入培养箱中至少15min进行复温。将购买自中国科学院细胞库的小鼠结肠癌细胞系和小鼠成纤维细胞系置于37℃水浴锅中，缓慢震荡2-5min以解冻冻存管。(注意：盖子不能没入水中)当冻存管中的液体溶解时，立即将冻存管从水浴锅中拿出，并用70％乙醇喷洒消毒。将冻存管内容物转移至含有5mL完全培养基的15mL离心管中，800rpm，离心5min，弃去上清，并用1mL完全培养基重悬沉淀，并转移至100mm培养皿中。次日更换培养基，待细胞生长至80％时，传代一次，进行后续实验。

2)Lipofectamine 2000细胞转染实验

转染前1d，0.15％的胰蛋白酶消化细胞，并计数，将细胞种于24孔板中，使转染当天的密度为70％左右。将10μL、25μM的miR21 antagomir与100μL的Opti-MEM减血清培养基进行混匀，得到溶液A。将3μL的Lipofecamine2000与100μL的Opti-MEM减血清培养基进行混匀，得到溶液B。将溶液A与溶液B混匀，并在室温下静置20min，得到混合液；将所得混合液加入提前更换为Opti-MEM培养基的24孔板中。将24孔板置于5％CO₂ 37℃细胞培养箱中孵育24小时后，换液为含血清的完全培养基。

3)NPs/miR21 antagomir细胞转染实验

转染前1d，0.15％的胰蛋白酶消化细胞，并计数，将细胞种于24孔板中，使转染当天的密度为70％左右。将10μL、25μM的miR21 antagomir与4μL、40μL 2mg/mL的ZnO NPs进行混合，涡旋震荡20s，进行混匀。使用QSONICA超声波破碎仪在提前预冷的4℃水中将上述混合物进行破碎，组装，振幅100，破碎时间30s，随后室温下静置30min，然后加入提前更换为Opti-MEM培养基的24孔板中。将24孔板置于5％CO₂ 37℃细胞培养箱中孵育24小时后，换液为含血清的完全培养基。使用荧光标记的cy3miRNA与纳米氧化锌组装，制备荧光标记的NPs，转染细胞后，通过荧光检测，证明纳米氧化锌具有向哺乳动物细胞递送miRNA的能力，结果见图4。

4)细胞免疫荧光染色实验

弃去24孔板中培养基，用PBS清洗细胞一次。应用4％多聚甲醛，室温下固定12min，弃去多聚甲醛，用PBS清洗3次，每次5min。应用包含0.1％Triton-100 PBS溶液穿孔细胞，室温下静置20min。应用包含5％BSA的PBS溶液进行室温下封闭30min。将对应的一抗稀释于封闭液中，加入细胞中，置于4℃过夜，用PBS清洗三次，每次5min。将对应的二抗稀释液置于包含DAPI(2μg/mL)的PBS中，室温下孵育1h，用PBS清洗三次，每次5min，加入足量的新的PBS溶液，避免细胞干燥。倒置荧光显微镜下进行拍照，结果如图7所示。

其中，免疫荧光所用抗体见下表4：

表4免疫荧光实验所用抗体

5)CCK8细胞增殖和细胞毒性实验

在96孔板中接种细胞悬液(5000cells/100μL)，将培养板放在培养箱中预培养或进行相关处理。每一孔中加入10μL CCK8。(注意：不要在孔中生成气泡)将培养板在培养箱内孵育1-4h，根据细胞数量而定。用酶标仪测定OD450处吸光度。(结果参见图1和6)

6)Live-Dead染色

在96孔板中接种细胞悬液(5000cells/100μL)，将培养板放在培养箱中预培养或进行相关处理。配制Live-Dead染色液，加5μL calcein AM(组分A)和20μL ethidiumhomodimer-1(组分B)进入10mL DPBS中，轻柔混合均匀。弃去96孔板中的培养基。向每孔中加入100μL上述配制的Live-Dead染色液。在20-25℃环境下孵育30min。倒置荧光显微镜下拍照，计数。(结果参见图2和6)

六、膜伪装M@NPs药物递送系统经尾静脉给药后体内分布

建立小鼠结肠癌皮下瘤模型后，待肿瘤体积达到200mm³，将小鼠随机分为4组，分别为：PBS治疗组(PBS)、DiR标记的混合细胞膜NPs治疗组(M@NPs/NC)、NPs/Cy5miR21antagomir组(Cy5NPs)和DiR标记的混合细胞膜伪装NPs/Cy5miR21 antagomir组(M@Cy5NPs).

根据ZnO(2μg/μL)与miRNA21(25μM)体积比(v/v ratio＝4:1)混合，100振幅超声30秒(Q700,Qsonica,USA).室温静置5min后加入细胞膜室温静置20min制备方案，构建DiR标记的混合细胞膜伪装NPs/Cy5miR21 antagomir纳米复合物，将60μL的ZnO(2μg/μL)与15μL Cy5-miR21 antagomir，(25μM)混合，加入75μL(300μg/mL)细胞膜其它复合物用量等比例提升，终体积为150μL，若部分实验组终体积不能达到150μL，则用PBS补为150μL制备M@NPs(见图8)。通过尾静脉给药方式，分别给予小鼠150μL的PBS、M@NPs/NC、Cy5NPs和M@Cy5NPs，每24h给药一次，连续给药2次。第二次给药6h后，应用CO₂对小鼠进行安乐死，收集小鼠的肝脏、脾脏、肾脏、肺和皮下瘤组织。使用Odyssey CLx双激光红外成像仪对各组小鼠的皮下瘤组织进行荧光检测，并分析荧光信号。使用PerkinElmer小动物成像仪检测各组小鼠组织器官和皮下瘤组织的荧光信号，并进行分析。

实验结果：通过静脉注射检测M@NPs向肿瘤组织富集情况，结果如图9所示，将近红外标记的细胞膜与cy5荧光标记的cy5NPs组装后静脉注射肿瘤小鼠，10h后荧光成像，图9中A图的结果显示，与PBS对照组相比，M@NPs在肿瘤组织富集。分别比较不同时间点后，机体对M@NPs的清除情况，图9中B图的结果显示，与无细胞膜伪装的cy5NPs相比，膜伪装的M@NPs能够有效逃逸机体的快速清除。

七、M@NPs用于结直肠癌皮下瘤治疗

建立小鼠结肠癌皮下移植瘤模型。每天测量并记录小鼠体重和肿瘤体积。注：当肿瘤不能被手触及时不进行测量。接种10d后，小鼠皮下瘤可触及，所有小鼠随机分为5组，分别为：PBS组(PBS)，混合细胞膜碎片治疗组(M)、ZnO NPs组(NPs/NC)、NPs/miR21 antagomir组(NPs/miR21)和混合细胞膜伪装NPs/miR21 antagomir组(M@NPs/miR21)。肿瘤细胞接种后第十天进行第一次给药记为Day 1，随后每隔1d尾静脉显微注射给药一次(见图10中A)。尾静脉给药操作较为复杂，可借助静脉可视小鼠鼠尾固定器进行辅助，尾静脉给药需要由有经验的操作人员进行，以保证每次给药量统一。连续给药5次后，安乐死小鼠，分别收集小鼠肾，肺，脾，肝和皮下瘤组织。将所收集组织均分为二，一半冷冻于液氮，一半经4％多聚甲醛过夜固定后行组织学染色实验。

在治疗的过程中，小鼠体重变化未见统计学差异，说明混合细胞膜伪装NPs/miR21antagomir(M@NPs/miR21)在进行结直肠癌治疗时不会引起肝脏毒性而造成小鼠体重骤减。经混合细胞膜伪装NPs/miR21 antagomir(M@NPs/miR21)进行治疗的小鼠，肿瘤生长速率明显降低，小鼠安乐死后，对皮下瘤进行称重，相较于PBS治疗的对照组(PBS)，经混合细胞膜伪装NPs/miR21 antagomir(M@NPs/miR21)进行治疗的小鼠的皮下瘤重量仅为PBS治疗组的1/5，说明混合细胞膜伪装NPs/miR21 antagomir在小鼠体内发挥了明显的抗肿瘤特性。

八、M@NPs用于结肠癌肺转移瘤治疗与肺部药物富集

实验动物：年龄为8周的C57/BL6野生型雌性小鼠，购自西安交通大学医学部动物实验中心，饲养于SPF动物实验中心。

实验操作：复苏MC38小鼠结肠癌细胞系，培养于10cm的培养皿中。待细胞密度达到70％-80％，且处于对数生长期时，用0.15％的胰蛋白酶将细胞消化，并用提前预冷的PBS清洗两次。用细胞计数器进行细胞计数，并用PBS将细胞浓度调整为1×10⁷/mL，分装于1.5mL离心管中，置于冰上，待用。用碘酒对小鼠尾进行消毒，借助GEGD-Q9G静脉可视小鼠尾注射固定器固定小鼠。应用移液器混匀肿瘤细胞，用U100 1.0mL胰岛素注射器吸取100μL的肿瘤细胞缓慢注射入小鼠尾静脉，棉签按压小鼠尾部注射位点进行止血。将小鼠返回至SPF中等待3周，使肿瘤细胞随血液循环系统定植于小鼠肺部。将接受尾静脉注射的小鼠随机分为4组：PBS治疗组(PBS)、混合细胞膜伪装ZnO NPs组(M@NPs/NC)、NPs/miR21 antagomir(NPs/miR21)和混合细胞膜伪装NPs/miR21 antagomir组(M@NPs/miR21)。将小鼠接种肿瘤细胞后的第21天记为Day 1，进行给药，每隔一天给药一次。连续给药15次后，取出小鼠肺组织，在体视显微镜下对肺组织中转移瘤的数量和大小进行计数(见图12)。将肺组织均分为二，一半置于液氮，一半4％多聚甲醛过夜固定后行后续实验。

实验结果：给药10h后检测肺部荧光，结果显示，荧光标记的膜伪装的M@NPs/miR21能够高效的将miRNA递送到肺部并有效抑制肺部肿瘤的发生发展(如图12所示)。通过肺部HE染色(如图13所示)和肺部Bcl2和Ki67免疫荧光染色(如图14所示)，结果显示，M@NPs能够有效地抑制肺转移模型小鼠肺部肿瘤发生与发展。

以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种多重细胞膜介导的仿生纳米/基因递送平台，其特征在于，由纳米氧化锌颗粒、miRNA21拮抗剂、结肠癌细胞膜和巨噬细胞膜组装而成。

2.如权利要求1所述的多重细胞膜介导的仿生纳米/基因递送平台，其特征在于，由纳米氧化锌颗粒与miRNA21拮抗剂体外自组装构成NPs纳米复合物，然后将NPs纳米复合物与结肠癌细胞膜及巨噬细胞膜组装，构建得到多重细胞膜介导的仿生纳米/基因递送平台M@NPs。

3.如权利要求1或2所述的多重细胞膜介导的仿生纳米/基因递送平台，其特征在于，所述结肠癌细胞膜为MC38肿瘤细胞膜。

4.如权利要求1或2所述的多重细胞膜介导的仿生纳米/基因递送平台，其特征在于，所述miRNA21拮抗剂的序列如SEQ ID NO：1所示。

5.如权利要求1或2所述的多重细胞膜介导的仿生纳米/基因递送平台，其特征在于，结肠癌细胞膜和巨噬细胞膜的体积比为2:1。

6.如权利要求1或2所述的多重细胞膜介导的仿生纳米/基因递送平台，其特征在于，纳米氧化锌颗粒与miRNA21拮抗剂的体积比为4:1。

7.权利要求1或2所述的多重细胞膜介导的仿生纳米/基因递送平台的制备方法，其特征在于，包括：

1)合成ZnO纳米颗粒；

2)将ZnO纳米颗粒与miRNA21拮抗剂在体外自组装，构成NPs纳米复合物；

3)将NPs纳米复合物与结肠癌细胞膜及巨噬细胞膜进行组装，构建得到多重细胞膜介导的仿生纳米/基因递送平台。

8.如权利要求7所述的多重细胞膜介导的仿生纳米/基因递送平台的制备方法，其特征在于，步骤1)中，合成ZnO纳米颗粒，具体操作如下：

将Zn(OAc)₂·2H₂O与NaOH分别溶于去离子水中，分别得到Zn(OAc)₂·2H₂O溶液和NaOH溶液，将Zn(OAc)₂·2H₂O溶液和NaOH溶液充分混匀，收集沉淀物，洗涤、干燥，得到ZnO前驱体；

将ZnO前驱体于250℃下持续加热处理3h，得到粒径均一的ZnO纳米颗粒，采用PEI修饰ZnO纳米颗粒，制得ZnO纳米颗粒。

9.如权利要求7所述的多重细胞膜介导的仿生纳米/基因递送平台的制备方法，其特征在于，将ZnO纳米颗粒与miRNA21按照体积比为4:1混合后，在100振幅下超声处理90s，组装成ZnO/miR21即NPs，室温静置5min后，然后按照NPs与细胞膜为1:1的体积比，加入细胞膜室温静置20min；

所述miRNA21拮抗剂的序列如SEQ ID NO：1所示。

10.权利要求1或2所述的多重细胞膜介导的仿生纳米/基因递送平台在制备抗结肠癌的药物中的应用。

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