CN105727307B - 一种硫辛酸修饰的纳米多肽载体及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种硫辛酸修饰的纳米多肽载体及其制备方法和应用。本发明提供一种硫辛酸修饰的多肽类纳米载体，由精氨酸、组氨酸、硫辛酸和半胱氨酸组成。本发明的纳米载体采用硫辛酸自带的二硫键进行交联，所形成的多肽聚合物可在细胞内迅速被降解，不会在细胞内蓄积，多肽中的精氨酸和半胱氨酸均为体内存在的氨基酸，对细胞及人体无毒副作用，CCK‑8法细胞增殖试验表明，制备的纳米载体具有很低的细胞毒性，同时又有较好的共载基因与化疗药的能力，本发明的纳米载体能在乳腺癌耐药治疗中能特异性增强耐药细胞对化疗药的敏感性，促进乳腺癌细胞的凋亡，从而成为乳腺癌耐药治疗的一种靶向、高效、低毒的纳米级递送系统。

Description

一种硫辛酸修饰的纳米多肽载体及其制备方法和应用
技术领域：
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种硫辛酸修饰的纳米多肽载体及其制备方法和应用。
背景技术：
乳腺癌是威胁女性健康的恶性肿瘤之一，目前临床对其治疗仍以手术为主，同时配合放射治疗、化疗药物治疗(简称化疗)进行综合治疗，其中化疗在乳腺癌治疗中起着关键作用，但临床应用中乳腺癌细胞多存在多药耐药性(multidrug resistance，MDR)现象，从而导致化疗的失败。因此，逆转乳腺癌耐药成为关键技术。纳米技术的引入，不仅实现了肿瘤的靶向性治疗、降低了毒副作用，而且有效的实现了耐药乳腺癌细胞的逆转。因此，制备一种能靶向性治疗乳腺癌耐药的纳米递药系统具有非常重要的意义。
纳米药物输送系统是于20世纪60年代开始发展的一种新型给药系统。纳米粒子也叫超微颗粒，最常见的是固体胶体粒子制成的高分子材料，范围的大小从1到1000nm(1μm)，有时也认为粒子在1至200纳米范围内。纳米材料颗粒与多数大蛋白(也为纳米级)大小相仿，在体内不易作为异物受到排斥，加之可对纳米材料进一步生物兼容性官能团化，更易满足药物载体在组织、血液、免疫等生物兼容性方面的要求。
胶束(micelles)亦称胶团，是过量的表面活性剂在水中自组装形成的胶体溶液，表面活性剂分子缔合形成胶束时的最低浓度称为临界胶束浓度(CMC)。文献中常将胶束形成的过程称为“自组装”。纳米胶束是由具有亲水基团和疏水基团的两亲嵌段共聚物在水中自组装形成的纳米级大小的核－壳型胶束。
由于肿瘤治疗的难度和复杂性，化疗药物和基因药物的协同传递系统成为近年来肿瘤治疗研究的热点。共递送系统能提高转染效率，提高药物疗效的协同效应，从而提高肿瘤治疗的疗效。化疗药物和基因药物的运输的挑战之一是这些共同递送系统的设计和开发。有效的输送系统可以跨越各种障碍，药物递送到体内细胞内而产生抗肿瘤作用。因此，这些传递系统必须具有多种功能，而且必须长期稳定、专一，并且能够提高内涵体逃逸。
多肽类载体主要是指各种细胞穿透肽。其在基因治疗方面因其高效传递基因物质的能力及低毒性，容易制备而在过去20多年中成为研究热点。研究发现，多肽类载体中的精氨酸因其表面富集的正电荷可有效地吸附带负电荷的基因物质而形成粒径小，结构稳定的载体/基因复合物(Farkhani,S.M.,Valizadeh,A.,Karami,H.,Mohammadi,S.,Sohrabi,N.,&Badrzadeh,F.Cell penetrating peptides:efficient vectors for delivery ofnanoparticles,nanocarriers,therapeutic and diagnostic molecules.Peptides,2014,57:78-94.)。
纳米胶束通过细胞内吞作用进入细胞后被内吞体吞噬，进而与溶酶体融合，基因药物在进入溶酶体后容易被溶酶体中的酶降解，因此，基因物质只有在内涵体和溶酶体中逃逸出来才能发挥作用。研究报道，组氨酸具有“质子海绵效应”而具有内吞体逃逸的能力。本研究采用精氨酸与组氨酸相连的序列连接方式以达到高效转染、有效逃逸内涵体的目的。
硫辛酸是一种具有分子内五元环二硫键结构，末端羧基的两亲性物质，与细胞膜具有脂质双分子层具有较好的亲和力，具有较好的包载化疗药物的作用，且二硫键可在细胞还原性条件下裂解，为药物在肿瘤部位的有效释放提供条件。
专利号为CN201210305540.1，公开号为CN102920649A的中国发明专利“载药纳米胶束及其制备方法和应用”公开了一种载药纳米胶束，其中的纳米递送载体是由两亲性三嵌段共聚物形成的具有三层结构的复合体，其中，所述两亲性三嵌段共聚物为包含聚乙二醇衍生物、聚赖氨酸和聚亮氨酸的线性高分子化合物，所述聚赖氨酸的一端通过酰胺键与所述聚乙二醇衍生物相连，另一端通过肽键与所述聚亮氨酸相连；所述聚亮氨酸构成所述复合体的内层，所述聚赖氨酸构成所述复合体的中间层，所述聚乙二醇衍生物构成所述复合体的外层；所述Bcl-2siRNA分散在中间层的所述聚赖氨酸中；药物--多烯紫杉醇分散在内层的所述聚亮氨酸层中。
专利申请号为CN201410053888.5，公开号为CN104840968A的中国发明专利申请“甲基聚乙二醇2000-b-聚D,L-乳酸1000-1500嵌段共聚物载多烯紫杉醇纳米胶束制剂”公开了一种利用两亲性嵌段共聚物甲基聚乙二醇2000-b-聚D,L-乳酸1000～1500纳米递送载体。
目前尚无一种硫辛酸修饰的多肽，并且能够靶向性治疗乳腺癌耐药的纳米递送载体。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种可生物降解的，内部空腔包裹化疗药物，外部包载基因的基因转染效率高的多肽类纳米载体。本发明的另一个目的是提供该纳米多肽载体的制备方法；本发明的第三目的是提供该多肽载体在共载化疗药与基因治疗药物中的应用。
本发明所要解决的主要技术问题是：如何提高多肽纳米载体引导基因片段进入细胞的能力，以及如何提高多肽纳米载体共载化疗药与基因的能力，同时保证材料具有生物可降解特性。
本发明设计了一种硫辛酸修饰的多肽类纳米载体，由精氨酸、组氨酸、硫辛酸和半胱氨酸组成的多肽，精氨酸带正电荷可与带负电的基因片段结合并具有穿膜作用，组氨酸因其质子海绵效应而促进基因片段内涵体逃逸，硫辛酸部分可以增加载体与细胞膜的亲和力并可包载化疗药物达到共载，及其自身二硫键的交联而增加载药及转染能力，并可在生物还原性条件下裂解而实现释药的目的。
本发明的第一个方面，是提供了一种硫辛酸修饰的多肽，所述多肽的氨基酸序列如下所示：
HHHRRRRRR(SEQ ID NO：1)；氨基酸之间以肽键相连，多肽可简写为H3R6，缩写为HR。
所述的硫辛酸修饰，是指硫辛酸羧基与组氨酸的氨基以酰胺键连接。
本发明所述的硫辛酸修饰的多肽可以简写为：LA-H3R6，可简写为LAHR，其中LA为硫辛酸，H为组氨酸，R为精氨酸，LA-H3R6缩写为LAHR。
进一步地，本发明提供了一种硫辛酸修饰的多肽类可降解纳米载体，所述的纳米载体为上述硫辛酸修饰的多肽的聚合物，所述的聚合物的化学结构式如式(Ⅰ)所示：
Figure BDA0000956532940000041
所述的硫辛酸修饰的多肽通过半胱氨酸经二硫键交联形成聚合物。
本发明的H组氨酸，R精氨酸组成9肽，氨基酸之间以肽键连接，英文缩写为HR；在12肽的N端，硫辛酸与氨基以酰胺键连接，硫辛酸修饰的多肽英文缩写为LAHR；硫辛酸的巯基经半胱氨酸氧化交联形成聚合物，聚合物的英文缩写为LAHRss。
本发明所述的一种硫辛酸修饰的多肽类纳米载体，聚合物的分子量优选为3000-30000Da,该分子量之外的聚合物不适宜，会降低基因载体的转染效率；最优为15000-30000Da。
本发明的第二个方面，是提供了上述的硫辛酸修饰的多肽类可降解纳米载体的制备方法，所述的制备方法包括如下步骤：
(A)硫辛酸修饰的多肽和合成：合成LA-H3R6；
(B)硫辛酸修饰的多肽类可降解纳米载体的制备：将步骤(A)合成的硫辛酸修饰的多肽溶于甲醇，加入半胱氨酸盐酸盐，使半胱氨酸的比列在5％-20％之间，调节溶液的pH为7，避光搅拌反映12小时。
在本发明的一个优选实施例中，步骤(B)具体为：取硫辛酸修饰的多肽LAHR与半胱氨酸溶解于甲醇中，使得半胱氨酸的比例在10％之间，加入氢氧化钠溶液将pH调节至7.0，搅拌反应12小时，反应温度为室温。
步骤(B)反应后的溶液，用N2吹干。用N2吹干后的样品在-20℃保持。
步骤(B)反应后的溶液移入截留分子量为1000的透析袋中，透析液为蒸馏水，透析12小时。
为维持纳米载体材料较高的活性，将透析后的溶液冷冻干燥，并保存于-20℃，纳米材料在复溶后可在4℃长期保存。
本发明的第三个方面，是提供了上述的硫辛酸修饰的多肽纳米载体共载基因与化疗药物的耐药乳腺癌中的应用。
所述的应用，是指纳米载体中的精氨酸带正电可以与带负电的基因进行结合。
所述的应用，是指纳米载体中的硫辛酸的脂溶性可以包载脂溶性的化疗药物。
所述的基因，为质粒DNA(pDNA)。
所述的化疗药物，为脂溶性的阿霉素，也可以是多西他赛、环磷酰胺等。
进一步地，本发明还提供了硫辛酸修饰的多肽类纳米载体共载基因与化疗药在耐药乳腺癌中的应用，所述的应用具体为：
将此纳米载体与pDNA混合，制得基因转染体系。
所述的纳米载体与pDNA的N/P比为5:1-40：1，在此比例范围内，所述纳米载体材料能够引导pDNA进入细胞内，有较高的转染效率。
所述的纳米载体包载阿霉素的能力，在半胱氨酸比例为5％-20％时，具有较好的载药量和包封率。
所述的纳米载体与pDNA在缓冲液中混合，缓冲液pH为5.0-7.0，室温孵育20～30分钟，合理的pH值和孵育时间确保了基因转染体系的形成。
本发明提供的纳米载体适用于实验所需的治疗性质粒DNA及化疗药。
本发明的优点在于：
本发明的纳米载体采用硫辛酸自带的二硫键进行交联，所形成的多肽聚合物可在细胞内迅速被降解，不会在细胞内蓄积，多肽中的精氨酸和半胱氨酸均为体内存在的氨基酸，对细胞及人体无毒副作用，CCK-8法细胞增殖试验表明，制备的纳米载体具有很低的细胞毒性，同时又有较好的共载基因与化疗药的能力，因此非常适合于体内外的化疗与基因治疗研究与应用。
本发明的制备方法操作简单，反应试剂和得到的产物无毒性，不会对环境产生污染，反应条件温和，反应后得到的纳米载体纯化简单，成分低廉，并且该制备方法可以通过控制多肽与半胱氨酸的比例来控制纳米载体的交联度，利于大规模推广于研究和应用领域。
附图说明：
图1为LAHR的核磁共振氢谱图；
图2不同交联度下LAHRss/pEGFP纳米胶束的粒径图；
图3不同交联度下LAHRss/pEGFP纳米胶束的电位图；
图4不同N/P条件下不同交联度载体转染效果考察；
图5半胱氨酸量为10％，N/P为40时纳米胶束的粒径图；
图6半胱氨酸量为10％，N/P为40时纳米胶束的电位图；
图7透射电镜观察下半胱氨酸量为10％，N/P为40时纳米胶束的形态；
图8不同pH条件下DOX的释放度考察；
图9不同时间点MCF-7细胞对YOYO-1-1pDNA基因的摄取情况；
图10不同时间点MCF-7细胞对DOX的摄取情况；
图11不同时间点MCF-7细胞对YOYO-1pDNA的摄取情况；
图12不同时间点MCF-7/ADR细胞对DOX的摄取情况；
图13不同浓度条件下载体对细胞的细胞毒性考察；
图14考察不同浓度DOX条件下对MCF-7细胞的细胞毒性；
图15考察不同浓度DOX条件下对MCF-7/ADR细胞的细胞毒性；
图16流式细胞仪观察不同给药组对MCF-7/ADR细胞凋亡的影响。
具体实施方式：
以下结合附图和具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
实施例1：硫辛酸修饰的9肽的合成
硫辛酸(LA)修饰的9肽氨基酸序列：His His His Arg Arg Arg Arg Arg Arg(His,组氨酸；Arg，精氨酸)(SEQ ID NO：1)，LA-HR，有上海吉尔生化有限公司采用多肽固相合成法合成并命名为LA-H3R6，利用制备高效液相色谱纯化合成的LA-HR，使其纯度达到95％以上。LA-为硫辛酸，R为精氨酸，H为组氨酸，氨基酸之间以肽键连接形成9肽。
实施例2：硫辛酸修饰的多肽类纳米载体LAHRss的制备
取50mg硫辛酸修饰的多肽LAHR与不同量的半胱氨酸盐酸盐溶于10ml甲醇中，加入氢氧化钠溶液将pH调节至7.0，搅拌反应12小时，反应温度为10～30℃。半胱氨酸的量分别为：2.5％、5％、10％、20％。
如表1所示，根据LAHR与半胱氨酸的比例不同，制得了不同分子量的LAHRss。所得溶液经过截留分子量为1000的透析袋透析12小时，透析液为蒸馏水，每4小时，更换透析液。所得透析产物冷冻干燥，并储存于-20℃，冻干后的载体在复溶条件下可长期保存。合成的载体经核磁共振氢谱1H-NMR(600M)检测，分子量经凝胶渗透色谱(GPC)测定。
表1不同分子量的LAHRss的合成
Figure BDA0000956532940000071
注意:a半胱氨酸与LHR的摩尔比.b由凝胶渗透色谱检测。
由表1可知，加入半胱氨酸后，聚合物分子量明显加大，表明载体已成功交联，且随着半胱氨酸量的增加，分子量增加。
实施例3：LAHRss在pDNA纳米胶束的制备
将载体(LAHRss)和虫荧光素酶表达质粒pEGFP(上海创新生物科技有限公司)分别溶于水中制备水溶液，按氮磷比(N/P)分别为2.5、5、10、20、40、80配置纳米复合物涡旋10s后静置30min，即得纳米胶束。纳米胶束的平均粒径与N/P有关，当N/P＝40时得到最佳粒径，粒径在80-300之间，具体见图2。纳米胶束的Zeta电位对N/P的增大而升高，在N/P大于2.5时稳定在0-30mV，具体见图3。
实施例4：LAHRss/pEGFP体外转染效率考察
将人乳腺癌细胞株MCF-7、MCF-7/ADR细胞(购自中国科学院上海生物科学研究所细胞培养中心)按照30w/孔分别接种于12孔板上，加入1ml含10％FBS(Gibco公司，美国)的DMRM培养基(Gibco公司，美国)培养24小时，使细胞汇合度达70-80％，将培养基更换为无血清培养基。
将不同交联度载体(LAHRss)和虫荧光素酶表达质粒pEGFP分别溶于水中制备水溶液，按氮磷比(N/P)分别为2.5、5、10、20、40、80配置纳米复合物涡旋10s后静置30min，加入孔板中，培养4小时后，更换为新鲜培养基，继续培养24小时。荧光显微镜观察细胞转染情况，如图4所示。由综合以上结果(LHRss3具有较为合适的分子量，较小的粒径，较高的正电荷，及在此条件下较佳的转染荧光强度)，因此取LHRss3用于进一步考察。
实施例5：LAHRss3/(DOX/TRAIL)纳米胶束的制备
取2mg阿霉素盐酸盐(DOX.HCL)溶于1ml丙酮中，加入摩尔比3:1的乙二胺脱盐处理，将20mg载体(LAHRss3)溶于1ml丙酮中。
将上述两种溶液混合后，缓慢滴加与含1％胆酸钠的10ml纯水中，搅拌挥发溶剂，超滤去除胆酸钠，计算包封率和载药量。按N/P40加入pTRAIL质粒，测定粒径和电位，如图5和6。透射电镜下观察纳米复合物形态，见图7。
由图5及图6可知，所得纳米共载胶束粒径在80nm左右，电位在30mV以上，能保证其包载基因的能力及较好的穿膜作用。图7显示，纳米胶束的形态完整，近球形，分散均匀，能较好的防止其聚集。
实施例6：阿霉素体外释放特性考察
采用透析袋法(赵志娟等，肺靶向阿霉素微球的体外释放度测定方法的建立，山西医药杂志，2007,4(36):304-305)考察阿霉素的体外释放情况，选取截留分子量为3500的透析袋，透析介质pH分别为7.4、5.5，37℃进行考察。取2mg阿霉素盐酸盐(DOX.HCL)溶于1ml丙酮中，加入摩尔比3:1的乙二胺脱盐处理，将20mg载体(LAHRss3)溶于1ml丙酮中。将上述两种溶液混合后，缓慢滴加与含1％胆酸钠的10ml纯水中，搅拌挥发溶剂，超滤去除胆酸钠，制得LAHRss3/DOX纳米胶束。将1mlLAHRss3/DOXPBS溶液于透析袋中，放置于含50mlPBS的缓冲液中，100r/min，37℃，分别于1、2、4、6、8、10、12、20、24、48、60时间点取500μl外液，并补加500μl，利用阿霉素自带荧光测定其吸收。绘制体外释放曲线如图8所示。
由图8可知，pH5.5条件下阿霉素的释放速度明显快于pH7.4条件下，且其在60小时时，其累计释放率将近95％。结果表明所述多肽载体具有pH敏感行为，其为抗肿瘤药物在肿瘤微环境释放提供了条件。
实施例7：LAHRss3/DOX、LAHRss3/YOYO-1-pDNA的细胞摄取情况
以YOYO-1标记的pDNA(YOYO-1-pDNA)作为模型质粒进行评价。将MCF-7、MCF-7/ADR细胞按照30w/孔分别接种于12孔板上，加入1ml含10％FBS(Gibco公司，美国)的DMRM培养基(Gibco公司，美国)培养24小时，使细胞汇合度达70-80％，将培养基更换为无血清培养基。将LHRss3/DOX、DOX按5μg/ml加入细胞孔中，LAHRss3/YOYO-1-pDNA、YOYO-1-pDNA按N/P40制备纳米复合物，并加入细胞孔中，分别孵育1、2、4小时，吸去培养基，PBS洗3遍，消化离心收集，利用流式细胞仪检测细胞对DOX及YOYO-1-pDNA的摄取情况。
结果如图9-12所示，不同时间点MCF-7对DOX及LAHRss3/DOX的摄取差异不明显，而MCF-7/ADR对DOX及LAHRss3/DOX的摄取上存在较大差异。1小时时对DOX基本无摄取，而对LAHRss3/DOX摄取较明显，在4小时时基本接近100％。而不同时间点MCF-7及MCF-7/ADR对LAHRss3/YOYO-1-pDNA的摄取比LHR/YOYO-1-pDNA高的多，说明交联增加了载体与细胞膜的亲和力，化疗药物经载体的包载在耐药细胞上抑制了其外排，及包载基因后基因能更好的进入细胞。
实施例8：LHRss3的细胞毒性研究
将MCF-7、MCF-7/ADR细胞按照8×103/孔接种于96孔板中，培养24h，使细胞汇合度达到50％。吸去培养基，每孔加入100μl含不同浓度LHRss3(5、10、20、40、60、100、200μg/ml)，继续培养24、48h，CCK-8法检测细胞毒性，统计细胞存活率，用商品化的转染试剂BPEI(美国Sigma-Aldrich公司，分子量25kDa)，作为对照。
结果如图13所示，对照BPEI-25K的细胞毒性很强，在40μg/ml时细胞存活率接近20％，而LHRss3的细胞毒性较低，在100μg/ml时细胞存活几乎不受影响，细胞存活率大于90％，在200μg/ml时80％左右的存活率。
实施例9：LHRss3/(DOX/TRAIL)的药效研究
将实验分为5组：对照组、单纯DOX组、单载DOX组、单载TRAIL组、共载DOX和TRAIL组。将MCF-7、MCF-7/ADR按照8×103/孔接种于96孔板中，培养24h，使细胞汇合度达到50％。吸去培养基，每孔加入100μl含不同药物浓度的培养基(DOX:0.01、0.1、1、10、100μg/ml)，继续培养24、48h，CCK-8法检测细胞毒性，统计细胞存活率。
结果如图14,15所示，对于MCF-7细胞而言，单纯TRAIL及单载TRAIL组对细胞存活率几乎无影响；单纯DOX组、单载DOX组及共载DOX和TRAIL组，对细胞存活影响相似，IC50＝0.22μg/ml。对于MCF-7/ADR细胞而言，单纯TRAIL及单载TRAIL组对细胞存活率几乎无影响；单纯DOX对MCF-7/ADR细胞存活的影响也不大，当药物浓度达到100μg/ml时，细胞存活率仍有60％，对于单载DOX组，IC50＝6μg/ml，而共载DOX和TRAIL组，IC50＝2.5μg/ml。因此，将DOX包载在纳米胶束中增强了对耐药细胞的药效，说明化疗药物的入胞途径是产生耐药性的主要原因。而共载TRAIL后，增强了耐药细胞的敏感性。
实施例10：LHRss3/(DOX/TRAIL)促凋亡研究
将实验分为6组：对照组、载体组、单纯DOX组、单载DOX组、单载TRAIL组、共载DOX和TRAIL组。将MCF/ADR细胞按照4×105/孔接种于12孔板中，培养24h，使细胞汇合度达到80-90％。吸去培养基，每孔加入1ml含一定药物浓度的培养基(DOX：5μg/ml)，继续培养24h，流式细胞仪测定细胞凋亡。
结果如图16所示，对照组早期凋亡加晚期凋亡的总和即凋亡细胞总比例为2.34％、载体组为4.48％，单载TRAIL组为13.78％、单纯DOX组为12.73％，单载DOX组为66.19％，共载DOX和TRAIL组为83.78％。由此可见，药物经载体包裹后促进了细胞凋亡，且共载效果更加明显。
综合以上各项实施例，可见纳米载体LHRss3能有效地包载化疗药并携带pDNA片段进入靶细胞，化疗药在体内外对肿瘤细胞均有明显的抑制作用，pDNA在体内外均具有明显的转染效率，并且有较低的细胞毒性，说明LHRss适合作为化疗药与基因药联合应用的载体。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
Figure IDA0000956533020000011

Claims (6)

1.一种硫辛酸修饰的纳米多肽载体，其特征在于，所述的纳米多肽载体为硫辛酸修饰的多肽的聚合物，
所述的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述的硫辛酸修饰，是指硫辛酸的羧基与第一个组氨酸的氨基以酰胺基连接；所述的聚合物是通过硫辛酸二硫键经半胱氨酸进行交联形成的，
该硫辛酸修饰的纳米多肽载体的制备方法包括如下步骤：
(A)合成硫辛酸修饰的多肽；
(B)硫辛酸修饰的多肽类可降解纳米载体的制备：取步骤(A)合成的硫辛酸修饰的多肽与半胱氨酸盐酸盐溶解于甲醇中，使得半胱氨酸的摩尔量为硫辛酸修饰的多肽的10％，加入氢氧化钠溶液将pH调节至7.0，搅拌反应12h。
2.根据权利要求1所述的硫辛酸修饰的纳米多肽载体，其特征在于，所述的聚合物的分子量为3000-30000Da。
3.根据权利要求1所述的硫辛酸修饰的纳米多肽载体，其特征在于，步骤(B)反应后的溶液，用N2吹干。
4.根据权利要求3所述的硫辛酸修饰的纳米多肽载体，其特征在于，用N2吹干后的样品在-20℃保持。
5.一种如权利要求1所述的硫辛酸修饰的纳米多肽载体在制备联合化疗药物或基因药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的硫辛酸修饰的纳米多肽载体在制备联合化疗药物或基因药物中的应用，其特征在于，所述的应用具体如下：
将纳米多肽载体与化疗药物用超声乳化制备纳米胶束，再将其与DNA混合，制得共载体系；
所述的化疗药的包封率为10％-15％，纳米多肽载体与DNA的氮磷比为5:1-40:1。
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