一种多肽纳米载体及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域,具体涉及一种多肽纳米载体及其制备方法和应用。
背景技术
乳腺癌是世界女性最常见的恶性癌症之一。目前临床常用的乳腺癌治疗方法包括放射治疗、化学治疗、靶向治疗、内分泌治疗等,而化疗被认为是治疗乳腺癌的重要方式。然而,在化疗期间,耐药性经常发展,降低了乳腺癌的治愈率并且经常导致患者的死亡。急需新的治疗方式的突破。
随着对肿瘤免疫学研究的深入,癌症免疫疗法正在成为治疗许多癌症的标准方法,特别是以anti PD-1/PD-L1(免疫检查点阻断剂)的药物上市,带来的有益的临床结果和数十亿美元的市场,进一步促使了其的研究和发展。一系列涉及PD-1/PD-L1乳腺癌的临床试验也公布了令人可喜的成绩。但是,anti PD-1/PD-L1治疗中仅仅有一小部分患者受益。anti PD-1/PD-L1通过阻断PD-1功能,增强的T细胞应答,但肿瘤的免疫逃逸还涉及其他的免疫抑制分子如吲哚胺2,3-双加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO)。IDO(吲哚胺2,3-双加氧酶),是色氨酸沿着犬尿氨酸途径代谢分解的限速酶,从而导致色氨酸的耗竭,有研究表明色氨酸的代谢产物犬尿氨酸使得效应T细胞失活,树突状细胞免疫抑制的作用。一系列研究表明阻断PD-1和IDO通路可能是乳腺癌治疗的一种有潜力的治疗策略。
目前尚无一种多肽的纳米粒,并且能够靶向进行治疗乳腺癌免疫治疗的载体。
发明内容
在传统的给药方式下,抗体与正常组织的脱靶效应、在体内不能有效地传递的原因会带来一系列的免疫相关的副作用,不能达到预期的治疗效果,所以本发明考虑引入siRNA干扰,实现精确定位的方式来干扰PD-1/PD-L1通路的。1-甲基-DL-色氨酸(1-MT)具有IDO的药理抑制作用,可以增强T细胞依赖性抗肿瘤免疫。本发明设想联合1MT和anti-PD-L1siRNA治疗乳腺癌具有很好的前景。
以聚合物胶束为代表的一类具有核-壳纳米结构的纳米载体,可以有效的封装基因和化疗药物。基于肽的两亲性的结构,其中疏水核心可以包载不溶于水的药物,而阳离子的肽段可以压缩负电荷的siRNA。线性多肽(Lin TT1)(序列:AKRGARSTA)可以有效地结合肿瘤细胞表面和内皮细胞表面上的p32/gC1qR,实现有效乳腺癌肿瘤归巢和穿透。另外,组氨酸在多个研究中证实可以有效的实现内涵体逃逸,因为精氨酸的残基可以不同的pH环境中质子化和去质子化,它就是基于质子海绵假说来实现核内体逃逸。
本发明通过构建了胆固醇修饰的多肽Chol-HHHHHHHAKRGARSTA(简称CHL),可以通过自装配的形式将siRNA和化学药物1MT包载在胶束当中。在生理pH环境中,通过疏水作用力和π-π共轭将1MT被包载疏水性的核心中,同时siRNA结合在Lin TT1构成的阳离子外壳上。在静脉注射给药后,因为Lin TT1的靶向性可以精准的靶向到肿瘤部位,细胞内化后,由于低pH环境下CHL中组氨酸结构质子化,该胶束复合物可从胞内逃逸,从而导致复合物的溶胀,加速药物释放,并将治疗基因递送至细胞核。
本发明的目的在于提供一种安全低毒的包裹免疫治疗化学药物,外部包载基因的基因转染效率高的多肽类纳米载体。本发明的另一个目的是提供该多肽纳米载体的制备方法;本发明的第三目的是提供该多肽纳米载体在免疫治疗化学药物与基因治疗药物中的联合应用。
本发明所要解决的主要技术问题是:如何提高多肽纳米载体载运siRNA基因片段进入细胞并有效转染的能力,以及如何提高多肽纳米载体共载免疫治疗化学药物能力,
本发明设计了一种胆固醇修饰的多肽纳米载体,Lin TT1带正电荷可与带负电的基因片段结合并具有乳腺癌穿膜和定位的作用,组氨酸因其质子海绵效应而促进基因片段内涵体逃逸,进入细胞后可以达到内涵体逃逸和释药的目的。
本发明的第一方面,提供一种多肽,所述的多肽的氨基酸序列如下所示:
HHHHHHHAKRGARSTA(SEQ ID NO.1)。氨基酸之间以肽键相连。多肽部分的英文缩写为HL。
本发明的第二方面,提供一种胆固醇修饰的多肽,为胆固醇修饰的上述多肽,所述的胆固醇修饰,是指多肽的氨基与胆固醇的羧基以酰胺键连接。胆固醇修饰的上述多肽的英文缩写为CHL。
进一步的,所述的胆固醇修饰的上述多肽的化学结构如式(I)所示:
进一步的,所述的胆固醇修饰的多肽的分子量为2289-2300Da。优选为2289.65Da。
本发明的第三方面,提供一种多肽纳米载体,其制备方法包括如下步骤:
(A)胆固醇修饰的上述多肽的合成:合成Chol-HHHHHHHAKRGARSTA(简称CHL);
(B)合成的CHL溶于DMSO,加入分子截留量1000的透析袋中,于水中透析12h,每2h换水一次,浓缩后冻干后复溶即得。
进一步的,步骤(B)反应后的溶液,浓缩后用冻干机冻干。
进一步的,步骤(B)透析袋中,透析液为蒸馏水,透析12小时。
在本发明的一个实施例中,步骤(B)具体为:合成的CHL溶于DMSO,加入分子截留量1000的透析袋中,于水中透析12h,每2h换水一次,浓缩后冻干后复溶制得空白CHL纳米胶束(Blank-CHL)。
为维持多肽纳米载体材料较高的活性,将透析后的溶液冷冻干燥,并保存于-20℃,纳米材料在复溶后可在4℃长期保存。
本发明的第四方面,提供一种上述的多肽、胆固醇修饰的多肽、多肽纳米载体在制备化疗药物或基因药物中的应用。
本发明的第五方面,提供一种上述的多肽、胆固醇修饰的多肽、多肽纳米载体在制备联合化疗药物和基因药物中的应用。
进一步的,本发明提供上述的多肽、胆固醇修饰的多肽、多肽纳米载体在制备乳腺癌治疗药物中的应用。
进一步的,本发明还提供上述的多肽纳米载体共载基因和化疗药物,在制备乳腺癌治疗药物中的应用。
所述的应用,是指多肽纳米载体中的精氨酸带正电可以与带负电的基因进行结合。
所述的应用,是指多肽纳米载体中的胆固醇的脂溶性可以包载脂溶性的化学药物。
所述的基因,为siRNA。
优选的,所述的基因为siPD-L1,其序列如下所示:
正义链:5’-AGAcGuAAGcAGuGuuGAA-3’(SEQ ID NO.2);
反义链:5’-UUcAAcACUGCUuACGUCU-3’(SEQ ID NO.3)。
所述的正义链和反义链还可以在3’端再加上TT以增加siRNA的稳定性。
所述的化疗药物,为水不溶性的1-甲基色氨酸(1MT)。
进一步的,所述的应用:
将纳米载体与化疗药物用透析法制备纳米胶束,再将其与siRNA混合,制得共载体系;
所述的化疗药物的包封率为75-80%,纳米载体与RNA的氮磷比为5:1-40:1。
所述的多肽纳米载体包载1MT的能力,在投料比CHL:1MT=3:1时具有较好的载药量和包封率。
进一步的,将此多肽纳米载体与siPD-L1混合,制得基因转染体系。
所述的CHL与siPD-L1的N/P比为5:1-40:1,在此比例范围内,所述纳米载体材料能够引导siPD-L1进入细胞内,有较高的转染效率。优选N/P比20:1。
在本发明的一个实施例中,将CHL和1-甲基色氨酸(1MT)分别溶于DMSO中制备溶液,加入分子截留量1000的透析袋中,于水中透析12h,每2h换水一次,透析后制得胶束1MT-CHL,在低温冻干后-20℃保存,复溶1MT-CHL后按CHL与siPD-L1的氮磷比(N/P)5:1-40:1与siPD-L1混合,涡旋10s后静置30min,即得Co-CHL(共载免疫检查点阻断剂siPD-L1和1MT的Co-CHL纳米胶束)。
优选的,所述的CHL与siPD-L1在缓冲液中混合,缓冲液pH为5.0-7.0,室温孵育20~30分钟,合理的pH值和孵育时间确保了基因转染体系的形成。
本发明提供的多肽纳米载体适用于实验所需的治疗性siRNA及化疗药物。
本发明优点在于:
1、本发明的多肽纳米载体由多种氨基酸和胆固醇组成,所形成的胆固醇修饰的多肽可在对细胞及人体无毒副作用,CCK-8法细胞增殖试验表明,制备的纳米载体具有很低的细胞毒性,同时又有较好的共载基因与化学药的能力,因此非常适合于体内外的化疗与基因治疗研究与应用。
2、本发明的制备方法操作简单,反应试剂和得到的产物无毒性,不会对环境产生污染,反应条件温和,反应后得到的多肽纳米载体纯化简单,成本低廉,利于大规模推广于研究和应用领域。
3、本发明的多肽纳米载体在乳腺癌治疗中能成功递送siRNA抑制化疗药物引起的自噬特异性增强肿瘤细胞对化疗药的敏感性,促进乳腺癌细胞的凋亡,从而成为乳腺癌治疗的一种靶向、高效、低毒的纳米级递送系统。
附图说明
图1.CHL的核磁共振氢谱图;
图2.CHL合成纯度的HPLC图;
图3.N/P为20时Co-CHL纳米胶束的粒径图;
图4.N/P为20时Co-CHL纳米胶束的电位图;
图5.Co-CHL纳米胶束透视电镜图;
图6.不同pH条件下1MT的释放度考察;
图7.不同时间点4T1细胞对Nile Red-CHL的摄取情况;
图8.不同N/P 4T1细胞对FAM-siPD-L1的摄取情况;
图9.Co-CHL在4T1细胞内胞内分布情况;
图10.不同浓度条件下载体对细胞的细胞毒性考察;
图11. 1MT,1MT-CHL,Co-CHL细胞毒性考察;
图12.不同浓度时siPD-L1的转染效果;
图13.犬尿氨酸生成抑制;
图14.肿瘤-淋巴细胞共培养环境下药物刺激肿瘤细胞凋亡。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1:胆固醇修饰的多肽的合成
胆固醇修饰的多肽:Chol-HHHHHHHAKRGARSTA,由浙江鸿拓有限公司采用多肽固相合成法合成并命名为CHL,利用制备高效液相色谱纯化合成的CHL,使其纯度达到95%以上。其中HL为多肽,组氨酸等氨基酸之间以肽键连接形成16肽(图1、图2)。
实施例2:CHL胶束载化学药物和基因的方法
将CHL和1-甲基色氨酸(1MT,南京艾康)分别溶于DMSO中制备溶液,透析后制得胶束1MT-CHL,在低温冻干后-20℃保存,复溶1MT-CHL后按氮磷比(N/P)分别为5、10、20、40与siPD-L1混合,涡旋10s后静置30min,即得Co-CHL(即共载免疫检查点阻断剂siPD-L1和1MT的Co-CHL纳米胶束)。纳米胶束的平均粒径与N/P有关,当N/P=20时得到最佳粒径,粒径在80-300之间,具体见图3,粒径大小与图5Co-CHL透视电镜图相一致。纳米胶束的Zeta电位对N/P的增大而升高,在N/P大于2.5时稳定在0-30mV,见图4。
实施例3:1MT体外释放特性考察
采用透析袋法(赵志娟等,肺靶向阿霉素微球的体外释放度测定方法的建立,山西医药杂志,2007,4(36):304-305.),进一步评价Co-CHL在不同pH下的释放度,选择相对分子质量1000的透析袋,透析介质为pH7.4的PBS溶液和pH5.0,37℃下。将Co-CHL溶液置于透析袋中,放于含有50mL的透析液中,100r/min,分别于2,4,6,8,10,12,24,48点取1mL外液,并补加1mL透析液,利用HPLC测定浓度,绘制体外释放曲线。这是由于肽在pH5.0时亲水性增强所致。由于组氨酸咪唑基的pKa约为6.0,咪唑在微酸性环境下的质子化将消失,破坏H7与1-MT之间的疏水相互作用,导致胶束的致密性降低,药物在pH5.0时迅速释放。
如图6所示,在pH=5时1MT从Co-CHL中的释放速度,释放率均高于pH=7.4时,总的释放度约为78%左右。
实施例4:CHL胶束细胞摄取考察
小鼠乳腺癌4T1细胞铺12孔板,以每孔3×106铺板,以前述制备方法,采用透析法以Nile Red(尼罗红)代替1MT制备Nile Red-CHL,细胞培养板中分别给予尼罗红,NileRed-CHL补充不含血清培养基到500μL。1h,2h,4h后移除培养基,用PBS洗涤三次后,胰酶消化后使得细胞悬浮下PBS中,利用流式细胞仪检测4T1细胞(小鼠乳腺癌肿瘤细胞)对NileRed的摄取情况进行考察。
同法用FAM标记的siPD-L1(100nM)制备siPD-L1-CHL胶束,依照N/P比0,5,10,20,40,80分别制备FAM-siRNA/CHL胶束,同4T1细胞培养4h后移除培养基,用PBS洗涤三次后,胰酶消化后使得细胞悬浮于PBS中,利用流式细胞仪检测4T1细胞对CHL胶束的摄取情况和平均荧光强度。
如图7所示,在4h时,4T1细胞对Nile Red大于自由状态Nile Red,说明在CHL的介导下Nile Red摄取大大增加。
如图8所示,在N/P=20时,4T1细胞对siPD-L1摄取达到最大,而随着N/P的增加,摄取不再增加。
实施例5:Co-CHL的细胞分布情况
以前述制备方法,采用透析法以Nile Red代替1MT制备Nile Red-CHL,以FAM标记的siPD-L1制备FAM-PD-L1-CHL,同法制备Co-CHL胶束。4T1细胞以每孔5×104cells铺24孔板,培养24h后,使细胞汇合度达70-80%,将培养基更换为无血清培养基。用前法制备的Nile Red,Nile Red-CHL胶束,Co-CHL胶束(100nM of FAM-siRNA,N/P=20)胶束加入培养板中,37℃,5%CO2培养4h后,吸去培养基,PBS洗1次,预冷的4%多聚甲醇固定30min,PBS洗3次。吸取8μL含有DAPI的封片液滴于载玻片上,将圆形盖玻片取出,使含有细胞的一面贴于含有DAPI液的载玻片上。利用激光共聚焦显微镜观察多肽胶束。在4T1细胞内的分布情况,并拍照记录。
结果如图9所示,通过激光共聚焦实验考察Co-CHL在细胞内分布情况,图中用红色的Nile Red代表1MT,用绿色标记FAM的RNA,蓝色的DAPI染色的细胞核。Nile Red-CHL组、Co-CHL组中,Nile Red红色荧光与细胞核的蓝色荧光重合,说明在CHL载体的介导下更多Nile Red进入细胞质,FAM-PD-L1-CHL组,Co-CHL组中在载体CHL介导的FAM-siRNA中绿色的RNA荧光围绕在蓝色细胞核周围说明,CHL将RNA载送入细胞中。而从Co-CHL组可见从合并图中黄色的荧光部分(绿色和红色荧光叠加而来)主要集中在细胞核周围说明,CHL将FAM-RNA和Nile Red载入到细胞中。
实施例6:Co-CHL的细胞毒性研究
细胞毒性测定采用CCK8法检测Blank-CHL,1-MT-CHL,Co-CHL对4T1细胞的细胞毒性。
4T1细胞在细胞培养到80%融合时,用胰酶消化并计数,以每孔密度为5000个细胞/孔,铺96孔板,细胞在含有10%胎牛血清的RMPI-1640培养基中生长24小时。然后,移除旧的培养基后在每孔中加入不同浓度CHL的样品,并用不含血清的培养基补充到100μL。24h后,培养板移去旧的培养基,重新加入90μL培养基和10μL CCK8试剂,然后放入孵育箱中放置2h。取出需要检测的培养板,放于酶标仪震荡30s,然后测定在450nm波长处的各个孔的OD值。空白组为未接种细胞组的OD值,对照组为未加入药物的OD值,每个孔重复测量6次。1MT-CHL,Co-CHL细胞存活率依照上法进行。
存活率=[1-(实验组-空白组)/(对照组-空白组)]*100%
如图10所示,在载体浓度为200μg/mL时细胞的活力仍在90%以上。说明载体CHL本身的毒性较低,可以排除下步实验中因为载体毒性所引起的细胞活力的下降。如图11所示,细胞活力实验发现,单独1MT,1MT-CHL,Co-CHL组细胞活力并没有显著性差异,说明这表明在这些实验条件下Co-CHL纳米胶束并没有明显的毒性。
实施例7:siPD-L1-CHL的体外转染效率考察
以2×106cells/孔铺6孔板,培养过夜后,移去培养基后加入每孔加入含有IFN-γ(25ng/mL)培养基培养24h,移去培养基加入PBS洗一次,加入空白培养基,含有50、100、150nM siPD-L1-CHL的培养基培养24h后,移去培养基用PBS洗涤一次,小心用细胞刮刀收集细胞,进WB检测。
如图12所示,在80nM时siPD-L1可以显著抑制4T1细胞PD-L1的表达,抑制率达到50%。
实施例8:犬尿氨酸生成抑制
通过检测犬尿氨酸生产量来研究1MT和1MT-CHL对4T1细胞IDO的抑制作用。4T1细胞以5000个细胞/孔铺96孔板,培养过夜后。然后更换含有重组小鼠IFN-γ(50ng/mL)新鲜培养基刺激肿瘤细胞的IDO的表达。同时,不同浓度的1MT-CHL胶束(等效1MT浓度1,5,10,20,100,200μM)加入96孔培养板。经过12h的培养后,100μL上层清液中加入三氯乙酸(75μL;30%)在50℃烘箱中30分钟水解N-甲酰犬尿氨酸为犬尿氨酸。然后在室温下,用等量的Ehrlich试剂(2%对二甲胺基苯甲醛的冰醋酸溶液(w/v))孵育10min。在490nm的条件下,酶标仪测定了反应产物的吸光度。
不同浓度的1MT或者1MT-CHL处理,12小时后在490nm处检测培养基中犬尿氨酸的量,如图13所示,从1MT-CHL中对犬尿氨酸生成的抑制效果优于单独的1MT给药组,单独1MT不易被细胞摄取,但在CHL胶束的介导下,细胞摄取1MT增加,犬尿氨酸的生成受到抑制。
实施例9:Co-CHL的促凋亡研究
4T1细胞在细胞培养到80%融合时,用胰酶消化后PBS洗涤、离心,用预先配置的含有IFN-γ(25ng/mL)的培养基培养24h,诱导4T1细胞表面PD-L1的高表达,而后移去旧的培养基加入按照肿瘤细胞:淋巴细胞量=1:10的比例加入预先从Balb/c(6周,雌性)脾脏分离(splenocytes)的淋巴细胞培养12h后)制成细胞混合悬液,将上述制得的细胞混悬液加入12孔板,每孔1mL,而后加入CHL,1MT,1MT-CHL,siPD-L1-CHL,Co-CHL刺激,48h后收集培养板孔中的细胞,用胰酶收集贴壁的4T1肿瘤细胞。
将收集到的细胞用预先配置好的淋巴细胞特异标识点CD45-BV421分选后,用,细胞凋亡试剂盒Annexin V-PI染色后,室温避光染色10min后,用缓冲液洗涤后,进行流式细胞仪检测,肿瘤细胞凋亡/死亡的部分。
结果如图14所示,siPD-L1-CHL和Co-CHL可有效下调肿瘤细胞中PD-L1的表达,从而恢复淋巴细胞的细胞毒性,起到肿瘤细胞杀伤的作用。虽然单独的1MT或1MT-CHL也具有诱导淋巴细胞杀死肿瘤的能力,但作用明显低于是siPD-L1。与siPD-L1-CHL相比,Co-CHL的诱导的肿瘤细胞凋亡率明显提高,可以看出,载体递送进入细胞质中的1MT可以放大这种效应。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明,但本发明创造并不限于所述实施例,熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换,这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
序列表
<110> 上海维洱生物医药科技有限公司
上海宝龙药业有限公司
宝龙药业有限公司
上海宝龙安庆药业有限公司
<120> 一种多肽纳米载体及其制备方法和应用
<130> /
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 1
His His His His His His His Ala Lys Arg Gly Ala Arg Ser Thr Ala
1 5 10 15
<210> 2
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 2
agacguaagc aguguugaa 19
<210> 3
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 3
uucaacacug cuuacgucu 19