CN113730580B - Pd-l1抑制剂在制备药物或试剂盒中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及PD‑L1抑制剂在制备药物或试剂盒中的用途。本发明提供PD‑L1抑制剂在制备药物或试剂盒中的用途，所述药物或试剂盒用于：治疗肿瘤；和/或，调节STAT3蛋白的表达水平；和/或，调节STAT3蛋白的磷酸化水平。本发明所提供的PD‑L1抑制剂的用途可以在没有T细胞的情况下，有效促进肿瘤细胞凋亡抑制其增殖，抑制肿瘤组织生长，且不会引起明显的组织损伤和炎症反应，从而提供了一种高效的、特异性强的、能从根源上抑制检查点蛋白的表达但又不依赖于T细胞的免疫治疗新策略，具有良好的产业化前景。

Description

PD-L1抑制剂在制备药物或试剂盒中的用途

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及PD-L1抑制剂在制备药物或试剂盒中的用途。

背景技术

非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是最具致死率的肿瘤之一，在肺癌中约占80％～85％，具有PD-L1过表达和免疫耐药倾向的特点。目前，用于晚期NSCLC患者的治疗方法主要为手术、化疗和放疗等传统的肿瘤治疗手段，但治疗效果欠佳。自2015年FDA批准首个PD-1(程序死亡蛋白1)抗体(Nivolumab)作为免疫检查点抑制剂用于治疗晚期NSCLC后，免疫治疗成为除化疗和靶向治疗外的第三大治疗手段。

使用免疫检查点抑制剂以增强宿主免疫防御来攻击肿瘤细胞被认为是对抗晚期癌症最有力的武器之一。由于在一部分非小细胞肺癌中程序性死亡蛋白配体1(PD-L1)过表达，并与受体PD-1结合，抑制细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的细胞活性，诱导免疫逃逸。目前临床中应用的免疫检查点抑制剂主要是通过竞争性的与肿瘤细胞表面的PD-L1结合，从而阻断其与免疫细胞表面的受体PD-1之间的信号转导，重新激活T细胞发挥免疫监视作用。

然而，由于患者自身生理、心理因素的不同以及传统检查点封锁疗法固有的挑战，持续的临床治疗效益仅在极少数患者身上才能实现。实际上，治疗效果的关键决定因素很大程度上取决于肿瘤组织周围杀伤肿瘤T细胞的数量。然而，大多数募集或浸润的T细胞(>90％)被认为是不能识别和杀死周围肿瘤细胞的“旁观者”T细胞。一些癌症患者体内甚至没有肿瘤浸润性T细胞。此外，检查点阻断抗体只能阻断细胞膜上的免疫检查点，而细胞内在不断的产生新的免疫检查点蛋白并由细胞质转运到细胞膜上，因此，这种抑制作用并不持久。其次，检查点阻断抗体甚至可以攻击那些没有处于适当激活状态的T细胞，诱导对其进一步免疫治疗的抵抗作用，最终导致治疗失败。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供PD-L1抑制剂在制备药物或试剂盒中的用途，用于解决现有技术中的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明一方面提供PD-L1抑制剂在制备药物或试剂盒中的用途，所述药物或试剂盒用于：

1)治疗肿瘤；和/或，

2)调节STAT3蛋白的表达水平；和/或，

3)调节STAT3蛋白的磷酸化水平。

在本发明一些实施方式中，在不依赖T细胞的条件下治疗肿瘤。

在本发明一些实施方式中，在不依赖T细胞的条件下调节STAT3蛋白的表达水平。

在本发明一些实施方式中，在不依赖T细胞的条件下调节STAT3蛋白的磷酸化水平。

在本发明一些实施方式中，所述药物为非肿瘤免疫治疗药物，优选为肿瘤细胞凋亡促进药物。

在本发明一些实施方式中，所述PD-L1抑制剂能够抑制PD-L1的表达和/或功能。

在本发明一些实施方式中，所述PD-L1抑制剂为单一有效成分。

在本发明一些实施方式中，所述PD-L1抑制剂选自核酸分子、蛋白分子或化合物。

在本发明一些实施方式中，所述核酸分子选自针对PD-L1的干扰RNA、针对PD-L1的反义寡核苷酸、用于敲除或敲减PD-L1表达的物质。

在本发明一些实施方式中，所述肿瘤选自PD-L1阳性的肿瘤，优选的，所述肿瘤选自非小细胞肺癌肿瘤。

在本发明一些实施方式中，所述药物或试剂盒用于下调STAT3蛋白的表达水平。

在本发明一些实施方式中，所述药物或试剂盒用于下调STAT3蛋白的磷酸化水平。

在本发明一些实施方式中，所述PD-L1抑制剂包裹于修饰有靶向多肽的脂质体中，所述靶向多肽的化学结构式如式I所示：

在本发明一些实施方式中，通过式II化合物形成所述脂质体：

在本发明一些实施方式中，所述脂质体为球形脂质体。

在本发明一些实施方式中，所述修饰有靶向多肽的脂质体的平均粒径为80～120nm。

附图说明

图1显示为本发明实施例1中马来酰亚胺功能化的支链聚合物结构鉴定示意图。

图2显示为本发明实施例1中支链聚合物和靶向支链聚合物的合成路线示意图。

图3显示为本发明实施例1中基于RNAi的肽靶向纳米阻断剂的组装和纳米阻断剂的表征示意图。

图4显示为本发明实施例2中流式细胞术分析和共聚焦荧光成像示意图。

图5显示为本发明实施例2中Nanoblocker的基因沉默效率示意图。

图6显示为本发明实施例2中Nanoblocker的作用机理示意图。

图7显示为本发明实施例2中Nanoblocker的体外抑瘤效果示意图。

图8显示为本发明实施例3中靶向及非靶向Nanoblocker的体内实验示意图。

图9显示为本发明实施例3中Nanoblocker体内PD-L1基因敲除的效果示意图。

图10显示为本发明实施例4中Nanoblocker的体内安全性评估示意图。

具体实施方式

为了使本发明的发明目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容容易地了解本申请发明的其他优点及功效。

本发明第一方面提供PD-L1抑制剂在制备药物或试剂盒中的用途，所述药物或试剂盒用于治疗肿瘤。本发明发明人发现，对PD-L1蛋白进行沉默以后，在T细胞不存在的条件下可以有效促进肿瘤细胞(例如，H460细胞)凋亡，而在荷瘤小鼠动物模型中，施用PD-L1抑制剂的小鼠的肿瘤生长明显被抑制，并且对体重无明显影响，且不会导致炎症因子(例如，IL-6、IL-10、MCP-1、INF-γ、INF、IL-12p70等)水平显著升高，从而验证了PD-L1抑制剂可以被作为用于治疗肿瘤的药物。

本发明中，“治疗”一词包括可导致欲求的药学和/或生理效果的预防性、治愈性或缓和性处置。该效果较佳是指医疗上可减少疾病的一种或多种症状或者完全消除疾病，或阻滞、延迟疾病的发生和/或降低疾病发展或恶化的风险。

本发明第二方面提供PD-L1抑制剂在制备药物或试剂盒中的用途，所述药物或试剂盒用于调节STAT3蛋白的表达水平，或者用于调节STAT3蛋白的磷酸化水平。本发明发明人发现，对PD-L1蛋白进行沉默以后，可以激活肿瘤细胞内的细胞凋亡信号通路STAT3/CASP-7，并进一步影响STAT3蛋白的表达水平和STAT3蛋白的磷酸化水平，从而验证了PD-L1抑制剂可以被用于调节STAT3蛋白的表达水平，或者被用于调节STAT3蛋白的磷酸化水平。所述调节STAT3蛋白的表达水平通常可以是下调STAT3蛋白的表达水平，例如，可以是作为STAT3蛋白抑制剂；所述调节STAT3蛋白的磷酸化水平可以是下调STAT3蛋白的磷酸化水平，例如，可以是作为STAT3磷酸化蛋白的抑制剂。

本发明中，所述PD-L1抑制剂通常可以在不依赖T细胞的条件下治疗肿瘤、调节STAT3蛋白的表达水平、或者调节STAT3蛋白的磷酸化水平。也就是说，PD-L1抑制剂可以不同于通常的肿瘤免疫治疗药物，可以不依赖于免疫系统或T细胞发挥作用，直接调节STAT3蛋白的表达水平、或者调节STAT3蛋白的磷酸化水平，诱导肿瘤细胞自身发生凋亡，从而可以作为一种非肿瘤免疫治疗药物，更具体可以作为一种肿瘤细胞凋亡促进药物。本发明发明人发现，在T细胞缺失的细胞实验中，对PD-L1蛋白进行沉默以后即可以有效促进肿瘤细胞(例如，H460细胞)凋亡，且可以激活肿瘤细胞内的细胞凋亡信号通路STAT3/CASP-7。而在T细胞缺失的荷瘤小鼠动物模型中(例如，免疫胸腺缺陷的裸鼠，T细胞免疫功能缺失)，施用PD-L1抑制剂的小鼠的肿瘤生长明显被抑制，并且对体重无明显影响，且不会导致炎症因子水平显著升高。

本发明中，所述PD-L1抑制剂通常指可以抑制PD-L1的表达和/或功能的物质。例如，所述PD-L1抑制剂可以部分抑制，即降低PD-L1的表达和/或功能，也可为完全抑制，即完全消除PD-L1的表达和/或其功能。合适的能够作为PD-L1的物质的种类对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，所述抑制剂可以是拮抗剂、阻断剂等，再例如，所述PD-L1抑制剂的抑制功能可以是在PD-L1基因核酸分子水平(例如，mRNA水平、DNA水平)和/或蛋白分子水平上表达水平的抑制。更具体的，所述PD-L1抑制剂可以是核酸分子、蛋白分子或化合物等，例如，所述核酸分子可以选自针对PD-L1的干扰RNA、针对PD-L1的反义寡核苷酸、用于敲除或敲减PD-L1表达的物质，更具体可以是siRNA、miRNA、shRNA、基因敲除载体、基因表达载体(例如，能够表达siRNA、shRNA、干扰RNA等)等。在本发明一具体实施例中，所述核酸分子的靶序列可以包括SEQ ID No.2所示的序列。在本发明另一具体实施例中，所述核酸分子的多核苷酸序列可以包括SEQ ID No.1所示的序列。

5’-UUC AUU UGG AGG AUG UGC CUU-3’(SEQ ID NO.1)

5’-GGC ACA UCC UCC AAA UGA AUU-3’(SEQ ID NO.2)

本发明所提供的药物或试剂盒中，所述PD-L1抑制剂可以是作为单一有效成分，也可以与其他活性组分进行组合，共同地用于治疗肿瘤、调节STAT3蛋白的表达水平、或调节STAT3蛋白的磷酸化水平。

本发明中，所述肿瘤通常为PD-L1阳性的肿瘤。所述PD-L1阳性通常指出现PD-L1的表达、或PD-L1的表达水平高于一定的标准，例如，PD-L1阳性可以是肿瘤组织中可检测出PD-L1的mRNA的表达，再例如，PD-L1阳性可以是肿瘤组织中可检测出PD-L1的蛋白的表达，再例如，PD-L1阳性可以是肿瘤组织的PD-L1的mRNA表达水平高于其周围健康组织，再例如，PD-L1阳性可以是肿瘤组织的PD-L1蛋白的表达水平高于其周围健康组织。所述肿瘤可以是实体瘤或血液肿瘤，更具体可以是非小细胞肺癌等。

本发明中，所述PD-L1抑制剂可以包裹于修饰有靶向多肽的脂质体中。通常来说，所述靶向多肽需要通过合适的修饰以修饰于脂质体上，例如，所述靶向多肽可以是经过支链聚合物(例如，PBPC等)修饰的多肽，由于多肽本身是亲水的，而支链聚合物为疏水的，这样可以使经过修饰后的多肽分别包括亲水端和疏水端，从而可以使靶向多肽能够与脂质体相互作用并将其包裹其中，而亲水的多肽本身则暴露在表面。在本发明一具体实施例中，所述靶向多肽的化学结构式如式I所示。本发明发明人发现，通过特定的靶向多肽修饰的脂质体，可以使得PD-L1抑制剂能够更加富集于肿瘤部位，且不会引起明显的组织损伤或炎症反应。所述脂质体通常可以位于水中，所述靶向多肽通常可以通过其脂质体之间的亲和力(例如，亲疏水相互作用)修饰于脂质体表面，形成修饰有靶向多肽的脂质体。

本发明中，合适的能够形成脂质体且能够包括PD-L1抑制剂的物质对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，用于形成脂质体的物质可以包括化学结构式如式II所示的化合物；再例如，所形成的脂质体可以为球形脂质体；再例如，可以将用于形成脂质体的物质(例如，阳离子类脂分子等)、PD-L1抑制剂分散于水中，还可以进一步将靶向多肽分散于水中，使其自组装形成包裹有PD-L1抑制剂的脂质体，所述脂质体可以修饰有靶向多肽。在制备过程中，带负电荷的siRNA分子自发地与用于形成脂质体的物质通过静电相互作用组装成小配合物，再进一步加入靶向多肽，通过亲疏水相互作用即可自组装成包裹有PD-L1抑制剂的核壳聚合物。对于制备获得的修饰有靶向多肽的脂质体，其中包裹有PD-L1抑制剂，其整体的形状可以为球形，所述修饰有靶向多肽的脂质体的平均粒径为80～120nm、80～90nm、90～95nm、95～100nm、100～105nm、105～110nm、或110～120nm。

本发明第三方面提供一种组合物，所述组合物包括PD-L1抑制剂，所述组合物用于：治疗肿瘤；和/或，调节STAT3蛋白的表达水平；和/或，调节STAT3蛋白的磷酸化水平。所述PD-L1抑制剂可以是如上所述的各种PD-L1抑制剂。

本发明第四方面提供一种调控方法，所述调控方法可以用于调节STAT3蛋白的表达水平，或用于调节STAT3蛋白的磷酸化水平，具体可以用于调节个体、细胞等中STAT3蛋白的表达水平、或STAT3蛋白的磷酸化水平。例如，可以是向个体施用有效量的PD-L1抑制剂、或本发明第三方面所提供的组合物。

本发明第五方面提供一种治疗方法包括：向个体施用治疗有效量的PD-L1抑制剂、或本发明第三方面所提供的组合物。本发明所提供的治疗方法可以用于治疗包括但不限于肿瘤等的适应症。所述肿瘤通常为PD-L1阳性的肿瘤等，更具体可以是实体瘤或血液肿瘤，更具体可以是非小细胞肺癌等。

本发明中，“个体”通常包括人类、非人类的灵长类，如哺乳动物、狗、猫、马、羊、猪、牛等，其可因利用所述制剂、试剂盒或联合制剂进行治疗而获益。

本发明中，“治疗有效量”通常指一用量在经过适当的给药期间后，能够达到治疗如上所列出的疾病的效果。

本发明所提供的PD-L1抑制剂的用途可以在没有T细胞的情况下，有效促进肿瘤细胞凋亡抑制其增殖，抑制肿瘤组织生长，且不会引起明显的组织损伤和炎症反应，从而提供了一种高效的、特异性强的、能从根源上抑制检查点蛋白的表达但又不依赖于T细胞的免疫治疗新策略，具有良好的产业化前景。

下面通过实施例对本申请的发明予以进一步说明，但并不因此而限制本申请的范围。

实施例1

靶向纳米阻断剂Nanblocker的设计和构建：

马来酰亚胺功能化的分支聚合物的合成：如图2所示，将234.8mg mPEG-NH2MW:3400(a)、10mg MAL-PEG-NH2MW:5000(b)和聚(马来酸酐-alt-1-十八烯)平均Mn30,000-50,000,(c)溶于15mL DMSO与吡啶体积比为9:1的溶液中反应12小时，然后加入溶于400μLDMSO中的22mgN-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐(d)，继续反应24小时，获得的支链聚合物用去离子水透析，真空干燥，核磁氢谱表征结果显示，成功获得了马来酰亚胺功能化的支链聚合物，核磁数据如图1所示，得到160mg左右的产物。

肿瘤归巢肽修饰的支链聚合物的合成：如图2所示，将CREKA靶向识别肽与马来酰亚胺功能化的支链聚合物(投料摩尔比为2:1，上文中制备获得)溶解于20mL的10％甲醇溶液中，无氧条件下室温搅拌反应4小时，然后去离子水透析去掉未反应上的小分子多肽，冷冻干燥的靶向支链聚合物，负20℃保存待用。

肿瘤靶向的纳米阻断剂(Nanoblocker)及非靶向纳米阻断剂的组装：如图3A所示，首先，将1,2-环氧十四烷与PAMAM树状分子G0(生成0代乙二胺核)以7:1的摩尔比混合，合成了类脂配体。向装有25ml异丙醇的圆底烧瓶中加入2g 20％PAMMA原液和1.15g 1,2-环氧十四烷，然后在90℃油浴下剧烈搅拌(1200rpm)2天。采用梯度硅胶柱层析法对产物进行分离，将溶解在无核酸酶水中的siRNA(SEQ ID NO.1)加入到含有类脂配体(类脂配体/siRNA,N/P＝10)和含有靶向支链聚合物(上文中制备获得)及非靶向支链聚合物(即，没有靶向多肽配体修饰的支链聚合物)的THF溶液中搅拌，制备负载siRNA的纳米阻断剂。搅拌10min后，转入超滤装置(EMD Millipore,MWCO 100k)，离心收集靶向及非靶向肿瘤的Nanoblocker，经过三次水洗后，将Nanoblocker重新分散在生理盐缓冲液中进行实验。

纳米阻断剂的结构及形貌表征：通过透射电镜和原子力显微镜及水合粒径DLS表征Nanoblocker的大小(图3B-E)直径在100nm以内，DLS Zeta电势数据表明该结构成电中性。

实施例2

体外Nanoblocker不依赖于T细胞的抗肿瘤效果：

使用绿色荧光蛋白表达的A549(GFP-A549)细胞来研究工程纳米载体的细胞内siRNA传递，将GFP-A549细胞与Cy5siRNA(sense strand 5’-GGC ACA UCC UCC AAA UGAAUU-3’，SEQ ID NO.3；Antisense strand 5’-Cy5-UCC UUG AAG AAG AUG GUG CUU-3’，SEQID NO.4)负载的Nanoblocker孵育，通过流式细胞术分析和共聚焦荧光成像观察两种剂型的细胞摄取情况(图4A-B，附图中，non-targeted为非靶向的Nanoblocker，targeted为靶向的Nanoblocker)。两种制剂在孵育2小时后均可被A549细胞迅速内化，但靶向的细胞摄取高于非靶向的Nanoblocker，在处理6小时后更明显，说明靶向的Nanoblocker具有良好的靶向肿瘤的能力。

进一步评估Nanoblocker和商用转染试剂(Lipofectamine 2000或Lipo2K)的基因沉默效率，具体步骤如下：利用上述方法将靶向GFP的siRNA(sense strand 5’-GCA CCAUCU UCU UCA AGG AUU-3’，SEQ ID NO.5；Antisense strand 5’-UCC UUG AAG AAG AUGGUG CUU-3’，SEQ ID NO.6)包裹在靶向和非靶向纳米阻断剂中。在体外研究中，以每孔5k细胞的密度将表达GFP的A549细胞接种于96孔板中，然后在37℃、5％CO2和加湿的空气中培养过夜。此后，在5nM siRNA剂量下分别加入载GFP siRNA的T NPs、NT NPs和lipo2k，治疗48h后，通过共聚焦荧光成像和流式细胞术检测对照组和实验组中GFP的表达情况。结果表明我们的这种策略基因沉默效果达到90％以上，远远要比商业化转染试剂效果高(如图5，blank为空白对照，Lip-2K为商用转染试剂，non-target为非靶向的Nanoblocker，targeted为靶向的Nanoblocker)，且没有表现出明显的细胞毒副作用。

此外，细胞凋亡实验，H460细胞种六孔板，200k细胞/孔，24h贴壁后分别加入工作浓度5nM的T,NT,NC和PBS，继续培养48h,收集包含有培养液的所有细胞，1000g离心5min，按照凋亡试剂盒进行凋亡染色及处理，上流式进行细胞凋亡的荧光检测分析，具体实验结果如图5所示。从图5可知，在没有T细胞的情况下，采用基于RNAi的Nanoblocker沉默PD-L1直接导致H460细胞显著死亡(图6A-D，A:PBS对照组，B:NC siGFP的RNA对照序列组，C:NT非靶向纳米制剂组，T:靶向纳米制剂组)，在对照组细胞凋亡数为7％的基础上实验组经纳米阻断剂处理后细胞凋亡达到46％左右(图6D)。

进一步对其凋亡机制进行探索，具体步骤如下：H460细胞种六孔板，200k细胞/孔，24h贴壁后分别加入工作浓度5nM的T,NT,NC和PBS，继续培养48h，收集细胞，分别提取总蛋白，进行Western blot检测分析。可以发现siRNA对靶蛋白PDL1的沉默激活了肿瘤细胞内的细胞凋亡信号通路STAT3/CASP-7(图6E，blank为空白对照，NC为siGFP RNA序列的Nanoblocker NT为非靶向的Nanoblocker，T为靶向的Nanoblocker)。

此外，还考察了纳米阻断剂在体外抑制肿瘤增殖的效果，并且用PD-L1低表达的A549细胞作为对照，具体步骤如下：A549细胞和H460细胞分别中六孔板，20k细胞/孔，24小时细胞贴壁后，分别加入5nM或10nM的纳米阻断剂，然后每隔天用无毒的染料对细胞进行计数，观察细胞的增殖情况，具体结果如图7所示。由图7可知，靶向纳米阻断剂明显的能够抑制PD-L1高表达的H460细胞增殖，而在PD-L1低表达的A549细胞中没有明显抑制作用(图7，PBS为空白对照，NC为siGFP RNA序列的Nanoblocker，NT为非靶向的Nanoblocvker,T为靶向的Nanoblocker)。

综上所述，由靶向支链聚合物制备的纳米阻断剂表现出了长期的抗肿瘤增殖效果，当对照组癌细胞以指数增殖的情况下，加入靶向Nanoblocker的组细胞增殖显著被抑制。

实施例3

靶向Nanoblocker在非小细胞肺癌动物模型中的免疫疗效：

对基于RNAi的Nanoblocker在活体内的靶向肿瘤能力进行评估，具体步骤如下：采用健康C57BL/6小鼠进行药动学研究。简而言之，将cy5.5-siRNA(sense strand 5’-Cy5-GCA CCA UCU UCU UCA AGG AUU-3’，SEQ ID NO.7；Antisense strand 5’-Cy5-UCC UUGAAG AAG AUG GUG CUU-3’，SEQ ID NO.8)负载的靶向和非靶向纳米制剂经尾静脉注射到C57BL/6小鼠体内。按规定的时间间隔抽取血液进行荧光定量。药代动力学结果(图8A)显示在健康小鼠血液中循环时间相对较长。

进一步验证纳米阻断剂的肿瘤靶向性，将负载H460异种移植瘤的小鼠(构建方法：为了建立H460异种移植瘤模型，在雌性balb/c裸小鼠4-5周龄时，将5x 10⁶H460细胞悬浮于基质胶和培养基(v/v,1:1)混合物注射在每只小鼠的背部皮下，监测各组肿瘤大小和体重，当肿瘤体积达到50-100mm³时，对小鼠进行体内实验)，连续三天注射靶向及非靶向siPD-L1递送的nanoblocker，PBS为对照组，每组3只小鼠，一天注射一次，每次1nmol siRNA,的量，连续注射三天，并使用Cy5.5siRNA负载的纳米阻断剂进行生物分布评估。两种靶向及非靶向制剂均可将siRNA递送至肿瘤组织。注射后24小时后的体内组织分布情况如图8B所示，可见，靶向制剂在肿瘤组织中比非靶向制剂有更高的siRNA富集，这是由于肿瘤靶向肽的修饰。

将携带H460异种移植瘤的雌性Balb/c裸鼠随机分为3个治疗组(每组3只)，肿瘤大小为50-100mm3。然后，这些组通过尾静脉给药(1nmol siRNA/小鼠/次)，以siGFP RNA装载的纳米制剂(NC)、siPD-L1装载的纳米制剂(NT)或siPD-L1装载的纳米制剂(T)静脉注射三次。最后注射24小时后将小鼠处死，收集肿瘤组织并各分为两部分，一部分用于进行PD-L1表达的Western blot分析，另一部分用与切片免疫组化分析。与体外结果一致的是，纳米载体抑制PD-L1的表达导致了肿瘤细胞的显著凋亡，DNA降解增加，增殖能力下降，TUNEL和Ki-67染色分别证实了这一点(图9A、图9B，PBS为空白对照，NC为siGFP的RNA对照序列组，NT为非靶向的Nanoblocker，T为靶向的Nanoblocker)。

将H460异种移植肿瘤小鼠连续接受尾静脉注射，siPD-L1-负载的Nannoblocker900μg siRNA/公斤注射剂量连续四天，每只小鼠1nmol siRNA的量，即1nmol siRNA/只，每隔一天给一次药，连续4次给药，观察各组肿瘤生长情况。作为参考，我们还测量了游离的siPD-L1的抗癌效果，实验中，25只荷瘤小鼠随机分为5组，分别是：PBS空白对照组，游离siPD-L1RNA对照组，NC乱序siRNA纳米制剂对照组，NT非靶向siPD-L1纳米制剂组，T靶向siPD-L1纳米制剂组。每只小鼠进行标记从给药开始算第0天，每隔一天测量肿瘤大小及体重，肿瘤体积的计算公式为：(长*宽*宽)/2。可见，负载siPD-L1的靶向Nanoblocker对各组肿瘤生长的抑制作用最强，并且对体重无明显影响(图9C、D，图8C，PBS为空白对照，NC为siGFP的RNA对照序列组，NT为非靶向的Nanoblocker，T为靶向的Nanoblocker，free siPD-L1为游离的siRNA)。

实施例4

纳米阻断剂的体内生物安全性评价：

健康免疫活性的小鼠尾静脉注射PD-L1nanoblocker治疗剂量，9只健康的C57BL/6小鼠随机分为3组，PBS空白对照组，NT非靶向siPD-L1纳米制剂组和T靶向siPD-L1纳米制剂组，分别尾静脉注射与治疗组同等剂量的药物后(1nmol siRNA/小鼠)，通过眼眶穿刺收集小鼠的血液，进行ELISA酶联免疫实验检测血清水平的多种炎症因子，包括INF-γ、IL-12和TNF-α等。与预期一样，与对照组相比，给予这些纳米阻断剂并不会导致这些炎症因子水平显著升高(图10)。

9只健康的C57BL/6小鼠随机分为3组，PBS空白对照组，NT非靶向siPD-L1纳米制剂组和T靶向siPD-L1纳米制剂组，分别尾静脉注射与治疗组同等剂量的药物后，通过眼眶穿刺收集小鼠的血液并分离出血清进行血液生化分析，图11为经治疗后的小鼠血液生化分析结果，Lymph％:淋巴细胞的百分比，Mon％:单核细胞的百分比，Gran％:中性粒细胞百分比，HCT:血细胞比容、RDW:红细胞分布宽度、WBC:白细胞数,PLT:血小板数,HGB:血红白,MCH:平均红细胞血红蛋白含量、MCHC:平均红细胞血红蛋白浓度、MCV:平均红细胞体积,和MPV:平均血小板体积。

此外，收集小鼠的主要器官，心、肝、脾、肺、肾用10％福尔马林固定，切片后HE染色进行组织学分析，如图12为各组织学分析结果。

血液生化分析显示，各关键指标实验组与对照组之间无显著性差异。此外，组织学分析显示，与对照组小鼠相比，纳米阻断剂的治疗没有引起明显的组织损伤或炎症反应。所有这些体内实验结果都表明，基于RNAi的PD-L1纳米阻断剂有望成为一种有效、安全的非小细胞肺癌体内免疫治疗的新策略。

综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

序列表

<110> 湖南大学

<120> PD-L1抑制剂在制备药物或试剂盒中的用途

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

uucauuugga ggaugugccu u 21

<210> 2

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggcacauccu ccaaaugaau u 21

<210> 3

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggcacauccu ccaaaugaau u 21

<210> 4

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

uccuugaaga agauggugcu u 21

<210> 5

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gcaccaucuu cuucaaggau u 21

<210> 6

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

uccuugaaga agauggugcu u 21

<210> 7

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gcaccaucuu cuucaaggau u 21

<210> 8

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

uccuugaaga agauggugcu u 21

Claims (6)

1.PD-L1抑制剂在制备药物或试剂盒中的用途，所述药物或试剂盒用于：

1)在不依赖T细胞的条件下治疗肿瘤；和/或，

2)在不依赖T细胞的条件下下调STAT3蛋白的表达水平；和/或，

3)在不依赖T细胞的条件下下调STAT3蛋白的磷酸化水平；

所述肿瘤为非小细胞肺癌，所述PD-L1抑制剂为核酸分子，所述核酸分子的多核苷酸序列包括SEQ ID No.1所示的序列，所述PD-L1抑制剂为单一有效成分，所述PD-L1抑制剂包裹于修饰有靶向多肽的脂质体中，所述靶向多肽的化学结构式如式I所示：

通过式II化合物形成所述脂质体：

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物为非肿瘤免疫治疗药物。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物为肿瘤细胞凋亡促进药物。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述PD-L1抑制剂能够抑制PD-L1的表达和/或功能。

5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述核酸分子选自针对PD-L1的干扰RNA、针对PD-L1的反义寡核苷酸、用于敲除或敲减PD-L1表达的物质。

6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，

所述脂质体为球形脂质体；

和/或，所述修饰有靶向多肽的脂质体的平均粒径为80～120nm。

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