CN107184987A - 一种硫辛酸修饰的靶向整合素αvβ3纳米多肽载体及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医药技术领域,具体是一种硫辛酸修饰的靶向整合素αvβ3纳米多肽载体及其制备方法和应用。本发明的纳米载体采用硫辛酸自带的二硫键进行交联,所形成的多肽聚合物可在细胞内迅速被降解,不会在细胞内蓄积,多肽中的精氨酸和天冬氨酸、甘氨酸、半胱氨酸均为体内存在的氨基酸,对细胞及人体无毒副作用,CCK‑8法细胞增殖试验表明,制备的纳米载体具有很低的细胞毒性,同时又有较好的共载基因与化疗药的能力,本发明的纳米载体能在乳腺癌治疗中能特异性靶向靶向整合素αvβ3增强化疗药对乳腺癌细胞作用,促进乳腺癌细胞的凋亡,从而成为乳腺癌耐药治疗的一种靶向、高效、低毒的纳米级递送系统。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域,具体地说,是一种硫辛酸修饰的靶向整合素αvβ3纳米多肽载体及其制备方法和应用。
背景技术
乳腺癌是严重威胁全球女性健康的常见恶性肿瘤之一。在美国女性癌症中是除了皮肤癌之外的最普遍的癌症,占接近三分之一。美国癌症协会2016年最新数据表明,乳腺癌在预计新发人数上位居第一,预计死亡人数上排名第二(仅次于肺癌)。目前晚期、复发、转移乳腺癌的治疗面临着很多问题,如何增加肿瘤细胞对药物的敏感性已成为相关研究的热点问题。目前临床对其治疗仍以手术为主,同时配合放射治疗、化疗药物治疗(简称化疗)进行综合治疗,其中化疗在乳腺癌治疗中起着关键作用。纳米技术的引入,可以有效的实现乳腺癌的靶向治疗,降低了毒副作用。因此,制备一种能靶向性治疗乳腺癌的纳米递药系统具有非常重要的意义。
细胞穿膜肽(cell penetrating peptides,CPPs)是一类具有较强的细胞膜穿透能力的小分子短肽,可携带多种大分子进入细胞。这类肽很快用到药物的靶向和导入的研究中,可以有效地将包括亲水性蛋白质和多肽、核苷酸、小分子药物、量子点和显像剂等在内的多种货物分子导入各种细胞中,开辟了药物进入细胞的新介导途径。其在基因治疗方面因其高效传递基因物质的能力及低毒性,容易制备而在过去20多年中成为研究热点。研究发现,多肽类载体中的精氨酸因其表面富集的正电荷可有效地吸附带负电荷的基因物质而形成粒径小,结构稳定的载体/基因复合物。此类聚合物除了具有非病毒载体共有的优点外,其表面往往带有较多氨基,在生理的条件可以质子化带正电荷,从而压缩或者以达到包裹基因的目的。此外阳离子聚合物与DAN或RNA会形成一种核壳结构,外壳是亲水的阳离子片段,内部疏水的核则是部分被中和的DNA或RNA,这一结构可以提高其稳定性,从而避免被体内的酶降解。
肿瘤细胞中的谷胱甘肽(GSH)是胞外或循环系统的100-1000倍(胞内GSH浓度约2-10mM,胞外仅为2-20μM)。当携带药物纳米胶束进入肿瘤细胞中,在还原性条件下可断裂的二硫键在高浓度GSH作用下打开,可以使得载体降解,纳米胶束在胞内触发释放药物发挥药效。硫辛酸是一种具有分子内五元环二硫键结构,末端羧基的两亲性物质,与细胞膜具有脂质双分子层具有较好的亲和力,具有较好的包载化疗药物的作用,且二硫键可在细胞还原性条件下裂解,为药物在肿瘤部位的有效释放提供条件。本发明中的硫辛酸修饰可以实现肿瘤微环境靶向。
整合素αvβ3在肿瘤细胞及肿瘤血管内皮细胞中高表达,RGD序列作为其配体,可与其进行特异性结合,为肿瘤的诊断和靶向治疗提供了理论基础。RGD诊断试剂的前期研究和临床试验数据表明其具有良好的肿瘤组织靶向性。RGD-纳米抗肿瘤制剂(RGD-脂质体、RGD-胶束和RGD-纳米粒)在体外可提高细胞对药物的吸收率,增强细胞毒性;在动物移植瘤模型中,能更好地抑制肿瘤的生长,延长了动物的生存时间。在肿瘤发病率居高不下,治疗手段和疗效都较为有限的今天,RGD靶向制剂在肿瘤诊断和治疗中所具有的优势值得特别关注。
硫辛酸修饰的纳米胶束可以实现肿瘤微环境敏感的被动靶向,这重要是依赖于肿瘤部位血管的高渗透强滞留的效应(EPR,enhanced permeability and retentioneffect)。研究发现,多肽类载体中的精氨酸因其表面富集的正电荷可有效地吸附带负电荷的基因物质而形成粒径小,结构稳定的载体/基因复合物。此类聚合物除了具有非病毒载体共有的优点外,其表面往往带有较多氨基,在生理的条件可以质子化带正电荷,从而压缩或者以达到包裹基因的目的.此外精氨酸是发挥穿膜效应的关键氨基酸。Yayuan Liu等人在ACS Applied Materials&Interfaces期刊上的研究表明RX-dGR中精氨酸(R)的个数是6的时候,穿膜效应最强,且在体内循环时间最长,则为其实现被动靶向和主动靶向提供了非常有利的条件(参考文献:Yayuan Liu,Zhengze Lu,Ling Mei,et al;Tandem peptide basedon structural modification of poly-argininefor enhancing tumor targetingefficiency and therapeutic effect.ACS Appl Mater Interfaces.2017V9N3:2083-2092)。本发明是将R6-dGR具有穿膜效应且带有靶向整合素αvβ3靶头dGR的多肽进行硫辛酸修饰,希望进一步实现肿瘤微环境靶向的目的。
中国专利文献CN105727307A公开了一种硫辛酸修饰的纳米多肽载体,由精氨酸、组氨酸、硫辛酸和半胱氨酸组成,采用硫辛酸自带的二硫键进行交联,所形成的多肽聚合物可在细胞内迅速被降解,具有很低的细胞毒性,同时又有较好的共载基因与化疗药的能力,能在乳腺癌耐药治疗中能特异性增强耐药细胞对化疗药的敏感性,促进乳腺癌细胞的凋亡。
目前尚无一种硫辛酸修饰的靶向整合素αvβ3的多肽,并且能够靶向性治疗乳腺癌的纳米递送载体。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可生物降解的,内部空腔包裹化疗药物,外部包载基因的基因转染效率高的多肽类纳米载体。本发明的另一个目的是提供该纳米多肽载体的制备方法;本发明的第三目的是提供该多肽载体在靶向递送化疗药与基因药物至肿瘤部位的应用。
本发明所要解决的主要技术问题是:如何提高多肽纳米载体引导基因片段进入细胞的能力,以及如何提高多肽纳米载体共载化疗药与基因的能力,同时保证材料具有生物可降解特性。
本发明设计了一种硫辛酸修饰的靶向整合素αvβ3纳米多肽载体,由精氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、硫辛酸和半胱氨酸组成的多肽,精氨酸带正电荷可与带负电的基因片段结合并具有穿膜作用,精氨酸、天冬氨酸、甘氨酸部分是靶头dRG部分,可以靶向整合素αvβ3,整合素αvβ3在肿瘤细胞及肿瘤血管内皮细胞中高表达,已有研究表明整合素αvβ3在黑色素瘤、结肠癌、乳腺癌等肿瘤中高表达。硫辛酸部分可以增加载体与细胞膜的亲和力并可包载化疗药物达到共载,及其自身二硫键的交联而增加载药及转染能力,并可在生物还原性条件下裂解而实现释药的目的。
本发明的第一方面,提供一种硫辛酸修饰的多肽,所述多肽的氨基酸序列如下所示:
RRRRRR-dGR(SEQ ID NO:1);氨基酸之间以肽键相连,多肽可简写为R6-dGR,简写RR。
所述的硫辛酸修饰,是指硫辛酸的羧基与精氨酸的氨基以酰胺键连接。
本发明所述的硫辛酸修饰的多肽可以简写为:LA-R6-dGR,缩写为LARdGR,其中LA为硫辛酸,d为天冬氨酸,G为甘氨酸,R为精氨酸。
本发明的第二方面,提供一种硫辛酸修饰的靶向整合素αvβ3纳米多肽载体,所述的纳米多肽载体为上述硫辛酸修饰的多肽的聚合物,所述的聚合物是通过硫辛酸二硫键经半胱氨酸进行交联形成的。
所述的聚合物,即硫辛酸修饰的靶向整合素αvβ3纳米多肽载体的化学结构式如式(I)所示:
本发明的R精氨酸、dGR(精氨酸、甘氨酸、天冬氨酸)组成9肽,氨基酸之间以肽键连接,英文缩写为RdGR;在9肽的N端,硫辛酸与氨基以酰胺键连接,硫辛酸修饰的多肽英文缩写为LARdGR;硫辛酸的巯基经半胱氨酸氧化交联形成聚合物,聚合物的英文缩写为LARdGRss。
优选的,所述的聚合物的分子量为1500-30000Da,该分子量之外的聚合物不适宜,会降低基因载体的转染效率;最优为15000-30000Da。
优选的,所述的聚合物中半胱氨酸的摩尔量为硫辛酸修饰的多肽的5%-10%。在半胱氨酸比例为5%-10%时,所述的纳米多肽载体具有较好的载药量和包封率。最优为10%。
本发明的第三个方面,提供上述的硫辛酸修饰的靶向整合素αvβ3纳米多肽载体的制备方法,所述的制备方法包括如下步骤:
(A)合成上述的硫辛酸修饰的多肽:LARdGR;
(B)硫辛酸修饰的靶向整合素αvβ3纳米多肽载体的制备:将步骤(A)合成的硫辛酸修饰的多肽溶于甲醇,加入半胱氨酸盐酸盐,使半胱氨酸的摩尔量为硫辛酸修饰的多肽的5%-20%之间,避光搅拌反映12小时。
在本发明的一个优选实施例中,步骤(B)具体为:取硫辛酸修饰的多肽LARdGR与半胱氨酸溶解于甲醇中,使半胱氨酸的摩尔量为硫辛酸修饰的多肽的10%,搅拌反应12小时,反应温度为室温。
优选的,步骤(B)反应后的溶液,用N2吹干。用N2吹干后的样品在-20℃保存。
步骤(B)反应后的溶液移入截留分子量为1000的透析袋中,透析液为蒸馏水,透析12小时。
为维持纳米载体材料较高的活性,将透析后的溶液冷冻干燥,并保存于-20℃,纳米材料在复溶后可在4℃长期保存。
本发明的第四个方面,提供上述的硫辛酸修饰的靶向整合素αvβ3纳米多肽载体在制备联合化疗药物或基因药物中的应用。
进一步的,本发明提供上述的硫辛酸修饰的靶向整合素αvβ3纳米多肽载体在制备乳腺癌治疗药物中的应用。
进一步的,本发明还提供上述的硫辛酸修饰的靶向整合素αvβ3纳米多肽载体共载基因和化疗药物,在制备乳腺癌治疗药物中的应用。
所述的应用,是指纳米载体中的精氨酸带正电可以与带负电的基因进行结合。
所述的应用,是指纳米载体中的硫辛酸的脂溶性可以包载脂溶性的化疗药物。
所述的基因,为质粒DNA(pDNA)或者siRNA。
所述的化疗药物,为脂溶性的阿霉素,也可以是多西他赛、环磷酰胺等。
所述的应用具体为:
将纳米多肽载体与化疗药物用超声乳化制备纳米胶束,再将其与DNA或者siRNA混合,制得共载体系。
将此纳米载体与pDNA或者siRNA混合,制得基因转染体系。所述的纳米载体与pDNA或者siRNA的N/P比为5:1-20:1,在此比例范围内,所述纳米载体材料能够引导pDNA或者siRNA进入细胞内,有较高的转染效率。
所述的纳米载体与pDNA或者siRNA在缓冲液中混合,室温孵育20~30分钟,可确保了基因转染体系的形成。
所述的纳米载体包载阿霉素的能力,在半胱氨酸比例为5%-10%时,具有较好的载药量和包封率。
本发明提供的纳米载体适用于实验所需的治疗性质粒DNA或者siRNA及化疗药。
本发明优点在于:
本发明的纳米载体采用硫辛酸自带的二硫键进行交联,所形成的多肽聚合物可在细胞内迅速被降解,不会在细胞内蓄积,多肽中的精氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸均为体内存在的氨基酸,对细胞及人体无毒副作用,CCK-8法细胞增殖试验表明,制备的纳米载体具有很低的细胞毒性,同时又有较好的共载基因与化疗药的能力,因此非常适合于体内外的化疗与基因治疗研究与应用。
本发明的制备方法操作简单,反应试剂和得到的产物无毒性,不会对环境产生污染,反应条件温和,反应后得到的纳米载体制备简单,成分低廉,并且该制备方法可以通过控制多肽与半胱氨酸的比例来控制纳米载体的交联度,利于大规模推广于研究和应用领域。
本发明的纳米载体能在乳腺癌治疗中能特异性靶向靶向整合素αvβ3增强化疗药对乳腺癌细胞作用,促进乳腺癌细胞的凋亡,从而成为乳腺癌耐药治疗的一种靶向、高效、低毒的纳米级递送系统。
附图说明
图1为LARdGR的核磁共振氢谱图;
图2为LARdGRss/pDNA纳米复合物的粒径;
图3为LARdGRss/pDNA纳米复合物电位图;
图4为LARdGRss/Cy3-siRNA复合物处理后荧光信号流式细胞术摄取数据图;
图5为LARdGRss//DOX复合物处理后荧光信号流式细胞术摄取数据图;
图6为LARdGRss/Cy3-siRNA复合物与细胞孵育3小时后的激光共聚焦显微镜照片;
图7为LARdGRss对MCF-7细胞的毒性;
图8为LARdGRss/Cy5-siRNA体内活体成像图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1:硫辛酸修饰的9肽的合成
硫辛酸(LA)修饰的9肽氨基酸序列:Arg Arg Arg Arg Arg Arg Asp Gly Arg(Arg,精氨酸;Asp,天冬氨酸;Gly,甘氨酸)(SEQ ID NO:1),LAR6-dGR,有上海吉尔生化有限公司采用多肽固相合成法合成并命名为LAR6-dGR,利用制备高效液相色谱纯化合成的LAR6-dGR,使其纯度达到95%以上。LA-为硫辛酸,R为精氨酸,D为天冬氨酸,G为甘氨酸,氨基酸之间以肽键连接形成9肽。核磁共振图谱如图1。
实施例2:硫辛酸修饰的多肽类纳米载体LARdGRss的制备
取20mg硫辛酸修饰的多肽LARdGR与不同量的半胱氨酸盐酸盐溶于10ml甲醇中,加入氢氧化钠溶液将pH调节至7.0,搅拌反应12小时,反应温度为10~30℃。半胱氨酸的量分别为:2.5%、5%、10%、20%。
根据LARdGRss与pDNA胶束制备后的粒径和电位进行筛选最适的半胱氨酸的比例。
实施例3:LAHRss在pDNA纳米胶束的制备
将载体(LARdGRss)和虫荧光素酶表达质粒pEGFP(上海创新生物科技有限公司)分别溶于水中制备水溶液,按氮磷比(N/P)分别为2.5、5、10、20、40配置纳米复合物涡旋10s后静置30min,即得纳米胶束。纳米胶束的平均粒径与N/P有关,当N/P=20时得到最佳粒径,粒径在100-300之间,具体见图2。纳米胶束的Zeta电位对N/P的增大而升高,在N/P大于5时稳定在0-30mV,具体见图3。
实施例4:LARdGRss/(DOX/pDNA)纳米胶束的制备
取2mg阿霉素盐酸盐(DOX·HCL)溶于1ml丙酮中,加入摩尔比3:1的乙二胺脱盐处理,将20mg载体(LAHRss)溶于1ml丙酮中。
将上述两种溶液混合后,搅拌挥发溶剂,计算包封率和载药量。按N/P20加入pDNA质粒,测定粒径和电位。
实施例5:LARdGRss/cy3-siRNA的细胞摄取情况
以cy3标记的阴性对照siRNA作为模型siRNA进行评价。将MCF-7、细胞按照30w/孔分别接种于12孔板上,加入1ml含10%FBS(Gibco公司,美国)的DMRM培养基(Gibco公司,美国)培养24小时,使细胞汇合度达70-80%,将培养基更换为无血清培养基。将LARdGRss/DOX、DOX按5μg/ml加入细胞孔中,LARdGRss cy3-siRNA、cy3-siRNA按N/P=20制备纳米复合物,并加入细胞孔中,孵育4小时,吸去培养基,PBS洗3遍,消化离心收集,利用流式细胞仪检测细胞对DOX及cy3-siRNA的摄取情况。
结果如图4和图5所示,MCF-7对DOX及LARdGRss//DOX的摄取差异明显,对LARdGRss//DOX摄取较明显,在4小时时基本接近90%。MCF-7对LARdGRss/cy3-siRNA的摄取比单纯的cy3-siRNA高的多,说明LARdGRss可以显著增加细胞对化疗药和cy3-siRNA的摄取。
实施例6:LARdGRss/DOX入胞研究
细胞铺板前取圆形盖玻片于75%乙醇中浸泡5分钟,无菌超净台内吹干。将盖玻片置于24孔板内,每孔种入3万个MCF-7细胞培养24小时,使细胞汇合度达到50%,更换培养基为无血清DMEM培养基。将DOX、LARdGRss/DOX胶束溶液,加入到24孔板的细胞孔中,一组在孵中培养4小时后吸取培养基,多聚甲醛固定后DAPI染色,制备观察用玻片。两组玻片均用激光共聚焦显微镜观察拍照。
见图6,LARdGRss载体可以成功的将化疗药载入细胞内,并比单纯的DOX的细胞摄入更多。
实施例7:LARdGRss的细胞毒性研究
将MCF-7细胞按照8×103/孔接种于96孔板中,培养24h,使细胞汇合度达到50%。吸去培养基,每孔加入100μl含不同浓度LARdGRss(10、20、40、60、80、100μg/ml),继续培养24、48h,CCK-8法检测细胞毒性,统计细胞存活率,用商品化的转染试剂BPEI(美国Sigma-Aldrich公司,分子量25kDa),作为对照。
结果如图7所示,对照BPEI-25K的细胞毒性很强,在40μg/ml时细胞存活率接近20%,而LARdGRss的细胞毒性较低,在100μg/ml时细胞存活几乎不受影响,细胞存活率大于90%,在200μg/ml时80%左右的存活率。
实施例8:LARdGRss/Cy5-siRNA活体成像考察
实验采用MCF-7细胞皮下注射法构建乳腺癌裸鼠移植瘤模型,培养细胞足量,消化,离心,计数,加入预冷的生理盐水重悬细胞并调整细胞密度至1×108个/ml。基质胶提前24小时4℃解冻,等体积加入至细胞悬液中,冰浴混匀即制得接种液。裸鼠右上肢背部皮肤消毒,每只裸鼠皮下注射150μl接种液,保证注射速度均一。裸鼠继续饲养2周,选取肿瘤圆润且体积大于100mm3的裸鼠进行下一步实验。
通过超声乳化法制备含有的多肽胶束。制备成功后按照N/P=20加入Cy5标记的siRNA,孵育半个小时。
挑选的荷瘤裸鼠随机分成三组,分组5只。分别通过尾静脉的方式注射PBS、单纯Cy-5siRNA和载Cy-5siRNA的多肽胶束。注射后的6h,12h,24h使用小动物活体成像仪检测裸鼠体内的荧光分布。检测条件:激发波长为635nm,发射波长670nm,曝光时间为3s。并用小动物活体成像仪检测荧光分布,并拍照记录。
结果显示,LARdGRss胶束组与单纯的Cy-5siRNA相比可以有效的将Cy-5siRNA靶向至肿瘤部位,24h后离体器官的荧光分布也证实了这一点,见图8。
综合以上各项实施例,可见纳米载体LARdGRss能有效地包载化疗药并携带siRNA片段进入靶细胞,化疗药在体外对肿瘤细胞均有明显的抑制作用,pDNA在体外具有明显的转染效率,并且有较低的细胞毒性,说明LARdGRss适合作为化疗药与基因药联合应用的载体。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明,但本发明创造并不限于所述实施例,熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换,这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
Claims (10)
1.一种硫辛酸修饰的多肽,其特征在于,所述的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示;所述的硫辛酸修饰,是指硫辛酸的羧基与第一个精氨酸的氨基以酰胺基连接。
2.一种硫辛酸修饰的靶向整合素αvβ3纳米多肽载体,其特征在于,所述的纳米多肽载体为如权利要求1所述的硫辛酸修饰的多肽的聚合物,所述的聚合物是通过硫辛酸二硫键经半胱氨酸进行交联形成的。
3.根据权利要求2所述的硫辛酸修饰的靶向整合素αvβ3纳米多肽载体,其特征在于,所述的纳米多肽载体的化学结构如式(I)所示:
4.根据权利要求2所述的硫辛酸修饰的靶向整合素αvβ3纳米多肽载体,其特征在于,所述的聚合物的分子量为1500-30000Da。
5.根据权利要求2所述的硫辛酸修饰的靶向整合素αvβ3纳米多肽载体,其特征在于,所述的聚合物中半胱氨酸的摩尔量为硫辛酸修饰的多肽的5%-10%。
6.一种如权利要求2所述的硫辛酸修饰的靶向整合素αvβ3纳米多肽载体的制备方法,其特征在于,所述的制备方法包括如下步骤:
(A)合成如权利要求1所述的硫辛酸修饰的多肽;
(B)硫辛酸修饰的靶向整合素αvβ3纳米多肽载体的制备:将步骤(A)合成的硫辛酸修饰的多肽溶于甲醇,加入半胱氨酸盐酸盐,使半胱氨酸的摩尔量为硫辛酸修饰的多肽的5%-20%,搅拌反应12h。
7.根据权利要求6所述的硫辛酸修饰的靶向整合素αvβ3纳米多肽载体的制备方法,其特征在于,步骤(B)具体为:取步骤(A)合成的硫辛酸修饰的多肽与半胱氨酸盐酸盐溶解于甲醇中,使得半胱氨酸的摩尔量为硫辛酸修饰的多肽的5%-10%,搅拌反应12h。
8.根据权利要求6或7所述的硫辛酸修饰的靶向整合素αvβ3纳米多肽载体的制备方法,其特征在于,步骤(B)反应后的溶液,用N2吹干;用N2吹干后的样品在-20℃保存。
9.一种如权利要求2-5任一所述的硫辛酸修饰的靶向整合素αvβ3纳米多肽载体在制备联合化疗药物或基因药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的硫辛酸修饰的靶向整合素αvβ3纳米多肽载体在制备联合化疗药物或基因药物中的应用,其特征在于,所述的应用具体如下:
将纳米多肽载体与化疗药物用超声乳化制备纳米胶束,再将其与DNA或者siRNA混合,制得共载体系。
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