CN108175759A - 一种抗肿瘤靶向给药系统及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种抗肿瘤靶向给药系统及其制备方法与应用，属于生物技术领域。该系统由小核酸药物、包裹小核苷酸药物的脂膜囊状物及其靶向肿瘤细胞的靶头组成，特别提供了靶头是基于适配体AS1411，脂膜囊状物为外泌体来共同组成的递送let‑7的给药系统。本发明除了提供上述系统的制备方法，还提供了上述AS1411‑exosome‑let‑7在细胞水平和小鼠在体水平的靶向性检测结果和抗肿瘤的应用，结果说明采用AS1411‑exosome，与单独的exosome相比在细胞水平和小鼠体内均有更强的靶向性，而且可将let‑7更有效的递送到肿瘤组织中发挥抑制肿瘤增殖和迁移功能。

Description

一种抗肿瘤靶向给药系统及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种药物给药系统，具体涉及一种抗肿瘤靶向给药系统及其制备方法与应用。
背景技术
近年来，核酸药物在人类重大疾病尤其是肿瘤治疗的研究中显示出了巨大潜力，为现代生物医药产业开辟了一个崭新的方向。但是裸露的核酸药物存在以下缺点：(1)核酸药物在组织或细胞中易被核酶降解；(2)核酸药物的细胞靶向能力较差；(3)核酸药物自身带有负电荷，与带有负电荷的细胞膜之间存在排斥作用，导致其细胞内吞和逃逸内涵体的能力较差。以上缺点导致核酸药物的治疗效果不佳。因此，需要寻求合适的载体负载核酸药物，将其递送到靶细胞，有效逃离内涵体吞噬，释放基因治疗药物进入细胞质，以实现该药物的高效表达。所以目前核酸药物治疗领域中最大的瓶颈就是核酸药物载体。
传统的基因药物主要依靠病毒载体运输，但是病毒作为药物载体，可能引起免疫反应、整合入基因组的隐患及病毒具有复活毒性的可能等所造成的系列安全问题一直饱受争议。另有许多科学家利用纳米粒子(LPNs)作为基因药物载体，如阳离子脂质及脂质类似物或阳离子多聚体，例如多聚赖氨酸、多聚精氨酸、组蛋白、脱乙酰壳多糖、聚乙烯亚胺(PEI)等。但是脂质体给药系统上存在缺乏靶向性、转染率低和全身给药的毒性等问题。因此其毒性和递送药物的脱靶效应等问题，限制了脂质体在体内的应用。此外，研究发现利用聚合物载体作为基因传递系统效率非常低，大多被陷在了细胞回收利用器—胞内体中，只有极少数核酸药物可以被运到细胞质中发挥作用。Gaurav Sahay对纳米颗粒运输siRNA进入细胞质的效率进行了深入研究，发现大多数的siRNAs陷入到了细胞的胞吞回收通路中，一些随后移动到溶酶体(lysosome)中被降解；而另一些则基本困在了内吞膜泡(endocyticvesicles)中，只有极少数的siRNA能够达到细胞质发挥生物功能。因此，选择一种具有高效性、靶向性和安全性非病毒基因药物载体是基因治疗领域中最主要、最关键的问题之一。
Exosome是由细胞内多胞体(multivesicular body，MVB)与细胞膜融合后释放到细胞外基质的一种直径约为30～120nm的小囊泡。大多数生物细胞都可以分泌这种小囊泡，并且它们天然存在于体液中，如血液、唾液、尿液和母乳等。无论是培养基中的exosome，还是各种器官分泌到体液中的exosome，都像货车(cargo)一样运载货物然后穿梭于各种细胞参与细胞间通信、免疫反应的促进、抗原呈递、程序性细胞死亡、血管生成、炎症和凝血等。Exosome的蛋白质组学分析结果显示，不同类型的细胞和体液(血液、乳汁和尿液)中，exosome膜上或泡内含有相同的标记蛋白分子，这些分子分别来自细胞质、质膜及高尔基体和内质网的生物膜。典型的exosome标记蛋白有：(1)四跨膜蛋白超家族，如CD9、CD63和CD81蛋白；(2)细胞质蛋白，如肌动蛋白(actin)、钙磷脂结合蛋白(annexins)、Rab蛋白；(3)参与生物合成的分子，如凋亡连接基因2相互作用蛋白X(apoptosis-linked gene2-interacting protein X，ALIX)、肿瘤易感基因101的蛋白质(tumor susceptibilitygene101，TSG101)、热休克蛋白(heat shock proteins，HSPs)70和热休克蛋白90。
2007年Valadi等发现，MC/9和人肥大细胞系分泌的exosome包含了约1300个基因的mRNA以及small RNA，其中包括121个microRNA。这项研究让人们意识到miRNA功能可能不仅仅在细胞内调控基因表达，还可以利用exosome这个运载工具通过各种体液在细胞间进行信息的传递。
与其它转运膜泡和载体相比，exosome作为药物载体有诸多优越性：如在血液中能够稳定存在；以及用病人自身的exosome会有较低的免疫原性等；且组织特异性的exosome可以携带miRNA、miRNA的拮抗物和小的效应分子靶向穿梭于特定组织中。
2011年英国科学家Alvarez-Erviti.L等人报道了从实验鼠的树突状细胞内提取出来的exosome，让其与从实验鼠的病毒中提取出来的蛋白质靶头—脑特异性识别多肽—RVG结合在一起。随后他们将GAPDH siRNA通过电转方式装载到exosome中，再将此exosome复合体从体外注射到小鼠体内。利用exosome的内源性、通透性特点突破血脑屏障，将siRNA递送到大脑细胞并敲除基因BACE1(该基因与与阿尔茨海默病相关)。结果显示，BACE1基因的表达降低了60％。这是科学家首次使用天然系统向大脑内递送药物。一年后，瑞典的Wahlgren J团队通过电转染的方式将siRNA装载到正常人类血清来源的exosome中，证明装载siRNA的exosome可以有效地传递MAKP1-siRNA到作为受体的外周血单核细胞，体外敲除了特定基因。T.A.Shtam等也用类似的方法递送RAD51-siRNA和RAD52-siRNA来诱导两个基因的敲除并降低纤维素肉瘤细胞的生存和增殖。L.Alvarez-Erviti等在研究中发现，在靶向递送富含siRNA的exosome后，无论管家基因mRNA如GAPDH表达的下调还是阿尔茨海默病相关的基因BACE1的下调，都能在被靶向递送的特定神经细胞中被观察到。还有一些关于短发夹RNAs(shRNA)的使用和所谓的自我递送RNAs被包含在exosome中作为治疗药物的研究。例如，Q.Pan等研究发现，一种抑制病毒进入受体和丙型肝炎病毒(HCV)复制的shRNA，通过exosome介导可以使肝细胞的HCV的感染率降低。因为exosome天生携带miRNAs，这一特征的治疗应用也是符合逻辑的，正如一些将这一方法应用于不同疾病模型的研究所阐述的那样。研究发现Exosome包裹的miR-150能降低内皮细胞的迁移，介导效应T细胞的抑制；当293T细胞培养在含有exosome(来自miR-122转导的293T细胞)的条件培养基时，细胞内的miR-122的表达提高数倍。在体外，富含miR-133b的MSC exosome提高了神经突触的生长速率，提示这种MSC exosome成为大脑缺血的潜在治疗药物。另外，miR-214可以通过exosome穿梭到肝星状细胞，造成CCN2表达的降低，而CCN2基因在调控肝脏纤维化中起到很重要的作用。正如近期Heidi G等对多形性成胶质母细胞瘤(GBM)的评论中表述的那样，大多数肿瘤类型都有miRNAs的异常表达。MSC衍生的exosome抑制miRNA--miR-146b的高表达，在GBM的异植瘤模型中可抑制肿瘤的生长，显示了exosome-based药物递送和miRNA-based治疗两者之间存在的相关性。在外GBM细胞体研究中，MSC分泌的exosome递送anti-miRs来敲除致癌的miR-9从而提高了GBM细胞对替莫唑胺化学治疗的敏感性。exosome递送miR-143和let-7a，在体外可分别抑制前列腺癌和乳腺癌的生长。但在正常的前列腺上皮细胞中用装载miR-143的exosome处理后没有观察到类似的效果。
Exosome除了可以装载干扰RNAs进行治疗外，其他类型的物质也可以被装载进行递送，例如载入细胞毒素的阿霉素的exosome或者是exosome类似物纳米膜泡，可体外抑制乳腺癌和结肠腺癌异植瘤增殖。另外，通过修饰未成熟树突细胞分泌的exosome的膜蛋白使该exosome靶向递送阿霉素到肿瘤组织能力，而且研究结果表明这种方式既显著提高了阿霉素的功效，又降低了药物的毒副作用。
此外，很多研究分析了exosome装载蛋白进行疾病治疗的效果。例如，exosome在包裹药物的稳定性或抗炎症影响的优点，学者们在GBM的小鼠模型中，将STAT3抑制剂JSI-124(葫芦素I)装载进入exosome后进行小鼠给药，结果显示该exosome可有效的抑制肿瘤增殖。也有研究通过转染包含胞嘧啶脱氨酶和尿嘧啶磷酸核糖转移酶的载体到HEK293T细胞中后，该细胞可分泌出胞内富集该蛋白酶的exosome，并且这类exosome与化疗药物前体—5-氟胞嘧啶联合使用，在一个神经鞘瘤模型中，能有效的促进活性5-氟尿嘧啶和5-氟代-脱氧尿苷-单磷酸盐之间的转换，这一联合处理导致了肿瘤细胞显著凋亡并达到抑制肿瘤增殖的效果。该研究结果也进一步强调了蛋白负载exosome在恶性肿瘤治疗中的潜力。
除此之外，越来越多的证据证明exosome可以在基因治疗中作为新的纳米传递系统以及作为疾病生物标记物用于分子诊断等功能。例如在利用MRI的癌症诊断治疗中，负载超顺磁性氧化铁纳米粒子(SPIONs)的exosome利用局部磁高热达到治疗的目的，显示出较大的应用潜力。
Exosome用于递送系统的研究是近年来的研究热门，但是在肿瘤靶向递送中尚未合理解决内源性靶向递送这个问题。目前报道的靶向性都是要先利用基因工程构建出工程化细胞，使分泌的exosome膜表面带有靶向多肽，以达到靶向递送功能。但是这种构建具有靶向性的exosome方法实验周期长，因此研究怎样更加有效的赋予exosome靶向性是研究的一个重点方向。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种抗肿瘤靶向给药系统。该给药系统以外泌体exosome为载体、核酸适配体AS1411为靶头，是介导抑癌miRNA、siRNA到体内肿瘤组织发挥抗肿瘤生物活性作用的一套全新、高效、低副作用、靶向的药物给药系统。
本发明的另一目的在于提供上述抗肿瘤靶向给药系统的制备方法。
为完成本发明的目的，本发明首先提供了核酸适配体AS1411偶联在exosome膜表面的方法。接着，本发明又提供了将抗肿瘤小核酸药物如siRNA-VEGF以及miRNA let-7装载入上述系统形成复合物AS1411-exosome-siRNA-VEGF和AS1411-exosome-let-7的方法。
本发明的另一目的在于提供上述抗肿瘤靶向给药系统的应用。
在细胞学水平和小鼠动物学水平上应用上述给药系统，提供抗肿瘤方面的系统稳定性、靶向性、递送效率、毒性、免疫原性的一系列数据信息。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种抗肿瘤靶向给药系统，由小核酸药物、包裹小核苷酸药物的脂膜囊状物及其靶向肿瘤细胞的靶头组成。
作为本发明中运送小核酸药物的脂膜囊状物，既可以是来自细胞内源产生的外泌体或者内囊泡，也可以是外源人工合成的脂质体。
外泌体是本发明主要采用的一种载体，但基于外泌体内源性的直径约为30～120nm的小囊泡，因此有同样类似特征的内源性的内囊泡也可以作为本发明的载体。类似地，本发明的所采用的载体不限于外泌体和内囊泡，包括任何有类似脂膜结构和大小的外源性人工合成的脂质体，如阳离子脂质体、单层脂质体、多层脂质体和多囊脂质体等。
本发明提供的外泌体(exosome)，不限于本发明内容公开的来自于属于免疫细胞的DC细胞，还有T细胞、B细胞等，而且还可以来自间充质干细胞、间质细胞、上皮细胞等多种自体产生或者细胞株产生的外泌体，但不包括来自任何肿瘤细胞的外泌体。
本发明提供的外泌体，当实际应用时，应采用人源的外泌体；但限于小鼠在体动物实验的局限性，本研究的实施例采用的是小鼠来源的外泌体。
作为本发明采用的靶头，可以是多肽、人工合成的化合物、天然产物或者核苷酸类物质。
所述的作为靶头的核苷酸类物质为适配体；首选的是靶向核仁素的适配体AS1411。适配体是一类相对较短的单链DNA或RNA的寡聚核苷酸，在体内以特定的三维空间结构与靶蛋白通过高亲和力结合发挥生理作用。AS1411是第一个进入临床研究的抗肿瘤核酸适配体，富含鸟苷酸，其与核仁素蛋白(Nucleolin)有特定的亲和力。临床前研究表明，核仁素是肿瘤治疗的一个重要靶点，在多种肿瘤细胞中核仁素是细胞膜表面分子，可以被肿瘤归巢肽识别并通过内吞进入细胞。
类似是，作为本发明所采用的靶头，还可以是适配体NOX-A12，适配体NOXXON，它们均能够与CXCL12结合，有高度的亲和性和高度的特异性。
同样类似的，作为本发明所采用的靶头，不仅仅限于适配体，还可以是其他靶向肿瘤表面标志性抗原的小分子短肽或者化合物，比如已经报道的整合素亲和多肽RGD、血管活性肠肽VIP、P32受体亲和肽LyP-1。
本发明所装载的小核酸药物是siRNA、miRNA、piRNA或者人工合成的30nt以内单链及双链RNA分子，不限于本发明提供的siRNA-VEGF和miRNA let-7，也可以是已知的具有明确抑制癌症功能的其他小核酸药物，比如miRNA-16、miRNA-15b、miRNA-20a、miRNA-20b、miRNA-221、miRNA-222、miRNA-486、miRNA-937等。
所述的抗肿瘤靶向给药系统的制备方法，包括如下步骤：
(1)选用连接肽(即linker)，先将靶头与连接肽偶联在一起，进行修饰，得到靶头修饰后的多肽；
(2)将靶头修饰后的多肽与脂膜囊状物进行混合孵育，得到混合物；特别的，为了更好地促进连接肽与脂膜囊状物进行融合，本发明采用的连接肽，N端标记了胆固醇分子。
(3)通过电击转染方法将小核酸药物装载到步骤(2)得到的混合物中，得到抗肿瘤靶向给药系统。
优选的，所述的连接肽为N端标记了胆固醇分子的连接肽。
更优选的，所述的连接肽为胆固醇-IIASTIGGIFGSSTTQSGGGG。
所述的抗肿瘤靶向给药系统在制备抗肿瘤药物方面的应用，特别是在制备靶向抑制肿瘤生长和抑制肿瘤转移的治疗药物上的应用。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：
本发明首先提供了在细胞水平采用该给药系统递送抑癌小核酸Let-7抑制细胞增殖和迁移的应用结果，结果说明裸露的let-7不能抑制乳腺癌细胞迁移，而采用本发明提供的给药系统AS1411-exosome则可将let-7有效的递送到细胞内发挥功能来抑制乳腺癌细胞的增殖和迁移。其次，本发明还提供了小鼠在体内水平采用该给药系统递送Let-7抑制肿瘤增殖和靶向肿瘤的应用，结果说明AS1411-exosome-let-7与其他对照组相比在小鼠体内可明显抑制乳腺癌肿瘤增殖。而exosome-let-7也具有一定抑制肿瘤组织增殖，但是与AS1411-exosome-let-7相比，抑制作用明显减弱。这个结果也进一步说明本发明的给药系统AS1411-exosome与单独的exosome相比对乳腺癌肿瘤有更强的靶向性，可将let-7更有效的递送到肿瘤组织中发挥抑制肿瘤增殖和迁移功能(*P<0.05)。
附图说明
图1是实施例1获得exosome的透射电镜结果；其中，箭头指示的含有多个白色“环装”结构(Scare bare＝100nm)。
图2是实施例2中靶向给药系统AS1411-exosome的荧光显微镜分析结果；其中，BL表示明场，FL表示红色荧光场，Merge表示明场与荧光场的叠加。
图3是实施例3中荧光显微镜分析磁珠吸附AS1411-exosome-let-7-Cy3的荧光强度(比例尺为100μm)。
图4是实施例3中AS1411-exosome-let-7透射电镜(TEM)图。
图5是实施例4中流式细胞仪分析C2C12(左)和MDA-MB-231(右)细胞膜表面核仁素的表达水平。
图6是实施例4中动物水平分析AS1411-exosome的肿瘤靶向性功能体内分析。
图7是实施例5中WST-8分析MDA-MB-231细胞活性。
图8是实施例5中转移小室法分析AS1411-exosome-let-7对MDA-MB-231细胞迁移作用。
图9是实施例5中小鼠体内分析AS1411-exosome-let-7对肿瘤的抑制作用。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
以下实施例中除特别说明外，均为本领域内的常规实验方法和操作步骤。
实施例1：Exosome的收集
收集培养小鼠来源的未成熟树突状细胞(immature dendritic cell，iDC)的培养上清，300×g离心10min，收集上清，经过0.22μm滤膜过滤去除细胞碎片和杂质，然后用100kDa超滤管浓缩上清(5000×g，30min)，得到浓缩液，再用PBS稀释到原来的体积，100kDa超滤管5000×g离心30min再次浓缩。接着按照浓缩液：exosome抽提试剂＝2:1的体积比来添加exosome抽提液，充分混匀，4℃孵育过夜。最后12000×g离心2h，去上清，收集exosome，用灭菌后的PBS重悬。用Nandrop 2000分光光度计测试蛋白浓度后，-20℃保存，一个月内使用可在4℃保存。
用约10μg纯化的exosome，加入等体积4％戊二醛，室温固定30min。然后将样品放到超声仪中超声2min，涡旋震荡仪震荡1min。取10μL滴在铜网上待液体风干。然后用2％醋酸双氧铀染色15min，再用滤纸将液体吸干。样品充分晾干后，常温储备以待透射电镜观察。在电镜下观察exosome的大小、形貌，并拍摄具有代表性的电镜照片。
如图1透射电镜结果显示，箭头指示的含有多个白色“环装”结构(Scare bare＝100nm)，这些“环装”结构直径大小在50nm左右，属于exosome粒径范围，说明成功抽取获得exosome。
实施例2：AS1411-exosome的制备
具体步骤为：
(1)储液A、B配置：称取3mg标记了胆固醇的多肽(胆固醇-IIASTIGGIFGSSTTQSGGGG)溶解于1.5mL无菌水中，配制成2mg/mL的储液A；5OD标记了CY3的核酸适配体AS1411(5′-TTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGT GG-CY3-3′，)分别溶解于500μL无菌水中，配制成储液B；
(2)取三只玻璃瓶，每瓶加入500μL储液A；然后分别加入等摩尔的EDC和NHS水溶液，常温下搅拌2小时，用于活化多肽；
(3)分别将500μL储液B加入到上述步骤2的溶液中，室温下搅拌4天。
(4)待反应结束后，用分子量为3kDa的透析袋透析过夜，得到核酸适配体修饰的多肽。
(5)150μg的exosome和20μL 5μM的AS1411-CY3在4℃条件下孵育过夜。
之后，利用Zeta电位分析仪表征AS1411-exosome电位，验证AS1411与exosome是否偶联。
图2是荧光显微镜分析AS1411稳定结合于exosome膜表面外部：结果显示的是CY3-AS1411-exosome被DNase酶切前后用磁珠抓捕后进行荧光显微观察的结果，CY3-AS1411-exosome被DNase酶切后荧光强度明显减弱，这说明AS1411-CY3在exosome膜外，当DNase将AS1411降解后，荧光标记物CY3绝大多数脱离exosome，使荧光强度明显减弱。上述实验结果显示AS1411已经成功结合在exosome膜表面外部，证明我们的靶向给药系统AS1411-exosome构建成功。
实施例3：AS1411-exosome-let-7的制备
将150μg AS1411-exosome与150μg miRNA let-7用OPTI-MEM无血清培养基混匀后加入0.4cm电击杯，冰浴，之后在0.7kV，350微秒、20次脉冲条件下用Eppendorf公司出品的multiporator点击装载。
为进一步判断装载成功与否，采用标记了Cy3的let-7来进行装载并采用荧光显微镜分析磁珠吸附AS1411-exosome-let-7-Cy3的荧光强度。从图3可知，磁珠吸附AS1411-exosome-let-7-Cy3后具有很强的荧光信号，说明let-7-Cy3通过电击成功装载到AS1411-exosome内，并赋予了AS1411-exosome很强的荧光信号(比例尺为100μm)。
装载后的AS1411-exosome-let-7在透射电镜下观察，判断电击对该复合体形貌的影响。结果图4所示，通过电击转染let-7后，AS1411-exosome的结构并没有明显变化，依然有其特有的“环状”结构，并且粒径大小显示也在50nm左右。
实施例4：AS1411-Exosome-Let-7的靶向性研究
(1)AS1411-Exosome-Let-7体外细胞水平靶向性研究
MDA-MB-231和C2C12细胞(购买自美国菌种保藏中心)经胰酶消化后，用各自的培养基将细胞稀释到2×105个/mL，然后分别吸取细胞悬液加到24孔板中，每孔500μL，并用振荡器轻微震荡使细胞均匀悬在培养液中，接着在37℃，5％CO2培养箱中培养过夜。设置一组MDA-MB-231对照组，即将核仁素抗体(200μg/mL)以1:100稀释到MDA-MB-231细胞培养皿的孔中，37℃，5％CO2培养箱中培养1～2h。通过电击转染方法将荧光基团Cy3修饰的let-7装载到AS1411-exosome或exosome中，然后，等量的AS1411-exosome-let-7-Cy3或exosome-let-7-Cy3与各组细胞孵育1h。接着，PBS反复冲洗细胞3～5遍后，胰酶消化后PBS洗脱两遍后，流式细胞仪检测细胞荧光；或是DAPI染色10min后荧光显微镜检测荧光强度。
流式细胞仪分析结果，如图5所示，C2C12(图5左)和MDA-MB-231(图5右)细胞膜表面核仁素的表达水平：结果显示，MDA-MB-231细胞膜表面核仁素含量明显比C2C12细胞膜表面含量高出许多。
结果发现，乳腺癌MDA-MB-231细胞孵育等量的AS1411-exosome-let-7-Cy3和exosome各45分钟后，荧光显微镜下观察到AS1411-exosome-let-7-Cy3实验组的荧光信号明显比exosome-let-7-Cy3对照组强。
(2)AS1411-Exosome-Let-7在体动物水平靶向性研究
通过电击转染方法将荧光基团Cy5修饰的let-7装载到AS1411-exosome或exosome中，并100KD超滤管超滤3次以去除未装载的let-7-Cy5。将50μg的AS1411-exosome-let-7-Cy5和exosome-let-7-Cy5通过尾静脉注射到负荷MDA-MB-231乳腺癌肿瘤的裸鼠体内，每半小时观察小鼠体内荧光分布，当小鼠肿瘤部位荧光信号到达顶峰时(约4.5h)，处死小鼠，摘取并拍摄小鼠主要器官。
动物水平分析AS1411-exosome的肿瘤靶向性功能体内分析结果，如图6所示，负荷乳腺癌肿瘤裸鼠被注射AS1411-exosome-let-7-Cy5或exosome-let-7-Cy54.5h后，各个主要器官的荧光强度。结果显示，实验组AS1411-exosome-let-7-Cy5中肿瘤的荧光强度明显强于其他器官的荧光强度，也比对照组exosome-let-7-Cy5的各个器官的荧光强度都强。说明AS1411-exosome能携带小核苷酸靶向肿瘤组织发挥作用。
实施例5：AS1411-Exosome-Let-7抗肿瘤活性检测
(1)AS1411-Exosome-Let-7体外细胞水平抗肿瘤活性检测
将乳腺癌细胞系MDA-MB-231接种于96空板中，每孔细胞约2,000个细胞。待细胞贴壁后加入15μg的AS1411-exosome-let-7和等量的对照组样品。加10μL WST-8溶液到含有100μL培养液的细胞中，孵育1～4小时。用酶标仪在450nm波长条件下检测吸光度值，并根据吸光值计算细胞活率。结果如图7所示，发现，实验组AS1411-exosome-let-7与对照组相比可明显抑制MDA-MB-231细胞活性。而AS1411-exosome，裸露的let-7，exosome，T-AS1411对MDA-MB-231细胞没有明显作用。结果说明裸露的let-7不能抑制乳腺癌细胞增殖，而AS1411-exosome可将let-7有效的递送到细胞内发挥功能来抑制乳腺癌细胞增殖(*P<0.05)。
将transwell小室接种乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞，每孔5,000个细胞。细胞贴壁后分别加入200μg的AS1411-exosome-let-7，AS1411-exosome、exosome和let-7以及等量的T-AS1411(30μL的5μM T-AS1411)和PBS培养48h。结晶紫染色：去掉培养基，PBS洗小室3次，用4％多聚甲醛室温静置固定20min；PBS洗3次，室温晾干；用0.1％结晶紫染色1～2min，PBS洗3次，用棉签轻轻刮掉小室内表面的细胞，室温晾干。显微镜下拍照，比较细胞迁移数目。转移小室法分析结果如图8所示，发现，实验组AS1411-exosome-let-7与其他对照组相比可明显抑制细胞迁移作用，而AS1411-exosome、裸露的let-7、exosome、T-AS1411对MDA-MB-231细胞没有明显作用。结果说明裸露的let-7不能抑制乳腺癌细胞迁移，而AS1411-exosome可将let-7有效的递送到细胞内发挥功能来抑制乳腺癌细胞迁移。
(2)AS1411-Exosome-Let-7在体动物水平抗肿瘤活性检测
将传代获得的MDA-MB-231细胞，经过PBS清洗两遍后，用无血清的1640培养基重悬并在显微镜下观察并计数，再以无血清的1640培养液调节细胞浓度到2×107个/mL，并收集在15mL的离心管中备用。然后分别按每只小鼠0.2mL细胞混悬液的量给随机选取的雌性BABL/cL裸鼠注射于右上肢腹股沟处，随后每天观察成瘤情况，并记录，一周左右基本上全部成瘤。
根据瘤体大小，随机将负荷乳腺癌的裸鼠分成7组并编号，每组6只。每组名称分别为：PBS组、T-AS1411组、裸露let-7组、exosome组、AS1411-exosome组、exosome-let-7组、AS1411-exosome-let-7组。
待小鼠肿瘤增长到0.8cm3体积(体积＝长×宽×宽/2)后，尾静脉给药150μg的AS1411-exosome-let-7，exosome-let-7，exosome，AS1411-exosome，裸露let-7以及与实验组等量的T-AS1411和PBS。每隔一天尾静脉方法注射一次，注射25天，共注射13次。每次给药前用游标卡尺测量小鼠的肿瘤长和宽来统计各组小鼠肿瘤生长情况。待最后一天将小鼠用脱颈发处死并解刨小鼠肿瘤进行拍照。
应用SPSS17软件进行统计分析，单组数据间使用t检验，多组数据间使用单因素方差分析，P＜0.05为有统计学意义。
结果如图9所示，显示，AS1411-exosome-let-7与其他对照组相比在小鼠体内可明显抑制乳腺癌肿瘤增殖。而exosome-let-7也具有一定抑制肿瘤组织增殖，但是与AS1411-exosome-let-7相比，抑制作用明显减弱。这个结果也进一步说明AS1411-exosome与exosome相比对乳腺癌肿瘤有更强的靶向性，可将let-7更有效的递送到肿瘤组织中发挥抑制肿瘤增殖和迁移功能(*P<0.05)。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 暨南大学
<120> 一种抗肿瘤靶向给药系统及其制备方法与应用
<130> 1
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 标记了CY3的核酸适配体AS1411
<220>
<221> CY3标记
<222> (28)..(28)
<400> 1
ttggtggtgg tggttgtggt ggtggtgg 28
<210> 2
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 标记了胆固醇的多肽
<220>
<221> 胆固醇标记
<222> (1)..(1)
<400> 2
Ile Ile Ala Ser Thr Ile Gly Gly Ile Phe Gly Ser Ser Thr Thr Gln
1 5 10 15
Ser Gly Gly Gly Gly
20

Claims (10)

1.一种抗肿瘤靶向给药系统，其特征在于由小核酸药物、包裹小核苷酸药物的脂膜囊状物及其靶向肿瘤细胞的靶头组成。
2.根据权利要求1所述的抗肿瘤靶向给药系统，其特征在于：
所述的脂膜囊状物是来自细胞内源产生的外泌体或者内囊泡，或是外源人工合成的脂质体。
3.根据权利要求2所述的抗肿瘤靶向给药系统，其特征在于：
所述的外源人工合成的脂质体为离子脂质体、单层脂质体、多层脂质体或多囊脂质体；
所述的外泌体来自于免疫细胞、间充质干细胞、间质细胞或上皮细胞，但不包括来自任何肿瘤细胞。
4.根据权利要求1所述的抗肿瘤靶向给药系统，其特征在于：所述的靶头是多肽、人工合成的化合物、天然产物或者核苷酸类物质。
5.根据权利要求4所述的抗肿瘤靶向给药系统，其特征在于：
所述的多肽为整合素亲和多肽RGD、血管活性肠肽VIP或P32受体亲和肽LyP-1；
所述的核苷酸类物质为适配体。
6.根据权利要求5所述的抗肿瘤靶向给药系统，其特征在于：
所述的适配体为适配体AS1411、适配体NOX-A12或适配体NOXXON。
7.根据权利要求1所述的抗肿瘤靶向给药系统，其特征在于：
所述的小核酸药物是siRNA、miRNA、piRNA或者人工合成的30nt以内单链及双链RNA分子。
8.根据权利要求7所述的抗肿瘤靶向给药系统，其特征在于：
所述的siRNA为siRNA-VEGF；
所述的miRNA为miRNA let-7、miRNA-16、miRNA-15b、miRNA-20a、miRNA-20b、miRNA-221、miRNA-222、miRNA-486或miRNA-937。
9.权利要求1～8任一项所述的抗肿瘤靶向给药系统的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)选用连接肽，先将靶头与连接肽偶联在一起，进行修饰，得到靶头修饰后的多肽；
(2)将靶头修饰后的多肽与脂膜囊状物进行混合孵育，得到混合物；
(3)通过电击转染方法将小核酸药物装载到步骤(2)得到的混合物中，得到抗肿瘤靶向给药系统；
所述的连接肽为N端标记了胆固醇分子的连接肽。
10.权利要求1～8任一项所述的抗肿瘤靶向给药系统在制备抗肿瘤药物方面的应用。
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