CN103550783A

CN103550783A - 一种核酸类药物靶向递送系统及其制备方法

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Publication number: CN103550783A
Application number: CN201310151807.0A
Authority: CN
Inventors: 王清清; 王啸林; 付洁; 高新; 葛华; 宋海峰
Original assignee: Institute of Radiation Medicine of CAMMS
Current assignee: Institute of Radiation Medicine of CAMMS
Priority date: 2013-04-27
Filing date: 2013-04-27
Publication date: 2014-02-05

Abstract

本发明属于核酸类药物靶向递送领域。本发明提供了一种核酸类药物靶向递送系统及其制备方法。本发明的靶向递送系统通过将核酸类药物与辅助分子，鱼精蛋白和/或小牛胸腺DNA结合形成复合物，递送系统稳定控制在100-150nm，便于药物进入靶点内部，并提高了系统的递送效率。通过化学修饰或自身耦合的方式使靶向配基与核酸-脂质类非病毒载体复合物交联，提高了该复合物的靶向性。

Description

一种核酸类药物靶向递送系统及其制备方法

技术领域

本发明属于药物靶向递送领域。本发明提供了基于脂质类非病毒载体的核酸类药物的靶向递送系统。具体而言，本发明提供了核酸类药物-脂质类非病毒载体复合物的制备过程，以及该核酸类药物-脂质类非病毒载体复合物与特异性配基的连接方法。本发明的靶向递送系统的特异性来源于靶向性配基。本发明靶向递送系统能将siRNA、DNA、MicroRNA或CpG等核酸类药物靶向递送至靶细胞并进入其内部发挥作用。

背景技术

以小干扰RNA（small interference RNA, siRNA）、反义寡核苷酸 (antisense oligodeoxynucleotide, ASODN)和核酸刺激基序（CpG）为代表的小分子核酸类药物在基因治疗中占据着越来越重要的地位，部分药物已经通过FDA批准上市，目前更有多种核酸类药物处于临床前和临床试验。核酸类药物是指通过结合或裂解作用特异地针对致病基因或蛋白，从而抑制/促进某些的基因/蛋白表达的核酸序列，其包括一切可替换缺陷基因的人体正常基因，阻断基因表达的反义核酸或促进三链形成的单链核酸等，如siRNA、DNA、MicroRNA或CpG等。

作为治疗性药物，核酸类药物需进入靶细胞才能发挥治疗效果，而核酸分子全身给药进入机体后短时间内即可被酶类降解。因此，如何确保核酸分子以最有效率的方式，并保持完整状态地进入靶细胞，进而发挥其药物活性，即成为核酸类药物体内研究所要解决的首要难题。“包裹”与“靶向”无疑是解决这一难题的两大主要策略。

在“包裹”方面，目前多采用将核酸类药物包裹在病毒载体或脂质类非病毒载体内，可使药物的稳定性明显增加。其中脂质类非病毒载体主要包括阳离子脂质体、脂质类胶束、聚合物或高聚物、纳米粒等，非病毒载体相对于病毒载体具有低毒，低免疫原性等特点适合体内多次注射，且易于大量生产，其在基因治疗上具有很大的临床应用潜力。但应用于体内递送时，脂质类非病毒载体系统还存在包裹率低、转染效率不高以及易出现脱靶效应等问题，这些均限制了其推广和应用。因此提高递送系统靶向性及转染效率也成为核酸类药物所要解决的另一大难题。

为了增加脂质类非病毒载体的组织细胞靶向性，在“靶向”策略中，常用配基包括寡核苷酸类适配子、抗体分子、抗体片断、天然产生的受体表面结合物、多肽等。这些常用配基均具有靶分子范围广、特异性强、亲和力高、无或低免疫原性等显著优势而显示出巨大的应用潜力。

本发明人通过大量实验和创造性劳动，设计和构建出了性能稳定具有高靶向性和高递送效率的核酸类药物靶向递送系统。

发明内容

本发明的目的是在于提高核酸类药物在脂质类非病毒载体中的稳定性、靶向性和递送效率。使核酸类药物全身给药后能以有效量到达靶组织并进入靶细胞，保持其生物活性，进而为核酸类药物的实验研究和临床应用创造条件。

本发明提供了一种核酸类药物靶向递送系统，该系统包括：

（a）脂质类非病毒载体；

（b）包裹或装载于所述脂质类非病毒载体的一种或多种核酸类药物以及辅助分子，其中辅助分子作用在于控制所述核酸类药物体积，便于药物进入靶点内部，提高系统的递送效率；和

（c）与所述脂质类非病毒载体直接复合或化学缀合的靶向性配基，所述靶向性配基的作用在于提高脂质类非病毒载体的靶向性。

本发明所述的核酸类药物靶向递送系统作用原理见图1。

本发明中，所述脂质类非病毒载体包括但不限于阳离子脂质体、脂质类胶束、聚合物或高聚物、纳米粒等。

在本发明中的一个实施方案中，其中所述的脂质类非病毒载体是脂质体，其主要含有磷脂和胆固醇。其中所述的磷脂为医用天然磷脂、合成磷脂或氢化磷脂，胆固醇为医用天然胆固醇或合成胆固醇。

在本发明中，所述核酸类药物通过被靶向至相应靶点发挥药物学活性，所述靶点包括但不限于基因序列、特定组织和细胞等。

本发明所述核酸类药物包括化学合成的核酸分子、修饰的核酸分子或通过Dicer酶降解产生的核酸分子，包括但不限于siRNA、DNA、MicroRNA和CpG等。

在本发明的一个优选实施方案中，其中所述siRNA的正义序列为 5’-GCA CTT GGC AAA GCC GCC C-3’。

在本发明的一个优选实施方案中，其中所述ODN是 5′-TAC CGC GTG CGA CCC TCT-3′。

本发明所述具有药物学活性的所述核酸分子以一种或多种化学修饰方式制备或合成，其中化学修饰方式包括：氟代修饰，甲氧基修饰，氨基修饰，锁核酸等修饰形式。

在本发明中，所述辅助分子是指可以与核酸类药物结合形成复合物的蛋白或核酸分子，包括小牛胸腺DNA和/或鱼精蛋白等。

在本发明中，所述靶向性配基包括：寡核苷酸类适配子、抗体分子、抗体片断、天然产生的受体表面结合物或多肽等。所述靶向性配基可以以一种或多种化学修饰方式制备或合成，其中化学修饰方式包括氟代修饰、甲氧基修饰、氨基修饰、锁核酸、糖基化、氨基化或磷酸化等修饰形式。所述的靶向性配基可以通过共价键的形式与PEG结合，其中PEG包括PEG 1000、PEG 2000、PEG 4000、DSPE-PEG或DSAA-PEG等不同聚合程度及修饰形式。

另外，本发明提供了一种核酸类药物靶向递送系统的制备方法，该方法包括：（a）制备脂质类非病毒载体；（b）将核酸类药物与辅助分子混合；（c）将步骤（a）与步骤（b）中的制备产物共孵育，生成核酸-脂质类非病毒载体复合物；（d）将步骤（c）制得的核酸-脂质类非病毒载体复合物与靶向配基结合，制得本发明所述的核酸类药物靶向递送系统。

本发明中所提到适配子-脂质体-siRNA复合物与适配子-脂质体-siRNA递送系统为同一物质。本发明制备的靶向性配基-脂质体-核酸复合物的粒径均在100 - 150 nm。

在本发明的一个实施方案中，本发明所述的核酸类药物靶向递送系统的制备方法包括：（a）将磷脂和胆固醇按一定比例混合，通过薄膜分散法制备阳离子脂质体；（b）将具有药物活性的核酸分子与小牛胸腺DNA和鱼精蛋白制成混合溶液，将该混合溶液与步骤（a）制备的阳离子脂质体混合，制备成脂质体-核酸复合物；然后，（c）将化学修饰后的靶向性配基与上述脂质体-核酸复合物在一定条件下混合，最终制备成靶向性配基-脂质体-核酸复合物。

一个具体实施方案中，所述磷脂与胆固醇的质量比为1:1~10:1，其中优选为1:1~5:1。制备具体操作为：将磷脂与胆固醇溶于5 mL氯仿；缓慢旋蒸15 min除去有机溶剂，使之在茄形瓶底部形成厚度均一且分散均匀的脂质薄膜；加入5 mL H₂O，置于旋蒸仪上旋蒸水合50 min，使形成均匀溶液且无颗粒状杂质。溶液超声处理后依次过0.45 μm和0.22 μm的滤膜，反复挤压使脂质体形成均一稳定的粒径。

一个具体实施方案中，所述核酸分子与鱼精蛋白的质量比为1:0.1~1:10，优选为1:0.5~1:2。具体操作为：将FAM标记的siRNA与小牛胸腺DNA混合后加入不同比例鱼精蛋白，室温孵育10 min，再加入本发明制备的空白脂质体，室温下孵育20 min，形成无杂质的淡乳白色均匀溶液；即，脂质体-siRNA复合物溶液。其中所述核酸分子与脂质体的质量比为1:100~1:1200，优选为1:300~1:600。

附图说明

图1：图示的是本发明所述核酸类药物靶向递送系统结构模式图。

图2：图示的是适配子-脂质体-siRNA核酸类药物靶向递送系统的透射电镜照片。

图3：图示的是适配子-脂质体-siRNA核酸类药物靶向递送系统的粒径和Zeta电位。其中图3A图示的是本发明构建的递送系统粒径；图3B图示的是本发明构建的递送系统Zeta电位示意图。

图4：本发明所构建的靶向递送系统与LNCap细胞特异性结合的流式检测结果。其中图4A图示的是阳性对照（PSMA抗体）的细胞亲和力测定结果；图4B图示的是所构建递送系统细胞亲和力测定结果。

图5：不同递送系统对siRNA在LNCap细胞中递送效率的比较。图中显示均为荧光显微结果。图5A至图5F分别图示的是细胞空白对照、裸siRNA、Lipofectamine-2000包裹siRNA、脂质体包裹siRNA、脂质体包裹siRNA（加入小牛胸腺DNA及鱼精蛋白）、本发明构建递送系统包裹siRNA。

图6：不同递送系统对靶mRNA的抑制效率比较。其中，*表示与裸siRNA组相比有显著性差异（p＜0.05）；# 表示与Lipofectamine 2000组相比有显著性差异（p＜0.05）（N=3）。

本发明的优点：

1. 本发明所述的核酸类药物靶向递送系统中加入了小牛胸腺DNA和鱼精蛋白，能够将靶向递送系统的粒径稳定控制在100-150 nm之内，并且提高了核酸类药物入胞效率。

2. 本发明所述的靶向递送系统表面稳定连接了靶向配基，能够将核酸类药物特异性地靶向递送至靶细胞，从而发挥特异性药学活性。

3. 本发明的递送系统和递送方法适用范围广，能用于将siRNA、DNA、MicroRNA或CpG等核酸类药物运送至靶细胞。

除另外说明外，本申请中的所有科技术语都具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。尽管与本申请中描述类似或等同的方法及材料都可用于实施或检验本发明，但是下文仍还是对合适的方法和材料进行了描述。本申请中引用的全部出版物、专利申请、专利及其他参考文献其全部内容在此引入作为参考。如有抵触，包括定义，以本申请为准。

下列实施例旨在进一步举例说明实现本发明的具体方式，而绝不构成对本发明的限制。本领域技术人员应该理解的是，在不违背本发明的精神和原则的前提下，对本发明进行改动得到的技术方案都将落入本发明的待批权利要求范围内。

实施例

在本申请中，如无特别说明，本发明的实施都使用分子生物学、微生物学、制剂学等的常规技术，这些技术都是本领域技术人员所掌握的。这些技术在本领域技术人员常用文献中有详细地描述。

实施例1 适配子-脂质体-siRNA核酸类药物靶向递送系统的制备

本实施例中适配子-脂质体-siRNA靶向递送系统主要成分有脂质体，适配子，小牛胸腺DNA，鱼精蛋白，siRNA等。所选用适配子为靶向LNCap细胞膜蛋白PSMA的RNA适配子A10。

脂质体的制备

将磷脂与胆固醇各2 mg（质量比1：1）溶于5 mL氯仿；缓慢旋蒸15 min除去有机溶剂，使之在茄形瓶底部形成厚度均一且分散均匀的脂质薄膜；加入5 mL H₂O，置于旋蒸仪上旋蒸水合50 min，使形成均匀溶液且无颗粒状杂质。溶液超声处理后依次过0.45 μm和0.22 μm的滤膜，反复挤压使脂质体形成100-150 nm均一稳定的粒径；

1.2 脂质体包裹siRNA

将FAM标记的siRNA与小牛胸腺DNA混合后加入0.02 ng/μL鱼精蛋白，室温孵育10 min，再加入1.1中制备的空白脂质体，室温下孵育20 min，形成无杂质的淡乳白色均匀溶液；即，脂质体-siRNA复合物溶液。

适配子-脂质体-siRNA靶向递送系统的制备

将PEG化修饰的RNA适配子（序列：5’-UCC UCA CUG CAU UUG UAC CGA CUA GGC GUA GCA GGA GGG -3’）与脂质体-siRNA复合物按摩尔比0.3:1混合后，60℃孵育1 h，使适配子能够均匀分散并锚定于脂质体表面。制备得到适配子-脂质体-siRNA靶向递送系统。

通过透射电镜观察适配子-脂质体-siRNA靶向递送系统的形态。如图2所示，在透射电镜下观察到，适配子-脂质体-siRNA复合物呈现球形或者类球形。马尔文激光粒度仪测定本递送系统的不同批次的平均粒径在100-150 nm，Zeta电位平均值在60 mV。图3所示为其中一批次结果。

实施例2 适配子-脂质体-siRNA核酸类药物靶向递送系统与LNCap细胞特异性结合的评价

本实验的原理是，LNCap细胞膜上前列腺特异性膜抗原（PSMA）能够特异地与其抗体（PSMA抗体），或相应适配子（A10及本发明所构建的适配子-脂质体-siRNA靶向递送系统）结合。通过PE-标记PSMA抗体与靶向递送系统竞争性结果反映出靶向递送系统与LNCap细胞结合的特异性。

将消化后的状态良好的前列腺癌细胞LNCap细胞1×10⁶个（密度为1×10⁶个/ml）于PBS中混匀，将PE-标记PSMA抗体与LNCap细胞混合后孵育20 min；PBS洗掉未结合的抗体。接着，将适配子-脂质体-siRNA核酸类药物靶向递送系统与用PE标记抗体孵育过的靶细胞混合，孵育20 min；PBS洗掉未竞争结合后脱落的抗体。将先后经PE标记抗体和本发明递送系统孵育过的靶细胞用甲醛固定后，通过流式细胞仪检测，结果如图4。

图4A显示，PE-标记PSMA抗体可以与LNCap细胞结合，使得未染色LNCap细胞的荧光结果右移（红色线条表示）；当加入PSMA抗体后，未标记抗体与PE-标记抗体竞争性结合PSMA位点，使得荧光结果峰值左移（蓝色线条表示）。

图4B显示出与4A相似的结果，即，当加入适配子-脂质体-siRNA复合物后，荧光强度减弱，峰值左移（蓝色线条表示）。此结果表明，本发明的适配子-脂质体-siRNA复合物可与PE-标记PSMA抗体进行竞争结合。从而证明，本发明的适配子-脂质体-siRNA复合物与LNCap细胞结合的特异性。

实施例3适配子-脂质体-siRNA核酸类药物靶向递送系统的siRNA入胞活性评价

每个实验孔中均匀接种250 μL培养基，约1×10⁵个前列腺癌细胞LNCap细胞（细胞密度为4×10⁵个/ml），接种前需细胞状态良好，实验分组（A-F组）如下：空白细胞组（阴性对照），裸siRNA组，Lipofectamine-2000+siRNA组（阳性对照），脂质体+siRNA组，脂质体+小牛胸腺DNA+鱼精蛋白+siRNA组，适配子+脂质体+小牛胸腺DNA+鱼精蛋白+siRNA组，每组样品做一个复孔。

转染前，吸弃培养基后用PBS洗细胞2次，保证转染时无血清干扰，分别加入以上各组溶液50 μL/孔于试验孔，分别补无血清培养基至300 μL；于37℃、5% CO₂环境下孵育6 h；之后，吸弃无血清培养基，加入新鲜培养基继续培养，并随时观察细胞状态。

转染后6 h，通过荧光显微镜观察FAM标记的siRNA入胞效果如图5所示。与空白细胞组（图5A）相比，没有其他任何脂质体辅助的裸siRNA组（图5B）具有一定的入胞效果，但远低于其他各组的入胞效率。单纯脂质体介导的siRNA入胞（脂质体+siRNA组）（图5D）与商品化转染试剂Lipofectamine-2000介导的siRNA入胞效率（图5C）相当，但均低于脂质体+鱼精蛋白+小牛胸腺DNA+siRNA组（图5E）。而本发明构建的递送系统（适配子+脂质体+小牛胸腺DNA+鱼精蛋白+siRNA组）（图5 F）其入胞效率显著高于其他各组，进一步说明加入适配子后能够显著提高siRNA入胞效率。

实施例4 适配子-脂质体-siRNA核酸类药物靶向递送系统的靶基因沉默活性评价。

每个实验孔中均匀接种250 μL培养基中均匀接种1×10⁵个前列腺癌细胞LNCap细胞（细胞密度为2×10⁵个/ml），接种前需细胞状态良好，实验分组如下：空白细胞组（阴性对照），裸siRNA组，Lipofectamine-2000+siRNA组，脂质体+siRNA组，脂质体+小牛胸腺DNA+鱼精蛋白+siRNA组，适配子+脂质体+siRNA组，适配子+脂质体+小牛胸腺DNA+鱼精蛋白+siRNA组，每组样品做一个复孔。

转染前，吸弃培养基后用PBS洗细胞2次，保证转染时无血清干扰，分别加入以上各组溶液 50 μL/孔于试验孔，分别补无血清培养基至300 μL；于37℃、5% CO₂环境下孵育6 h；之后，吸弃无血清培养基，加入新鲜培养基继续培养，并随时观察细胞状态。

转染后48 h，用Trizol裂解细胞，提取总RNA，测定浓度。将提取所得总RNA通过一步法RT-PCR扩增DNA，琼脂糖凝胶电泳检测各组中靶基因（plk-1）沉默效果。以GAPDH为看家基因，根据灰度分析调节目的基因上样量。将PCR产物在的琼脂糖凝胶（含溴化乙锭5 g·L^-1）中电泳，凝胶成像系统下观察照相，通过Tanon GIS凝胶图像处理系统（上海天能科技有限公司，版本号4.10）进行灰度分析，以Plk-1/GAPDH条带的光密度比值进行Plk-1 mRNA表达水平的半定量分析（图6），如图6显示，Lipofectamine-2000+siRNA组，脂质体+siRNA组，脂质体+小牛胸腺DNA+鱼精蛋白+siRNA组，适配子+脂质体+siRNA组，适配子+脂质体+小牛胸腺DNA+鱼精蛋白+siRNA组与阴性对照（裸siRNA组）相比均有显著差异（^*p＜0.05）。而与Lipofectamine 2000+siRNA组相比，只有本实施例的适配子-脂质体-siRNA组在沉默效率上显示出统计意义差异（^#p＜0.05）。说明本发明制备的递送系统具有更高的siRNA递送效率。

实施例5 适配子-脂质体-ODNs核酸类药物靶向递送系统的制备

本实施例中适配子-脂质体-ODNs靶向递送系统主要成分有脂质体，适配子，小牛胸腺DNA，鱼精蛋白，ODNs等。所选用适配子为靶向LNCap细胞膜蛋白PSMA的RNA适配子A10。

脂质体的制备

将磷脂6 mg与胆固醇2 mg（质量比3：1）溶于5 mL氯仿；缓慢旋蒸20 min除去有机溶剂，使之在茄形瓶底部形成厚度均一且分散均匀的脂质薄膜；加入5 mL H₂O，置于旋蒸仪上旋蒸水合50 min，使形成均匀溶液且无颗粒状杂质。溶液超声后依次通过0.45 μm和0.22 μm的滤膜，反复挤压使脂质体形成100-150 nm以下均一稳定的粒径。

脂质体包裹ODNs

将ODNs与小牛胸腺DNA混合后加入0.04 ng/μL鱼精蛋白，室温孵育15 min，再加入上述空白脂质体室温下孵育20 min，使形成无杂质的淡乳白色均匀溶液；即，脂质体-ODNs复合物溶液。

适配子-脂质体-ODNs靶向递送系统的制备

将PEG化修饰的适配子与脂质体-ODNs复合物按摩尔比0.3:1混合后，60℃孵育1 h，使适配子能够均匀分散并锚定于脂质体表面；制备得到适配子-脂质体-ODNs靶向递送系统。

通过透射电镜观察适配子-脂质体-ODNs靶向递送系统的形态，用马尔文激光粒度仪测定本粒径和Zeta电位。

Claims

1.一种核酸类药物靶向递送系统，该系统包括：

（a）脂质类非病毒载体；

2.权利要求1的核酸类药物靶向递送系统，其中所述的脂质类病毒载体包括阳离子脂质体、脂质类胶束、聚合物或高聚物、纳米粒等。

3.权利要求1或2的核酸类药物靶向递送系统，其中所述的核酸类药物是siRNA、DNA、MicroRNA或CpG。

4.权利要求1至3中任一项所述的核酸类药物靶向递送系统，其中所述的辅助分子是小牛胸腺DNA和/或鱼精蛋白。

5.权利要求1至4中任一项所述的核酸类药物靶向递送系统，其中所述的靶向配基：

（1）选自寡核苷酸类适配子、抗体分子、抗体片断、天然产生的受体表面结合物或多肽；

（2）以一种或多种化学修饰方式制备或合成，其中化学修饰方式包括氟代修饰、甲氧基修饰、氨基修饰、锁核酸、糖基化、氨基化或磷酸化等修饰形式；或者

（3）所述的靶向性配基通过共价键的形式与PEG结合，其中PEG包括PEG 1000、PEG 2000、PEG 4000、DSPE-PEG或DSAA-PEG等不同聚合程度及修饰形式。

6.一种核酸类药物靶向递送系统的制备方法，该方法包括：（a）制备脂质类非病毒载体；（b）将核酸类药物与辅助分子混合，（c）将步骤（a）和步骤（b）中制备产物共孵育，生成核酸-脂质类非病毒载体复合物，（d）将步骤（c）中制得的核酸-脂质类非病毒载体复合物与靶向配基结合，制得所述核酸类药物靶向递送系统。

7.一种适配子-脂质体-siRNA复合物的制备方法，该方法包括：（a）将磷脂和胆固醇混合，通过薄膜分散法制备阳离子脂质体；（b）将核酸类药物与小牛胸腺DNA和鱼精蛋白制成混合溶液，（c）将该混合溶液与步骤（a）制备的阳离子脂质体混合，制备成脂质体-核酸复合物；（d）将化学修饰后的靶向性配基与上述（c）中制备的脂质体-核酸复合物在一定条件下混合，最终制备成靶向性配基-脂质体-核酸复合物。

8.权利要求7的制备方法，其中磷脂与胆固醇的质量比为1:1~10:1，其中优选为1:1~5:1，其中所述核酸分子与脂质体的质量比为1:100~1:1200，优选为1:300~1:600，核酸类药物与小牛胸腺DNA和鱼精蛋白之间的质量比为1:0.1~1:10，其中优选为1:0.5~1:10。