CN112111524B - mRNA-GalNAc靶向分子的制备方法及其体内递送系统和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种mRNA‑GalNAc靶向分子的制备方法及其体内递送系统和应用，所述mRNA‑GalNAc靶向分子包括mRNA分子，所述mRNA分子与3’带有N‑乙酰半乳糖胺修饰的PolyA连接；所述mRNA分子的序列包含5’帽子和目的基因序列。采用本发明的技术方案，通过将表达目的基因的mRNA分子直接与偶联有GalNAc的polyA序列进行连接，合成出3’端带有GalNAc的mRNA分子，从而实现达到肝脏靶向性药物递送的目的，方法更加简单可靠，解决了现有的mRNA与N‑乙酰半乳糖胺的偶合难题。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种mRNA-GalNAc靶向分子的制备方法及其体内递送系统和应用。
背景技术
目前，mRNA向细胞内的递送可以通过不同的方法实现，例如电穿孔，声孔效应，显微注射或化学化合物转染，但这些方法细胞毒性和生物安全性无法满足临床需求，临床转化具有一定难度。
去唾液酸糖蛋白受体是数量丰富的一种异源低聚物的内吞型受体，主要存在于肝脏实质细胞朝向窦状隙一侧的细胞膜表面，具有对糖的特异性。由于各种糖蛋白在用酶水解或用酸解除去末端唾液酸后，暴露出的次末端是半乳糖残基，所以ASGPR 的糖结合特异性实际上在于半乳糖基，故又称半乳糖特异性受体。末端为非还原性的半乳糖（Gal）或GalNAc（N-acetylgalactosamine，N-乙酰半乳糖胺）残基的糖蛋白均可以被ASGPR 识别，GalNAc 与ASGPR 结合的亲和性比Gal 高几十倍（约50 倍）研究观察到，三触角的成簇化GalNAc缀合物可以将GalNAc与肝实质细胞的亲和性提高约50 倍。
经过多年持续的研发，GalNAc 缀合的小干扰RNA（Small interfering RNA，siRNA）已实现高效肝脏靶向性药物递送。尽管该受体已被发现多年，但基于该受体及其配体的信使RNA（Messenger RNA，mRNA）递送系统未能取得突破，原因在于现有技术手段未能实现GalNAc与mRNA的高效耦合， mRNA-GalNAc复合物在体内递送时电荷属性以及被细胞内吞后的内体逃逸效率等问题。
发明内容
针对以上技术问题，本发明公开了一种mRNA-GalNAc靶向分子的制备方法及其体内递送系统和应用，实现了mRNA与N-乙酰半乳糖胺的直接高效偶联，并通过正电荷蛋白改变mRNA-GalNAc复合物在体内递送时电荷属性，增加了其内体逃逸效率。
对此，本发明采用的技术方案为：
一种mRNA-GalNAc靶向分子，即mRNA-GalNAc靶向分子，其包括mRNA分子，所述mRNA分子与3’带有N-乙酰半乳糖胺修饰的PolyA连接；所述mRNA分子的序列包含5’帽子和目的基因序列。
采用此技术方案的mRNA-GalNAc靶向分子可以用于药物递送系统中，mRNA靶向分子的3’端连接有N-乙酰半乳糖胺，通过N-乙酰半乳糖胺与肝脏细胞表面唾液酸糖蛋白受体特异性结合引物细胞内吞，从而使mRNA进入细胞进行表达，解决了核酸药物在药物递送过程中的靶向递送的技术难题。
作为本发明的进一步改进，所述mRNA分子通过夹板DNA与3’带有N-乙酰半乳糖胺修饰的PolyA连接。
作为本发明的进一步改进，所述mRNA分子采用包含DNA片段的质粒通过体外转录得到，其中所述DNA片段包括启动子、目的基因、第一夹板DNA序列依次连接而成；
所述3’带有N-乙酰半乳糖胺修饰的PolyA片段，其5’端为能与第二夹板DNA序列互补配对的RNA序列，所述第一夹板DNA序列和第二夹板DNA序列构成夹板DNA序列。
在没有夹板DNA的情况下，mRNA分子与3’带有N-乙酰半乳糖胺修饰的PolyA若直接进行偶联，会出现错配率高，而且连接效率低等问题。此技术方案采用夹板DNA，能大大提高链接效率和准确率。在退火反应中，带有第一夹板DNA序列的互补序列的mRNA分子与带有第二夹板DNA序列互补配对的RNA序列的PolyA分子分别与夹板DNA互补结合，在T4 DNA连接酶作用下，所述mRNA分子的3’端羟基与带有N-乙酰半乳糖胺修饰的PolyA的5’端磷酸基团连接，经过DNA酶处理后，得到基于带有N-乙酰半乳糖胺修饰的mRNA靶向分子。
进一步的，所述启动子为T3或T7或SP6启动子。
进一步的，所述第一夹板DNA序列如SEQ ID No.1所示，所述第二夹板DNA序列如SEQ ID No.2所示。
SEQ ID No.1：5’-TACCGGTTAG-3’，
SEQ ID No.2：5’-TAATGAGTTT-3’。
本发明还公开了一种如上所述的mRNA-GalNAc靶向分子的制备方法，其包括以下步骤：
步骤S1，设计并合成一段带有启动子序列、目的基因序列的质粒载体；
步骤S2，以步骤S1的质粒载体为模板进行体外转录，得到mRNA分子，所述mRNA分子的序列包含5’帽子和目的基因序列；
步骤S3，在连接酶的作用下，mRNA分子与3’带有N-乙酰半乳糖胺修饰的PolyA序列结合，得到mRNA-GalNAc靶向分子。
作为本发明的进一步改进，步骤S1中，所述质粒载体中的DNA序列包括依次连接的启动子序列、目的基因序列和第一夹板DNA序列；
进一步的，步骤S2中得到mRNA分子的序列包含依次连接的5’帽子、目的基因序列、第一夹板DNA序列的互补序列对应的RNA序列；
进一步的，步骤S3中，所述3’带有N-乙酰半乳糖胺修饰的PolyA片段，其5’端为能与第二夹板DNA序列互补配对的RNA序列，所述第一夹板DNA序列和第二夹板DNA序列构成夹板DNA；
进一步的，步骤S3中，在退火反应中，带有第一夹板DNA序列的互补序列的mRNA分子与带有第二夹板DNA序列互补配对序列的PolyA分子分别与夹板DNA互补结合，在T4 DNA连接酶作用下，所述mRNA分子的3’端羟基与带有N-乙酰半乳糖胺修饰的PolyA的5’端磷酸基团连接，经过DNA酶处理后，得到基于带有N-乙酰半乳糖胺修饰的mRNA靶向分子。
作为本发明的进一步改进，所述第一夹板DNA序列如SEQ ID No.1所示，所述第二夹板DNA序列如SEQ ID No.2所示。
进一步的，所述连接酶为T4 DNA连接酶。
进一步的，所述启动子为T3或T7或SP6启动子。
本发明还公开了一种体内递送系统，其包括上任意一项所述的mRNA-GalNAc靶向分子和带正电荷的蛋白分子。通过研究发现，采用直接偶联的mRNA-GalNAc在不进行电荷中和的情况下，在体内无法进行组织的靶向递送，只能在体外细胞实验中实现肝脏细胞的转染。本发明所述递送系统，通过使用带正电荷的蛋白实现了不依赖于传统脂质体、脂质纳米颗粒的体内递送。在体内提高了mRNA-GalNAc的稳定性，增加了细胞内吞后内体的逃逸效率，实现组织器官靶向递送。
作为本发明的进一步改进，所述带正电荷的蛋白为鱼精蛋白（Protamine）或人血清白蛋白（human serum albumin， HSA）中的至少一种。采用此技术方案，通过筛选出有效的带正电荷的蛋白分子，中和mRNA分子本身的负电荷实现了mRNA-GalNAc在体内的稳定性从而实现了体内组织器官靶向递送。
目前鱼精蛋白、人血清白蛋白等正电荷蛋白在核酸递送过程中的应用主要通过借助偶联脂质体、脂质纳米颗粒等载体行使功能。采用此技术方案，通过组合mRNA-GalNAc、鱼精蛋白、人血清白蛋白实现了不依赖脂质体、脂质纳米颗粒等传统载体的体内组织器官靶向递送。
作为本发明的进一步改进，所述体内递送系统通过佐剂鱼精蛋白/人血清白蛋白（Protamine/HSA）调节所述带有N-乙酰半乳糖胺修饰的mRNA靶向分子的电荷属性得到，其中所述鱼精蛋白、人血清白蛋白的摩尔比为1：2.75~5.5或1：6~20。进一步优选的，所述鱼精蛋白、人血清白蛋白的摩尔比为1：2.75~5.5。采用此技术方案可以增强mRNA在体内的稳定性和转染效率。
本发明还公开了一种如上所述的mRNA-GalNAc靶向分子的应用，所述mRNA-GalNAc靶向分子用于体内靶向药物递送，3’端连接有N-乙酰半乳糖胺，通过N-乙酰半乳糖胺与肝脏细胞表面唾液酸糖蛋白受体特异性结合引物细胞内吞，从而使mRNA进入细胞进行表达。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
采用本发明的技术方案，通过将表达目的基因的mRNA分子直接与偶联有GalNAc的PolyA序列进行连接，合成出3’端带有GalNAc的mRNA分子，在正电荷蛋白的作用下实现体内靶向递送，达到肝脏靶向性给药的目的，此方法不依赖脂质体、脂质纳米颗粒等传统载体，方法更加简单可靠，解决了现有的mRNA与N-乙酰半乳糖胺的偶合难题，以及体内靶向递送的难题。进一步的，通过夹板DNA能大大提高连接效率和准确率；采用带正电荷的蛋白分子，中和mRNA分子本身的负电荷，实现了mRNA-GalNAc在体内的稳定性，并增强内体逃逸效率，从而更好的实现药物在体内组织器官的靶向递送。
附图说明
图1是本发明实施例1一种mRNA-GalNAc靶向分子的制备方法的流程示意图；其中（a）为质粒DNA中DNA片段以及进行体外转录得到mRNA分子的结构示意图；（b）为mRNA分子与3’带有N-乙酰半乳糖胺修饰的PolyA待结合的示意图；（c）为得到的mRNA-GalNAc靶向分子的示意图。
图2是本发明实施例2的一种mRNA-GalNAc靶向分子的制备方法的流程示意图；其中（a）为质粒DNA中DNA片段以及进行体外转录得到mRNA分子的结构示意图；（b）为mRNA分子通过夹板DNA与3’带有N-乙酰半乳糖胺修饰的PolyA连接的示意图；（c）为得到的mRNA-GalNAc靶向分子的示意图。
图3是本发明实施例2的mRNA-GalNAc靶向分子与正电荷蛋白相互作用制备体内递送系统的原理图。
图4是本发明实施例2的mRNA-GalNAc靶向分子在体内递送的原理示意图，其中，GalNAc-mRNA耦合物通过结合肝脏细胞表面ASGPR引起细胞内吞使得mRNA进入细胞，经过内体逃逸以及核糖体翻译等步骤，进而表达目的基因蛋白。
图5是本发明实施例3的GalNAc-mRNA递送系统体内递送目的基因到肝脏组织的结果对比图。其中，（a）为采用不同比例的鱼精蛋白/人血清白蛋白递送系统的体内递送荧光素酶（Luc）活性对比结果；（b）为采用不同比例的鱼精蛋白/人血清白蛋白递送系统的红细胞生成素（Epo）的对比结果；（c）为采用不同比例的鱼精蛋白/人血清白蛋白递送系统递送红细胞生成素（Epo）后，动物血细胞比容的对比结果。
图6是本发明实施例3的采用两种不同比例的鱼精蛋白/人血清白蛋白GalNAc-mRNA肝脏递送系统与对比例不采用正电荷蛋白的递送系统在肝脏细胞中表达绿色荧光蛋白（GFP）的对比示意图。
图7是本发明实施例4的采用不同比例的鱼精蛋白/人血清白蛋白GalNAc-mRNA肝脏递送系统与对比例在体内递送荧光素酶（Luc）到肝脏组织的结果示意图。
具体实施方式
下面对本发明的较优的实施例作进一步的详细说明。
实施例1
一种mRNA-GalNAc靶向分子，即mRNA-GalNAc靶向分子，其包括mRNA分子，所述mRNA分子与3’带有N-乙酰半乳糖胺修饰的PolyA连接；所述mRNA分子的序列包含5’帽子和目的基因序列。
如图1所示，所述mRNA-GalNAc靶向分子采用以下步骤制备得到：
步骤S1，设计并合成一段带有启动子序列、目的基因序列的质粒载体；
步骤S2，以步骤S1的质粒载体为模板进行体外转录，得到mRNA分子，所述mRNA分子的序列包含5’帽子和目的基因序列；
步骤S3，在连接酶的作用下，mRNA分子与3’带有N-乙酰半乳糖胺修饰的PolyA序列结合，得到mRNA-GalNAc靶向分子。
进一步的，所述连接酶为DNA T4连接酶。
本实施例中，所述启动子的序列如SEQ ID No.3所示。
进一步的，所述目的基因为如SEQ ID No.4所示。
SEQ ID No.3：TAATACGACTCACTATAGG
SEQ ID No.4：
gtgagcaagggcgaggagaccacaatgggcgtaatcaagcccgacatgaagatcaagctgaagatggagggcaacgtgaatggccacgccttcgtgatcgagggcgagggcgagggcaagccctacgacggcaccaacaccatcaacctggaggtgaaggagggagcccccctgcccttctcctacgacattctgaccaccgcgttcagttacggcaacagggccttcaccaagtaccccgacgacatccccaactacttcaagcagtccttccccgagggctactcttgggagcgcaccatgaccttcgaggacaagggcatcgtgaaggtgaagtccgacatctccatggaggaggactccttcatctacgagatacacctcaagggcgagaacttcccccccaacggccccgtgatgcagaaggagaccaccggctgggacgcctccaccgagaggatgtacgtgcgcgacggcgtgctgaagggcgacgtcaagatgaagctgctgctggagggcggcggccaccaccgcgttgacttcaagaccatctacagggccaagaaggcggtgaagctgcccgactatcactttgtggaccaccgcatcgagatcctgaaccacgacaaggactacaacaaggtgaccgtttacgagatcgccgtggcccgcaactccaccgacggcatggacgagctgtacaagtaa
本实施例制备得到的mRNA-GalNAc靶向分子，可以用于制备特异性药物递送的mRNA药物中，3’端连接有N-乙酰半乳糖胺，通过N-乙酰半乳糖胺与肝脏细胞表面唾液酸糖蛋白受体特异性结合引物细胞内吞，从而使mRNA进入细胞进行表达。
实施例2
一种mRNA-GalNAc靶向分子，即mRNA-GalNAc靶向分子，其包括mRNA分子，所述mRNA分子的序列包含5’帽子和目的基因序列。所述mRNA分子通过夹板DNA与3’带有N-乙酰半乳糖胺修饰的PolyA连接。所述mRNA-GalNAc靶向分子包括带正电荷的蛋白分子。
如图2所示，所述mRNA-GalNAc靶向分子采用以下步骤制备得到：
步骤S1，设计并合成一段带有启动子序列、目的基因序列和第一夹板DNA序列的质粒载体；
步骤S2，以步骤S1的质粒载体为模板进行体外转录，得到mRNA分子，所述mRNA分子的序列包含依次连接的5’帽子、目的基因序列、以及与第一夹板DNA序列的互补序列对应的RNA序列；
步骤S3，3’带有N-乙酰半乳糖胺修饰的PolyA片段，其5’端为能与第二夹板DNA序列互补配对的RNA序列，所述第一夹板DNA序列和第二夹板DNA序列构成夹板DNA；在退火反应中，带有第一夹板DNA序列的互补序列的mRNA分子与带有与第二夹板DNA序列互补配对序列的PolyA分子分别与夹板DNA互补结合，在T4 DNA连接酶作用下，所述mRNA分子的3’端羟基与带有N-乙酰半乳糖胺修饰的PolyA的5’端磷酸基团连接，经过DNA酶处理后，得到基于带有N-乙酰半乳糖胺修饰的mRNA靶向分子。
本实施例中，所述第一夹板DNA序列如SEQ ID No.1所示，所述第二夹板DNA序列如SEQ ID No.2所示。
所述启动子的序列如SEQ ID No.3所示。
所述目的基因为如SEQ ID No.4所示。
进一步的，所述连接酶为DNA T4连接酶。
本实施例得到的mRNA-GalNAc靶向分子可以用于制备特异性药物递送的mRNA药物中，3’端连接有N-乙酰半乳糖胺，通过N-乙酰半乳糖胺与肝脏细胞表面唾液酸糖蛋白受体特异性结合引物细胞内吞，从而使mRNA进入细胞进行表达，如图3和图4所示。
实施例3
一种体内递送系统，其包括实施例2的mRNA-GalNAc靶向分子和带正电荷的蛋白。该体内递送系统在得到mRNA-GalNAc靶向分子后，通过佐剂Protamine/HSA调节N-乙酰半乳糖胺的mRNA靶向分子的电荷属性得到。该步骤使得mRNA-GalNAc靶向分子包含带正电荷的蛋白，增强mRNA在体内的稳定性和转染效率。进一步的，所述带正电荷的蛋白为鱼精蛋白或人血清白蛋白中的至少一种。
本实施例通过筛选出有效的带正电荷的蛋白分子，中和mRNA分子本身的负电荷，实现了mRNA-GalNAc在体内的稳定性，增加了细胞内吞后内涵体的逃逸效率，从而实现了体内组织器官靶向递送，作用原理如图4所示。
本实施例还选用了不同比例的鱼精蛋白与人血清白蛋白、以及单独的鱼精蛋白、人血清白蛋白进行了实验，其中Protamine/HAS RatioA的摩尔比为1：2.75至1：5.5，Protamine/HAS RatioB 的摩尔比为1：6至1：20，测试结果如图5（a）~（c）所示，通过对比可见，采用鱼精蛋白与人血清白蛋白两种混合正电荷蛋白比采用单一正电荷蛋白的递送系统具有更好的稳定性和转染效率，且鱼精蛋白与人血清白蛋白的比例为RatioA的递送系统的稳定性和转染效率最高。
另外，针对采用鱼精蛋白与人血清白蛋白的摩尔比为RatioA和RatioB的递送系统与不采用鱼精蛋白与人血清白蛋白的递送系统进行实验对比，如图6所示，采用RatioA和RatioB的递送系统与不采用鱼精蛋白与人血清白蛋白的递送系统相比，在肝脏细胞中能更加高效的表达绿色荧光蛋白（GFP）。
实施例4
在实施例3的基础上，一种体内递送系统，其包括mRNA-GalNAc靶向分子和带正电荷的蛋白，与实施例3不同的是，其中所述mRNA-GalNAc靶向分子中的目的基因序列如SEQID No.5。
SEQ ID No.5：
atggaagatgccaaaaacattaagaagggcccagcgccattctacccactcgaagacgggaccgccggcgagcagctgcacaaagccatgaagcgctacgccctggtgcccggcaccatcgcctttaccgacgcacatatcgaggtggacattacctacgccgagtacttcgagatgagcgttcggctggcagaagctatgaagcgctatgggctgaatacaaaccatcggatcgtggtgtgcagcgagaatagcttgcagttcttcatgcccgtgttgggtgccctgttcatcggtgtggctgtggccccagctaacgacatctacaacgagcgcgagctgctgaacagcatgggcatcagccagcccaccgtcgtattcgtgagcaagaaagggctgcaaaagatcctcaacgtgcaaaagaagctaccgatcatacaaaagatcatcatcatggatagcaagaccgactaccagggcttccaaagcatgtacaccttcgtgacttcccatttgccacccggcttcaacgagtacgacttcgtgcccgagagcttcgaccgggacaaaaccatcgccctgatcatgaacagtagtggcagtaccggattgcccaagggcgtagccctaccgcaccgcaccgcttgtgtccgattcagtcatgcccgcgaccccatcttcggcaaccagatcatccccgacaccgctatcctcagcgtggtgccatttcaccacggcttcggcatgttcaccacgctgggctacttgatctgcggctttcgggtcgtgctcatgtaccgcttcgaggaggagctattcttgcgcagcttgcaagactataagattcaatctgccctgctggtgcccacactatttagcttcttcgctaagagcactctcatcgacaagtacgacctaagcaacttgcacgagatcgccagcggcggggcgccgctcagcaaggaggtaggtgaggccgtggccaaacgcttccacctaccaggcatccgccagggctacggcctgacagaaacaaccagcgccattctgatcacccccgaaggggacgacaagcctggcgcagtaggcaaggtggtgcccttcttcgaggctaaggtggtggacttggacaccggtaagacactgggtgtgaaccagcgcggcgagctgtgcgtccgtggccccatgatcatgagcggctacgttaacaaccccgaggctacaaacgctctcatcgacaaggacggctggctgcacagcggcgacatcgcctactgggacgaggacgagcacttcttcatcgtggaccggctgaagagcctgatcaaatacaagggctaccaggtagccccagccgaactggagagcatcctgctgcaacaccccaacatcttcgacgccggggtcgccggcctgcccgacgacgatgccggcgagctgcccgccgcagtcgtcgtgctggaacacggtaaaaccatgaccgagaaggagatcgtggactatgtggccagccaggttacaaccgccaagaagctgcgcggtggtgttgtgttcgtggacgaggtgcctaaaggactgaccggcaagttggacgcccgcaagatccgcgagattctcattaaggccaagaagggcggcaagatcgccgtgtaa
该体内递送系统在得到mRNA-GalNAc靶向分子后，通过佐剂Protamine/HSA调节N-乙酰半乳糖胺的mRNA靶向分子的电荷属性得到，其中Protamine/HAS RatioA的摩尔比为1：2.75至1：5.5，Protamine/HAS RatioB 的摩尔比为1：6至1：20。
针对采用鱼精蛋白与人血清白蛋白的摩尔比为RatioA和RatioB的递送系统与不采用鱼精蛋白与人血清白蛋白的递送系统进行实验对比，如图7所示，采用RatioA和RatioB的递送系统与不采用鱼精蛋白与人血清白蛋白的递送系统相比，能更加高效的递送荧光素酶（Luc）到肝脏组织，其中，鱼精蛋白与人血清白蛋白的摩尔比为RatioA的递送系统的效果最好。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 深圳市瑞吉生物科技有限公司
<120> mRNA-GalNAc靶向分子的制备方法及其体内递送系统和应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
taccggttag 10
<210> 2
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
taatgagttt 10
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
taatacgact cactatagg 19
<210> 4
<211> 708
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
gtgagcaagg gcgaggagac cacaatgggc gtaatcaagc ccgacatgaa gatcaagctg 60
aagatggagg gcaacgtgaa tggccacgcc ttcgtgatcg agggcgaggg cgagggcaag 120
ccctacgacg gcaccaacac catcaacctg gaggtgaagg agggagcccc cctgcccttc 180
tcctacgaca ttctgaccac cgcgttcagt tacggcaaca gggccttcac caagtacccc 240
gacgacatcc ccaactactt caagcagtcc ttccccgagg gctactcttg ggagcgcacc 300
atgaccttcg aggacaaggg catcgtgaag gtgaagtccg acatctccat ggaggaggac 360
tccttcatct acgagataca cctcaagggc gagaacttcc cccccaacgg ccccgtgatg 420
cagaaggaga ccaccggctg ggacgcctcc accgagagga tgtacgtgcg cgacggcgtg 480
ctgaagggcg acgtcaagat gaagctgctg ctggagggcg gcggccacca ccgcgttgac 540
ttcaagacca tctacagggc caagaaggcg gtgaagctgc ccgactatca ctttgtggac 600
caccgcatcg agatcctgaa ccacgacaag gactacaaca aggtgaccgt ttacgagatc 660
gccgtggccc gcaactccac cgacggcatg gacgagctgt acaagtaa 708
<210> 5
<211> 1653
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
atggaagatg ccaaaaacat taagaagggc ccagcgccat tctacccact cgaagacggg 60
accgccggcg agcagctgca caaagccatg aagcgctacg ccctggtgcc cggcaccatc 120
gcctttaccg acgcacatat cgaggtggac attacctacg ccgagtactt cgagatgagc 180
gttcggctgg cagaagctat gaagcgctat gggctgaata caaaccatcg gatcgtggtg 240
tgcagcgaga atagcttgca gttcttcatg cccgtgttgg gtgccctgtt catcggtgtg 300
gctgtggccc cagctaacga catctacaac gagcgcgagc tgctgaacag catgggcatc 360
agccagccca ccgtcgtatt cgtgagcaag aaagggctgc aaaagatcct caacgtgcaa 420
aagaagctac cgatcataca aaagatcatc atcatggata gcaagaccga ctaccagggc 480
ttccaaagca tgtacacctt cgtgacttcc catttgccac ccggcttcaa cgagtacgac 540
ttcgtgcccg agagcttcga ccgggacaaa accatcgccc tgatcatgaa cagtagtggc 600
agtaccggat tgcccaaggg cgtagcccta ccgcaccgca ccgcttgtgt ccgattcagt 660
catgcccgcg accccatctt cggcaaccag atcatccccg acaccgctat cctcagcgtg 720
gtgccatttc accacggctt cggcatgttc accacgctgg gctacttgat ctgcggcttt 780
cgggtcgtgc tcatgtaccg cttcgaggag gagctattct tgcgcagctt gcaagactat 840
aagattcaat ctgccctgct ggtgcccaca ctatttagct tcttcgctaa gagcactctc 900
atcgacaagt acgacctaag caacttgcac gagatcgcca gcggcggggc gccgctcagc 960
aaggaggtag gtgaggccgt ggccaaacgc ttccacctac caggcatccg ccagggctac 1020
ggcctgacag aaacaaccag cgccattctg atcacccccg aaggggacga caagcctggc 1080
gcagtaggca aggtggtgcc cttcttcgag gctaaggtgg tggacttgga caccggtaag 1140
acactgggtg tgaaccagcg cggcgagctg tgcgtccgtg gccccatgat catgagcggc 1200
tacgttaaca accccgaggc tacaaacgct ctcatcgaca aggacggctg gctgcacagc 1260
ggcgacatcg cctactggga cgaggacgag cacttcttca tcgtggaccg gctgaagagc 1320
ctgatcaaat acaagggcta ccaggtagcc ccagccgaac tggagagcat cctgctgcaa 1380
caccccaaca tcttcgacgc cggggtcgcc ggcctgcccg acgacgatgc cggcgagctg 1440
cccgccgcag tcgtcgtgct ggaacacggt aaaaccatga ccgagaagga gatcgtggac 1500
tatgtggcca gccaggttac aaccgccaag aagctgcgcg gtggtgttgt gttcgtggac 1560
gaggtgccta aaggactgac cggcaagttg gacgcccgca agatccgcga gattctcatt 1620
aaggccaaga agggcggcaa gatcgccgtg taa 1653
Claims (1)
1.一种体内递送系统，其特征在于：其包括mRNA-GalNAc靶向分子和带正电荷的蛋白分子；所述带正电荷的蛋白为鱼精蛋白和人血清白蛋白；
所述mRNA分子与3’带有N-乙酰半乳糖胺修饰的PolyA连接；所述mRNA分子的序列包含5’帽子和目的基因序列；
所述mRNA分子通过夹板DNA与3’带有N-乙酰半乳糖胺修饰的PolyA连接；
所述mRNA分子采用包含DNA片段的质粒通过体外转录得到，其中所述DNA片段包括启动子、目的基因、第一夹板DNA序列依次连接而成；
所述3’带有N-乙酰半乳糖胺修饰的PolyA片段，其5’端为能与第二夹板DNA序列互补配对的RNA序列，所述第一夹板DNA序列和第二夹板DNA序列构成夹板DNA序列；
所述第一夹板DNA序列如SEQ ID No.1所示，所述第二夹板DNA序列如SEQ ID No.2所示，所述启动子为T3或T7或SP6启动子；
所述目的基因序列如SEQ ID No.4或SEQ ID No.5所示；
该体内递送系统通过佐剂鱼精蛋白/人血清白蛋白调节所述带有N-乙酰半乳糖胺修饰的mRNA靶向分子的电荷属性得到，其中所述鱼精蛋白、人血清白蛋白的摩尔比为1∶2.75～5.5或1∶6～20；
所述mRNA-GalNAc靶向分子的制备方法，包括以下步骤：
步骤S1，设计并合成一段带有启动子序列、目的基因序列的质粒载体；
步骤S2，以步骤S1的质粒载体为模板进行体外转录，得到mRNA分子，所述mRNA分子的序列包含5’帽子和目的基因序列；
步骤S3，在连接酶的作用下，mRNA分子与3’带有N-乙酰半乳糖胺修饰的PolyA序列结合，得到mRNA-GalNAc靶向分子；
步骤S1中，所述质粒载体中的DNA序列包括依次连接的启动子序列、目的基因序列和第一夹板DNA序列；
步骤S2中得到mRNA分子的序列包含依次连接的5’帽子、目的基因序列、第一夹板DNA序列的互补序列对应的RNA序列；
步骤S3中，所述3’带有N-乙酰半乳糖胺修饰的PolyA片段，其5’端为能与第二夹板DNA序列互补配对的RNA序列，所述第一夹板DNA序列和第二夹板DNA序列构成夹板DNA序列；在退火反应中，带有第一夹板DNA序列的互补序列的mRNA分子与带有第二夹板DNA序列互补配对序列的PolyA分子分别与夹板DNA互补结合，在T4 DNA连接酶作用下，所述mRNA分子3’端羟基与带有N-乙酰半乳糖胺修饰的PolyA的5’端磷酸基团连接，经过DNA酶处理后，得到带有N-乙酰半乳糖胺修饰的mRNA靶向分子。
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Citations (4)
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|---|---|---|---|---|
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| CN108026527A (zh) * | 2015-06-15 | 2018-05-11 | Mpeg La有限责任公司 | 确定的多偶联寡核苷酸 |
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