CN110777158B - 一种DNA片段、具有细胞特异性结合能力的mRNA-抗体融合分子及其制备方法 - Google Patents

一种DNA片段、具有细胞特异性结合能力的mRNA-抗体融合分子及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种DNA片段、具有细胞特异性结合能力的mRNA‑抗体融合分子及其制备方法，所述DNA片段包括启动子序列、目的基因序列、2A肽序列、以及编码特异性识别特异性细胞表面受体的抗体的DNA序列依次连接而成，含有该DNA片段的质粒载体通过转录得到mRNA，在T4连接酶的作用下与DNA‑嘌呤霉素连接体相连接，通过蛋白翻译将mRNA药物分子3’端连接一个能特异性识别目标细胞表面抗原的抗体，使得使mRNA分子本身具有结合特定细胞的能力，从而达到精准给药的目的，增加了mRNA药物分子的药效。

Description

一种DNA片段、具有细胞特异性结合能力的mRNA-抗体融合分 子及其制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种DNA片段、具有细胞特异性结合能力的mRNA-抗体融合分子及其制备方法。
背景技术
随着生物技术的发展，mRNA 药物因其不进入细胞核、不整合入基因组、能瞬时表达药效快、能通过生理代谢降解等优点受到了很多生物技术公司和科研机构的关注，加上mRNA 的生产简易、成本低，极大地缩短和降低了新药开发的周期和成本，使得 mRNA 药物具有很大优势。但是现有的mRNA药物递送系统，无法实现精确给药，因此在应用过程中，存在药物药效不高，以及毒副作用等问题。
发明内容
针对以上技术问题，本发明公开了一种DNA片段、具有细胞特异性结合能力的mRNA-抗体融合分子及其制备方法，通过使mRNA分子本身具有结合特定细胞的能力，从而达到精准给药的目的。
对此，本发明采用的技术方案为：
一种DNA片段，所述DNA片段包括启动子、目的基因、2A、特异性识别特异性细胞表面受体的抗体序列依次连接而成。该DNA片段用于构建具有细胞特异性结合能力的mRNA-抗体融合分子。在此DNA片段的基础上，可以进行体外转录得到mRNA，从而通过嘌呤霉素使mRNA药物分子3’端连接一个能特异性识别目标细胞表面抗原的抗体，使得mRNA分子能特异性结合特定的目标细胞，从而增加mRNA药物分子的药效。
作为本发明的进一步改进，所述目的基因为绿色荧光蛋白mWasabi，所述抗体为心肌细胞表面特异抗体Cx43、NK细胞表面特异抗体CD56或内皮细胞表面特异抗体CD146；或者所述目的基因为表皮生长因子EGF，所述抗体为表皮细胞表面特异受体EPCAM1的抗体；或者所述目的基因为软骨素酶ABC，所述抗体为神经胶质细胞表面特异蛋白Annexin A6的抗体；或者所述目的基因为转化生长因子TGFβ3，所述抗体为软骨细胞表面特异蛋白CXCR4的抗体。
进一步的，所述绿色荧光蛋白Wasabi的序列如SEQ ID No.3所示。
进一步的，所述心肌细胞表面特异抗体Cx43的序列如SEQ ID No.9所示，所述NK细胞表面特异抗体CD56的序列如SEQ ID No.10所示，所述内皮细胞表面特异抗体CD146的序列如SEQ ID No.11所示，所述EPCAM1的抗体的序列如SEQ ID No.12所示，所述Annexin A6的抗体的序列如SEQ ID No.13所示，所述CXCR4的抗体的序列如SEQ ID No.14所示。
作为本发明的进一步改进，所述2A为带有HSV TK poly(A)信号序列的T2A、P2A、E2A或F2A序列。进一步的，所述HSV TK poly(A) signal sequence序列如SEQ ID No.4所示。进一步的，所述T2A的序列如SEQ ID No.5所示；所述P2A的序列如SEQ ID No.6所示；所述E2A的序列如SEQ ID No.7所示；所述F2A的序列如SEQ ID No.8所示。
作为本发明的进一步改进，所述启动子为T7或SP6启动子。所述T7启动子的序列如SEQ ID No.1所示。所述SP6启动子的序列如SEQ ID No.2所示。本发明还公开了一种具有细胞特异性结合能力的mRNA-抗体融合分子，其包括mRNA分子，所述mRNA分子的抗体端通过嘌呤霉素连接抗体蛋白，即所述mRNA-抗体融合分子为mRNA-嘌呤霉素-抗体蛋白；所述mRNA分子为采用包含如上任意一项所述的DNA片段的质粒通过体外转录得到，所述mRNA分子的序列依次包含5’帽子、目的基因序列、2A序列、抗体序列；所述抗体蛋白为所述抗体序列通过核糖体翻译得到。
采用此技术方案，采用此mRNA-抗体融合分子，在药物递送中，通过抗体抗原反应，mRNA-嘌呤霉素-抗体能与细胞表面受体特异性结合，从而实现mRNA的特异性递送，达到精准给药的效果。
本发明还公开了一种如上所述的具有细胞特异性结合能力的mRNA-抗体融合分子的制备方法，包括以下步骤：
步骤S1，根据所递送的组织、器官或细胞选取特异性细胞表面受体，并设计特异性识别所述特异性细胞表面受体的抗体序列，并将启动子序列、目的基因序列、2A序列、特异性识别所述特异性细胞表面受体的抗体序列组合克隆到质粒载体中，得到质粒DNA；
步骤S2，以步骤S1的质粒DNA为模板进行体外转录，得到含有5’帽子、目的基因序列、2A序列、抗体序列的mRNA序列；
步骤S3，在连接酶的作用下，所述mRNA分子与DNA-嘌呤霉素连接体结合，并形成mRNA-嘌呤霉素复合体；
步骤S4，将步骤S3得到的mRNA-嘌呤霉素复合体进行体外翻译，所述mRNA-嘌呤霉素复合体被核糖体翻译出基因功能蛋白-2A肽-抗体的融合蛋白序列；
步骤S5，翻译结束时，嘌呤霉素通过核糖体A位连接到抗体的尾部，形成mRNA-嘌呤霉素-抗体-2A肽-基因功能蛋白复合物；
步骤S6，对步骤S5得到的产物采用2A剪切酶进行酶切，mRNA-嘌呤霉素-抗体-2A肽-基因功能蛋白复合物中2A肽-基因功能蛋白部分被剪切，得到mRNA-嘌呤霉素-抗体。
此技术方案中，嘌呤霉素（Puromycin）是转运RNA（tRNA，transfer RNA）的类似物，在转录过程中能够结合到核糖体的A位、并与正在合成的多肽片段形成肽键并阻止肽段的延伸。此外，嘌呤霉素还可以结合到RNA或DNA的3’端，利用这些性质，通过将带有嘌呤霉素的肽段结合到RNA分子3’端，形成一个肽段-RNA的融合分子（peptide-RNA fusionproduct）。基于这一原理，制备得到了mRNA-抗体融合分子，通过mRNA-抗体融合分子的抗体与特定细胞的表面抗原相结合达到特异性药物递送的目的。
作为本发明的进一步改进，所述DNA-嘌呤霉素连接体的序列如SEQ ID No.15和SEQ ID No.16所示。
作为本发明的进一步改进，步骤S1中，所述质粒载体为pCDNA3.1质粒载体。
本发明还公开了一种如上所述的具有细胞特异性结合能力的mRNA-抗体融合分子的应用，用于特异性药物递送的mRNA药物制备中。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
采用本发明的技术方案，通过将mRNA药物分子3’端连接一个能特异性识别目标细胞表面抗原的抗体（短多肽片段），使得使mRNA分子本身具有结合特定细胞的能力，从而达到精准给药的目的，增加了mRNA药物分子的药效。
附图说明
图1是本发明一种具有细胞特异性结合能力的mRNA-抗体融合分子的制备方法的流程示意图；其中a）为质粒DNA中DNA片段的示意图；b）为以质粒DNA为模板进行体外转录得到的mRNA与DNA-嘌呤霉素连接体待结合的示意图；c）为mRNA-嘌呤霉素复合体的示意图；d）mRNA-嘌呤霉素复合体进行体外翻译的示意图；e）为翻译结束后得到的mRNA-嘌呤霉素-抗体-2A肽-基因功能蛋白复合物的示意图；f）为mRNA-嘌呤霉素-抗体的示意图。
图2是本发明实施例1的具有组织细胞特异性结合能力的mRNA-抗体融合分子的检测示意图。
图3是本发明实施例1的具有组织细胞特异性结合能力的mRNA-抗体融合分子的转染效果对比示意图，其中，a）为绿色荧光蛋白Wasabi与Cx43抗体的mRNA/Protein融合分子特异性转染心肌细胞的效果图，b）为绿色荧光蛋白Wasabi与Cx43抗体的mRNA/Protein融合分子转染293T细胞的效果图。
图4是本发明实施例2的具有组织细胞特异性结合能力的mRNA-抗体融合分子的检测示意图。
图5是本发明实施例2的具有组织细胞特异性结合能力的mRNA-抗体融合分子的转染效果对比示意图，其中，a）为绿色荧光蛋白Wasabi与CD56抗体的mRNA/Protein融合分子特异性转染NK细胞的效果图，b）为绿色荧光蛋白Wasabi与CD56抗体的mRNA/Protein融合分子转染293T细胞的效果图。
图6是本发明实施例3的具有组织细胞特异性结合能力的mRNA-抗体融合分子的检测示意图。
图7是本发明实施例3的具有组织细胞特异性结合能力的mRNA-抗体融合分子的转染效果对比示意图，其中，a）为绿色荧光蛋白Wasabi与CD146抗体的mRNA/Protein融合分子特异性转染内皮细胞的效果图，b）为绿色荧光蛋白Wasabi与CD146抗体的mRNA/Protein融合分子转染心肌细胞的效果图。
图8是本发明实施例4的EGF/EPCAM1 mRNA/Protein融合分子的示意图。
图9是本发明实施例4对比例的EGF mRNA分子的示意图。
图10是本发明实施例4的表皮生长因子EGF与EPCAM1（表皮细胞表面特异蛋白）抗体的mRNA/Protein融合分子与对比例的EGF mRNA分子在小鼠皮肤创伤愈合中的应用的效果对比图。
图11是本发明实施例5的chABC/Annexin A6 mRNA/Protein融合分子的示意图。
图12是本发明实施例5对比例的chABC mRNA分子的示意图。
图13是本发明实施例5的软骨素酶ABC (Chondroitinase ABC, ChABC)与AnnexinA6（神经胶质细胞表面特异蛋白）抗体的mRNA/Protein融合分子与对比例的chABC mRNA分子药效实验的效果对比图。
图14是本发明实施例6的TGFβ3/CXCR4 mRNA/Protein融合分子的示意图。
图15是本发明实施例6对比例的TGFβ3 mRNA分子的示意图。
图16是本发明实施例6的转化生长因子TGFβ3与CXCR4（软骨细胞表面特异蛋白）抗体的mRNA/Protein融合分子与对比例的TGFβ3 mRNA分子药效实验的效果对比图。
具体实施方式
为了本发明更容易理解，下面对本发明的具体实施方式结合附图作进一步的详细说明。
一种用于构建具有细胞特异性结合能力的mRNA抗体融合分子的DNA片段，所述DNA片段包括启动子、目的基因、2A、特异性识别特异性细胞表面受体的抗体依次连接而成，如图1a）所示。进一步的，所述T7启动子的序列如SEQ ID No.1所示，所述SP6启动子的序列如SEQ ID No.2所示，所述启动子为T7或SP6启动子。所述2A序列为带有HSV TK poly(A)信号序列的T2A、P2A、E2A或F2A序列。所述HSV TK poly(A) signal sequence序列如SEQ IDNo.4所示，所述T2A的序列如SEQ ID No.5所示；所述P2A的序列如SEQ ID No.6所示；所述E2A的序列如SEQ ID No.7所示；所述F2A的序列如SEQ ID No.8所示。
一种具有细胞特异性结合能力的mRNA-抗体融合分子，如图1f）所示，其包括mRNA分子，所述mRNA分子的抗体端通过嘌呤霉素连接抗体蛋白；所述mRNA分子为采用包含上述述的DNA片段的质粒通过体外转录得到，所述mRNA分子的序列依次包含5’帽子、目的基因序列、2A序列、抗体序列，如图1b）所示；所述抗体蛋白为所述抗体序列通过核糖体翻译得到。
一种具有细胞特异性结合能力的mRNA-抗体融合分子的制备方法，流程示意图如图1所示，包括以下步骤：
步骤S1，根据所递送的组织、器官或细胞选取特异性细胞表面受体，并设计特异性识别所述特异性细胞表面受体的抗体序列，并将启动子序列、目的基因序列、2A序列、特异性识别所述特异性细胞表面受体的抗体序列组合克隆到质粒载体中，得到质粒DNA，如图1a）所示。该步骤采用常规方法克隆得到。
步骤S2，以步骤S1的质粒DNA为模板进行体外转录，得到含有5’帽子、目的基因序列、2A序列、抗体序列的mRNA序列；在连接酶的作用下，将所述mRNA分子与DNA-嘌呤霉素连接体结合，如图1b）所示。
步骤S3，形成mRNA-嘌呤霉素复合体，如图1c）所示。
步骤S4，将步骤S3得到的mRNA-嘌呤霉素复合体进行体外翻译，所述mRNA-嘌呤霉素复合体被核糖体翻译出基因功能蛋白-2A肽-抗体的融合蛋白序列，如图1d）所示。
步骤S5，翻译结束时，嘌呤霉素通过核糖体A位连接到抗体的尾部，形成mRNA-嘌呤霉素-抗体-2A肽-基因功能蛋白复合物，如图1e）所示。
步骤S6，对步骤S5得到的产物采用2A剪切酶进行酶切，mRNA-嘌呤霉素-抗体-2A肽-基因功能蛋白复合物中2A肽-基因功能蛋白部分被剪切，得到mRNA-嘌呤霉素-抗体，如图1f）所示。最终得到的mRNA-嘌呤霉素-抗体，通过抗体抗原反应，mRNA-嘌呤霉素-抗体能与细胞表面受体特异性结合，实现mRNA的特异性递送。
下面通过具体的实施例进行进一步的举例说明，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1
一种具有细胞特异性结合能力的mRNA-抗体融合分子，其采用如下步骤制备得到：
步骤S1，选取目的基因为绿色荧光蛋白mWasabi，并设计特异性识别特异性细胞表面受体的抗体序列，本实施例中抗体为Cx43（心肌细胞表面特异蛋白）抗体，并将相关克隆元件组合克隆到pCDNA3.1质粒载体中。其中，该质粒DNA中DNA片段包括依次连接的启动子序列、绿色荧光蛋白mWasabi Gene序列、2A序列、Cx43抗体序列，所述启动子为T7启动子，所述T7启动子的序列如SEQ ID No.1所示，绿色荧光蛋白mWasabi Gene序列如SEQ ID No.3所示，本实施例中所述2A序列为带有HSV TK poly(A)信号序列的P2A序列，HSV TK poly(A)信号序列如SEQ ID No.4所示，所述P2A的序列如SEQ ID No.6所示。所述Cx43抗体序列如SEQID No.9所示。
T7 Promoter sequence:（SEQ ID No.1）
TAATACGACTCACTATAGG
Gene sequence: （SEQ ID No.3）
GTGAGCAAGGGCGAGGAGACCACAATGGGCGTAATCAAGCCCGACATGAAGATCAAGCTGAAGATGGAGGGCAACGTGAATGGCCACGCCTTCGTGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCAAGCCCTACGACGGCACCAACACCATCAACCTGGAGGTGAAGGAGGGAGCCCCCCTGCCCTTCTCCTACGACATTCTGACCACCGCGTTCAGTTACGGCAACAGGGCCTTCACCAAGTACCCCGACGACATCCCCAACTACTTCAAGCAGTCCTTCCCCGAGGGCTACTCTTGGGAGCGCACCATGACCTTCGAGGACAAGGGCATCGTGAAGGTGAAGTCCGACATCTCCATGGAGGAGGACTCCTTCATCTACGAGATACACCTCAAGGGCGAGAACTTCCCCCCCAACGGCCCCGTGATGCAGAAGGAGACCACCGGCTGGGACGCCTCCACCGAGAGGATGTACGTGCGCGACGGCGTGCTGAAGGGCGACGTCAAGATGAAGCTGCTGCTGGAGGGCGGCGGCCACCACCGCGTTGACTTCAAGACCATCTACAGGGCCAAGAAGGCGGTGAAGCTGCCCGACTATCACTTTGTGGACCACCGCATCGAGATCCTGAACCACGACAAGGACTACAACAAGGTGACCGTTTACGAGATCGCCGTGGCCCGCAACTCCACCGACGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA
HSV TK poly(A) signal sequence: (SEQ ID No.4)
CGGCAATAAAAAGACAGAATAAAACGCACGGGTGTTGGGTCGTTTGTTC
P2A sequence: (SEQ ID No.6)
GCCACGAACTTCTCTCTGTTAAAGCAAGCAGGAGACGTGGAAGAAAACCCCGGTCCT
Cx43 antibody sequence: （SEQ ID No.9）
GGCTATACCTTTACCAGCTATTATATTAACCCGAGCAACGGCGGCACCACCCGCGAAGGCAACCCGTATTATACCATGAACTATCAGAGCCTGCTGGAAAGCGATGGCAAAACCTATCTGGTGAGCTGGCAGGGCACCCATTTTCCGTGGACC
步骤S2，体外转录后生成的mRNA序列，该mRNA序列含有5’帽子、基因序列、2A序列、抗体序列。在T4 连接酶的作用下 mRNA分子可与DNA-嘌呤霉素连接体（DNA PuromycineLinker）结合。其中，所述DNA-嘌呤霉素连接体采用standard DNA splint，其序列如SEQ IDNo.15和SEQ ID No.16所示。
puromycin DNA spacer linker - standard DNA splint序列：
5'-TTTTTTTTTTAGCGCAAGA （SEQ ID No.15）
5'-TTTTTTTTTTNAGCGCAAGA （SEQ ID No.16）
步骤S3，形成mRNA-嘌呤霉素复合体。
步骤S4，将步骤S3得到的mRNA-嘌呤霉素复合体进行体外翻译，所述mRNA-嘌呤霉素复合体被核糖体（Ribosome）翻译出基因功能蛋白-2A肽-抗体这一融合蛋白序列。
步骤S5，当翻译结束时，嘌呤霉素通过核糖体A位连接到抗体的尾部，形成mRNA-嘌呤霉素-抗体-2A肽-基因功能蛋白复合物。
步骤S6，进行酶切，在2A剪切酶的作用下，mRNA-嘌呤霉素-抗体-2A肽-基因功能蛋白复合物中2A肽-基因功能蛋白部分被剪切，得到mRNA-嘌呤霉素-抗体，最终得到的mRNA-嘌呤霉素-抗体，通过抗体抗原反应，mRNA-嘌呤霉素-抗体能与细胞表面受体特异性结合，实现mRNA的特异性递送。
对本实施例得到的产物进行检测，如图2所示。将得到的绿色荧光蛋白Wasabi与Cx43抗体的mRNA/Protein融合分子分别用于转染心肌细胞和293T细胞（对比例），其效果对比如图3所示，可见，3a）具有很好的转染效果，而3b）基本不转染293T细胞，说明得到的绿色荧光蛋白Wasabi与Cx43抗体的mRNA/Protein融合分子能特异性转染心肌细胞。
实施例2
在实施例1的基础上，本实施例中，目的基因为为绿色荧光蛋白Wasabi，抗体为CD56（NK细胞表面特异蛋白）抗体，所述CD56抗体的序列如SEQ ID No.10所示。采用实施例1的制备方法得到绿色荧光蛋白Wasabi与CD56抗体的mRNA/Protein融合分子。
CD56 antibody sequence: （SEQ ID No.10）
GGCGATAGCGTGAGCAGCAACAGCGCGGCGACCTATTATCGCAGCAAATGGTATAACGCGCGCGAAAACATTGCGGCGTGGACCTGGGCGTTTGATATTTGGCAGAGCGTGAGCAGCAGCTATGATACCAGCCAGCAGTATGGCAGCAGCCCGACCTTT
对产物进行检测，如图4所示。将得到的绿色荧光蛋白Wasabi与CD56抗体的mRNA/Protein融合分子分别用于转染NK细胞和293T细胞（对比例），其效果对比如图5所示，可见，5a）具有很好的转染效果，而5b）基本不转染293T细胞，说明得到的绿色荧光蛋白Wasabi与CD56抗体的mRNA/Protein融合分子能特异性转染NK细胞。
实施例3
在实施例1的基础上，本实施例中，目的基因为绿色荧光蛋白Wasabi，抗体为CD146（内皮细胞表面特异蛋白）抗体，所述CD146抗体的序列如SEQ ID No.11所示。采用实施例1的制备方法得到绿色荧光蛋白Wasabi与CD146抗体的mRNA/Protein融合分子。
CD146 antibody sequence如下：（SEQ ID No.11）
GCGCGCGGCGCGCTGGCGAGCGAACGCCTGTATAGCAGCGAACGCGTGGCGCTGAGCGAACGCACCCATCGCAGCGAACGCGGCCTGTATACCTATCGCAGCGAACGCACCTATCGCATGGAAACCACCTATCGCGCGCTGGCGAGCGAACGCGCGAGCAACCTGGAAGGCCTGAGCGAACGCGGCCTGAACCATATTAGCAGCGAACGCGCGCGCGGCGGCCTGCTGGAACCGCGCCCGCATGAAACCCATCGCGGCCTGTATACCTATCGCACCCATCGCCCGCATGAAACCCATCGCGCGAGCAACACCTATCGCGGCCTGTATATGGAAACCGCGAGCAACACCCGCCCGATTCTGGAAGCGAGCAACACCCATCGCACCTATCGCACCCATCGCGGCCTGTATGGCCTGCCGCGCACCCATCGCACCTATCGCGCGCTGGCGGCGAGCCCGGCGAGCCCGCCGCATGAACTGTATAGCACCTATCGCGCGCGCGGCACCTATCGCGCGAGCAACCTGTATAGCACCTATCGCGGCCTGGCGCGCGGCGCGCTGGCGATGGAAACCGCGAGCCCGACCTATCGC
对产物进行检测，如图6所示。将得到的绿色荧光蛋白Wasabi与CD146抗体的mRNA/Protein融合分子分别用于转染NK细胞和293T细胞（对比例），其效果对比如图7所示，可见，7a）具有很好的转染效果，而7b）基本不转染心肌细胞，说明得到的绿色荧光蛋白Wasabi与CD146抗体的mRNA/Protein融合分子能特异性转染内皮细胞。
实施例4
在实施例1的基础上，本实施例中，目的基因为为表皮生长因子EGF，抗体为EPCAM1（表皮细胞表面特异蛋白）抗体，所述EPCAM1抗体的序列如SEQ ID No.12所示。采用实施例1的制备方法得到表皮生长因子EGF与EPCAM1抗体的mRNA/Protein融合分子即EGF/EPCAM1mRNA/Protein融合分子，如图8所示。
EPCAM1 antibody sequence：（SEQ ID No.12）
CTGTTTAAAGCGAAACAGTGCAACGGCACCAGCATGTGCTGGTGCGTGAACACCGCGGGCGTGCGCCGCACCGATAAAGATACCGAAATTACCTGCAGCGAACGCGTGCGCACCTATTGGATTATTATTGAACTGAAACATAAAGCGCGCGAAAAACCGTATGATAGCAAAAGCCTGCGCACCGCGCTGCAGAAAGAAATTACCACCCGCTATCAGCTGGATCCGAAATTTATTACCAGCATTCTGTATGAAAACAACGTGATTACCATTGATCTGGTGCAGAACAGCAGCCAGAAAACCCAGAACGATGTGGATATTGCGGATGTGGCGTATTAT
以EGF mRNA分子作为对比例，EGF mRNA的结构如图9所示，即表皮生长因子EGF的一端有5’帽子，另一端连接PolyA。
将两者分别用于小鼠皮肤创伤愈合中，其应用效果对比图如图10所示，可见，与对比例的EGF mRNA相比，EGF/EPCAM1 mRNA/Protein融合分子能更好的促进伤口愈合。
实施例5
在实施例1的基础上，本实施例中，目的基因为为软骨素酶ABC (ChondroitinaseABC, ChABC)，抗体为Annexin A6（神经胶质细胞表面特异蛋白）抗体，所述Annexin A6的序列如SEQ ID No.13所示。采用实施例1的制备方法得到软骨素酶ABC与Annexin A6抗体的mRNA/Protein融合分子即chABC/Annexin A6 mRNA/Protein融合分子，如图11所示。
Annexin A6的序列如下：（SEQ ID No.13）
AGCTATAAAAGCCTGTATGGCAAAGATCTGATTGCGGATCTGAAATATGAACTGACCGGCAAATTTGAACGCCTGATTGTGGGCCTGATGCGCCCGCCGGCGTATTGCGATGCGAAAGAAATTAAAGATGCGATTAGCGGCATTGGCACCGATGAAAAATGCCTGATTGAAATTCTGGCG
以chABC mRNA分子作为对比例，chABC mRNA的结构如图12所示，即软骨素酶chABC的一端有5’帽子，另一端连接PolyA。
将两者用于进行药效对比试验。在细胞培养皿中，正常培养的神经胶质细胞与脊柱损伤中形成的硫酸软骨素蛋白聚糖 （Chondroitin sulfate proteoglycans，CSPGs）共培养。对比效果如图13所示，第0天，向培养体系中分别加入chABC/Annexin A6 mRNA/Protein 融合分子（本实施例） 以及 chABC mRNA 分子（对比例）。第3天，与对比例（chABCmRNA）相比，chABC/Annexin A6 mRNA/Protein融合分子能充分降解硫酸软骨素蛋白聚糖，具有更显著的效果。
实施例6
在实施例1的基础上，本实施例中，目的基因为为转化生长因子beta3(Transforming Growth Factor Beta 3，TGFβ3)，抗体为CXCR4（软骨细胞表面特异蛋白）抗体，所述CXCR4抗体的序列如SEQ ID No.14所示。采用实施例1的制备方法得到转化生长因子TGFβ3与CXCR4抗体的mRNA/Protein融合分子即TGFβ3/CXCR4 mRNA/Protein融合分子，如图14所示。
CXCR4 antibody sequence：（SEQ ID No.14）
GGCCTGGTGATTCTGGTGATGGGCTATCAGAAAAAACTGCGCAGCATGACCGATAAATATCGCCTGCATCTGAGCGTGGCGGATCTGCTGTTTGTGATTACCCTGCCGTTTTGGGCGGTGGATGCGGTGGCGAACTGGTATTTTGGCAACTTTCTGTGCAAAGCGGTGCATGTGATTTAT
以TGFβ3 mRNA分子作为对比例，TGFβ3 mRNA的结构如图15所示，即转化生长因子beta3的一端有5’帽子，另一端连接PolyA。
将两者用于进行药效对比试验。在细胞培养皿中正常培养的人软骨细胞组织，对比效果如图16所示。第0天，向培养体系中分别加入TGFβ3/CXCR4 mRNA/Protein 融合分子（本实施例） 以及 TGFβ3 mRNA 分子（对比例）。第7天，与对比例（TGFβ3 mRNA）相比，TGFβ3/CXCR4 mRNA/Protein融合分子能好的促进软骨组织的再生。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 深圳市臻质医疗科技有限公司
<120> 一种DNA片段、具有细胞特异性结合能力的mRNA-抗体融合分子及其制备方法
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
taatacgact cactatagg 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
atttaggtga cactataga 19
<210> 3
<211> 708
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
gtgagcaagg gcgaggagac cacaatgggc gtaatcaagc ccgacatgaa gatcaagctg 60
aagatggagg gcaacgtgaa tggccacgcc ttcgtgatcg agggcgaggg cgagggcaag 120
ccctacgacg gcaccaacac catcaacctg gaggtgaagg agggagcccc cctgcccttc 180
tcctacgaca ttctgaccac cgcgttcagt tacggcaaca gggccttcac caagtacccc 240
gacgacatcc ccaactactt caagcagtcc ttccccgagg gctactcttg ggagcgcacc 300
atgaccttcg aggacaaggg catcgtgaag gtgaagtccg acatctccat ggaggaggac 360
tccttcatct acgagataca cctcaagggc gagaacttcc cccccaacgg ccccgtgatg 420
cagaaggaga ccaccggctg ggacgcctcc accgagagga tgtacgtgcg cgacggcgtg 480
ctgaagggcg acgtcaagat gaagctgctg ctggagggcg gcggccacca ccgcgttgac 540
ttcaagacca tctacagggc caagaaggcg gtgaagctgc ccgactatca ctttgtggac 600
caccgcatcg agatcctgaa ccacgacaag gactacaaca aggtgaccgt ttacgagatc 660
gccgtggccc gcaactccac cgacggcatg gacgagctgt acaagtaa 708
<210> 4
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
cggcaataaa aagacagaat aaaacgcacg ggtgttgggt cgtttgttc 49
<210> 5
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
gaaggtagag gttctctcct cacttgtggt gatgttgaag aaaaccctgg tcca 54
<210> 6
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
gccacgaact tctctctgtt aaagcaagca ggagacgtgg aagaaaaccc cggtcct 57
<210> 7
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
cagtgtacta attatgctct cttgaaattg gctggagatg ttgagagcaa cccaggtccc 60
<210> 8
<211> 66
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
gtgaagcaga ccctgaactt cgatctgctg aagctggccg gcgatgtgga gagcaacccc 60
gggccc 66
<210> 9
<211> 153
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
ggctatacct ttaccagcta ttatattaac ccgagcaacg gcggcaccac ccgcgaaggc 60
aacccgtatt ataccatgaa ctatcagagc ctgctggaaa gcgatggcaa aacctatctg 120
gtgagctggc agggcaccca ttttccgtgg acc 153
<210> 10
<211> 159
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
ggcgatagcg tgagcagcaa cagcgcggcg acctattatc gcagcaaatg gtataacgcg 60
cgcgaaaaca ttgcggcgtg gacctgggcg tttgatattt ggcagagcgt gagcagcagc 120
tatgatacca gccagcagta tggcagcagc ccgaccttt 159
<210> 11
<211> 588
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
gcgcgcggcg cgctggcgag cgaacgcctg tatagcagcg aacgcgtggc gctgagcgaa 60
cgcacccatc gcagcgaacg cggcctgtat acctatcgca gcgaacgcac ctatcgcatg 120
gaaaccacct atcgcgcgct ggcgagcgaa cgcgcgagca acctggaagg cctgagcgaa 180
cgcggcctga accatattag cagcgaacgc gcgcgcggcg gcctgctgga accgcgcccg 240
catgaaaccc atcgcggcct gtatacctat cgcacccatc gcccgcatga aacccatcgc 300
gcgagcaaca cctatcgcgg cctgtatatg gaaaccgcga gcaacacccg cccgattctg 360
gaagcgagca acacccatcg cacctatcgc acccatcgcg gcctgtatgg cctgccgcgc 420
acccatcgca cctatcgcgc gctggcggcg agcccggcga gcccgccgca tgaactgtat 480
agcacctatc gcgcgcgcgg cacctatcgc gcgagcaacc tgtatagcac ctatcgcggc 540
ctggcgcgcg gcgcgctggc gatggaaacc gcgagcccga cctatcgc 588
<210> 12
<211> 336
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
ctgtttaaag cgaaacagtg caacggcacc agcatgtgct ggtgcgtgaa caccgcgggc 60
gtgcgccgca ccgataaaga taccgaaatt acctgcagcg aacgcgtgcg cacctattgg 120
attattattg aactgaaaca taaagcgcgc gaaaaaccgt atgatagcaa aagcctgcgc 180
accgcgctgc agaaagaaat taccacccgc tatcagctgg atccgaaatt tattaccagc 240
attctgtatg aaaacaacgt gattaccatt gatctggtgc agaacagcag ccagaaaacc 300
cagaacgatg tggatattgc ggatgtggcg tattat 336
<210> 13
<211> 180
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 13
agctataaaa gcctgtatgg caaagatctg attgcggatc tgaaatatga actgaccggc 60
aaatttgaac gcctgattgt gggcctgatg cgcccgccgg cgtattgcga tgcgaaagaa 120
attaaagatg cgattagcgg cattggcacc gatgaaaaat gcctgattga aattctggcg 180
<210> 14
<211> 180
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 14
ggcctggtga ttctggtgat gggctatcag aaaaaactgc gcagcatgac cgataaatat 60
cgcctgcatc tgagcgtggc ggatctgctg tttgtgatta ccctgccgtt ttgggcggtg 120
gatgcggtgg cgaactggta ttttggcaac tttctgtgca aagcggtgca tgtgatttat 180
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 15
tttttttttt agcgcaaga 19
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 16
tttttttttt nagcgcaaga 20

Claims (7)

1.一种具有细胞特异性结合能力的mRNA-抗体融合分子，其特征在于：其包括mRNA分子和抗体蛋白，所述mRNA分子的抗体端通过嘌呤霉素连接抗体蛋白；所述mRNA分子为采用包含DNA片段的质粒通过体外转录得到，所述DNA片段包括启动子、目的基因、2A、编码特异性识别特异性细胞表面受体的抗体DNA序列依次连接而成；所述2A为带有HSV TK poly(A)信号序列的T2A、P2A、E2A或F2A序列；所述启动子为T7或SP6启动子；
所述mRNA分子的序列依次包含5’帽子、目的基因序列、2A序列、抗体序列；所述抗体蛋白为所述抗体序列通过核糖体翻译得到。
2.根据权利要求1所述的具有细胞特异性结合能力的mRNA-抗体融合分子，其特征在于：所述目的基因为绿色荧光蛋白mWasabi，所述抗体为心肌细胞表面特异抗体Cx43、NK细胞表面特异抗体CD56或内皮细胞表面特异抗体CD146；或者所述目的基因为表皮生长因子EGF，所述抗体为表皮细胞表面特异受体EPCAM1的抗体；或者所述目的基因为软骨素酶ABC，所述抗体为神经胶质细胞表面特异蛋白Annexin A6的抗体；或者所述目的基因为转化生长因子TGFβ3，所述抗体为软骨细胞表面特异蛋白CXCR4的抗体。
3.根据权利要求2所述的具有细胞特异性结合能力的mRNA-抗体融合分子，其特征在于：所述心肌细胞表面特异抗体Cx43的序列如SEQ ID No.9所示，所述NK细胞表面特异抗体CD56的序列如SEQ ID No.10所示，所述内皮细胞表面特异抗体CD146的序列如SEQ IDNo.11所示，所述EPCAM1的抗体的序列如SEQ ID No.12所示，所述Annexin A6的抗体的序列如SEQ ID No.13所示，所述CXCR4的抗体的序列如SEQ ID No.14所示。
4.一种如权利要求1所述的具有细胞特异性结合能力的mRNA-抗体融合分子的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤S1，根据所递送的组织、器官或细胞选取特异性细胞表面受体，并设计特异性识别特异性细胞表面受体的抗体序列，并将启动子序列、目的基因序列、2A序列、特异性识别所述特异性细胞表面受体的抗体序列组合克隆到质粒载体中，得到质粒DNA；
步骤S2，以步骤S1的质粒DNA为模板进行体外转录，得到含有5’帽子、目的基因序列、2A序列、抗体序列的mRNA序列；
步骤S3，在T4连接酶的作用下，所述mRNA分子与DNA-嘌呤霉素连接体结合，并形成mRNA-嘌呤霉素复合体；
步骤S4，将步骤S3得到的mRNA-嘌呤霉素复合体进行体外翻译，所述mRNA-嘌呤霉素复合体被核糖体翻译出基因功能蛋白-2A肽-抗体的融合蛋白序列；
步骤S5，翻译结束时，嘌呤霉素通过核糖体A位连接到抗体的尾部，形成mRNA-嘌呤霉素-抗体-2A肽-基因功能蛋白复合物；
步骤S6，对步骤S5得到的产物采用2A剪切酶进行酶切，mRNA-嘌呤霉素-抗体-2A肽-基因功能蛋白复合物中2A肽-基因功能蛋白部分被剪切，得到mRNA-嘌呤霉素-抗体。
5.根据权利要求4所述的具有细胞特异性结合能力的mRNA-抗体融合分子的制备方法，其特征在于：所述DNA-嘌呤霉素连接体的序列如SEQ ID No.15和SEQ ID No.16所示。
6.根据权利要求4所述的具有细胞特异性结合能力的mRNA-抗体融合分子的制备方法，其特征在于：步骤S1中，所述质粒载体为pCDNA3.1质粒载体。
7.一种如权利要求1所述的具有细胞特异性结合能力的mRNA-抗体融合分子的应用，其特征在于：用于制备特异性药物递送的mRNA药物中。
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