CN115960209A - 一种重组人源化胶原蛋白及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种重组人源化胶原蛋白及其应用，所述重组人源化胶原蛋白包括前导肽和至少一个基本重复单元；所述基本重复单元包括SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。本发明还提供了所述重组人源化胶原蛋白的制备方法。本发明所述的重组人源化胶原蛋白具有良好的溶解性、稳定性、生物活性和粘附性，免疫原性低更加安全；制备成本低、效率高，技术成熟，容易操作，具有重要的应用前景。

Description

一种重组人源化胶原蛋白及其应用

技术领域

本发明属于重组蛋白技术领域，尤其涉及一种重组人源化胶原蛋白及其应用。

背景技术

胶原蛋白是动物体内含量最丰富的蛋白质，约占体内所有蛋白质的30％。在表皮和真皮当中存在一层称为“微胶原层”的组织，里面含有大量的胶原蛋白，可以支撑表皮，防止皮肤塌陷，使皮肤紧致又光滑。补充III型胶原蛋白是护肤的关键，因此，胶原蛋白可以广泛地应用在医药和化妆品等行业中。

然而，天然的胶原蛋白无法溶于水，难以被人体利用，且成分复杂，安全性较低。目前市面上常用的动物来源的胶原蛋白伴有传染的风险，同时人体使用后容易产生免疫排异。更为重要的是，动物源胶原蛋白通常通过酸、碱、酶解法处理得到，其生物学活性远远不及人体天然的胶原蛋白。人源的胶原蛋白可以从人胎盘原料中提取，但来源有限，且存在多方面的限制。

重组人源化胶原蛋白结构跟人体来源的胶原蛋白相似，经过设计和优化后，能够增加胶原蛋白的活性，降低免疫原性。

CN107714504A公开了一种同人源胶原蛋白组合物，该组合物包括如下重量比的组分：同人源胶原蛋白0.001～0.5％；植物调理剂0.2～20.0％；功能复配物0.05～10.0％；基质辅料69.5～99.7％；所述的同人源胶原蛋白结构氨基酸序列含有599个氨基酸，分子量为55.0kDa。所述组合物具有保湿、透皮吸收、皮肤护理、抗炎低敏、滋养修复、抑菌方便的协同作用。虽然所述同人源胶原蛋白在护肤产品领域有着广阔的应用前景，但是由于同人源胶原蛋白分子量大稳定性差，生物学活性难以长期保持，从而导致其护肤效果不持久。

因此，如何提供一种溶解性好、免疫原性低、容易获取、生物活性高的人源III型胶原蛋白及其制备方法，已成为亟待解决的问题。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种重组人源化胶原蛋白及其应用，所述重组人源化胶原蛋白具有良好的溶解性、稳定性与生物活性，生物粘附性高，具备促进细胞愈合能力与增殖能力，免疫原性低，具有实际应用的价值。

为达此目的，本发明采用如下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种重组人源化胶原蛋白，所述重组人源化胶原蛋白包括前导肽和至少一个基本重复单元；

所述基本重复单元包括SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。

其中，基本重复单元的数量例如可以是1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

SEQ ID No.1：GPIGPPGPRGNRGERGSEGSPGHPGQPGPPGPPGAPGPC。

本发明中，通过添加人源前导肽，降低了重组胶原蛋白的免疫原性；选用Ⅲ型胶原蛋白中具有晶体解析结构的片段作为基本重复单元，增加了重组胶原蛋白的稳定性。所述重组人源化胶原蛋白可通过蛋白表达技术进行体外表达，生产成本较低且产物成分单一，安全性更高；具有良好的可溶性及粘附性，生物活性好，在药品及化妆品等相关领域中具有广阔的应用前景。

本发明中，所述重组人源化胶原蛋白为单链结构，呈可溶性表达。

优选地，所述前导肽包括SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

SEQ ID No.2：MESCPTGPQNYSPQYDSYDVKSGVAVG。

优选地，所述基本重复单元的数量为3～6个，例如可以是3个、4个、5个或6个。

本发明中，通过将基本重复单元的数量控制在3～6个的范围内，可以使重组蛋白兼具良好的稳定性及可溶性；若基本重复单元的数量较少，则重组蛋白的稳定性较差；若基本重复单元的数量过多，则会降低重组蛋白的可溶性。

优选地，所述重组人源化胶原蛋白包括SEQ ID No.3所示的氨基酸序列。

SEQ ID No.3：

MESCPTGPQNYSPQYDSYDVKSGVAVGGPIGPPGPRGNRGERGSEGSPGHPGQPGPPGPPGAPGPCGPIGPPGPRGNRGERGSEGSPGHPGQPGPPGPPGAPGPCGPIGPPGPRGNRGERGSEGSPGHPGQPGPPGPPGAPGPCGPIGPPGPRGNRGERGSEGSPGHPGQPGPPGPPGAPGPCHHHHHH。

第二方面，本发明提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码第一方面所述的重组人源化胶原蛋白。

优选地，所述核酸分子包括SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。

SEQ ID No.4：

atggaatcttgcccgaccggtccgcagaactactctccgcagtacgactcttacgacgttaaatctggtgttgctgttggtggtccgatcggtccgccgggtccgcgtggtaaccgtggtgaacgtggttctgaaggttctccgggtcacccgggtcagccgggtccgccgggtccgccgggtgctccgggtccgtgcggtccgatcggtccgccgggtccgcgtggtaaccgtggtgaacgtggttctgaaggttctccgggtcacccgggtcagccgggtccgccgggtccgccgggtgctccgggtccgtgcggtccgatcggtccgccgggtccgcgtggtaaccgtggtgaacgtggttctgaaggttctccgggtcacccgggtcagccgggtccgccgggtccgccgggtgctccgggtccgtgcggtccgatcggtccgccgggtccgcgtggtaaccgtggtgaacgtggttctgaaggttctccgggtcacccgggtcagccgggtccgccgggtccgccgggtgctccgggtccgtgccaccatcatcaccaccattaa。

本发明中，编码所述的重组人源化胶原蛋白的核酸分子序列根据宿主的密码子偏好性进行了密码子优化，显著提高了其在大肠杆菌中的表达效率。

本发明中，在所述核酸分子序列中引入了NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点，用于与表达载体进行连接。

第三方面，本发明提供了一种表达载体，所述表达载体含有至少一个拷贝的第二方面所述的核酸分子。

第四方面，本发明提供了一种重组细胞，所述重组细胞表达第一方面所述的重组人源化胶原蛋白。

优选地，所述重组细胞的基因组中整合有第二方面所述的核酸分子。

优选地，所述重组细胞中含有第三方面所述的表达载体。

第五方面，本发明提供一种第一方面所述的重组人源化胶原蛋白的制备方法，所述制备方法包括：

构建表达载体，将所述表达载体转入受体细胞中，筛选；

培养筛选得到的工程菌株，诱导表达并进行纯化，得到所述的重组人源化胶原蛋白。

优选地，所述受体细胞包括大肠杆菌表达菌株。

优选地，所述诱导表达的方法包括IPTG诱导。

优选地，所述纯化前还包括破碎菌体的步骤。

优选地，所述纯化的方法包括镍离子柱亲和层析。

作为优选技术方案，本发明所述重组人源化胶原蛋白的制备方法，包括以下步骤：

(1)将编码所述重组人源化胶原蛋白的核酸分子连入质粒载体中，构建表达载体，将所述表达载体转入大肠杆菌表达菌株中，筛选，得到大肠杆菌基因工程菌株；

(2)发酵培养所述大肠杆菌基因工程菌株，用IPTG诱导蛋白表达后，离心收集菌体；

(3)对收集得到的菌体进行超声破碎，离心收集上清液；

(4)对上清液进行镍离子柱亲和层析纯化，得到所述重组人源化胶原蛋白。

第六方面，本发明提供了第一方面所述的重组人源化胶原蛋白在制备化妆品或皮肤损伤治疗药物中的应用。

相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：

本发明在重组人源化胶原蛋白中引入基本重复单元，提高了胶原蛋白的可溶性，并增加了重组蛋白的稳定性；通过添加人源的前导肽，降低了蛋白的免疫原性，增加了相关产品的安全性；所述重组人源化胶原蛋白通过蛋白表达系统在体外合成，产量高，成本低，反应条件温和，减少了化学物质对重组蛋白活性的影响。胶原是细胞外基质的主要成分。重组人源化胶原蛋白的主要生物学功能是为细胞提供支架和良好的微环境，如促进细胞粘附、增殖生长、迁移等。因此，可通过评价细胞-胶原蛋白相互作用来评价重组胶原蛋白的生物学功能。本发明重组人源化胶原蛋白的细胞粘附活性优于天然人胶原蛋白，具有良好的细胞迁移活性与促进细胞增殖生长能力，同时具备热稳定特质。生物活性更好，粘附性更强，良好的粘附性可提高其与皮肤的紧密贴合，在创面修复领域具有重要的应用前景。重组人源化胶原蛋白制备方法技术成熟，容易操作，促进了相关产品的推广与使用。

附图说明

图1为实施例1中的表达载体的质粒图谱；

图2为实施例1中的重组人源化胶原蛋白的SDS-PAGE检测结果图片，图中，泳道M-标准蛋白分子量Marker，泳道1-重组人源化胶原蛋白；

图3为本发明测试例1中的相对细胞粘附活性的检测结果图片；

图4为本发明测试例2中的细胞毒性检测结果；

图5为本发明测试例2中的细胞划痕检测结果；

图6为本发明测试例3中的细胞增殖检测结果；

图7为本发明测试例4中的重组人源化胶原蛋白的SDS-PAGE电泳检测结果，图中，泳道M-标准蛋白分子量Marker，泳道1-加热前的重组人源化胶原蛋白；泳道2-加热后的重组人源化胶原蛋白。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1

本实施例制备一种重组人源化胶原蛋白，所述重组人源化胶原蛋白包括前导肽和4个基本重复单元，所述重组人源化胶原蛋白的序列如SEQ ID No.3所示。

SEQ ID No.3：

MESCPTGPQNYSPQYDSYDVKSGVAVGGPIGPPGPRGNRGERGSEGSPGHPGQPGPPGPPGAPGPCGPIGPPGPRGNRGERGSEGSPGHPGQPGPPGPPGAPGPCGPIGPPGPRGNRGERGSEGSPGHPGQPGPPGPPGAPGPCGPIGPPGPRGNRGERGSEGSPGHPGQPGPPGPPGAPGPCHHHHHH。

所述重组人源化胶原蛋白通过如下方法进行制备：

(1)将编码所述重组人源化胶原蛋白的核酸分子进行密码子优化，并引入NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点，得到SEQ ID No.4所示的核苷酸序列：

SEQ ID No.4：

atggaatcttgcccgaccggtccgcagaactactctccgcagtacgactcttacgacgttaaatctggtgttgctgttggtggtccgatcggtccgccgggtccgcgtggtaaccgtggtgaacgtggttctgaaggttctccgggtcacccgggtcagccgggtccgccgggtccgccgggtgctccgggtccgtgcggtccgatcggtccgccgggtccgcgtggtaaccgtggtgaacgtggttctgaaggttctccgggtcacccgggtcagccgggtccgccgggtccgccgggtgctccgggtccgtgcggtccgatcggtccgccgggtccgcgtggtaaccgtggtgaacgtggttctgaaggttctccgggtcacccgggtcagccgggtccgccgggtccgccgggtgctccgggtccgtgcggtccgatcggtccgccgggtccgcgtggtaaccgtggtgaacgtggttctgaaggttctccgggtcacccgggtcagccgggtccgccgggtccgccgggtgctccgggtccgtgccaccatcatcaccaccattaa

(2)将SEQ ID No.4所示的核苷酸序列与质粒载体pET-32a(+)进行NdeⅠ和XhoⅠ双酶切，再进行连接，转化大肠杆菌DH5α，挑取单克隆菌落后利用碱裂解法提取质粒，经测序鉴定阳性克隆正确，成功构建得到表达载体，其质粒图谱如图1所示；

(3)将所述表达载体转入大肠杆菌表达菌株OverExpress C43(DE3)中，筛选，得到大肠杆菌基因工程菌株；

(4)挑取筛选后的单克隆菌落在4mL LB培养基中培养过夜，按照2％的接种量在摇瓶37℃培养至OD₆₀₀为0.4～0.6，按1:5000的比例加入IPTG，30℃培养15～20h诱导蛋白表达，离心收集菌体；

(5)用50mmoL Tri-HCl溶液(pH 7.4)重悬菌体于离心管中，在冰水混合物环境下超声破碎菌体(运行2s停4s)，6000rpm离心30min，收集上清液；

(6)在蛋白纯化仪上用镍离子亲和柱对上清液进行纯化，得到所述重组人源化胶原蛋白，其SDS-PAGE的检测结果如图2所示。

本实施例中，所述重组人源化胶原蛋白命名为COL-HJ-01。

对比例1

本对比例提供来源于人类胎盘的Ⅰ型胶原蛋白，从sigma公司购买，货号C7774。

对比例2

本对比例提供来源于人类胎盘的Ⅲ型胶原蛋白，从sigma公司购买，货号C4407。

测试例1

本测试例测试实施例1制备得到的重组人源化胶原蛋白与对比例1、对比例2天然人胎盘来源的胶原蛋白的细胞粘附性，步骤如下：

(1)蛋白样品的铺板：蛋白样品以每孔100μL添加至96孔板中，空白孔则不添加蛋白样品；

(2)蛋白样品的包被：将上述96孔板置于37℃，5％CO₂培养箱中包被；

(3)蛋白样品的封闭：加入100μL的1％BSA-PBS溶液，37℃，5％CO₂培养箱中封闭；移除多余封闭液后用D-PBS洗涤三次；

(4)细胞的准备：准备5×10⁴cell/mL的Bal b/c3T3细胞悬浮液以每孔100μL添加至96孔板中培养1-4h，每孔设置6个重复；

(5)检出：培养后用MTT法检出，在波长570nm、630nm处检测吸光值；

(6)计算：计算蛋白样品的相对细胞粘附活性，样品细胞粘附率＝样品组OD值/空白组OD值。

结果如图3所示，图3中，阳性对照为对比例1、对比例2中的人源胶原蛋白，COL-HJ-01为实施例1中制备的重组人源化胶原蛋白COL-HJ-01。由图可以看出，本申请实施例1中制备的重组人源化胶原蛋白COL-HJ-01与从人类胎盘中提取的Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白比较，具备优于后者的粘附能力，表明其具有良好的生物活性，可应用于相关的药物及化妆品的制备中。

测试例2

本测试例对实施例1制备得到的重组人源化胶原蛋白进行细胞毒性和细胞划痕实验。

(1)预实验(细胞毒性实验)

细胞毒性检测。找到合适的溶剂溶解样品，一般选用溶剂的顺序为超纯水、95％乙醇、DMSO。以最大溶解度为最高浓度进行初次实验，根据初次实验情况缩小正式实验的样品浓度范围，选出正式实验所使用的安全浓度。细胞毒性实验的结果如图4所示，COL-HJ-01不具备细胞毒性。

(2)正式实验(细胞划痕实验)

(a)添加2mL稀释好的细胞悬液于6孔板中，使其浓度为1×10⁶cells/well。

(b)待细胞贴壁长满6孔板约80-90％的状态后，用含有丝裂霉素C的DMEM培养基预处理2h。

(c)用10μL移液枪头划痕，并用PBS清洗三遍后加入含有丝裂霉素C的DMEM培养基并加样。

(d)加样后放置于倒置显微镜下拍下0h划痕宽度并记录，放入培养箱培养24h。

(e)24h后从CO₂培养箱中取出6孔板，并置于倒置显微镜下拍下24h划痕宽度并记录数据。

(f)计算：划痕愈合率(％)＝(S₀-S₂₄划痕面积)/S₀划痕面积×100％。

结果如图5所示，在本次实验中，检测浓度范围内样品组与Control组(空白对照)相比具有显著性差异，具有促进细胞迁移的作用。

测试例3

本测试例测试实施例1制备得到的重组人源化胶原蛋白的细胞增殖实验，实验步骤如下所示：

(1)添加100μL稀释好的细胞悬液于96孔板中，使其浓度为1.0×10⁴cells/well。

(2)放入CO₂培养箱培养24h。

(3)加样后放入培养箱培养24h。

(4)用培养基配制CCK-8试剂的10倍稀释液。

(5)倾倒干净96孔板中含样品的培养基后，每孔加入100μL上述CCK-8的稀释液，于CO₂培养箱中培养1～2h。

(6)取出96孔板，用酶标仪在450nm处测定吸光度。

HaCaT细胞生存率(％)＝100％×空白组吸光度值/样品组吸光度值。

结果如图6所示，在本次实验中，检测浓度范围内样品组与Control组(空白对照)相比具有显著性差异，具有促进细胞增殖的作用。

测试例4

本测试例测试实施例1制备得到的重组人源化胶原蛋白的热稳定实验，实验步骤如下所示：

本次热稳定实验用水浴的热刺激方式，进行60℃水浴15min处理，加热后进行离心处理，对上清进行SDS-PAGE。结果如图7所示，泳道M-标准蛋白分子量Marker，泳道1-加热前的重组人源化胶原蛋白；泳道2-加热后的重组人源化胶原蛋白。水浴加热沉淀了大量杂蛋白，而COL-HJ-01仍有清晰条带，可知该蛋白具备热稳定性能。在后续应用、运输中具备相应的稳定优势。

综上所述，本申请制备得到的重组人源化胶原蛋白兼具良好的可溶性与热稳定性，免疫原性低，安全性好；生物活性高，粘附性强，促进细胞愈合能力与增殖能力强；制备方法技术成熟，效率高，成本低，生产条件温和，减少了化学试剂的使用，具有应用于生产实际中的价值。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种重组人源化胶原蛋白，其特征在于，所述重组人源化胶原蛋白包括前导肽和至少一个基本重复单元；

所述基本重复单元包括SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的重组人源化胶原蛋白，其特征在于，所述前导肽包括SEQ IDNo.2所示的氨基酸序列；

优选地，所述基本重复单元的数量为3～6个；

优选地，所述重组人源化胶原蛋白包括SEQ ID No.3所示的氨基酸序列。

3.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1或2所述的重组人源化胶原蛋白；

优选地，所述核酸分子包括SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。

4.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有至少一个拷贝的权利要求3所述的核酸分子。

5.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞表达权利要求1或2所述的重组人源化胶原蛋白；

优选地，所述重组细胞的基因组中整合有权利要求3所述的核酸分子；

优选地，所述重组细胞中含有权利要求4所述的表达载体。

6.一种权利要求1或2所述的重组人源化胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：

构建表达载体，将所述表达载体转入受体细胞中，筛选；

培养筛选得到的工程菌株，诱导表达并进行纯化，得到所述的重组人源化胶原蛋白。

7.根据权利要求6所述的重组人源化胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述受体细胞包括大肠杆菌表达菌株；

优选地，所述诱导表达的方法包括IPTG诱导。

8.根据权利要求6或7所述的重组人源化胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述纯化前还包括破碎菌体的步骤；

优选地，所述纯化的方法包括镍离子柱亲和层析。

9.根据权利要求6～8任一项所述的重组人源化胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：

(1)将编码所述重组人源化胶原蛋白的核酸分子连入质粒载体中，构建表达载体，将所述表达载体转入大肠杆菌表达菌株中，筛选，得到大肠杆菌基因工程菌株；

(2)发酵培养所述大肠杆菌基因工程菌株，用IPTG诱导蛋白表达后，离心收集菌体；

(3)对收集得到的菌体进行超声破碎，离心收集上清液；

(4)对上清液进行镍离子柱亲和层析纯化，得到所述重组人源化胶原蛋白。

10.权利要求1或2所述的重组人源化胶原蛋白在制备化妆品或皮肤损伤治疗药物中的应用。

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