CN112552393B - 一种重组人源iii型胶原蛋白及其毕赤酵母重组表达系统 - Google Patents

一种重组人源iii型胶原蛋白及其毕赤酵母重组表达系统 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种重组人源III型胶原蛋白及其毕赤酵母重组表达系统。本发明将人源III型胶原蛋白部分肽段中含有缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸的Gly‑X‑Y结构肽以使用频率较高的不含上述氨基酸的Gly‑X‑Y结构肽替换，根据替换后肽段获得编码肽段的基因序列，然后构建用于串联表达不同重复数目肽段的基因表达载体并转化毕赤酵母宿主菌，筛选获得高表达重组人源III型胶原蛋白的菌株。本发明通过蛋白结构的人工设计优化，有效解决天然胶原在发酵中发生降解的问题，表达产物稳定性高、生物相容性好，可用于大规模生产。

Description

一种重组人源III型胶原蛋白及其毕赤酵母重组表达系统
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及利用毕赤酵母表达重组人源III型胶原蛋白。
背景技术
胶原蛋白(collagen)是体内含量最多的一种蛋白质，是细胞外基质(ECM)的主要成分，其对维护细胞、组织、器官的正常生理功能和损伤修复具有重要作用，已广泛应用于医药、保健品及化妆品行业中。在分子结构上，每条胶原肽链主要由Gly-X-Y结构肽构成(X、Y是Gly之外的任何氨基酸残基)，这种肽链结构是形成胶原纤维高级结构所必需的，决定了胶原蛋白优良的生物相容性和低免疫原性。
胶原蛋白的主要来源是从动物组织中提取，而随着生物技术的发展，利用基因重组技术，通过微生物发酵法获得重组胶原蛋白，解决了传统提取法存在的病毒隐患，同时与天然胶原蛋白相比，人工设计的重组胶原蛋白的亲水性和生物相容性显著提高。但研究表明利用重组菌株，例如，毕赤酵母基因工程菌表达胶原蛋白时，在发酵过程中重组菌株表达的胶原蛋白会出现明显的降解现象，不利于后续的纯化及应用，同时也提高了胶原蛋白的生产消耗和成本。
中国专利CN111647089A公开了一种重组类人弹性蛋白及其组合物，通过短重复氨基酸序列串联(重复3～7次)构成目的蛋白多肽序列，具有较好的耐降解性能，催化活性较单一原始片段保持更久。但是短重复氨基酸序列串联导致重组蛋白与天然蛋白序列同源性降低，并不适合作为与生物体长期接触的生物材料进行应用。
中国专利CN109680025A公开了一种提高重组人源胶原蛋白生产水平且降低蛋白降解速度的发酵工艺，其在甲醇诱导培养阶段(90～120小时)向发酵培养基中加入柠檬酸铵，可以提高重组人源胶原蛋白的生物合成速率，缩短发酵时间，同时也提高了重组人源胶原蛋白在发酵液中的稳定性。但随着重组人源蛋白与发酵液分离，仍无法解决重组人源胶原蛋白在下游纯化过程及应用过程中的稳定性问题。
中国专利CN103102407A中提供了一种酵母基因工程菌，其可以表达带有特异性亲和纯化标记和两段相同的人源III型胶原蛋白片段的基因重组类人胶原蛋白。该专利采用与天然胶原的部分肽段序列完全相同的两段序列(通过EFT连接)构建重组蛋白，但从结果电泳图中可以看出目的蛋白附近有明显的降解片段。同时，虽然使用特异性纯化标记可获得纯度较高的目的蛋白，但纯化标记会影响蛋白的免疫原性，从而影响蛋白的应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种重组人源III型胶原蛋白及其毕赤酵母重组表达系统。
为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
一种重组人源III型胶原蛋白，该重组人源III型胶原蛋白包括重复串联的单体，所述单体为突变的人源III型胶原蛋白氨基酸序列片段，单体的突变位点为人源III型胶原蛋白氨基酸序列片段中含有缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸或丙氨酸的Gly-X-Y结构肽(三肽重复序列)。
优选的，所述单体为由50～500个氨基酸构成的肽段，突变的Gly-X-Y结构肽数与单体的Gly-X-Y结构肽总数的数量比为小于10％(例如，2％～8％)。
优选的，根据人源III型胶原蛋白氨基酸序列，选取该序列中第538至705位的168位氨基酸残基所组成的肽段，然后将该肽段中含有缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸或丙氨酸的Gly-X-Y结构肽作为突变位点进行优化，即将这些Gly-X-Y结构肽以使用频率较高且不含有上述氨基酸(缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸)的Gly-X-Y结构肽替换，并以优化后形成的168位氨基酸残基所组成的肽段作为重复串联表达的单体。
优选的，所述单体的氨基酸序列为SEQ.ID.NO.1自氨基端起的第2～169位。
优选的，所述重组人源III型胶原蛋白中，单体的串联个数为2～10(例如，二重复串联单体、四重复串联单体、六重复串联单体)。
优选的，所述重组人源III型胶原蛋白的分子量为10KD～100KD。
一种重组人源III型胶原蛋白的表达系统，该表达系统包括表达重组人源III型胶原蛋白的菌株，该菌株是转化有重组人源胶原蛋白基因分泌型表达载体的野生型或突变型巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)，所述分泌型表达载体包括重组人源胶原蛋白基因表达盒，所述表达盒包括启动子(例如，醇氧化物酶启动子)、目的基因序列和终止区序列(例如，TT)，所述目的基因序列是由KEX2酶切位点、人源III型胶原蛋白氨基端(N端)第一个氨基酸的编码序列(甘氨酸的密码子，例如GGT)以及与该序列紧邻的用于对上述单体进行重复串联表达的多段重复编码序列(例如，二重复、四重复、六重复)和终止密码子(例如，TGATAA)组成的DNA序列。
优选的，所述单体的编码序列为SEQ.ID.NO.2自5’端起的第16～519位。
一种重组人源III型胶原蛋白的生产方法，包括以下步骤：
1)表达载体的构建：人工全基因合成如SEQ.ID.NO.2所示的DNA序列，该DNA序列在5’端添加有Xho I限制性内切酶酶切位点和KEX2酶切位点以及Xba I限制内切酶酶切位点，在3’端添加有Nhe I限制性内切酶酶切位点和EcoR I限制性内切酶酶切位点(且二者之间用终止密码子间隔)；将SEQ.ID.NO.2所示的DNA序列连接至克隆载体(例如，pMD19-Tsimple等T载体)中，得到单体基因的克隆载体(例如，T-IIICOL质粒)；将单体基因的克隆载体进行Nhe I/EcoR I双酶切，并回收载体片段，另将单体基因的克隆载体进行Xba I/EcoRI双酶切，回收目的基因片段(含有单体的编码序列和终止密码子)，之后将回收的载体片段与目的基因片段进行连接、转化，获得含有二段重复的单体编码序列的克隆载体(例如，T-IIICOL-2质粒)，以此类推(即利用质粒酶切获得切除了终止密码子的载体片段和待增加的目的基因片段)，可获得不同的含有多段重复编码序列(例如，含有二段重复的单体编码序列、含有四段重复的单体编码序列、含有六段重复的单体编码序列)的克隆载体；将这些克隆载体分别利用Xho I/EcoR I进行双酶切，并将回收的含有不同重复数量的单体编码序列的目的基因序列(例如，二重复片段IIICOL-2、四重复片段IIICOL-4、六重复片段IIICOL-6)，分别与毕赤酵母表达载体(例如，pPIC9K)骨架连接，即可获得不同重复单体数的串联表达载体(例如，pPIC9K-IIICOL-2质粒、pPIC9K-IIICOL-4质粒、pPIC9K-IIICOL-6质粒)；
2)表达重组人源III型胶原蛋白的毕赤酵母基因工程菌的构建：将上述串联表达载体转化毕赤酵母宿主菌(例如，GS115)后进行抗性筛选，并经摇瓶表达鉴定，获得表达不同分子量的重组人源III型胶原蛋白的基因工程菌，实现重组人源III型胶原蛋白高表达；
3)重组人源III型胶原蛋白的发酵生产：对上述表达重组人源III型胶原蛋白的基因工程菌进行发酵，在发酵过程中通过添加甲醇诱导表达重组人源III型胶原蛋白。
优选的，所述步骤3)中，以无机盐BSM培养基作为底料，使用发酵罐进行发酵(pH4.5～6.0，温度25.0℃～30.0℃，溶氧控制在10％～50％)，甲醇诱导时间为40～50小时。
一种用于组织工程、美容产品的生物材料，该生物材料包括上述重组人源III型胶原蛋白。
本发明的有益效果体现在：
本发明将人源III型胶原蛋白天然序列中含有缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸的Gly-X-Y结构肽进行选择性突变(例如，以使用频率较高的不含上述氨基酸的Gly-X-Y结构肽替换)，通过构建用于串联表达不同重复片段数的优化序列的基因表达载体并转化毕赤酵母宿主菌，获得表达重组人源III型胶原蛋白的菌株，经发酵实验表明，所获得的重组人源III型胶原蛋白稳定性高，在发酵以及纯化和使用中几乎无降解，并且生物相容性好，有效的解决天然序列的重组人源III型胶原蛋白在发酵中发生降解的问题，可用于大规模生产重组人源III型胶原蛋白，且生产方法快速、简便。
进一步的，本发明可以通过构建表达不同重复片段数的毕赤酵母基因工程菌生产不同分子量的重组人源III型胶原蛋白，其中小分子量的重组人源III型胶原蛋白作为生物材料应用于化妆品等美容产品，大分子量的重组人源III型胶原蛋白作为生物材料应用于医疗器械。
附图说明
图1为天然人源III型胶原蛋白选定肽段(537-705)的氨基酸序列示意图；图中竖线下方为替换后的氨基酸残基。
图2为具有不同重复串联单体数的重组人源III型胶原蛋白表达载体的构建流程图。
图3为具有不同重复串联单体数的重组人源III型胶原蛋白表达载体的质粒图谱。
图4为毕赤酵母基因工程菌表达的重组人源III型胶原蛋白(优化序列)的电泳图，其中：泳道1为二重复重组人源III型胶原蛋白基因工程菌表达产物，泳道2为四重复重组人源III型胶原蛋白基因工程菌表达产物，泳道3为六重复重组人源III型胶原蛋白基因工程菌表达产物，泳道4为蛋白Marker。
图5为毕赤酵母基因工程菌表达的重组人源III型胶原蛋白(天然序列)的电泳图，其中：泳道M为蛋白Marker，泳道1为六重复重组人源III型胶原蛋白基因工程菌表达产物，泳道2为四重复重组人源III型胶原蛋白基因工程菌表达产物，泳道3为二重复重组人源III型胶原蛋白基因工程菌表达产物。
图6为不同基因工程菌发酵液上清电泳图，其中：泳道1为六重复重组人源III型胶原蛋白(优化序列)基因工程菌发酵液上清，泳道M为蛋白Marker，泳道2为六重复重组人源III型胶原蛋白(天然序列)基因工程菌发酵液上清。
图7为重组人源III型胶原蛋白的稳定性实验电泳图，其中：泳道M为蛋白Marker。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对发明做进一步详细说明，所述实施例仅用于解释本发明，而非对本发明保护范围的限制。
(一)人源胶原蛋白的结构设计
本发明根据天然人源III型胶原蛋白氨基酸序列(参考序列Genebank登录号：NM_000090.3)，选取其中由169个氨基酸构成的肽段，将该肽段中含有缬氨酸(V)、苯丙氨酸(F)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)或丙氨酸(A)的Gly-X-Y结构肽全部进行优化，主要优化方式为：以天然人源III型胶原蛋白螺旋区使用频率较高(≥3次)的不含上述氨基酸的Gly-X-Y结构肽替换。
本发明选取的169AA序列(参考序列中的第537-705位)为含缬氨酸(V)、苯丙氨酸(F)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)及丙氨酸(A)较少的区域。
本发明用于替换的Gly-X-Y结构肽为不含缬氨酸(V)、苯丙氨酸(F)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)及丙氨酸(A)的Gly-X-Y结构肽，具体包括GPP(出现40次)、GSP(出现21次)、GPQ(出现10次)、GEP(出现10次)、GQP(出现6次)、GES(出现4次)，以及GKP(出现3次)，可随机选择。
对上述肽段进行Gly-X-Y结构肽替换(替换位点的数量比例约为8％)后的氨基酸序列(下划线部分简称优化序列，该部分替换之前称为天然序列)示例如下(SEQ.ID.NO.1)，具体优化过程参见图1，序列N端的SR是为单体重复片段的载体构建引入的限制性内切酶切位点区：
GSRGSPGGPGSDGKPGPPGSQGESGRPGPPGPSGPRGQPGPPGSPGPKGNDGQPGKNGERGGPGGPGPQ GPPGKNGETGPQGPPGPTGPGGDKGDTGPPGPQGEPGKPGTGGPPGENGKPGEPGPKGPPGESGSPGGKGPPGQPGE RGPPGPQGEPGPQGPQGPPGPEG
本发明以上述替换后的氨基酸序列中的后168个氨基酸构成的肽段(即优化序列)作为单体进行重复串联表达。
(二)制备重组人源III型胶原蛋白
2.1单体基因的获得
根据上述替换后的氨基酸序列，以及毕赤酵母密码子偏好性，设计并人工全基因合成目标克隆序列，目标克隆序列包括所述168个氨基酸构成的肽段(即单体)的编码序列，同时在该编码序列5’端的TCTAGA(Xba I限制内切酶酶切位点)上游添加Xho I限制性内切酶酶切位点CTCGAG和KEX2酶切位点AAAAGA(Lys-Arg，在DNA翻译为蛋白时作为切割信号肽)以及甘氨酸的密码子(GGT，KEX2识别AAAAGA翻译的Lys-Arg后发生切割，该甘氨酸即是获得胶原蛋白N端的第一个氨基酸)，并在所述编码序列的3’端添加限制性内切酶Nhe I和EcoRI的酶切位点GCTAGC和GAATTC，且编码序列的3’端添加的这两个酶切位点之间用终止密码子TGATAA间隔。将上述目标克隆序列连接至T载体pMD19-T simple(Takara)中，经测序鉴定获得克隆载体T-IIICOL(简称T-IIICOL质粒)，目标克隆序列的示例参见SEQ.ID.NO.2(2020年3月设计完成)。
2.2二重复串联表达载体的构建
参见图2，取T-IIICOL质粒并进行Nhe I和EcoR I双酶切，回收载体片段(T-IIICOL骨架)；另取T-IIICOL质粒并进行Xba I和EcoR I双酶切，回收目的基因片段，之后将回收的载体片段与目的基因片段利用T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α，获得克隆载体T-IIICOL-2(简称T-IIICOL-2质粒)。然后将T-IIICOL-2质粒、毕赤酵母表达载体pPIC9K(Invitrogen)分别进行Xho I和EcoR I双酶切，分别回收酶切产物(目的基因序列IIICOL-2含有二段重复的单体编码序列、pPIC9K骨架)，并将回收的酶切产物利用T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α，氨苄青霉素筛选并经测序鉴定获得二重复串联表达载体pPIC9K-IIICOL-2(简称pPIC9K-IIICOL-2质粒)。在pPIC9K-IIICOL-2质粒(参见图3A)中，IIICOL-2插入pPIC9K的多克隆位点区，上游为醇氧化物酶启动子5’AOX1，下游为转录终止区TT。
2.3二重复重组人源III型胶原蛋白基因工程菌构建
将获得的pPIC9K-IIICOL-2质粒中量提取后，利用限制性内切酶Sal I酶切线性化，然后通过电穿孔仪转化毕赤酵母宿主菌GS115(Invitrogen)，经G418筛选(但图3中未显示相应的抗性基因)(4mg/mL，YPD培养基)高拷贝转化子，并通过摇瓶发酵(29℃、200rpm，BMMY培养基，间隔24小时甲醇补料1％)确定表达情况。摇瓶发酵上清液经SDS-PAGE电泳检测，在理论分子量30.6kDa位置有明显的电泳条带(图4泳道1)，确定获得二重复重组人源III型胶原蛋白基因工程菌。
2.4四重复串联表达载体构建
参照图2所示的二重复串联表达载体的构建，取T-IIICOL-2质粒进行Nhe I和EcoRI双酶切，回收载体片段(T-IIICOL-2骨架)；另取T-IIICOL-2质粒进行Xba I和EcoR I双酶切，回收目的基因片段，之后将回收的载体片段与目的基因片段利用T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α，获得克隆载体T-IIICOL-4(简称T-IIICOL-4质粒)。然后将T-IIICOL-4质粒、毕赤酵母表达载体pPIC9K分别进行Xho I和EcoR I双酶切，分别回收酶切产物(目的基因序列IIICOL-4含有四段重复的单体编码序列、pPIC9K骨架)，并将回收的酶切产物利用T4DNA连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α，经氨苄青霉素筛选及测序鉴定，获得四重复串联表达载体pPIC9K-IIICOL-4(简称pPIC9K-IIICOL-4质粒)，质粒图谱见图3B。
2.5四重复重组人源III型胶原蛋白基因工程菌构建
将获得的pPIC9K-IIICOL-4质粒中量提取后，利用限制性内切酶Sal I酶切线性化，然后通过电穿孔仪转化毕赤酵母宿主菌GS115，经G418筛选(4mg/mL，YPD培养基)高拷贝转化子，并通过摇瓶发酵(温度29℃、200rpm，BMMY培养基，间隔24小时甲醇补料1％)确定表达情况。摇瓶发酵上清液经SDS-PAGE电泳检测，在理论分子量61.2kDa位置有明显的电泳条带(图4泳道2)，确定获得四重复重组人源III型胶原蛋白基因工程菌。
2.6六重复串联表达载体构建
参照图2所示的二重复串联表达载体的构建，取T-IIICOL-4质粒并进行Nhe I和EcoR I双酶切，回收载体片段(T-IIICOL-4骨架)；另取T-IIICOL-2质粒并进行Xba I和EcoRI双酶切，回收目的基因片段，之后将回收的载体片段与目的基因片段利用T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α，获得克隆载体T-IIICOL-6(简称T-IIICOL-6质粒)。然后将T-IIICOL-6质粒、毕赤酵母表达载体pPIC9K分别进行Xho I和EcoR I双酶切，分别回收酶切产物(目的基因序列IIICOL-6含有六段重复的单体编码序列、pPIC9K骨架)，并将回收的酶切产物利用T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α，经氨苄青霉素筛选及测序鉴定，获得六重复串联表达载体pPIC9K-IIICOL-6(简称pPIC9K-IIICOL-6质粒)，质粒图谱见图3C。
2.7六重复重组人源III型胶原蛋白基因工程菌构建
将获得的pPIC9K-IIICOL-6质粒中量提取后，利用限制性内切酶Sal I酶切线性化，然后通过电穿孔仪转化毕赤酵母宿主菌GS115，经G418筛选(4mg/mL，YPD培养基)高拷贝转化子，并通过摇瓶发酵(29℃、200rpm，BMMY培养基，间隔24小时甲醇补料1％)确定表达情况。摇瓶发酵上清液经SDS-PAGE电泳检测，在理论分子量91.3kDa位置有明显的电泳条带(图4泳道3)，确定获得六重复重组人源III型胶原蛋白基因工程菌，其表达的重组人源III型胶原蛋白的分子量更接近于天然人源III型胶原蛋白螺旋区分子量，利于在生物材料中的应用。
2.8重组人源III型胶原蛋白(天然序列)串联表达载体及基因工程菌构建
针对上述天然人源III型胶原蛋白氨基酸序列中的169AA序列(参考序列中的第537-705位)，按照毕赤酵母密码子偏好性，设计并人工全基因合成目标克隆序列(除未进行Gly-X-Y结构肽替换外，包括SR的引入在内的其它分子设计与上述优化序列相同)，参照2.2至2.7的方法分别构建二重复、四重复、六重复串联表达载体及对应的基因工程菌，摇瓶发酵上清液电泳结果见图5。
(三)重组人源III型胶原蛋白的发酵生产
对实验组(优化序列)以及对照组(天然序列)的六重复重组人源III型胶原蛋白基因工程菌，在相同条件进行发酵，发酵过程如下：
以无机盐BSM培养基作为底料，使用10L发酵罐进行发酵(氨水调控pH5.0，温度29.0℃，溶氧控制在30％左右)，菌体湿重达180～200mg/mL时开始甲醇诱导(例如，甲醇补料速率为10ml/h/L)，诱导40～50小时，放罐，离心收取发酵上清液。
取发酵上清液进行SDS-PAGE电泳检测，结果表明(图6)：通过发酵获得的实验组重组人源III型胶原蛋白(优化序列)与对照组重组人源III型胶原蛋白(天然序列)相比，实验组的重组人源III型胶原蛋白在表达中稳定性更好(重组人源III型胶原蛋白表达量可达4～5g/L)，几乎无降解产物，但对照组的重组人源III型胶原蛋白降解明显。
其他实验表明，四重复重组人源III型胶原蛋白基因工程菌同样可以表达稳定性高的重组人源III型胶原蛋白。
(四)重组人源III型胶原蛋白稳定性实验
将上述(三)中发酵上清液经纯化(超滤、离子交换层析，回收率达到70％以上，纯度达到95％以上)获得的两组重组人源III型胶原蛋白的样品进行稳定性实验，使用纯化水配制成1mg/mL样品溶液，分别在-20℃、4℃和37℃放置1个月，于室温下利用SDS-PAGE电泳检测其蛋白的完整性，结果表明(图7)，实验组重组人源III型胶原蛋白在-20℃、4℃和37℃放置1个月后，各温度下目的蛋白条带依然完整，对照组重组人源III型胶原蛋白放置1个月后，-20℃和4℃下目的蛋白条带完整，而37℃下目的蛋白条带则呈弥散状，几乎降解完全。
(五)重组人源III型胶原蛋白细胞毒性检测
用含10％胎牛血清的DMEM/F12培养液将培养的小鼠成纤维细胞L929稀释成6×103/mL的单细胞悬液；取96孔培养板，每孔接种100μL的细胞悬液，置含5％CO2培养箱中，37℃培养24h；弃去原培养液，加入100μL重组人源III型胶原蛋白(优化序列，91.3kD)和牛胶原蛋白(sigma)，分别设置100mg/L，500mg/L，1000mg/L，5000mg/L蛋白溶液，同时设置阴性对照组(单纯细胞培养液)和阳性对照组(4％DMSO)，每组8孔；将培养板移入37℃、5％CO2培养箱中，96小时后取出培养板，每孔再加入MTT(噻唑蓝)50μL，继续在37℃条件下培养2h，吸弃液体，立即加入二甲基亚砜(每孔150μL)，室温放置并轻轻震荡10～15min；选择490nm波长，在酶标仪上测定各孔光吸收值，计算细胞相对增殖率：
RGR(％)＝(实验组吸收值/阴性对照组吸收值)×100％
结果可看出(表1)，不同浓度的重组人源III型胶原蛋白体系下细胞相对增殖率均大于100％，且显著高于牛胶原蛋白的增殖率，细胞毒性为0级，生物相容性良好。
表1.细胞毒性测定
Figure BDA0002879391940000091
注：表1为六重复串联单体重组胶原蛋白的结果，不同重复单体数对细胞的毒性未见明显差异。
总之，本发明提出以天然人源III型胶原蛋白序列为模板，为了获得与天然序列同源性更高的序列，选取含缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸及丙氨酸较少的天然序列区域，然后将该区域中含有上述氨基酸的Gly-X-Y结构肽，以使用频率较高的不含上述氨基酸的Gly-X-Y结构肽替换，通过替换获得了用于串联重复表达的优化序列，可以有效解决重组人源III型胶原蛋白在发酵等过程中发生降解的问题，提高重组人源III型胶原蛋白的稳定性，为重组人源胶原蛋白的应用奠定基础。
<110> 西安德诺海思医疗科技有限公司
<120> 一种重组人源III型胶原蛋白及其毕赤酵母重组表达系统
<160> 2
<210> 1
<211> 169
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Gly Ser Arg Gly Ser Pro Gly Gly Pro Gly Ser Asp Gly Lys Pro Gly
1 5 10 15
Pro Pro Gly Ser Gln Gly Glu Ser Gly Arg Pro Gly Pro Pro Gly Pro
20 25 30
Ser Gly Pro Arg Gly Gln Pro Gly Pro Pro Gly Ser Pro Gly Pro Lys
35 40 45
Gly Asn Asp Gly Gln Pro Gly Lys Asn Gly Glu Arg Gly Gly Pro Gly
50 55 60
Gly Pro Gly Pro Gln Gly Pro Pro Gly Lys Asn Gly Glu Thr Gly Pro
65 70 75 80
Gln Gly Pro Pro Gly Pro Thr Gly Pro Gly Gly Asp Lys Gly Asp Thr
85 90 95
Gly Pro Pro Gly Pro Gln Gly Glu Pro Gly Lys Pro Gly Thr Gly Gly
100 105 110
Pro Pro Gly Glu Asn Gly Lys Pro Gly Glu Pro Gly Pro Lys Gly Pro
115 120 125
Pro Gly Glu Ser Gly Ser Pro Gly Gly Lys Gly Pro Pro Gly Gln Pro
130 135 140
Gly Glu Arg Gly Pro Pro Gly Pro Gln Gly Glu Pro Gly Pro Gln Gly
145 150 155 160
Pro Gln Gly Pro Pro Gly Pro Glu Gly
165
<210> 2
<211> 537
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ctcgagaaaa gaggttctag aggttctcca ggtggtccag gttctgacgg taagccaggt 60
ccaccaggtt ctcaaggtga atctggtaga ccaggtccac caggtccatc tggtccaaga 120
ggtcaaccag gtccaccagg ttctccaggt ccaaagggta acgacggtca accaggtaag 180
aacggtgaaa gaggtggtcc aggtggtcca ggtccacaag gtccaccagg taagaacggt 240
gaaactggtc cacaaggtcc accaggtcca actggtccag gtggtgacaa gggtgacact 300
ggtccaccag gtccacaagg tgaaccaggt aagccaggta ctggtggtcc accaggtgaa 360
aacggtaagc caggtgaacc aggtccaaag ggtccaccag gtgaatctgg ttctccaggt 420
ggtaagggtc caccaggtca accaggtgaa agaggtccac caggtccaca aggtgaacca 480
ggtccacaag gtccacaagg tccaccaggt ccagaaggtg ctagctgata agaattc 537

Claims (7)

1.一种重组人源III型胶原蛋白，其特征在于：该重组人源III型胶原蛋白包括重复串联的单体，所述单体为突变的人源III型胶原蛋白氨基酸序列片段，单体的突变位点为人源III型胶原蛋白氨基酸序列片段中含有缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸或丙氨酸的Gly-X-Y三肽重复序列，将这些Gly-X-Y三肽重复序列替换为天然人源III型胶原蛋白螺旋区使用频率≥3次的不含上述氨基酸的Gly-X-Y三肽重复序列；
所述单体的氨基酸序列为SEQ.ID.NO.1的第2~169位。
2.根据权利要求1所述一种重组人源III型胶原蛋白，其特征在于：所述重组人源III型胶原蛋白中，单体的串联个数为2~10。
3.根据权利要求2所述一种重组人源III型胶原蛋白，其特征在于：所述重组人源III型胶原蛋白的分子量为10KD~100KD。
4.一种表达如权利要求1所述的重组人源III型胶原蛋白的菌株，其特征在于：该菌株是转化有重组人源胶原蛋白基因表达载体的野生型或突变型巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris），所述表达载体包括重组人源胶原蛋白基因表达盒，所述表达盒包括目的基因序列，所述目的基因序列包括用于对单体进行重复串联表达的DNA序列，所述单体为突变的人源III型胶原蛋白氨基酸序列片段，单体的突变位点为人源III型胶原蛋白氨基酸序列片段中含有缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸或丙氨酸的Gly-X-Y三肽重复序列，将这些Gly-X-Y三肽重复序列替换为天然人源III型胶原蛋白螺旋区使用频率≥3次的不含上述氨基酸的Gly-X-Y三肽重复序列。
5.根据权利要求4所述的菌株，其特征在于：所述单体的编码序列为SEQ.ID.NO.2的第16~519位。
6.一种重组人源III型胶原蛋白的生产方法，其特征在于：包括以下步骤：
以底料对权利要求4所述的菌株进行发酵，在发酵过程中通过添加甲醇诱导该菌株表达重组人源III型胶原蛋白。
7.一种用于组织工程、美容产品的生物材料，其特征在于：该生物材料包括权利要求1-3中任意一项所述的重组人源III型胶原蛋白。
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