CN107108754A - α‑1‑抗胰蛋白酶(A1AT)融合蛋白及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及MIC‑1融合蛋白。更具体地，涉及包含融合蛋白的化合物，该融合蛋白包含经由肽连接体连接的在该融合蛋白的C端处的MIC‑1蛋白或其类似物和在该融合蛋白的N端处的人A1AT(A1AT)的功能变体。本发明的化合物具有MIC‑1活性。本发明还涉及包含这类化合物和药学上可接受的赋形剂的药物组合物以及该化合物的医药用途。

Description

α-1-抗胰蛋白酶(A1AT)融合蛋白及其用途
技术领域
本发明涉及α-1-抗胰蛋白酶(A1AT)融合蛋白及其制药用途。
序列表的援引并入
名称为“序列表(SEQUENCE LISTING)”的序列表创建于2015年12月21日，并且通过引用并入本文。
背景
巨噬细胞抑制性细胞因子-1(MIC-1)，也称为GDF-15和胎盘骨形态发生蛋白(PLAB)，是TGF-β超家族(参与细胞生长和分化的肽激素家族)的远缘成员。MIC-1以分子量为24.5kDa的富含半胱氨酸的同型二聚体形式循环。最初报告MIC-1在巨噬细胞中被包括IL-1b、TNF-α、IL-2和TGF-b在内的刺激物上调。还显示MIC-1可减少脂多糖诱导的TNF-α产生，并且基于这些资料提出MIC-1是一种抗炎性细胞因子。最近，一项研究在探索为何人类晚期癌症患者体重减轻并且他们显示体重减轻与MIC-1的循环水平相关。这些资料表明MIC-1调节体重。该假说在异种移植前列腺肿瘤细胞的小鼠中进行了检验，其中数据表明，升高的MIC-1水平与体重减轻和食物摄入减少相关，施用抗MIC-1抗体能够逆转这种效应。由于给小鼠施用重组MIC-1能够调节下丘脑神经肽Y和阿黑皮素原，因此提出MIC-1通过中枢机制调节食物摄入。此外，超表达MIC-1的转基因小鼠在用正常低脂肪饮食和高脂肪饮食喂养时均获得较低的体重和体脂肪。而且，与用类似的饮食喂养的野生型动物相比，分别用低脂肪和高脂肪饮食喂养的超表达MIC-1的转基因小鼠具有改善的葡萄糖耐量。
天然MIC-1具有短半衰期，意味着用天然MIC-1进行的治疗需要每日给药以维持功效。
US 2012/0094356涉及人α-1-抗胰蛋白酶或其变体在与具有药学意义的蛋白质和肽融合中的用途。
WO 2005099746涉及通过施用MIC-1调节剂来调节食欲和/或体重的方法。
概述
本发明涉及开发包含通过居间肽连接体与MIC-1融合的N端融合配偶体的生物活性重组融合蛋白。所公开的融合蛋白集成了一系列有利特征，如改善的生产可行性、蛋白质稳定性、血浆半衰期和保持的融合蛋白生物学活性。
在一方面，本发明提供包含融合蛋白的化合物，该融合蛋白包含经由肽连接体连接的在该融合蛋白的C端处的MIC-1蛋白或其类似物和在该融合蛋白的N端处的人α-1-抗胰蛋白酶(A1AT)的功能变体。该肽连接体具有10至100个氨基酸的长度。在一方面，该肽连接体包含氨基酸序列[X-Ym]n，其中X为Asp或Glu；Y为Ala；m为2至4，且n至少为5。
在一方面，本发明提供编码包含融合蛋白的化合物的多核苷酸分子，该融合蛋白包含经由肽连接体连接的在该融合蛋白的C端处的MIC-1蛋白或其类似物和在该融合蛋白的N端处的人A1AT的功能变体。
在一方面，本发明提供包含本发明化合物或其药学上可接受的盐、酰胺或酯以及一种或多种药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
在一方面，本发明提供用作药物的本发明化合物。
在一方面，本发明提供用于例如通过减少食物摄入、减轻体重、抑制食欲和诱导饱腹感来治疗饮食失调如肥胖症的本发明化合物。
在一方面，本发明提供用于治疗肥胖症的本发明化合物。
在一方面，本发明化合物为MIC-1激动剂。在一方面，本发明化合物抑制食物摄入。在一方面，本发明化合物减轻体重。
在一方面，本发明化合物具有比天然MIC-1的半衰期更长的半衰期。
附图简述
图1.A1AT-MIC-1二聚体融合蛋白的图示。A、B和C分别表示A1AT域、连接体区和MIC-1的相对位置。-SS-表示将两个A1AT-MIC-1单体连接在一起以形成功能性二聚体融合蛋白的链间二硫桥。
详述
本发明涉及包含MIC-1融合蛋白的化合物。在一方面，本发明涉及MIC-1融合蛋白。
在一方面，本发明提供包含融合蛋白的化合物，该融合蛋白包含经由肽连接体连接的在该融合蛋白的C端处的MIC-1或其类似物和在该融合蛋白的N端处的人A1AT或其功能变体。该肽连接体具有10至100个氨基酸的长度。在一方面，该肽连接体包含氨基酸序列[X-Ym]n，其中X为Asp或Glu；Y为Ala；m为2至4，且n至少为5。
本发明的融合蛋白策略将可溶、稳定的血浆蛋白质——人α-1-抗胰蛋白酶(A1AT)——与天然MIC-1组合起来。人A1AT具有固有的特性，如高溶解度和稳定性，这使其有利于用作融合配偶体来改善表达产率且赋予MIC-1稳定性。作为融合配偶体的人A1AT还可通过显著的大小增加来延长MIC-1的血浆半衰期。本发明提供了包含血浆半衰期延长的MIC-1融合蛋白的化合物。
在下文中，希腊字母可用其符号或相应的书面名称表示，例如：α＝alpha；β＝beta；ε＝epsilon；γ＝gamma；ω＝omega；等等。此外，希腊字母μ也可用“u”表示，例如在μl＝ul或μM＝uM中。
MIC-1蛋白和类似物
如本文所用的术语“MIC-1”意指巨噬细胞抑制性细胞因子-1(MIC-1)，也称为GDF-15和胎盘骨形态发生蛋白(PLAB)。全长野生型人MIC-1蛋白的序列可以从UNIPROT数据库以登录号Q99988获得。由308个氨基酸组成的前体蛋白包括信号肽(氨基酸1-29)、前肽(氨基酸30-196)和成熟蛋白(氨基酸197-308)。由112个氨基酸组成的成熟MIC-1蛋白以SEQ IDNO：1的形式包括在本文中。成熟MIC-1含有九个半胱氨酸残基，这导致形成4个链内二硫键和一个链间二硫键，从而产生共价连接的24.5kDa同型二聚体。已经描述了对应于成熟蛋白(SEQ ID NO：1)中的His6Asp的天然存在的突变。
因此，野生型人MIC-1的具体实例为SEQ ID NO：1的成熟MIC-1蛋白，具有氨基酸修饰His6Asp的SEQ ID NO：1，以及以上提及的前肽和/或信号肽之后的任何这些序列。
如本文所用的术语“MIC-1蛋白”是指SEQ ID NO：1的人MIC-1蛋白或其类似物。具有SEQ ID NO：1序列的蛋白质也可称为“天然”MIC-1或“野生型”MIC-1。
如本文所用的术语“MIC-1类似物”或“MIC-1蛋白的类似物”是指这样的蛋白质或化合物，它是成熟MIC-1蛋白(SEQ ID NO：1)的变体。在一方面，MIC-1类似物为成熟MIC-1蛋白(SEQ ID NO：1)的功能变体。在本发明的一方面，MIC-1类似物表现出与天然MIC-1(SEQID NO：1)有至少85％、90％或95％的序列同一性。
在本发明的另一方面，相对于人天然MIC-1(SEQ ID NO：1)，MIC-1类似物包含少于17个氨基酸修饰(置换、缺失、添加(包括插入)及其任何组合)。作为测定两种类似物之间序列同一性的方法的一个例子，比对His6Asp MIC-1和天然MIC-1这两种肽。His6Asp MIC-1类似物相对于天然MIC-1的序列同一性通过将减去比对的不同残基数目而得到的相同残基数目再除以天然MIC-1中的残基总数而得出。因此，在所述例子中，序列同一性为(112-1)/112。
在本申请中通篇使用的术语“氨基酸修饰”以如下含义使用：与天然MIC-1(SEQ IDNO：1)相比，对氨基酸的修饰。该修饰可以是氨基酸的缺失、氨基酸的添加、将一个氨基酸置换为另一氨基酸或共价连接至该肽的氨基酸的取代基的结果。
置换。在一方面，氨基酸可通过保守置换来取代。如本文所用的术语“保守置换”表示一个或多个氨基酸被具有类似生物物理学性质的另一残基代替。实例包括具有类似特性的氨基酸残基的置换，例如小氨基酸、酸性氨基酸、极性氨基酸、碱性氨基酸、疏水性氨基酸和芳香族氨基酸的置换。
在一方面，MIC-1类似物可包含一个或多个非天然和/或非氨基酸例如氨基酸模拟物向MIC-1序列的置换。
缺失和截短。在一方面，本发明的MIC-1类似物可以单独地或与一个或多个插入或置换相组合地，从人MIC-1的氨基酸序列中缺失一个或多个氨基酸残基。
插入。在一方面，本发明的MIC-1类似物可以单独地或与一个或多个缺失和/或置换相组合地，具有插入到人MIC-1的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基。
在一方面，本发明的MIC-1类似物可包含一个或多个非天然氨基酸和/或非氨基酸向MIC-1序列中的插入。
MIC-1类似物可参考i)成熟MIC-1蛋白中与改变的氨基酸残基相对应的氨基酸残基的编号(即天然MIC-1中的相应位置)以及参考ii)实际改变来描述。换言之，MIC-1类似物为这样的MIC-1蛋白，其中当与天然MIC-1(SEQ ID NO：1)相比时，许多氨基酸残基已经改变。这些改变可独立地代表一个或多个氨基酸置换、添加和/或缺失。
以下是合适的类似物命名法的非限制性实例。His6Asp MIC-1表示人天然MIC-1的类似物，其中第6位的天然存在的组氨酸已被天冬氨酸置换。
从以上实例可以明显看出，氨基酸残基可通过其全称、其单字母代码和/或其三字母代码来确定。这三种方式完全等效。
例如在MIC-1蛋白的语境中所用的术语“蛋白”是指包含一系列通过酰胺(或肽)键互连的氨基酸的化合物。
氨基酸是含有胺基团和羧酸基团以及可选的一个或多个通常被称为侧链的额外基团的分子。
术语“氨基酸”包括编码(或蛋白型(proteinogenic)或天然)氨基酸(其中有20种标准氨基酸)以及非编码(或非蛋白型或非天然)氨基酸。编码氨基酸是自然地并入蛋白质中的氨基酸。标准氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸。非编码氨基酸或者不存在于蛋白质中，或者不通过标准细胞机制产生(例如，其可经历翻译后修饰)。在下文中，未说明其光学异构体的MIC-1蛋白的所有氨基酸应被理解为意指L-异构体(除非另有说明)。
α-1-抗胰蛋白酶
本发明涉及α-1-抗胰蛋白酶(A1AT)作为MIC-1的融合配偶体的用途。A1AT是一种分子大小为394个氨基酸并且具有高度有序的球状结构的蛋白酶抑制剂。由于存在三个N-连接的糖基化位点，A1AT表现出不同的糖形，并且这赋予该蛋白质天然存在的异质性。已经检测到A1AT的若干多态变体，其中一些不影响生物活性，而另一些则损害A1AT的功能，从而导致人类疾病。正常非致病性变体的一个实例是Val213Ala。致病变体的一个实例是Glu342Lys。A1AT的主要功能是平衡肺中的嗜中性粒细胞-蛋白酶的作用，例如，在存在炎症时由嗜中性粒细胞产生的嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的作用。A1AT已用于重度肺气肿的替代疗法。因此，单独用A1AT治疗已得到充分证明，并且因融合蛋白的野生型A1AT部分所致的毒理学事件可得到限制。作为本发明的一部分，A1AT作为MIC-1的融合配偶体进行评价，并且探索A1AT与MIC-1之间的连接体区域的结构/生物物理学变化。
已充分证明，当与治疗性蛋白质的N端或C端融合时，融合配偶体如人血清白蛋白(HSA)或Fc域(人IgG的恒定域)可延长血浆半衰期。众所周知的用于延长血浆半衰期的融合配偶体，如HSA和Fc，具有可达3周持续时间的极长半衰期，而A1AT具有约6天的血浆半衰期。A1AT不结合Fc新生受体，从而不允许从内体再循环，因此当用作融合配偶体时，最有可能赋予MIC-1较短的血浆半衰期。
将大融合配偶体添加至治疗性蛋白质可能存在问题，因为该策略可产生不稳定的融合蛋白，其在下游加工中难以处理。因此，重要的参数是表达可行性、融合蛋白稳定性、保持生物活性以及总生产成本。
包含感兴趣的治疗性蛋白质的重组A1AT蛋白可以如下获得：通过遗传操作，使得编码A1AT或其片段的DNA与编码治疗性蛋白质的DNA相连接。随后用在适当质粒上编码的融合核苷酸序列转化或转染合适的表达宿主以便表达该融合蛋白。据认为，作为融合配偶体的人A1AT通过能抑制肾清除率并且允许分子更长时间地存在于循环中的显著大小增加来延长治疗性蛋白质的血浆半衰期。
可以设计A1AT的功能变体，其具有与野生型A1AT相同的血浆半衰期延长益处(截短的和/或氨基酸置换的功能变体)。由于新A1AT变体可以以有利的方式改变融合配偶体的性质，因此新A1AT变体的设计可能是有益的。天然A1AT包括许多糖形。就在表达宿主中重组生成同源融合蛋白产物而言，去除该分子中的一些糖基化位点可能是有利的。
A1AT还在位置232处含有游离Cys，这可能导致聚集问题并影响该分子的生物物理学稳定性，但其可通过氨基酸置换而去除。
A1AT是生物活性蛋白酶抑制剂，其主要功能是平衡肺中的嗜中性粒细胞-蛋白酶的作用，例如，在存在炎症时由嗜中性粒细胞产生的嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的作用。尽管该生物活性对融合蛋白而言可能是优点，但如果A1AT的生物效应干扰MIC-1融合蛋白的所需药理学性质，则也可能希望去除该活性。这可通过以多种方式诱变A1AT中的反应性位点环来实现，该诱变保持与生产可行性、稳定性和延长效应相关的优点，但防止潜在的A1AT聚合物形成。也可能希望置换可导致重组生产困难的氨基酸残基，其非限制性实例是易于氧化的甲硫氨酸残基和单个Cys232。
野生型成熟人A1AT的序列以SEQ ID NO：2的形式包括在本文中，并且该序列在Uniprot数据库中注释为登录号P01009。本发明提供人A1AT融合蛋白，其包含生物活性MIC-1蛋白或其变体和人A1AT的生物活性和/或治疗活性片段或变体，或备选地由生物活性MIC-1蛋白或其变体和人A1AT的生物活性和/或治疗活性片段或变体组成。在一方面，本发明提供A1AT融合蛋白，其包含成熟天然MIC-1和成熟天然人A1AT，或备选地由成熟天然MIC-1和成熟天然人A1AT组成。
如本文所用的“功能变体”意指某种蛋白质的化学变体，其保留与原始蛋白质基本相同的功能。
融合蛋白
如本文所用的“融合蛋白”意欲表示由包含至少两个基因的核苷酸序列的核酸分子所表达的杂合蛋白。在一方面，本发明的融合蛋白包含作为融合配偶体与具有药学上有意义的活性的天然MIC-1相融合的人A1AT。融合蛋白通常用于改善治疗性蛋白质的重组表达或稳定性，以及用于改善这类蛋白质从细胞培养物中的回收和纯化等。融合蛋白可包含人工序列，例如连接体序列。
如本文所用的“融合配偶体”意欲表示这样的蛋白质，它是融合蛋白的一部分，即被融合蛋白所包含的至少两种蛋白质之一。
在本发明的一个实施方案中，融合配偶体包含近似分子量为52kDa的A1AT(SEQ IDNO：2)或其功能变体，其通过由不同长度、电荷和/或结构基序的氨基酸序列组成的域间连接体区可操作地连接至分子量约为12kDa的MIC-1(SEQ ID NO：1)或其功能变体的N端。
如本文所用的“融合标签”意欲表示这样的蛋白质序列，它是融合蛋白的一部分，即被融合蛋白所包含的至少两种蛋白质之一，并且包含改善融合蛋白的表达、溶解或纯化的序列，例如6X组氨酸标签(诸如His6)或增溶域(诸如巯基：二硫键互换蛋白DsbC(DsbC)、麦芽糖结合蛋白(MBP)或硫氧还蛋白(Trx))。
在本发明的一个方面，大小约为60kDa的NH2-A1AT-连接体-MIC-1-COOH的单体经由两个MIC-1分子之间的链间二硫桥而同型二聚化为天然分子，以形成分子量约为120kDa的活性A1AT-MIC-1融合蛋白(描绘为图1中的示意图)。
肽连接体
如本文所用的术语“肽连接体”意欲表示一般用来促进融合蛋白的功能、折叠或表达的氨基酸序列。本领域已知，以融合蛋白形式存在的两种蛋白质可以与彼此的功能活性相互作用，这种相互作用通常可以通过在这两个蛋白质序列之间插入连接体来消除或减少。
融合蛋白中包含的MIC-1蛋白向其推定受体的不同暴露、血浆半衰期或总体融合蛋白稳定性可受到该融合蛋白的连接体序列/结构差异的影响。
来自本发明的连接体被设计为具有不同的预测生物物理学或结构性质，包括连接体长度的变化(连接体中氨基酸数目的变化)，和预测的二级结构，如α-螺旋结构、刚性结构或柔性、无规卷曲结构或电荷，或上述的组合，例如，连接体的柔性N端部分或连接体的刚性N端部分与α-螺旋或刚性连接体组合。本发明包括含有位于连接体中段或连接体N端的1-4个相邻Pro残基的连接体的组合，这由于脯氨酸的构象刚性而影响邻近Pro残基的区域中的二级结构。A1AT的结构表明，C端与蛋白质的核心骨架结构非常靠近。连接体长度可通过改变由附接至生物活性MIC-1域的融合配偶体所提供的空间位阻的可能性来影响A1AT与MIC-1域之间的潜在相互作用。该空间位阻可影响融合蛋白单体的两个域的正确折叠、二聚体形成，或MIC-1部分与推定受体的相互作用。
功能性质
生物活性——体内药理学
在一方面，本发明的化合物在体内是有效的，它可以如本领域所知在任何合适的动物模型中以及在临床试验中测定。
非肥胖型Sprague Dawley大鼠是合适的动物模型的一个实例，并且可以在这种大鼠体内测定食物摄入的变化，例如如实施例2所述。
在一方面，在非肥胖型Sprague Dawley大鼠中，本发明的化合物抑制体内食物摄入。
作为一个例子，在本发明的特定方面，最大功效，即历经7天记录的24小时食物摄入的最大显著(p＜0.10)减少，应至少为10％，或至少15％。
作为一个例子，在本发明的特定方面，累积功效，即与媒介物(vehicle)相比的24小时食物摄入的显著(p＜0.10)减少的总和，应至少为10％，或至少30％。
生物物理学性质
在一方面，本发明的化合物具有良好的生物物理学性质。这些性质包括但不限于物理稳定性和/或溶解度。这些和其他生物物理学性质可使用蛋白质化学领域已知的标准方法来测量。在特定的实施方案中，这些性质与天然MIC-1(SEQ ID NO：1)相比得到改善。融合蛋白与天然MIC-1相比提高的生物物理学稳定性可至少部分地是由于融合配偶体的稳定效应。
生产方法
融合蛋白，诸如本发明的融合蛋白，可借助于本领域技术人员已知的重组蛋白技术而产生。通常，将编码感兴趣的蛋白质或其功能变体的核酸序列修饰为编码所需的融合蛋白。该修饰包括编码待表达为融合蛋白的两种或更多种蛋白质的核酸序列的符合读框的融合。这样的融合蛋白可具有或不具有连接肽以及融合至融合标签例如组氨酸标签(如His6)或增溶域(如DsbC、MBP或Trx)的融合蛋白。随后将这种修饰的序列插入到表达载体中，该表达载体继而转化或转染至表达宿主细胞中。
编码融合蛋白的核酸构建体可适当地为基因组、cDNA或合成来源的。通过公知的技术修饰遗传密码来实现氨基酸序列的改变。
通常将编码融合蛋白的DNA序列插入到重组载体中，该载体可以是可方便地经历重组DNA程序的任何载体，并且载体的选择通常依赖于其将被引入的宿主细胞。因此，该载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒。或者，该载体可以是当引入宿主细胞中时被整合至宿主细胞基因组中并且随同其已整合至的染色体一起复制的载体。
所述载体优选为表达载体，其中编码融合蛋白的DNA序列可操作地连接至DNA转录所需的附加区段。术语“可操作地连接”表示这些区段被排列为使得它们共同为了其预期目的而起作用，例如转录在启动子中开始，且通过编码多肽的DNA序列继续进行，直至其在终止子内终止。
因此，用于表达融合蛋白的表达载体将包含能够启动并引导克隆基因或eDNA的转录的启动子。该启动子可以是任何DNA序列，该DNA序列在所选宿主细胞中显示转录活性，并且可衍生自编码与宿主细胞同源或异源的蛋白质的基因。
另外，用于表达融合蛋白的表达载体还将包含终止序列，即被宿主细胞识别以终止转录的序列。终止序列可操作地连接至编码多肽的核酸序列的3’端。在所选宿主细胞中具有功能的任何终止子可用于本发明。
融合蛋白的表达可针对在宿主细胞的胞质溶胶中的细胞内表达或被引导至分泌途径中以便细胞外表达至生长培养基中。
细胞内表达是默认途径且需要具有如下DNA序列的表达载体，该DNA序列包含启动子，随后是编码融合蛋白的DNA序列，随后是终止子。
为了将融合蛋白引导至宿主细胞的分泌途径中，需要分泌信号序列(也称为信号肽或前序列)作为该融合蛋白的N端延伸。编码信号肽的DNA序列在正确的读框中连接至编码该融合蛋白的DNA序列的5’末端。信号肽可以通常与蛋白质相关联，或者可以来自编码另一分泌性蛋白质的基因。
用来分别连接编码融合蛋白的DNA序列、启动子、终止子和/或分泌信号序列，以及用来将它们插入含有复制所必需的信息的适当载体中的程序是本领域技术人员公知的(参见，例如，Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor，New York，1989)。
引入编码融合蛋白的DNA序列的宿主细胞可以是能够细胞内或细胞外表达该融合蛋白的任何细胞。融合蛋白可通过在允许表达该融合蛋白的条件下在合适的营养培养基中培养含有编码该融合蛋白的DNA序列且能够表达该融合蛋白的宿主细胞而产生。适合于表达融合蛋白的宿主细胞的非限制性实例为：大肠杆菌(Escherichia coli)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)以及人胚肾(HEK)、幼仓鼠肾(BHK)或中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。若需要翻译后修饰，则合适的宿主细胞包括酵母、真菌、昆虫和高等真核细胞如哺乳动物细胞。
一旦融合蛋白已经在宿主生物体中表达，其可通过常规技术回收并纯化至所需纯度。这类常规回收和纯化技术的非限制性实例是离心、溶解、过滤、沉淀、离子交换色谱法、固定化金属亲和色谱法(IMAC)、反相高效液相色谱法(RP-HPLC)、凝胶过滤和冷冻干燥。
融合蛋白的重组表达和纯化的实例可见于例如Cordingley等人，J.Virol.1989，63，pp5037-5045，Birch等人，Protein Expr Purif.，1995，6，pp609-618和WO2008/043847中。
融合蛋白的微生物表达和纯化的实例可见于例如Chich等人，Anal.Biochem，1995，224，pp 245-249和Xin等人，Protein Expr.Purif.2002，24，pp530-538。
在实验部分中包括制备多种本发明化合物的方法的具体实例。
给药方式
除非另有说明或与上下文明显矛盾，否则术语“治疗”意在包括预防和最小化所提及的疾病、病症或病状(即，“治疗”是指预防性和治疗性施用本发明化合物或包含本发明化合物的组合物)。
给药途径可以是有效地将本发明化合物输送至身体中的所需或适当位置的任何途径，诸如肠胃外，例如皮下、肌肉内或静脉内途径。或者，可口服、经肺、经直肠、经皮、经颊、舌下或经鼻施用本发明化合物。
与熟悉肥胖症和相关病症的治疗的医师协商决定待施用的本发明化合物的量，确定本发明化合物的给药频率，以及选择哪种或哪些本发明化合物任选地与另一药学活性剂一起施用。
药物组合物
包含本发明化合物或其药学上可接受的盐、酰胺或酯和药学上可接受的赋形剂的药物组合物可以如本领域已知的那样制备。
术语“赋形剂”宽泛地指除活性治疗成分以外的任何组分。赋形剂可以是惰性物质、无活性物质和/或非医药活性物质。
赋形剂可用于各种目的，例如作为载体、媒介物、稀释剂、片剂助剂和/或用来改善活性物质的给药和/或吸收。
药学活性成分与各种赋形剂的配制是本领域已知的，参见例如Remington：TheScience and Practice of Pharmacy(例如第19版(1995)和任何后续版本)。
术语“物理稳定性”是指多肽由于暴露于热-机械应力和/或与去稳定界面和表面(诸如疏水性表面)相互作用而形成无生物活性和/或不溶的聚集物的趋势。可在不同温度下暴露于机械/物理应力(例如搅动)不同的时间段之后，借助于目测和/或通过浊度测量来评估水性多肽制剂的物理稳定性。或者，可使用多肽的构象状态的光谱剂或探针例如硫代黄素T或“疏水贴片”探针来评估物理稳定性。
术语“化学稳定性”是指多肽结构的化学(特别是共价的)变化，其导致形成相比于完整多肽可能具有降低的生物效能和/或提高的免疫原性效应的化学降解产物。可通过在暴露于不同环境条件之后的多个时间点测量化学降解产物的量，例如通过SEC-HPLC和/或RP-HPLC，来评估化学稳定性。
联合治疗
用根据本发明的化合物进行的治疗还可以联合一种或多种药学活性物质，例如选自抗肥胖剂、食欲调节剂以及用于治疗和/或预防由肥胖症引起或与肥胖症相关的并发症和病症的药剂。
药物适应证
在一方面，本发明涉及用作药物的本发明化合物。
在特定的实施方案中，本发明的化合物可用于以下医学治疗：
(i)例如通过减少食物摄入、减轻体重、抑制食欲和诱导饱腹感来预防和/或治疗饮食失调，如肥胖症。
(ii)预防和/或治疗高血糖症和/或葡萄糖耐量减低。
具体实施方案
通过本发明的以下非限制性实施方案进一步描述本发明：
1.包含式(I)融合蛋白的化合物：
A-B-C (I)，
其中
A为人A1AT或其功能变体；
B为肽连接体，其中该肽连接体的长度为10至100个氨基酸；且
C为MIC-1蛋白或其类似物，并且
其中A1AT或其功能变体的C端融合至该肽连接体的N端，且该肽连接体的C端融合至该MIC-1蛋白或其类似物的N端。
2.根据实施方案1的化合物，其中所述肽连接体的长度为25-100、25-50或30-50个氨基酸。
3.根据实施方案1-2的化合物，其中所述肽连接体包含氨基酸序列[X-Ym]n，其中X为Asp或Glu；Y为Ala；m为2至4；且n至少为5。
4.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中所述化合物为两个式(I)融合蛋白的同型二聚体：
A-B-C (I)
其通过两个MIC-1蛋白或其类似物之间的链间二硫桥形成。
5.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中X为Asp。
6.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中X为Glu。
7.根据实施方案3-6的化合物，其中m为2-3且n为5-12。
8.根据实施方案3-7的化合物，其中n为10。
9.根据实施方案3-7的化合物，其中n为12。
10.根据前述实施方案中任一项的化合物，其在所述连接体中包含Pro残基。
11.根据前述实施方案中任一项的化合物，其在所述连接体中包含1-4个Pro残基。
12.根据实施方案11的化合物，其在所述连接体中包含4个Pro残基。
13.根据实施方案11的化合物，其在所述连接体中包含3个Pro残基。
14.根据实施方案11的化合物，其在所述连接体中包含2个Pro残基。
15.根据实施方案11的化合物，其在所述连接体中包含1个Pro残基。
16.根据实施方案10-15的化合物，其中所述Pro残基位于所述连接体的N端。
17.根据实施方案10-15的化合物，其中所述Pro残基不位于所述连接体的末端。
18.根据实施方案10-15的化合物，其在覆盖所述连接体长度约20％-30％的所述连接体的中段包含1-4个Pro残基。
19.根据实施方案18的化合物，其在覆盖所述连接体长度约20％-30％的所述连接体的中段包含2个Pro残基。
20.根据实施方案18的化合物，其在覆盖所述连接体长度约20％-30％的所述连接体的中段包含1个Pro残基。
21.根据实施方案10-15的化合物，其在覆盖所述连接体长度约10％-20％的所述连接体的中段包含1-4个Pro残基。
22.根据实施方案21的化合物，其在覆盖所述连接体长度约10％-20％的所述连接体的中段包含2个Pro残基。
23.根据实施方案21的化合物，其在覆盖所述连接体长度约10％-20％的所述连接体的中段包含1个Pro残基。
24.根据实施方案10-15的化合物，其在覆盖所述连接体长度约5％-10％的所述连接体的中段包含1-4个Pro残基。
25.根据实施方案24的化合物，其在覆盖所述连接体长度约5％-10％的所述连接体的中段包含2个Pro残基。
26.根据实施方案24的化合物，其在覆盖所述连接体长度约5％-10％的所述连接体的中段包含1个Pro残基。
27.根据实施方案1-9的化合物，其中所述肽连接体包含EAAEAAEAAEAAEAAEAAEAAEAAEAAEAAEE(SEQ ID NO：8)。
28.根据实施方案1-9的化合物，其中所述肽连接体包含GGSSEAAEAAEAAEAAEAAEAAEAAEAAEAAEAAEE(SEQ ID NO：9)。
29.根据实施方案1-9的化合物，其中所述肽连接体包含PPPPEAAEAAEAAEAAEAAEAAEAAEAAEAAEAAEE(SEQ ID NO：10)。
30.根据实施方案1-9的化合物，其中所述肽连接体包含PPPEAAEAAEAAEAAEAAEAAEAAEAAEAAEAAEE(SEQ ID NO：13)。
31.根据实施方案1-9的化合物，其中所述肽连接体包含PPEAAEAAEAAEAAEAAEAAEAAEAAEAAEAAEE(SEQ ID NO：14)。
32.根据实施方案1-9的化合物，其中所述肽连接体包含EAAEAAEAAEAAEAAEAAEPEAAEAAEAAEAAEAAEAAE(SEQ ID NO：15)。
33.根据实施方案1-9的化合物，其中所述肽连接体包含EAAEAAEAAEAAEAAEAAEPPEAAEAAEAAEAAEAAEAAE(SEQ ID NO：16)。
34.根据实施方案1-9的化合物，其中所述肽连接体包含EAAAEAAAEAAAEAAAEAAAEAAAEAAAEE(SEQ ID NO：17)。
35.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中C为表现出与天然MIC-1(SEQ IDNO：1)有至少85％序列同一性的MIC-1类似物。
36.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中C为表现出与天然MIC-1(SEQ IDNO：1)有至少90％序列同一性的MIC-1类似物。
37.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中C为表现出与天然MIC-1(SEQ IDNO：1)有至少95％序列同一性的MIC-1类似物。
38.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中C为与天然MIC-1(SEQ ID NO：1)相比具有最多17个氨基酸修饰的MIC-1类似物。
39.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中C为与天然MIC-1(SEQ ID NO：1)相比具有最多11个氨基酸修饰的MIC-1类似物。
40.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中C为与天然MIC-1(SEQ ID NO：1)相比具有最多5个氨基酸修饰的MIC-1类似物。
41.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中C为其中Asn3被Glu置换的MIC-1类似物(SEQ ID NO：19)。
42.根据实施方案1-40的化合物，其中C为成熟人MIC-1(SEQ ID NO：1)。
43.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中A为表现出与野生型人A1AT(SEQID NO：2)有至少85％序列同一性的人A1AT功能变体。
44.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中A为表现出与野生型人A1AT(SEQID NO：2)有至少90％序列同一性的人A1AT功能变体。
45.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中A为表现出与野生型人A1AT(SEQID NO：2)有至少95％序列同一性的人A1AT功能变体。
46.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中A为在与野生型人A1AT(SEQ IDNO：2)的位置232相对应的位置处包含除半胱氨酸之外的另一种氨基酸的人A1AT功能变体。
47.根据实施方案1-45的化合物，其中A为在与野生型人A1AT(SEQ ID NO：2)的位置232相对应的位置处包含丙氨酸或丝氨酸的人A1AT功能变体。
48.根据实施方案1-45的化合物，其中A为在与野生型人A1AT(SEQ ID NO：2)的位置232相对应的位置处包含丙氨酸的人A1AT功能变体。
49.根据实施方案1-45的化合物，其中A为SEQ ID NO：2的野生型人A1AT。
50.根据前述实施方案中任一项的化合物，其进一步包含融合配偶体。
51.根据前述实施方案中任一项的化合物，其进一步包含N端融合配偶体。
52.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中所述化合物为MIC-1激动剂。
53.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中所述化合物能够减少食物摄入。
54.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中如在非肥胖型Sprague Dawley大鼠中的单剂量研究中所测定的，所述化合物具有减少食物摄入的体内效果。
55.根据权利要求1的化合物，其中A为SEQ ID NO：2的人A1AT，B为SEQ ID NO：15的肽连接体，且C为SEQ ID NO：1的天然人MIC-1。
56.根据权利要求1的化合物，其中A为SEQ ID NO：2的人A1AT，B为SEQ ID NO：16的肽连接体，且C为SEQ ID NO：1的天然人MIC-1。
57.根据权利要求1的化合物，其中A为SEQ ID NO：20的人A1AT，B为SEQ ID NO：15的肽连接体，且C为SEQ ID NO：19的天然人MIC-1。
58.根据权利要求1的化合物，其中A为SEQ ID NO：2的人A1AT，B为SEQ ID NO：17的肽连接体，且C为SEQ ID NO：1的天然人MIC-1。
59.根据权利要求1的化合物，其由His标记的式(I)融合蛋白组成，其中该His标签为SEQ ID NO：3的His标签，A为SEQ ID NO：2的人A1AT，B为SEQ ID NO：15的肽连接体，且C为SEQ ID NO：1的天然人MIC-1。
60.根据权利要求1的化合物，其由His标记的式(I)融合蛋白组成，其中该His标签为SEQ ID NO：3的His标签，A为SEQ ID NO：2的人A1AT，B为SEQ ID NO：16的肽连接体，且C为SEQ ID NO：1的天然人MIC-1。
61.根据权利要求1的化合物，其由His标记的式(I)融合蛋白组成，其中该His标签为SEQ ID NO：3的His标签，A为SEQ ID NO：20的人A1AT，B为SEQ ID NO：15的肽连接体，且C为SEQ ID NO：19的天然人MIC-1。
62.根据权利要求1的化合物，其由His标记的式(I)融合蛋白组成，其中该His标签为SEQ ID NO：3的His标签，A为SEQ ID NO：2的人A1AT，B为SEQ ID NO：17的肽连接体，且C为SEQ ID NO：1的天然人MIC-1。
63.包含根据实施方案1-62中任一项的化合物或其药学上可接受的盐、酰胺或酯以及一种或多种药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
64.根据实施方案1-62中任一项的化合物，其用作药物。
65.根据实施方案1-62中任一项的化合物，其用于例如通过减少食物摄入、减轻体重、抑制食欲和诱导饱腹感来预防和/或治疗饮食失调，如肥胖症。
66.根据实施方案1-62中任一项的化合物，其用于预防和/或治疗肥胖症。
67.根据实施方案1-62中任一项的化合物在制备用于例如通过减少食物摄入、减轻体重、抑制食欲和诱导饱腹感来治疗饮食失调如肥胖症的药物中的用途。
68.根据实施方案1-62中任一项的化合物在制备用于治疗肥胖症的药物中的用途。
69.例如通过施用药学活性量的根据实施方案1-62中任一项的化合物来减少食物摄入、减轻体重、抑制食欲和诱导饱腹感从而治疗或预防饮食失调如肥胖症的方法。
70.通过施用药学活性量的根据实施方案1-62中任一项的化合物来治疗或预防肥胖症的方法。
71.编码根据实施方案1-62中任一项的化合物的多核苷酸分子。
实施例
本实验部分开始于缩写列表，接着是包括本发明化合物的通用制备、纯化和表征方法的部分。随后是关于这些融合蛋白的活性和性质的实施例(标题为药理学方法的部分)。这些实施例用来说明本发明。
缩写列表
“主峰”是指纯化色谱图中具有以毫吸光度(milliabsorbance)为单位的最高UV强度且含有融合蛋白的峰。
HPLC为高效液相色谱法。
SDS-PAGE为十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。
IMAC为固定化金属亲和色谱法。
SEC为大小排阻色谱法。
MS为质谱法。
材料与方法
简而言之，融合蛋白的一般设计由3部分组成：N端的人A1AT、连接体区和C端的野生型MIC-1。适用于在哺乳动物细胞中表达的质粒骨架pTT5在本发明中使用，并且之前已经描述(Shi等人，Biochemistry 2005，44，15705-15714)。除了融合蛋白编码序列之外，所有质粒还编码在编码该融合蛋白N端部分的区域的直接上游的CD33分泌信号序列，从而允许重组融合蛋白分泌到生长培养基中。为了促进蛋白质纯化，所有构建体都在融合蛋白的N端含有6xHis-标签(His6)。用上述融合配偶体测试各种不同的氨基酸连接体，以观察它们是否影响蛋白质的总产率。
通过现有技术的重组蛋白技术方法制备融合蛋白。使用相关序列的基于基因合成的策略并向pTT5哺乳动物表达载体(Genscript Inc)中亚克隆而获得编码融合蛋白的质粒，并且使用人胚肾细胞(HEK)(Expi293F，Invitrogen)作为表达宿主系统，以小规模的体积来初始评估表达产率。将表达的融合蛋白在摇瓶中放大，并使用两步自动色谱法进行纯化，该两步自动色谱法由在HisTrap Excel柱上捕获及随后在Superdex 200柱上进行大小排阻色谱法(SEC)组成。合并级分以避免被主峰之前洗脱的与产物相关的杂质污染。
下面更详细地描述这些方法。
通用制备方法
融合构建体的小规模筛选和表达
每个构建体的表达水平如下测定：将质粒瞬时转染至在Expi293TM表达培养基(Life TechnologiesTM#A1435101)中生长的2ml悬浮培养物中的人胚肾(HEK)细胞(Expi293FTM，Life TechnologiesTM#A14527)中。expi293细胞在37℃、8％CO2和80％湿度下，在一次性24孔多孔区组(Axygen，#P-DW-10ml-24-C-S)中生长。在Infors Multitron Cell培养箱中振摇速度为200rpm，轨道行程(orbital throw)为50mm。对于每次转染，按照制造商的说明书，使用在100μl转染培养基( I(1x)+GlutaMAXTM-I低血清培养基，Life technologiesTM#51985-026)中的2μg DNA和在转染培养基中的5.4μlExpiFectamineTM 293试剂(ExpiFectamineTM293转染试剂盒，Life technologiesTM#A14525)。在转染后16-20小时，向培养物中补充10μl增强剂1和100μl增强剂2(ExpiFectamineTM 293转染试剂盒，Life technologiesTM#A14525)。在转染后四至六天，通过在4000g下离心10分钟收集细胞培养物，并且澄清化的培养基用于蛋白质表达的进一步分析。
每种融合蛋白的生产可行性通过使用固定化金属亲和色谱法(IMAC)步骤的小规模纯化筛选来评估。纯化的蛋白质溶液如下显示：在不进行样品缩减的情况下，将样品在SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)凝胶(4-12％Bis-Tris midi蛋白质凝胶，26孔，Life TechnologiesTM#WG1403BOX)上运行，并且通过考马斯染色(Coomassie staining)(InstantBlueTM，Expedeon#ISBL1L)显示所得的蛋白质条带。使用该结果来确定每种构建体提供足以进行体内功效评估的蛋白质所需要的细胞培养物体积。
A1AT-MIC-1融合蛋白的扩大表达
将编码MIC-1融合蛋白的质粒转化至 Top10F′化学感受态大肠杆菌细胞( Top10F′，Life TechnologiesTM#C303003，或者XL1-Blue感受态细胞，Agilent technologies，#200249)，集落在Amp/Carb选择性琼脂板上生长，并且用转化体接种液体Terrific Broth(TB)培养物。在生长过夜之后，沉淀的大肠杆菌细胞用于大规模质粒制备( Plasmid Mega试剂盒，#12381)。
如下进行瞬时表达：将在转染培养基(50ml/升细胞培养物)中的质粒DNA(1mg/升细胞培养物)添加至在转染培养基(50ml/升细胞培养物)中的ExpiFectamineTM 293试剂(2.7ml/升细胞培养物)，温育10至20分钟，随后将转染混合物添加至细胞培养物(expi293F细胞，3×106个细胞/ml)。在转染后16至20小时，向培养物中补充增强剂1(5ml/升细胞培养物)和增强剂2(50ml/升细胞培养物)。expi293细胞在37℃、8％CO2和80％湿度下，在1升一次性摇瓶(Coming#CLS431147)中生长。在Infors MultitronCell培养箱中振摇速度为110rpm，轨道行程为50mm。
在转染后约90-120小时，通过在4000g下离心10分钟收集培养物。在纯化之前通过0.22μM过滤器无菌过滤澄清化的培养基。
纯化
在离心并通过0.22μm过滤器过滤之后，通过每升上清液添加200mL His-结合缓冲液(300mM磷酸纳(NaP)，1.8M NaCl，60mM咪唑，pH 7.5)调节澄清化的上清液以用于IMAC纯化。
使用色谱系统，在1ml/分钟的低流速下将经调节的上清液加至在缓冲液A(50mM NaP，300mM NaCl，10mM咪唑，pH 7.5)中平衡的5ml HisTrap Excel柱(GE-Healthcare，Sweden)上，之后用洗涤缓冲液(50mM NaP，300mM NaCl，30mM咪唑，pH 7.5)洗脱低亲和力结合的杂质。结合的融合蛋白用100％缓冲液B(50mM NaP，300mM NaCl，300-500mM咪唑，pH 7.5)分步洗脱，并且使用UnicomTM软件的峰检测选项收集主峰，并使用制备型大小排阻色谱法(SEC)在1×PBS pH 7.4(Ampliqon)中在HiLoad Superdex 200 16/600PG柱(GE-Healthcare，Sweden)上进一步自动纯化。收集1.8ml级分，并使用预制4-12％疑胶(Life technologiesTM)通过非还原SDS-PAGE进行分析。简而言之，将样品与4×LDS(十二烷基硫酸锂)样品缓冲液混合。混合物在95℃下加热5分钟，然后加载SDS-PAGE凝胶。Novex plus2预染色蛋白质标准物(Life technologiesTM)在SDS-PAGE上在级分旁边运行以用于大小估计。按照制造商的说明书，使用InstantBlueTM染料(Expedeon，Cambridgeshire，UK)显示蛋白质。
通用检测和表征方法
MS分析
进行肽质量作图以验证正确的连接体序列，并使用本领域技术人员已知的方法进行。简而言之，使用取自“In solution tryptic digest and guanidation kit”，Pierceproduct nr.89895的方法使纯化的蛋白质经历酶消化。所使用的酶为胰蛋白酶或AspN。采用与Maxis ImpactTM ESI-Q-OTOF质谱仪(Bruker Daltonics)耦合的Thermo-DionexUltimate3000TM HPLC(Thermo Fisher Scientific)，并在温度45℃、流速0.2ml/min和0-90％乙腈/TFA梯度(其中溶剂由缓冲液A：0.1％TFA/99.9％水和缓冲液B：0.1％TFA/99.9％乙腈组成，为了分离肽而设计)下使用反相柱(Waters BEH300 C8 1.7μm 1.0×100)，获得肽质量。按照制造商的说明书，使用数据分析软件(Bruker Daltonics)提取肽的实验测定质量并使用Biotools软件(Biotools)使实验质量与由预期融合蛋白序列得出的计算质量相匹配，以此进行允许鉴定和验证融合蛋白中的正确连接体序列的肽质量作图。通常，将可变修饰设定为“氧化(M)”和“脲基甲基(C)”，并且将质量容差设定为20ppm且将MS/MS容差设定为50mmu。
使用与标准HPLC耦合的化学发光氮检测(CLND)测定蛋白质浓度。
实施例1：本发明化合物的表达和纯化
编码表1中示出的融合蛋白变体的不同质粒被设计为在A1AT与MIC-1之间的连接体序列上具有差异。通过公知的重组DNA技术方法(获自GenScript Inc.)产生质粒。连接体序列在表2中给出。
作为代表性实例，化合物5的大规模生产通过如材料与方法部分所述在Expi293F细胞中瞬时表达来进行。简而言之，将500μg质粒DNA添加至25ml的转染培养基中，并将1.35ml ExpiFectamineTM 293试剂添加至25ml 转染培养基中。合并两种溶液以形成转染混合物。在20分钟温育之后，将转染混合物添加至细胞密度为3×106个细胞/ml的500ml expi293F细胞培养物中。在转染后18小时，向培养物中补充2.5ml增强剂1和25ml增强剂2。在转染后五天，通过在4000g下离心10分钟收集培养物。在纯化之前通过0.22μM过滤器无菌过滤澄清化的培养基。
为了检验通过可变连接体将A1AT分子融合至MIC-1蛋白N端的体内效果，使用在材料部分中描述的方法纯化经表达的分子。使用与大小排阻耦合的自动固定化金属离子色谱法成功地纯化了化合物5。对SEC柱的总体积内的两个峰进行分级分离并分析。第一峰在该柱的外水体积(void)中洗脱，并且非还原SDS-PAGE确认了洗脱出的蛋白质的聚集状态。该主峰与聚集体峰部分重叠。因此，并非所有代表整个主峰的级分都被包括在合并池(pool)中。对合并的级分进行的非还原SDS-PAGE产生了作为约120kDa蛋白质而迁移的单一条带。
表1.本发明化合物的列表。该表中提及的化合物具有在N端的野生型A1AT(SEQ IDNO：2)或Cys232Ala A1AT(SEQ ID NO：20)，如氨基酸序列所示的居间连接体序列，以及在C端(SEQ ID NO：1)的野生型MIC-1序列(SEQ：ID NO：1)或野生型MIC-1的Asn3Glu类似物(SEQID NO：19)。所有构建体都包含N端His6标签(SEQ ID NO：3)，以便于IMAC纯化。包含化合物1-4以供比较。
表2.具有相应SEQ ID NO和氨基酸序列的肽连接体的列表。
表3.具有相应SEQ ID NO的MIC-1变体的列表。
SEQ ID NO MIC-1变体
SEQ ID NO：1 野生型人MIC-1(hMIC-1)
SEQ ID NO：19 Asn3Glu hMIC-1
表4.具有相应SEQ ID NO的α-1-抗胰蛋白酶(A1AT)变体的列表。
SEQ ID NO α-1-抗胰蛋白酶变体
SEQ ID NO：2 野生型A1AT
SEQ ID NO：20 Cys232Ala A1AT
药理学方法
实施例2：在瘦型Sprague Dawley大鼠中本发明融合蛋白对食物摄入的影响
本实施例的目的在于测试化合物的体内功效。
在9-11周龄的非肥胖型Sprague Dawley大鼠中测量本发明化合物的体内功效。给动物注射一次4nmol/kg体重的剂量。化合物在生理等张磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液(137mMNaCl；2.7mM KCl；10mM Na2HPO4；1.8mM KH2PO4)中皮下施用(1ml/kg)。通过自动食物监测系统(针对大鼠的HM2 BioDAQ或Feedwin系统Ellegaard A/S)测量食物摄入的变化。在大鼠进入HM2系统中之前，将芯片插入大鼠的背颈部区域中，以在该系统中进行监测。HM2系统中的大鼠每个笼子圈养三只。在Feedwin系统中，大鼠单独圈养。在BioDAQ系统中，每个笼子圈养两只大鼠，由分割物隔开。每种化合物均在n＝5只动物中测试。在实验前，使动物适应环境至少7天。所收集的数据(参见表5)被表示为从每天每个12小时黑暗期开始至下一个黑暗期所测量的每日食物摄入(24小时食物摄入)。通过从治疗组的平均每日食物摄入减去媒介物/PBS组的平均每日食物摄入来计算食物摄入响应于所施用化合物的每日变化。如果使用student′s t检验(双尾)p＜0.1，则将变化视为显著的。结果被表示为在任意给定的某天，食物摄入相对于媒介物的“最大减少”[百分比]；数据还被表示为食物摄入的“累积减少”，其为整个研究期间食物摄入的显著减少(p＜0.1)的总和[百分比]；数据还被表示为“效果持续时间”，其为食物摄入显著减少(p＜0.1)的天数。
化合物1-3对最大功效或累积食物摄入没有显示出任何显著的PD效果(表1，表5)。由于这三种连接体基于Gly和Ser残基，数据表明不同长度的典型柔性连接体(即使长达30aa以上)不产生A1AT-MIC-1的功能活性变体。此外，包含Pro和Thr残基的化合物4和9也不显示任何食物摄入的显著减少(表1，表5)。相反，化合物5在持续2天的24小时给药后显著减少了食物摄入，其最大功效为18％并且累积食物摄入为35％。化合物5、6和7在瘦型SD大鼠中单次给药4nmol/kg后24小时分别抑制食物摄入达18％、19％和15％(表1，表5)。包含7个Glu-Ala-Ala-Ala重复的化合物16也导致了显著的食物摄入减少。这些数据合起来说明，包含Glu和Ala残基重复的变体的这四种连接体导致A1AT和MIC-1的生物活性融合蛋白，其显著减少食物摄入，并在化合物16的情况下具有3天的延长持续时间效果。如果化合物5连接体的Glu残基被Gln残基替代(化合物17)，或者Glu/Ala重复的数目从10减少至6(化合物8)，则没有观察到对食物摄入的显著影响。这些数据合起来说明，本发明的A1AT-MIC-1融合蛋白必须含有基于Glu和Ala重复的氨基酸结构和该连接体的最小长度，以便在减少食物摄入方面变得生物有效(表1，表5)。
在含Glu/Ala重复的连接体的N端含有Pro残基的化合物10、11使食物摄入减少21％(最大功效)，而在含Glu/Ala重复的连接体的中部分别含有1个或2个Pro的化合物12和13使食物摄入减少28％和23％(最大功效)。数据表明，如果与含Glu/Ala重复的连接体组合，则相邻Pro残基的数目或其在连接体中的位置的变化可影响最大功效、累积功效以及对食物摄入效果的持续时间。相反，当N端的Pro残基与柔性的富Gly/Ser连接体组合时，没有观察到对食物摄入的显著效果(以化合物3与化合物7相比较来例证)。
化合物14和15的结果表明，本发明的有效连接体在与MIC-1和A1AT的功能变体组合时，仍可导致对食物摄入的显著影响，如以置换MIC-1中的Asn3(化合物14，表3)和A1AT中的Cys232(化合物15，表4)所例证的。
表5.在瘦型SD大鼠中，单一剂量(4nmol/kg)的A1AT-MIC-1类似物对每日食物摄入的影响。数据以3种方式表示：1)最大功效，其为历经7天记录的24小时食物摄入的最大显著(p＜0.10)减少；2)累积功效，其为与媒介物相比24小时食物摄入的显著(p＜0.10)减少的总和；和3)效果持续时间，其为与媒介物相比食物摄入显著(p＜0.1)减少的天数。包含化合物1-4以供比较。
化合物 最大功效 累积功效 效果持续时间
1 0 0 0
2 0 0 0
3 0 0 0
4 0 0 0
5 18 35 2
6 19 19 1
7 15 15 1
8 0 0 0
9 0 0 0
10 21 40 2
11 21 21 1
12 28 65 4
13 23 49 3
14 18 30 2
15 23 39 2
16 18 50 3
17 0 0 0
尽管己在本文中说明和描述了本发明的某些特征，但本领域普通技术人员现将会想到许多修改、替代、改变和等同物。因此，应当理解，所附权利要求意欲涵盖落入本发明的真实精神内的所有这类修改和改变。

Claims (15)

1.包含式(I)融合蛋白的化合物：
A-B-C (I)，
其中
A为人A1AT或其功能变体；
B为肽连接体，其中该肽连接体的长度为10至100个氨基酸，且
C为MIC-1蛋白或其类似物，并且
其中A1AT或其功能变体的C端融合至所述肽连接体的N端，且所述肽连接体的C端融合至所述MIC-1蛋白或其类似物的N端。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中所述肽连接体包含氨基酸序列[X-Ym]n，其中X为Asp或Glu；Y为Ala；m为2至4；且n至少为5。
3.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中X为Glu。
4.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中m为2至3并且n为5-12。
5.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中n为7-12。
6.根据权利要求2-5中任一项所述的化合物，其在所述肽连接体中包含1-4个Pro残基。
7.根据权利要求6所述的化合物，其在覆盖所述连接体长度约20％-30％的所述连接体的中段包含1-4个Pro残基。
8.根据权利要求6或7所述的化合物，其在所述肽连接体中包含2个Pro残基。
9.根据权利要求8所述的化合物，其在所述肽连接体中包含1个Pro残基。
10.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中C为表现出与天然MIC-1(SEQ IDNO：1)有至少85％序列同一性的MIC-1类似物。
11.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中A为表现出与野生型人A1AT(SEQID NO：2)有至少85％序列同一性的人A1AT功能变体。
12.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中所述肽连接体的长度为25至100个氨基酸。
13.包含根据权利要求1-12中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐、酰胺或酯以及一种或多种药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
14.根据权利要求1-12中任一项所述的化合物，其用作药物。
15.根据权利要求1-12中任一项所述的化合物，其用于例如通过减少食物摄入、减轻体重、抑制食欲和诱导饱腹感来预防和/或治疗饮食失调，如肥胖症。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10588980B2 (en) 2014-06-23 2020-03-17 Novartis Ag Fatty acids and their use in conjugation to biomolecules
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US11492390B2 (en) * 2017-04-02 2022-11-08 B. G. Negev Technologies And Applications Ltd., At Ben-Gurion University Mutant alpha-1-antitrypsin compositions and use thereof
WO2019237079A2 (en) * 2018-06-07 2019-12-12 Xiaolong Zhang Pharmaceutical composition containing fusion protein and use thereof
US20210340205A1 (en) 2018-08-10 2021-11-04 Novartis Ag Gfral extracellular domains and methods of use

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080095774A1 (en) * 2001-02-16 2008-04-24 Wyeth Agents and Methods for Specifically Blocking CD28-Mediated Signaling
JP5448338B2 (ja) * 2004-04-13 2014-03-19 セントビンセンツ ホスピタル シドニー リミテッド 食欲を調節する方法
KR101183262B1 (ko) * 2009-04-22 2012-09-14 (주)알테오젠 체내 지속성을 유지함으로 체내 반감기가 증가된 단백질 또는 펩티드 융합체, 및 이를 이용하여 체내 반감기를 증가시키는 방법
EP3683228A3 (en) * 2012-01-26 2020-07-29 Amgen Inc. Growth differentiation factor 15 (gdf-15) polypeptides
CA2899170C (en) * 2013-01-30 2022-08-02 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Compositions and methods of use in treating metabolic disorders

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