CN108367053A - 使用生长分化因子15(gdf-15)治疗或改善代谢性疾病的方法 - Google Patents

使用生长分化因子15(gdf-15)治疗或改善代谢性疾病的方法 Download PDF

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Abstract

本公开涉及治疗非酒精性脂肪肝病(NAFLD)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)以及终末期肝疾病、肝脂肪变性(脂肪肝)、肝纤维化、肝炎、肝硬化、原发性胆汁性肝硬变(PBC)和肝细胞癌(HCC)的方法，通过对需要的受试者施用GDF15蛋白或功能性变体、其突变体、融合体或缀合物和包含它们的药物组合物来进行。

Description

使用生长分化因子15(GDF-15)治疗或改善代谢性疾病的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2015年12月22日提交的美国临时申请号62/270,967的权益，其内容通过引用以完整的形式并入本文作为参考。
序列表
本申请包含序列表，该序列表以ASCII格式通过电子方式提交并且通过引用以完整的形式并入本文作为参考。2016年12月16日生成的所述ASCII拷贝称作PAT057168-WO-PCT_SL.txt并且大小为920,254字节。
领域
本发明涉及治疗非酒精性脂肪肝病(NAFLD)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)以及相关病症的方法，所述相关病症包括但不限于酒精性脂肪性肝炎(ASH)、终末期肝疾病、肝脂肪变性(脂肪肝)、肝纤维化、肝炎、肝硬化、原发性胆汁性肝硬变(primary biliarycirrhosis，PBC)和肝细胞癌(HCC)。
背景
非酒精性脂肪肝病(NAFLD)是影响美国多达每3-5个成人中有1个人和10个儿童中有1个人的疾病，并且指的是几乎不饮酒或不饮酒的人的肝脏中过量脂肪积累的情况。NAFLD最常见的形式是称为肝脂肪变性(脂肪肝)的非严重病症，其中脂肪在肝细胞中累积；尽管不是生理正常状态，但作为肝脂肪变性自身本身可能不损害肝脏。
NAFLD自身最常出现在患有称为“代谢综合征”的一组危险因素的个体中，所述危险因素的特征在于空腹血糖(FPG)升高，伴随或不伴随餐后血糖不耐受，超重或肥胖，高血脂如胆固醇和甘油三酯(TGs)和低的高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平以及高血压。并非所有的NAFLD患者都具有代谢综合征的所有表现。
认为肥胖是NAFLD的最常见原因，一些专家估计约三分之二的肥胖成年人和一半肥胖儿童可能具有肝脂肪变性。大多数具有NAFLD的个体没有症状和正常的体格检查(尽管肝脏可能会轻度肿大)；儿童可能会出现例如腹痛和疲劳这样的症状，并可能出现斑片状深色皮肤变色(黑棘皮症)。NAFLD的诊断通常首先在超重或肥胖者中疑似，发现他们在常规检测中出现其肝脏血液检测的轻度升高；NAFLD可以存在于正常的肝脏血液检测中，然而或者偶然在例如腹部超声或CT扫描这样的成像检查中检测到。它通过影像学研究证实，最常见的是肝脏超声或核磁共振成像(MRI)，并且排除其它原因。
一些患有NAFLD的人可能会发展为更严重的状况，称为非酒精性脂肪性肝炎(NASH)：大约2-5％的成年美国人和多达20％的肥胖者可能患有NASH。在NASH中，肝脏中的脂肪堆积与炎症和不同程度的疤痕相关。NASH是一种潜在的严重疾病，具有进展为终末期肝病、肝硬化和肝细胞癌的实质性风险。一些发展为肝硬化的患者有发生肝衰竭的危险，且可能最终需要肝移植。
NAFLD可以通过NAFLD活动评分(NAFLD Activity Score，NAS)与NASH区分开来，NAFLD活动评分(NAS)是用于肝脂肪变性(0至3)、小叶炎症(0至2)和肝细胞球囊化(0至2)的肝活组织检查的组织病理学评分的总和。NAS<3相当于NAFLD，3-4相当于临界NASH，且>5相当于NASH。该活检也对纤维化(0至4)评分。
目前没有批准用于预防或治疗NAFLD或NASH的药物。在NAFLD/NASH中已经尝试了许多药物干预措施，但有益性总体有限。
概述
本发明涉及治疗非酒精性脂肪肝病(NAFLD)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)以及相关病症的方法，该方法包括向有此需要的受试者施用有效量的本文所述的GDF15融合多肽或GDF15缀合物，例如GDF15脂肪酸缀合物(通常为药物组合物的形式)。在一些方面，本发明涉及对需要的受试者治疗非酒精性脂肪肝病(NAFLD)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)以及终末期肝疾病、肝脂肪变性(脂肪肝)、肝纤维化、肝炎、肝硬化、原发性胆汁性肝硬变(PBC)和肝细胞癌(HCC)的方法，该方法包括对有此需要的受试者施用有效量的如本文所述的GDF15融合多肽(通常为药物组合物的形式)。
在一些实施方案中，本发明的方法包含野生型GDF15全长蛋白的部分，例如具有NCBI参比序列号NP_004855.2并且由具有NCBI参比序列号NM_004864.2的多核苷酸序列编码，并且在这样的公开的专利申请中发表，例如WO97/00958，授权给St.VincentsHospital。作为非限制性实例，在一些实施方案中，本发明的方法包含成熟GDF15蛋白，即野生型GDF15全长蛋白的氨基酸残基198-308。在其他实施方案中，本发明的方法包含全长GDF15蛋白的较小片段、结构域和/或区。
在一些实施方案中，本发明的方法包含GDF15蛋白质序列的变体或突变形式，例如生物活性GDF15变体并且可以包括GDF15蛋白的截短形式(其中来自C-和/或N-末端区的残基可以被消除，由此缩短/截短该蛋白质)以及在所关注的位置处具有一个或多个点取代、缺失和/或位点特异性并入的氨基酸变体(例如具有保守氨基酸残基、具有非保守残基或非天然氨基酸残基，例如吡咯赖氨酸)。术语“变体”和“突变体”可以互换使用并且在本文中进一步定义。
在一些实施方案中，本发明的方法包含GDF15融合蛋白序列，例如Fc融合体或血清白蛋白(SA)融合体。术语“融合蛋白”、“融合多肽”和“融合体”可互换使用并且在本文中进一步定义。又在其他实施方案中，本发明的方法包含GDF15和脂肪酸的缀合物。所述缀合物和融合体预期可以延长GDF15部分的半寿期，还可以用作本文列出的病症的治疗剂。在一些实施方案中，用于本发明方法的缀合物和融合体包含野生型GDF15；在其他实施方案中，所述缀合物和融合体包含与野生型全长或成熟蛋白相关的变体GDF15序列。
所述GDF15变体、缀合物和融合体的有代表性的实例描述在例如PCT公开号WO13/148117和WO14/120619和全部相关同族专利中(包括但不限于美国专利US 9,161,966B1)；和PCT公开号WO2012/138919、WO13/113008和WO15/017710和所有相关同族专利中。在所有情况下，所述GDF15变体、缀合物和融合体的有代表性的实例可以在美国和其余世界中的任何相关申请、授权专利和上述同族专利号中找到。上述以及任何相关申请、授权专利和同族专利号的内容通过引用以完整的形式并入本文作为参考。具体实施方案可以在下表中找到(表1)：
表1：GDF15变体和融合蛋白
在一些实施方案中，本发明的方法包含GDF15融合蛋白，例如Fc融合体或白蛋白融合体。所述融合体可以包含野生型GDF15或其变体。在一些实施方案中，本发明的方法包含多肽，其任选地通过接头融合至异源氨基酸序列，所述接头例如GS(SEQ ID NO：313)或(GGGGS)n(SEQ ID NO:303)，其中n是1-约20且优选1、2、3或4。
所述异源氨基酸序列可以为IgG恒定结构域或其片段(例如Fc区)、人血清白蛋白(HSA)或白蛋白结合多肽。在一些实施方案中，所述异源氨基酸序列来源于人IgG4Fc区，这归因于其结合Fcγ受体和互补因子的能力相对于其它IgG亚型降低。这类方法可以包含所述融合多肽的多聚体。在一些实施方案中，本发明的方法包含融合蛋白，其中异源氨基酸序列(例如HSA、Fc等)与如本文所述的GDF15蛋白或变体的氨基末端融合；在其他实施方案中，所述融合出现在GDF15蛋白或变体的羧基末端上。
在一些实施方案中，本发明的方法包含GDF15缀合物，如GDF15脂肪酸(FA)缀合物，例如通过接头共价连接至脂肪酸部分的GDF15野生型蛋白(全长、成熟或其片段或截短形式)或变体。在具体的实施方案中，本文提供的方法包括施用GDF15缀合物或GDF15变体缀合物，其不为脂肪酸缀合物。在具体的实施方案中，本文提供的方法包括施用GDF15脂肪酸缀合物或GDF15变体脂肪酸缀合物，其中脂肪酸部分不是肉豆蔻酸且不是如本文所述的式A1、A2和A3的脂肪酸。
在一些实施方案中，本发明的方法包含GDF15融合蛋白或缀合物，它们共价连接至一种多种聚合物，例如聚乙二醇(PEG)或聚唾液酸。PEG基团按照这种方式连接，以便增强和/或不干扰本发明的融合蛋白或缀合物的组成部分的生物功能。
本发明还提供了使用药物组合物治疗的方法，所述药物组合物包含本文公开的GDF15融合蛋白或GDF15缀合物和药学上可接受的制剂物质。这类药物组合物可以用于治疗非酒精性脂肪肝病(NAFLD)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)以及终末期肝疾病、肝脂肪变性(脂肪肝)、肝纤维化、肝炎、肝硬化、原发性胆汁性肝硬变(PBC)和肝细胞癌(HCC)中的一种或多种疾病的方法中，且所述方法包括对有此需要的人患者施用本发明的药物组合物。
本发明还提供了使用药物组合物治疗的方法，所述药物组合物包含本文公开的GDF15融合蛋白或GDF15缀合物和药学上可接受的制剂物质。这类药物组合物可以用于治疗非酒精性脂肪肝病(NAFLD)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)以及终末期肝疾病、肝脂肪变性(脂肪肝)、肝纤维化、肝炎、肝硬化、原发性胆汁性肝硬变(PBC)和肝细胞癌(HCC)中的一种或多种疾病的方法中，且所述方法包括对有此需要的人患者施用本发明的药物组合物。
本发明还提供了本文公开的GDF15融合蛋白或GDF15缀合物，其用于治疗非酒精性脂肪肝病(NAFLD)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)以及终末期肝疾病、肝脂肪变性(脂肪肝)、肝纤维化、肝炎、肝硬化、原发性胆汁性肝硬变(PBC)和肝细胞癌(HCC)中的一种或多种疾病。本发明还提供了用于治疗非酒精性脂肪肝病(NAFLD)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)以及终末期肝疾病、肝脂肪变性(脂肪肝)、肝纤维化、肝炎、肝硬化、原发性胆汁性肝硬变(PBC)和肝细胞癌(HCC)中的一种或多种疾病的药物组合物，其包含本文公开的GDF15融合蛋白或GDF15缀合物。
本公开的非限制性实施方案描述在如下方面中：
1.治疗非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH),终末期肝疾病、肝脂肪变性(脂肪肝)、肝纤维化、肝炎、肝硬化、原发性胆汁性肝硬变(PBC)或肝细胞癌(HCC)的方法，通过施用治疗有效量的GDF15治疗剂来进行，其包含GDF15变体、GDF15融合蛋白或GDF15缀合物的一种或多种。
2.方面1的方法，其中GDF15治疗剂是GDF15缀合物。
3.方面1的方法，其中GDF15治疗剂是HSA-GDF15融合蛋白或Fc-GDF15融合蛋白。
4.方面1的方法，其中GDF15治疗剂选自表1。
5.治疗非酒精性脂肪肝病(NAFLD)或非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的方法，通过施用治疗有效量的GDF15治疗剂来进行，其包含GDF15蛋白、变体、突变体、融合体或缀合物的一种或多种。
6.方面5的方法，其中GDF15治疗剂是脂肪酸-GDF15缀合物或PEG-GDF15缀合物。
7.方面5的方法，其中GDF15治疗剂是HSA-GDF15融合蛋白或Fc-GDF15融合蛋白。
8.方面5的方法，其中GDF15治疗剂选自表1。
9.治疗非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、终末期肝疾病、肝脂肪变性(脂肪肝)、肝纤维化、肝炎、肝硬化、原发性胆汁性肝硬变(PBC)或肝细胞癌(HCC)的方法，通过施用治疗有效量的包含GDF15治疗剂的药物组合物来进行，所述GDF15治疗剂包含GDF15蛋白、变体、突变体、融合体或缀合物的一种或多种。
10.方面9的方法，其中GDF15治疗剂是脂肪酸-GDF15缀合物或PEG-GDF15缀合物。
11.方面9的方法，其中GDF15治疗剂是HSA-GDF15融合蛋白或Fc-GDF15融合蛋白。
12.方面9的方法，其中GDF15治疗剂选自表1。
13.治疗非酒精性脂肪肝病(NAFLD)或非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的方法，通过施用治疗有效量的包含GDF15治疗剂的药物组合物来进行，所述GDF15治疗剂包含GDF15蛋白、变体、突变体、融合体或缀合物的一种或多种。
14.方面13的方法，其中GDF15治疗剂是脂肪酸-GDF15缀合物或PEG-GDF15缀合物。
15.方面13的方法，其中GDF15治疗剂是HSA-GDF15融合蛋白或Fc-GDF15融合蛋白。
16.方面13的方法，其中GDF15治疗剂选自表1。
17.方面1-16任一项的方法，其中GDF15治疗剂不含包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列的GDF15多肽。
18.方面1-17任一项的方法，其中GDF15治疗剂不是包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列的脂肪酸-GDF15缀合物。
19.方面1、2、4、5、6、8、9、10、12-14和16任一项的方法，其中GDF15治疗剂是脂肪酸缀合物，其不包含如下的氨基酸序列：
(i)SEQ ID NO:41；
(ii)
MHHHH HHAR NGDHC PLGPG RCCRL HTVRA SLEDL GWADW VLSPR EVQVT MCIGACPSQF RAANM HAQIK TSLHR LKPDT VPAPC CVPAS YNPMV LIQKT DTGVS LQTYD DLLAK DCHCI(M-(his)6-hGDF15(197-308))(SEQ ID NO:321),
(iii)
MHHHHHHMARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI(M-(his)6-M-hGDF15(197-308))(SEQID NO:322),
(iv)
MHHHHHHAHARDGCPLGEGRCCRLQSLRASLQDLGWANWVVAPRELDVRMCVGACPSQFRSANTHAQMQARLHGLNPDAAPAPCCVPASYEPVVLMHQDSDGRVSLTPFDDLVAKDCHCV(M-(his)6-dGDF15)(SEQ ID NO:323),
(v)
MHNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI(MH-hGDF15(199-308))(SEQ ID NO:324),
(vi)
MHAGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI(MHA-hGDF15(200-308))(SEQ ID NO:325),或
(vii)
AHNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI(AH-hGDF15(199-308))(SEQ ID NO:326)。
20.方面1-17任一项的方法，其中GDF15治疗剂不是包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列的白蛋白-GDF15融合体，例如人血清白蛋白-GDF15融合体。
21.方面1-16任一项的方法，其中GDF15治疗剂包含如下的任意一种的氨基酸序列：SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NOs：42-63、SEQ IDNO：69-107、SEQ ID NO：148,SEQ ID NO：149和SEQ ID NO：320；或如下的任意一种：SEQ IDNOs：42-63、SEQ ID NO：69-107、SEQ ID NO：148、SEQ ID NO：149和SEQ ID NO：320。
22.方面1-16任一项的方法，其中GDF15治疗剂不含如下氨基酸序列之一：
(i)MHHHH HHAR NGDHC PLGPG RCCRL HTVRA SLEDL GWADW VLSPR EVQVT MCIGACPSQF RAANM HAQIK TSLHR LKPDT VPAPC CVPAS YNPMV LIQKT DTGVS LQTYD DLLAK DCHCI(M-(his)6-hGDF15(197-308))(SEQ ID NO:321),
(ii)SEQ ID NO:6,
(iii)SEQ ID NO:7,
(iv)
MHHHHHHMARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI(M-(his)6-M-hGDF15(197-308))(SEQID NO:322),
(v)
MHHHHHHAHARDGCPLGEGRCCRLQSLRASLQDLGWANWVVAPRELDVRMCVGACPSQFRSANTHAQMQARLHGLNPDAAPAPCCVPASYEPVVLMHQDSDGRVSLTPFDDLVAKDCHCV(M-(his)6-dGDF15)(SEQ ID NO:323),
(vi)
MHNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI(MH-hGDF15(199-308))(SEQ ID NO:324),
(vii)
MHAGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI(MHA-hGDF15(200-308))(SEQ ID NO:325),
(viii)SEQ ID NO:41,和
(ix)
AHNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI(AH-hGDF15(199-308))(SEQ ID NO:326)。
23.方面1、2、4、5、6、8、9、10、12-14和16任一项的方法，其中GDF15治疗剂是脂肪酸-GDF15缀合物，其不含式A1、A2和A3的任意一种的脂肪酸：
R1是CO2H或H；
R2、R3和R4彼此独立地为H、OH、CO2H、-CH＝CH2或–C＝CH；
Ak是支链C6-C30亚烷基；
n、m和p彼此独立地6-30的整数；且不含十四烷酸。
24.方面1、2、4、5、6、8、9、10、12-14、16和22任一项的方法，其中GDF15治疗剂是脂肪酸-GDF15缀合物，其不含如下脂肪酸的一种或多种：
本发明的这些和其它方面阐述在如下本发明的详细描述中。
附图简述
图1A-B分别描绘施用0.0125和0.5mg/kg的脂肪酸-GDF15缀合物后的体重和累积食物摄取量的％改变(6周研究)。
图2A-B描绘施用0.0125和0.5mg/kg的脂肪酸-GDF15缀合物后的肝重和肝脂肪变性的改变(6周研究)。
图3描绘施用0.0125和0.5mg/kg的脂肪酸-GDF15缀合物后的体重的％改变(16周研究)。
图4A-B描绘施用0.0125和0.5mg/kg的脂肪酸-GDF15缀合物后的肝重和肝脂肪变性的改变(16周研究)。
详细描述
本发明涉及治疗非酒精性脂肪肝病(NAFLD)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)以及相关病症的方法，所述相关病症包括但不限于酒精性脂肪性肝炎(ASH)、终末期肝疾病、肝脂肪变性(脂肪肝)、肝纤维化、肝炎、肝硬化、原发性胆汁性肝硬变(PBC)和肝细胞癌(HCC)，通过施用GDF15例如GDF15的变体、缀合物或融合体来进行。
生长分化因子15(GDF15)是TGFβ超家族的趋异成员。它还称作巨噬细胞抑制细胞因子1(MICl)(Bootcov MR,1997,Proc Natl Acad Sci 94：11514-9)、胎盘骨形态发生因子(PLAB)(Hromas R 1997,Biochim Biophys Acta.1354:40-4)、胎盘转化生长因子β(PTGFB)(Lawton LN 1997,Gene.203：17-26)、前列腺衍生的因子(PDF)(Paralkar VM 1998,J BiolChem.273：13760-7)和非类固醇抗炎药-活化基因(NAG-1)(Baek SJ 2001,J BiolChem.276：33384-92)。
人GDF15基因位于染色体19p 13.2-13.1上；大鼠GDF15基因位于染色体16上；且小鼠GDF15基因位于染色体8上。GDF15可读框跨越两个外显子(Bottner M 1999,Gene.237：105-11和NCBI)。成熟GDF15肽共有与其它家族成员的低同源性(Katoh M 2006,IntJMolMed.17:951-5.)。
GDF15合成为大前体蛋白，其在二碱基切割位点处被切割以释放羧基末端成熟肽。小鼠和大鼠GDF15前多肽原均包含303个氨基酸。人全长前体包含308个氨基酸。啮齿动物成熟肽包含RGRR(SEQ ID NO：1)切割位点处加工后的115个氨基酸。人成熟肽包含RGRRRAR(SEQ ID NO:302)切割位点处加工后的112个氨基酸。人成熟GDF15肽与大鼠和小鼠成熟GDF15肽共有66.1％和68.1％的序列相似性(Bottner M 1999,Gene.237：105-11；BauskinAR 2000,EMBO J.19:2212-20；NCBI)。在成熟GDF15肽中不存在糖基化位点。
成熟GDF15肽包含形成半胱氨酸结基序所需的七保守半胱氨酸残基(具有3个链内二硫键)和对于TGF超家族成员典型的单一链间二硫键。成熟GDF15肽还包含形成第四链内二硫键的2个另外的半胱氨酸残基。生物活性GDF15是通过1个链间二硫键共价连接的成熟肽的25KD同二聚体。
已经报道GDF15循环水平在多种病理和生理条件下升高，最值得注意的是妊娠(Moore AG 2000.J Clin Endocrinol Metab 85：4781-4788)、β地中海贫血(Tanno T2007,Nat Med 13：1096-101)(Zimmermann MB,2008Am J Clin Nutr 88：1026-31)和先天性红细胞生成障碍性贫血(Tamary H 2008,Blood.112:5241-4)。文献报道中GDF15还与多种生物活性相关。GDF15敲除和转基因小鼠研究启示GDF15防止缺血/再灌注-或超负荷-诱导的心脏损伤(Kempf T,2006,Circ Res.98:351-60)(Xu J,2006,Circ Res.98:342-50)、防止与衰老相关的运动神经元和感觉神经元丧失(Strelau J,2009,J Neurosci.29：13640-8)、适度防止肾脏中的代谢性酸中毒，并且可以导致癌症患者中的恶病质(Johnen H2007Nat Med.11：1333-40)。许多研究小组还研究了GDF15在细胞凋亡和增殖中的作用并且报道使用不同的细胞培养物和异种移植物模型的有争议的结果。对转基因小鼠的研究显示GDF15防止肠和肺中致癌物或Apc突变诱导的瘤形成(Baek SJ 2006,Gastroenterology.131：1553-60；Cekanova M 2009,Cancer Prev Res 2:450-8)。
人成熟GDF15蛋白的X-射线晶体结构揭示出二硫键连接的二聚化结构。每个GDF15单体采取与具有在N-末端观察到的显著差异的其它TGFβ超家族半胱氨酸结蛋白类似的折叠。成熟GDF15蛋白包含总计9个半胱氨酸，它们全部与Cys273二硫键合，形成穿过二聚体界面的链间二硫键。当与TGFβ和BMP家族成员相比时，前4个半胱氨酸的二硫键合模式对于GDF15是独特的。Cys203和Cys210(成熟蛋白中的前2个半胱氨酸)彼此形成二硫键以形成从该蛋白质突出的小环结构。
其余的二硫键在结构上与TGFβ家族类似，但由Cys211-Cys274(第3和第7个半胱氨酸)、Cys240-Cys305(第4和第8个半胱氨酸)和Cys244-Cys307(第5和第9个半胱氨酸)形成。晶体结构进一步揭示出人GDF-15同二聚体中存在延伸的肽-肽界面，其具有～1300平方埃的埋入表面积并且牵涉37个氨基酸。
晶体结构显示如下氨基酸牵涉到肽-肽界面：Val216、Asp222、Leu223、Trp225、Val237、Met239、Ile241、Asn252、Met253、His254、Ile257、Lys258、Ser260、Leu261、Leu264、Lys265、Thr268、Val269、Pro270、Cys273、Val275、Pro276、Tyr279、Tyr297、Asp299、Leu300和Ile308。成熟肽的最后1个氨基酸Ile308离开其二聚体配偶体10个埃以下定位。对于该超家族显著的是，电子密度与指向蛋白质结构内部的侧链一致，以形成具有Val275和Pro276的疏水袋。其它家族成员具有指向结构内部的羧酸和暴露于溶剂的侧链(ref TGFb3(2PJY)、BMP6(2R52)、BMP7(1LX5)、GDF5(3EVS)、GDF2(4FAO))。这启示GDF15在其能于COOH-末端容纳更长肽序列而不干扰其蛋白质折叠的能力方面可能是独特的。
在一个实施方案中，本发明的方法包含如本文所述的GDF15融合蛋白，例如血清白蛋白融合体。在一些实施方案中，所述融合体可以包含任意适合的SA部分、任意适合的GDF15部分和如果期望的任意适合的接头。通常，选择SA部分、GDF15部分和如果存在的接头以提供融合多肽，预期它在NASH、NAFLD或本文所述的其它疾病中具有治疗效能且与预期所施用的物种免疫相容的。例如，当预期将所述融合多肽施用于人时，SA部分可以是HSA或其功能变体，且GDF15部分可以是人GDF15或其功能变体。类似地，当预期融合蛋白用于其他物种时，可以使用来源于该其他物种(例如宠物或家畜类动物)的SA及其功能变体和GDF15及其功能变体。
在一个具体的实施方案中，用于本发明方法的GDF15融合体不包含PCT公开号WO2015/198199中所述的GDF15融合体(例如SA-GDF15融合体或HSA-GDF15融合体)，其内容作为引用完整地并入本文作为参考。
在一个具体的实施方案中，用于本发明方法的GDF15缀合物不包含PCT公开号WO2015/200078中所述的GDF15缀合物(例如脂肪酸-GDF15缀合物)，其内容作为引用完整地并入本文作为参考。
GDF15部分
用于本发明方法的GDF15部分，例如在任意的GDF15融合蛋白或缀合物中，例如脂肪酸缀合物中的GDF15部分可以是任意适合的GDF15多肽或其功能变体，例如表1中所述的GDF15变体。优选地，GDF15部分是人GDF15或其功能变体。将人GDF15合成为308个氨基酸的前蛋白原(SEQ ID NO:1)，其包括信号肽(氨基酸1-29)、前肽(氨基酸30-196)和112个氨基酸的成熟GDF15肽(氨基酸197-308(SEQ ID NO:5))。分别将前肽和成熟肽报道为SEQ IDNO:2的氨基酸30-194和195-308。(参见Uniprot序列Q99988)。已经报道了序列变化形式。例如，分别将氨基酸202、269和288(在SEQ ID NO:2中)报道为Asp、Glu和Ala。(Hromas R等人,Biochem.Biophys.Acta 1354:40-44(1997),Lawton L.N.等人Gene 203:17-26(1997).)
用于本发明方法的包含人GDF15部分的融合蛋白通常包含112个氨基酸成熟GDF15肽(例如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5的氨基酸197-308)或其功能变体。该功能变体可以包括任意期望组合的一个或多个氨基酸缺失、添加或替代，例如表1中的GDF15变体。氨基酸序列变化形式的量(例如通过氨基酸缺失、添加或替代)限于保持成熟GDF15肽的重量减轻活性。在一些实施方案中，成熟GDF15肽的功能变体相对于SEQ ID NO:5以任意期望的组合具有1-约20、1-约18、1-约17、1-约16、1-约15、1-约14、1-约13、1-约12、1-约11、1-约10、1-约9、1-约8、1-约7、1-约6或1-约5个氨基酸缺失、添加或替代。备选地或额外地，当优选在SEQ IDNO:5全长范围内测定时，该功能变体可以具有氨基酸序列，其与SEQ ID NO:5具有至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性。在一个具体的实施方案中，当优选在SEQ ID NO:5全长范围内测定时，GDF15功能变体可以具有氨基酸序列，其与SEQ ID NO:5具有至少90％、至少95％或至少98％的氨基酸序列同一性。
不希望受任何具体理论束缚，GDF15在NASH、NAFLD和相关病症中的治疗功效可以通过由GDF15(和本文所述的融合蛋白和变体)结合至一种或多种受体和/或可溶性辅因子或者通过经直接竞争或变构调节来调节其它因子所利用的信号传导途径引发的细胞信号传导来介导。氨基酸取代、缺失或添加优选位于不牵涉受体或辅因子结合、也不牵涉通过肽内相互作用维持总体蛋白质构象的位置。
例如，第216、222、223、225、237、239、241、252、253、254、257、258、260、261、264、265、268、269、270、273、275、276、279、297、299、300和308位上的氨基酸牵涉肽-肽界面。在具体的实施方案中，这些位置上的任何氨基酸替代通常是不利的且任何替代应当是保守替代。表面暴露、但在物种中不保守的氨基酸通常可以被其它氨基酸替代但不破坏肽的折叠或其重量减轻活性。本发明人确定了人成熟GDF15肽的晶体结构，并且鉴定在217、219、226、234、243、246、247、263、265、268、277、280、287、290、303和304位上的氨基酸作为表面暴露的残基，它们在其它物种中不是保守的。
本发明人确定了人成熟GDF15肽的晶体结构，并且鉴定了在217、219、226、234、243、246、247、263、265、268、277、280、287、290、303和304位上的氨基酸作为表面暴露的残基，它们在其它物种中不是保守的。此外，成熟人GDF15的氨基末端(SEQ ID NO:1的氨基酸197-210)和Cys203、Cys 210和Cys273对于重量减轻活性不是必需的，它们通常可以被另一种氨基酸替代和/或被省略。在一个具体的实施方案中，成熟人GDF15的前1-8个或前1-6个N-末端氨基酸可以被除去或取代。在一个具体的实施方案中，成熟人GDF15的前1-5个或前1-4个N-末端氨基酸可以被除去或取代。在一个具体的实施方案中，成熟人GDF15的前2个或前3个N-末端氨基酸可以被除去或取代。在一个具体的实施方案中，成熟人GDF15的前3个或前6个N-末端氨基酸可以被除去或取代。
适用于融合多肽的人成熟GDF15肽的示例性变体包括SEQ ID NO:5，其中来自1-约25位的残基的一个或多个被替代或缺失。例如，该变体可以具有SEQ ID NO:44的序列，其中前25个、前15个、前14个、前13个、前12个、前11个、前10个、前9个、前8个、前7个、前6个、前5个、前4个、前3个、前2个或前1个氨基酸被缺失。
适用于融合多肽的人成熟GDF15肽的另外的示例性变体包括SEQ ID NO:1的氨基酸197-308(SEQ ID NO:5)，其中198位上的Arg、199位上的Asn或198位上的Arg和199位上的Asn被一个或多个另外的氨基酸替代。当氨基酸被替代时，优选保守氨基酸替代。在具体的实施方案中，198位上的Arg被His替代或199位上的Asn被Ala或Glu替代。在更具体的实施方案中，198位上的Arg被His替代且199位上的Asn被Ala替代。
在一个具体的实施方案中，适用于本发明缀合物和融合多肽的人成熟GDF15肽的示例性变体包括SEQ ID NO:1的氨基酸197-308(SEQ ID NO:5)，其中198位上的Arg未被His替代，且199位上的Asn未被Ala替代。在一个具体的实施方案中，适用于本发明缀合物和融合多肽的人成熟GDF15肽的示例性变体不包含SEQ ID NO：41或SEQ ID NO：320的GDF15变体或
MHHHH HHAR NGDHC PLGPG RCCRL HTVRA SLEDL GWADW VLSPR EVQVT MCIGACPSQF RAANM HAQIK TSLHR LKPDT VPAPC CVPAS YNPMV LIQKT DTGVS LQTYD DLLAK DCHCI(M-(his)6-hGDF15)(SEQ ID NO：321),
或
MHHHHHHMARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI(M-(his)6-M-hGDF15)(SEQ ID NO：322)。
在一个具体的实施方案中，适用于本发明脂肪酸-GDF15缀合物的人成熟GDF15肽的示例性变体不包含SEQ ID NO：41或SEQ ID NO：320的GDF15变体或
MHHHH HHAR NGDHC PLGPG RCCRL HTVRA SLEDL GWADW VLSPR EVQVT MCIGACPSQF RAANM HAQIK TSLHR LKPDT VPAPC CVPAS YNPMV LIQKT DTGVS LQTYD DLLAK DCHCI(M-(his)6-hGDF15)(SEQ ID NO：321),
或
MHHHHHHMARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI(M-(his)6-M-hGDF15)(SEQ ID NO：322)。
在一个具体的实施方案中，适用于本发明脂肪酸-GDF15缀合物的人成熟GDF15肽的示例性变体不包含SEQ ID NO：41或SEQ ID NO：320的GDF15变体或
MHHHH HHAR NGDHC PLGPG RCCRL HTVRA SLEDL GWADW VLSPR EVQVT MCIGACPSQF RAANM HAQIK TSLHR LKPDT VPAPC CVPAS YNPMV LIQKT DTGVS LQTYD DLLAK DCHCI(M-(his)6-hGDF15)(SEQ ID NO：321),
或
MHHHHHHMARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI(M-(his)6-M-hGDF15)(SEQ ID NO：322)。
在一个具体的实施方案中，适用于本发明GDF15融合多肽、例如SA-GDF15融合体的人成熟GDF15肽的示例性变体不包含SEQ ID NO：41或SEQ ID NO：320的GDF15变体或
MHHHH HHAR NGDHC PLGPG RCCRL HTVRA SLEDL GWADW VLSPR EVQVT MCIGACPSQF RAANM HAQIK TSLHR LKPDT VPAPC CVPAS YNPMV LIQKT DTGVS LQTYD DLLAK DCHCI(M-(his)6-hGDF15)(SEQ ID NO：321),
或
MHHHHHHMARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI(M-(his)6-M-hGDF15)(SEQ ID NO：322)。
在一个具体的实施方案中，适用于本发明缀合物和融合多肽的人成熟GDF15肽的变体包括与SEQ ID NO:5 95％同一的氨基酸序列，其中198位上的Arg未被His替代，且199位上的Asn未被Ala替代或其中GDF15变体不是SEQ ID NO：41或SEQ ID NO：320。在某一实施方案中，适用于本发明缀合物和融合多肽的人成熟GDF15肽的变体包括表1中所述的那些，其中198位上的Arg未被His替代，且199位上的Asn未被Ala替代或其中GDF15变体不是SEQID NO：41或SEQ ID NO：320。在某一实施方案中，适用于本发明缀合物(例如脂肪酸-GDF15缀合物)和融合多肽(例如SA-GDF15融合多肽)的人成熟GDF15肽的变体包括表1中所述的那些，其中人成熟GDF15肽的变体不包含SEQ ID NO：41或SEQ ID NO：320的GDF15变体或MHHHHHHAR NGDHC PLGPG RCCRL HTVRA SLEDL GWADW VLSPR EVQVT MCIGA CPSQF RAANM HAQIKTSLHR LKPDT VPAPC CVPAS YNPMV LIQKT DTGVS LQTYD DLLAK DCHCI(M-(his)6-hGDF15)(SEQ ID NO：321),
或
MHHHHHHMARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI(M-(his)6-M-hGDF15)(SEQ ID NO：322)。
在一个具体的实施方案中，适用于本发明缀合物和融合多肽的人成熟GDF15肽的变体不含PCT公开号WO2015/198199中所述的GDF15变体，该文献作为引用完整地并入本文作为参考，例如其中提供的SEQ ID NOs：SEQ ID NOS：20、26、28、30、32、38、40和42。在一个具体的实施方案中，适用于本发明缀合物和融合多肽的人成熟GDF15肽的变体不含下述GDF15变体，其包含一个或多个表面暴露的残基的氨基酸(例如Arg217、Ser219、Ala226、Glu234、Ala243、Ser246、Gln247、Arg263、Lys265、Thr268、A3a277、Asn280、Lys287、Thr290、Lys303和Asp3G4)、一个或多个N-末端氨基酸(氨基酸197-210)、Cys 203、Cys 210和/或Cys273替代或缺失。在一个具体的实施方案中，适用于本发明融合多肽例如白蛋白-GDF15融合体(例如HSA-GDF15融合体的人成熟GDF15肽的变体不含下述GDF15变体，其包含一个或多个表面暴露的残基的氨基酸(例如Arg217、Ser219、Ala226、Glu234、Ala243、Ser246、Gln247、Arg263、Lys265、Thr268、A3a277、Asn280、Lys287、Thr290、Lys303和Asp3G4)、一个或多个N-末端氨基酸(氨基酸197-210)、Cys 203、Cys 210和/或Cys273替代或缺失。
在一个具体的实施方案中，适用于本发明缀合物(例如脂肪酸-GDF15缀合物)和融合多肽(例如SA-GDF15融合多肽，例如HSA-GDF15融合多肽)的人成熟GDF15肽的变体不含如下GDF15变体：
(i)His6-hGDF15(197-308)：HHHHHHARNG DHCPLGPGRC CRLHTVRASL EDLGWADWVLSPREVQVTMC IGACPSQFRA ANMHAQIKTS LHRLKPDTVP APCCVPASYN PMVLIQKTDT GVSLQTYDDLLAKDCHCI(SEQ ID NO：6)；
(ii)His8-TEV-hGDF15(197-308)：HHHHHHHHGG SENLYFQGAR NGDHCPLGPGRCCRLHTVRA SLEDLGWADW VLSPREVQVT MCIGACPSQF RAANMHAQIK TSLHRLKPDT VPAPCCVPASYNPMVLIQKT DTGVSLQTYD DLLAKDCHCI(SEQ ID NO：7)；和
(iii)hGDF15(197-308)：ARNGDHCPLG PGRCCRLHTV RASLEDLGWA DWVLSPREVQVTMCIGACPS QFRAANMHAQ IKTSLHRLKP DTVPAPCCVP ASYNPMVLIQ KTDTGVSLQT YDDLLAKDCHCI(SEQ ID NO：5)。
成熟人GDF15包括9个半胱氨酸残基，其中8个以在TGFβ超家族成员中独特的模式形成链内二硫键。在一个实施方案中，Cys203、210和273可以被另外的氨基酸替代，或如果期望，可以被省略。
血清白蛋白(SA)部分
SA部分是任意适合的血清白蛋白(例如人血清白蛋白(HSA)或来自另一物种的血清白蛋白)或其功能变体。优选地，SA部分是HSA或其功能变体。与野生型GDF15相比，SA部分延长了添加其的融合多肽的血清半寿期。用于药代动力学分析和血清半寿期测定的方法是本领域技术人员熟知的。详细内容可以在Kenneth,A等人：Chemical Stability ofPharmaceuticals：A Handbook for Pharmacists和Peters等人,Pharmacokinetcanalysis：A Practical Approach(1996)中找到。还参考Marcel Dekker出版的“Pharmacokinetics,”M Gibaldi&D Perron,第2版，不包括修订版(1982)，其描述了药代动力学参数，例如tα和tβ半寿期和曲线下面积(AUC)。
人血清白蛋白(HSA)是约66,500KDa的血浆蛋白并且由585个氨基酸组成，包括至少17个二硫键。(Peters,T.,Jr.(1996),All about Albumin：Biochemistry,Genetics andMedical,Applications,pp10,Academic Press,Inc.,Orlando(ISBN 0-12-552110-3)。HSA具有长半寿期并且通过肝脏极为缓慢地清除。据报道HSA的血浆半寿期约为19天(Peters,T.,Jr.(1985)Adv.Protein Chem.37,161-245；Peters,T.,Jr.(1996)All about Albumin,Academic Press,Inc.,San Diego,CA.(第245-246页))；Benotti P,Blackburn GL：CritCare Med(1979)7:520-525)。
HSA已经用于产生具有改善的贮存期限和半寿期的融合蛋白。例如，PCT公开号WO01/79271A和WO03/59934A公开了：(i)包含各种治疗蛋白(例如生长因子，scFv)的白蛋白融合蛋白；和(ii)据报道HSA使得融合蛋白具有比单独的治疗蛋白更长的贮存期限和半寿期。
HSA可以包含成熟天然存在的HSA的585个氨基酸的全长序列(加工和除去信号和前肽后(SEQ ID NO:4))或其天然存在变体，包括等位基因变体。天然存在的HSA及其变体是本领域众所周知的。(参见，例如Meloun等人,FEBS Letters 58:136(1975)；Behrens等人,Fed.Proc.34:591(1975)；Lawn等人,Nucleic Acids Research 9:6102-6114(1981)；Minghetti等人,J.Biol.Chem.261:6747(1986))；和Weitkamp等人,Ann.Hum.Genet.37:219(1973).)
包含人血清白蛋白部分的融合蛋白通常包含585个氨基酸的HSA(SEQ ID NO:3的氨基酸25-609,SEQ ID NO:4)或其功能变体。该功能变体可以包括任意期望组合形式的一个或多个氨基酸缺失、添加或替代，并且包括HSA的功能片段。氨基酸序列变化形式的量(例如通过氨基酸缺失、添加或替代)限于保留HSA延长血清半寿期的特性。
在一些实施方案中，用于本文公开的融合蛋白的HSA的功能变体可以具有氨基酸序列，当在SEQ ID NO:4的全长序列内测定时，其具有与SEQ ID NO:4至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％的氨基酸序列同一性。备选地或额外地，HSA的功能变体可以具有任意期望组合形式的1-约20个、1-约18个、1-约17个、1-约16个、1-约15个、1-约14个、1-约13个、1-约12个、1-约11个、1-约10个、1-约9个、1-约8个、1-约7个、1-约6个或1-约5个氨基酸缺失、添加或替代。在一个具体的实施方案中，用于本文公开的融合蛋白的HSA的功能变体包含C34A突变。
用于本文公开的融合蛋白的HSA的一些功能变体可以至少为100个氨基酸长度或至少150个氨基酸长度，并且可以包含HSA结构域的全部或部分结构域或由HSA结构域的全部或部分结构域组成，例如结构域I(SEQ ID NO:4的氨基酸1-194)、II(SEQ ID NO:4的氨基酸195-387)或III(SEQ ID NO:4的氨基酸388-585)。如果期望，则HSA的功能变体可以由任意期望的HSA结构域组合组成或备选地包含它们，例如结构域I+II(SEQ ID NO:4的氨基酸1-387)、结构域II+III(SEQ ID NO:4的氨基酸195-585)或结构域I+III(SEQ ID NO:4的氨基酸1-194+SEQ ID NO:4的氨基酸388-585)。如本领域众所周知的，HSA的每个结构域由2个同源亚结构域构成，即分别为结构域I、II和III的氨基酸1-105和120-194、195-291和316-387、以及388-491和512-585，其中柔性亚结构域间的接头区包含残基Lys106-Glu119、Glu292-Val315和Glu492-Ala511。在某些实施方案中，本发明融合蛋白的SA部分包含HSA的至少一个亚结构域或结构域。
适用于本文公开的融合蛋白的HSA的功能片段包含HSA的至少约5个或以上的连续氨基酸，优选HSA序列的至少约10个、至少约15个、至少约20个、至少约25个、至少约30个、至少约50个或以上的连续氨基酸或可以包括HSA的特异性结构域的部分或全部。
在一些实施方案中，适用于本文公开的融合蛋白的HSA的功能变体(例如片段)包括N-末端缺失、C-末端缺失或N-末端和C-末端缺失的组合。这类变体便利地涉及使用该功能变体序列中的第一个和最后一个氨基酸的氨基酸编号。例如，具有C-末端截短的功能变体可以是HSA(SEQ ID NO:4)的氨基酸1-387。
适用于本文所述的GDF15融合多肽的HSA和HSA变体(包括片段)的实例是本领域公知的。适合的HSA和HSA变体包括，例如全长成熟HSA(SEQ ID NO:4)和片段，例如成熟HSA的氨基酸1-387、氨基酸54-61、氨基酸76-89、氨基酸92-l00、氨基酸170-176、氨基酸247-252、氨基酸266-277、氨基酸280-288、氨基酸362-368、氨基酸439-447、氨基酸462-475、氨基酸478-486和氨基酸560-566。这类HSA多肽和功能变体公开在PCT公开号WO 2005/077042A2中，该文献作为引用完整地并入本文作为参考。HSA的另外的变体例如HSA的氨基酸1-373、1-388、1-389、1-369、1-419和包含氨基酸1至氨基酸369-419的片段公开在欧洲公开的专利申请EP322094A1中，且包含1-177、1-200和氨基酸1至氨基酸178-199的片段公开在欧洲公开的专利申请EP399666A1中。
在一个具体的实施方案中，适用于本发明的HSA-GDF15融合多肽不包含如下融合体：
(i)HSA(25-609),C34S,N503Q-hGDF15(211-308):DAHKSEVAHR FKDLGEENFKALVLIAFAQY LQQSPFEDHV KLVNEVTEFA KTCVADESAE NCDKSLHTLF GDKLCTVATL RETYGEMADCCAKQEPERNE CFLQHKDDNP NLPRLVRPEV DVMCTAFHDN EETFLKKYLY EIARRHPYFY APELLFFAKRYKAAFTECCQ AADKAACLLP KLDELRDEGK ASSAKQRLKC ASLQKFGERA FKAWAVARLS QRFPKAEFAEVSKLVTDLTK VHTECCHGDL LECADDRADL AKYICENQDS ISSKLKECCE KPLLEKSHCI AEVENDEMPADLPSLAADFV ESKDVCKNYA EAKDVFLGMF LYEYARRHPD YSVVLLLRLA KTYETTLEKC CAAADPHECYAKVFDEFKPL VEEPQNLIKQ NCELFEQLGE YKFQNALLVR YTKKVPQVST PTLVEVSRNL GKVGSKCCKHPEAKRMPCAE DYLSVVLNQL CVLHEKTPVS DRVTKCCTES LVNRRPCFSA LEVDETYVPK EFQAETFTFHADICTLSEKE RQIKKQTALV ELVKHKPKAT KEQLKAVMDD FAAFVEKCCK ADDKETCFAE EGKKLVAASQAALGLGGGGS GGGGSGGGGS CRLHTVRASL EDLGWADWVL SPREVQVTMC IGACPSQFRA ANMHAQIKTSLHRLKPDTVP APCCVPASYN PMVLIQKTDT GVSLQTYDDL LAKDCHCI(SEQ ID NO:327)；
(ii)HSA-3x4GS-hGDF15(197-308):DAHKSEVAHR FKDLGEENFK ALVLIAFAQYLQQCPFEDHV KLVNEVTEFA KTCVADESAE NCDKSLHTLF GDKLCTVATL RETYGEMADC CAKQEPERNECFLQHKDDNP NLPRLVRPEV DVMCTAFHDN EETFLKKYLY EIARRHPYFY APELLFFAKR YKAAFTECCQAADKAACLLP KLDELRDEGK ASSAKQRLKC ASLQKFGERA FKAWAVARLS QRFPKAEFAE VSKLVTDLTKVHTECCHGDL LECADDRADL AKYICENQDS ISSKLKECCE KPLLEKSHCI AEVENDEMPA DLPSLAADFVESKDVCKNYA EAKDVFLGMF LYEYARRHPD YSVVLLLRLA KTYETTLEKC CAAADPHECY AKVFDEFKPLVEEPQNLIKQ NCELFEQLGE YKFQNALLVR YTKKVPQVST PTLVEVSRNL GKVGSKCCKH PEAKRMPCAEDYLSVVLNQL CVLHEKTPVS DRVTKCCTES LVNRRPCFSA LEVDETYVPK EFNAETFTFH ADICTLSEKERQIKKQTALV ELVKHKPKAT KEQLKAVMDD FAAFVEKCCK ADDKETCFAE EGKKLVAASQ AALGLGGGGSGGGGSGGGGS ARNGDHCPLG PGRCCRLHTV RASLEDLGWA DWVLSPREVQ VTMCIGACPS QFRAANMHAQIKTSLHRLKP DTVPAPCCVP ASYNPMVLIQ KTDTGVSLQT YDDLLAKDCH CI(SEQ ID NO:328)；
(iii)HSA-GGGGS-hGDF15(197-308):DAHKSEVAHR FKDLGEENFK ALVLIAFAQYLQQCPFEDHV KLVNEVTEFA KTCVADESAE NCDKSLHTLF GDKLCTVATL RETYGEMADC CAKQEPERNECFLQHKDDNP NLPRLVRPEV DVMCTAFHDN EETFLKKYLY EIARRHPYFY APELLFFAKR YKAAFTECCQAADKAACLLP KLDELRDEGK ASSAKQRLKC ASLQKFGERA FKAWAVARLS QRFPKAEFAE VSKLVTDLTKVHTECCHGDL LECADDRADL AKYICENQDS ISSKLKECCE KPLLEKSHCI AEVENDEMPA DLPSLAADFVESKDVCKNYA EAKDVFLGMF LYEYARRHPD YSVVLLLRLA KTYETTLEKC CAAADPHECY AKVFDEFKPLVEEPQNLIKQ NCELFEQLGE YKFQNALLVR YTKKVPQVST PTLVEVSRNL GKVGSKCCKH PEAKRMPCAEDYLSVVLNQL CVLHEKTPVS DRVTKCCTES LVNRRPCFSA LEVDETYVPK EFNAETFTFH ADICTLSEKERQIKKQTALV ELVKHKPKAT KEQLKAVMDD FAAFVEKCCK ADDKETCFAE EGKKLVAASQ AALGLGGGGSARNGDHCPLG PGRCCRLHTV RASLEDLGWA DWVLSPREVQ VTMCIGACPS QFRAANMHAQ IKTSLHRLKPDTVPAPCCVP ASYNPMVLIQ KTDTGVSLQT YDDLLAKDCH CI(SEQ ID NO:329)；
(iv)HSA-GPPGS-hGDF15(197-308):DAHKSEVAHR FKDLGEENFK ALVLIAFAQYLQQCPFEDHV KLVNEVTEFA KTCVADESAE NCDKSLHTLF GDKLCTVATL RETYGEMADC CAKQEPERNECFLQHKDDNP NLPRLVRPEV DVMCTAFHDN EETFLKKYLY EIARRHPYFY APELLFFAKR YKAAFTECCQAADKAACLLP KLDELRDEGK ASSAKQRLKC ASLQKFGERA FKAWAVARLS QRFPKAEFAE VSKLVTDLTKVHTECCHGDL LECADDRADL AKYICENQDS ISSKLKECCE KPLLEKSHCI AEVENDEMPA DLPSLAADFVESKDVCKNYA EAKDVFLGMF LYEYARRHPD YSVVLLLRLA KTYETTLEKC CAAADPHECY AKVFDEFKPLVEEPQNLIKQ NCELFEQLGE YKFQNALLVR YTKKVPQVST PTLVEVSRNL GKVGSKCCKH PEAKRMPCAEDYLSVVLNQL CVLHEKTPVS DRVTKCCTES LVNRRPCFSA LEVDETYVPK EFNAETFTFH ADICTLSEKERQIKKQTALV ELVKHKPKAT KEQLKAVMDD FAAFVEKCCK ADDKETCFAE EGKKLVAASQ AALGLGPPGSARNGDHCPLG PGRCCRLHTV RASLEDLGWA DWVLSPREVQ VTMCIGACPS QFRAANMHAQ IKTSLHRLKPDTVPAPCCVP ASYNPMVLIQ KTDTGVSLQT YDDLLAKDCH CI(SEQ ID NO:330)；
(v)HSA-hGDF15(197-308)(无接头):DAHKSEVAHR FKDLGEENFK ALVLIAFAQYLQQCPFEDHV KLVNEVTEFA KTCVADESAE NCDKSLHTLF GDKLCTVATL RETYGEMADC CAKQEPERNECFLQHKDDNP NLPRLVRPEV DVMCTAFHDN EETFLKKYLY EIARRHPYFY APELLFFAKR YKAAFTECCQAADKAACLLP KLDELRDEGK ASSAKQRLKC ASLQKFGERA FKAWAVARLS QRFPKAEFAE VSKLVTDLTKVHTECCHGDL LECADDRADL AKYICENQDS ISSKLKECCE KPLLEKSHCI AEVENDEMPA DLPSLAADFVESKDVCKNYA EAKDVFLGMF LYEYARRHPD YSVVLLLRLA KTYETTLEKC CAAADPHECY AKVFDEFKPLVEEPQNLIKQ NCELFEQLGE YKFQNALLVR YTKKVPQVST PTLVEVSRNL GKVGSKCCKH PEAKRMPCAEDYLSVVLNQL CVLHEKTPVS DRVTKCCTES LVNRRPCFSA LEVDETYVPK EFNAETFTFH ADICTLSEKERQIKKQTALV ELVKHKPKAT KEQLKAVMDD FAAFVEKCCK ADDKETCFAE EGKKLVAASQ AALGLARNGDHCPLGPGRCC RLHTVRASLE DLGWADWVLS PREVQVTMCI GACPSQFRAA NMHAQIKTSL HRLKPDTVPAPCCVPASYNP MVLIQKTDTG VSLQTYDDLL AKDCHCI(SEQ ID NO:331)；
(vi)HSA-hGDF15(197-308),R198H:DAHKSEVAHR FKDLGEENFK ALVLIAFAQYLQQCPFEDHV KLVNEVTEFA KTCVADESAE NCDKSLHTLF GDKLCTVATL RETYGEMADC CAKQEPERNECFLQHKDDNP NLPRLVRPEV DVMCTAFHDN EETFLKKYLY EIARRHPYFY APELLFFAKR YKAAFTECCQAADKAACLLP KLDELRDEGK ASSAKQRLKC ASLQKFGERA FKAWAVARLS QRFPKAEFAE VSKLVTDLTKVHTECCHGDL LECADDRADL AKYICENQDS ISSKLKECCE KPLLEKSHCI AEVENDEMPA DLPSLAADFVESKDVCKNYA EAKDVFLGMF LYEYARRHPD YSVVLLLRLA KTYETTLEKC CAAADPHECY AKVFDEFKPLVEEPQNLIKQ NCELFEQLGE YKFQNALLVR YTKKVPQVST PTLVEVSRNL GKVGSKCCKH PEAKRMPCAEDYLSVVLNQL CVLHEKTPVS DRVTKCCTES LVNRRPCFSA LEVDETYVPK EFNAETFTFH ADICTLSEKERQIKKQTALV ELVKHKPKAT KEQLKAVMDD FAAFVEKCCK ADDKETCFAE EGKKLVAASQ AALGLGGGGSGGGGSGGGGS AHNGDHCPLG PGRCCRLHTV RASLEDLGWA DWVLSPREVQ VTMCIGACPS QFRAANMHAQIKTSLHRLKP DTVPAPCCVP ASYNPMVLIQ KTDTGVSLQT YDDLLAKDCH CI(SEQ ID NO:332)；
(vii)HSA-hGDF15(197-308),R198H,N199A:DAHKSEVAHR FKDLGEENFK ALVLIAFAQYLQQCPFEDHV KLVNEVTEFA KTCVADESAE NCDKSLHTLF GDKLCTVATL RETYGEMADC CAKQEPERNECFLQHKDDNP NLPRLVRPEV DVMCTAFHDN EETFLKKYLY EIARRHPYFY APELLFFAKR YKAAFTECCQAADKAACLLP KLDELRDEGK ASSAKQRLKC ASLQKFGERA FKAWAVARLS QRFPKAEFAE VSKLVTDLTKVHTECCHGDL LECADDRADL AKYICENQDS ISSKLKECCE KPLLEKSHCI AEVENDEMPA DLPSLAADFVESKDVCKNYA EAKDVFLGMF LYEYARRHPD YSVVLLLRLA KTYETTLEKC CAAADPHECY AKVFDEFKPLVEEPQNLIKQ NCELFEQLGE YKFQNALLVR YTKKVPQVST PTLVEVSRNL GKVGSKCCKH PEAKRMPCAEDYLSVVLNQL CVLHEKTPVS DRVTKCCTES LVNRRPCFSA LEVDETYVPK EFNAETFTFH ADICTLSEKERQIKKQTALV ELVKHKPKAT KEQLKAVMDD FAAFVEKCCK ADDKETCFAE EGKKLVAASQ AALGLGGGGSGGGGSGGGGS AHAGDHCPLG PGRCCRLHTV RASLEDLGWA DWVLSPREVQ VTMCIGACPS QFRAANMHAQIKTSLHRLKP DTVPAPCCVP ASYNPMVLIQ KTDTGVSLQT YDDLLAKDCH CI(SEQ ID NO:333)；和
(viii)HSA-hGDF15(197-308),N199E:DAHKSEVAHR FKDLGEENFK ALVLIAFAQYLQQCPFEDHV KLVNEVTEFA KTCVADESAE NCDKSLHTLF GDKLCTVATL RETYGEMADC CAKQEPERNECFLQHKDDNP NLPRLVRPEV DVMCTAFHDN EETFLKKYLY EIARRHPYFY APELLFFAKR YKAAFTECCQAADKAACLLP KLDELRDEGK ASSAKQRLKC ASLQKFGERA FKAWAVARLS QRFPKAEFAE VSKLVTDLTKVHTECCHGDL LECADDRADL AKYICENQDS ISSKLKECCE KPLLEKSHCI AEVENDEMPA DLPSLAADFVESKDVCKNYA EAKDVFLGMF LYEYARRHPD YSVVLLLRLA KTYETTLEKC CAAADPHECY AKVFDEFKPLVEEPQNLIKQ NCELFEQLGE YKFQNALLVR YTKKVPQVST PTLVEVSRNL GKVGSKCCKH PEAKRMPCAEDYLSVVLNQL CVLHEKTPVS DRVTKCCTES LVNRRPCFSA LEVDETYVPK EFNAETFTFH ADICTLSEKERQIKKQTALV ELVKHKPKAT KEQLKAVMDD FAAFVEKCCK ADDKETCFAE EGKKLVAASQ AALGLGGGGSGGGGSGGGGS AREGDHCPLG PGRCCRLHTV RASLEDLGWA DWVLSPREVQ VTMCIGACPS QFRAANMHAQIKTSLHRLKP DTVPAPCCVP ASYNPMVLIQ KTDTGVSLQT YDDLLAKDCH CI(SEQ ID NO:334).
接头
关于用于本发明方法的GDF15融合蛋白(例如血清白蛋白GDF15融合蛋白)，异源蛋白质/肽例如SA和GDF15部分可以在连续的多肽链中彼此直接键合或优选通过适合的接头彼此间接键合。所述接头优选是肽接头。肽接头通常用于融合多肽，且用于选择或设计接头的方法是众所周知的。(参见，例如Chen X等人Adv.Drug Deliv.Rev.65(10):135701369(2013)和Wriggers W等人,Biopolymers 80:736-746(2005).)
通常将肽接头分类为：i)柔性接头；ii)螺旋形成接头；和iii)可切割接头，且每种类型的实例是本领域公知的。优选地，柔性接头包括在本文所述的融合多肽中。柔性接头可以包含无空间位阻的大部分氨基酸，例如甘氨酸和丙氨酸。亲水性氨基酸Ser也常用于柔性接头。柔性接头的实例包括聚甘氨酸(例如(Gly)4(SEQ ID NO：335)和(Gly)5)(SEQ ID NO：336)、聚丙氨酸聚(Gly-Ala)和聚(Gly-Ser)(例如(Glyn-Sern)n或(Sern-Glyn)n，其中n各自独立地是等于或大于1的整数)。
肽接头可以具有适合的长度。肽接头序列可以是至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75或75个以上氨基酸残基的长度。例如，肽接头可以约为5-约50个氨基酸长度；约10-约40个氨基酸长度；约15-约30个氨基酸长度；或约15-约20个氨基酸长度。肽接头长度的变化可以保留或促进活性，从而在活性研究中产生优良的效能。肽接头序列可以包含天然或非天然存在的氨基酸。
在一些方面，氨基酸甘氨酸和丝氨酸包含在接头序列中的氨基酸。在某些方面，接头区包含甘氨酸重复组(GSG3)n，其中n是等于或大于1的正整数(优选1-约20)(SEQ ID NO:305)。更具体地，接头序列可以为GSGGG(SEQ ID NO:306)。接头序列可以为GSGG(SEQ IDNO:307)。在某些另外的方面，接头区取向包含甘氨酸重复组(SerGly3)n，其中n是等于或大于1的正整数(优选1-约20)(SEQ ID NO:308)。
在多个实施方案中，接头可以包含随机方式的甘氨酸(G)和丝氨酸(S)或优选重复模式。例如，接头可以为(GGGGS)n(SEQ ID NO:303)，其中n是1-20、优选1-4的整数。在一个具体的实例中，n为3，且接头为GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:300)。
在其他实施方案中，接头可以包含随机方式的甘氨酸(G)、丝氨酸(S)和脯氨酸(P)或优选重复模式。例如，接头可以为(GPPGS)n(SEQ ID NO:304)，其中n是1-20的整数，优选1-4个。在一个具体的实例中，n为1，且接头为GPPGS(SEQ ID NO:309)。
通常，当接头施用于患者例如人时是非免疫原性的。因此，可以选择接头，使得它们具有低免疫原性或认为它们具有低免疫原性。
本文所述的接头是示例性的，且如果期望，则该接头可以包括其他氨基酸，例如Glu和Lys。如果期望，则肽接头可以包括例如(G4S)(SEQ ID NO:310)、(G3S)(SEQ ID NO:311)、(G2S)(SEQ ID NO:312)和/或(GlySer)(SEQ ID NO:313)的多个重复单元。在某些方面，肽接头可以包括例如(SG4)(SEQ ID NO:314)、(SG3)(SEQ ID NO:315)、(SG2)(SEQ IDNO:316)或(SerGly)(SEQ ID NO:317)的多个重复单元。在其它方面，肽接头可以包括重复氨基酸序列单元的组合和多个重复氨基酸序列单元，例如(G3S)+(G4S)+(GlySer)(SEQ IDNO:311+SEQ ID NO:310+SEQ ID NO:313)。在其它方面，Ser可以被Ala替代，例如(G4A)(SEQID NO:318)或(G3A)(SEQ ID NO：301)。在另外的方面，接头包含基序(EAAAK)n，其中n为等于或大于1的正整数，优选1-约20(SEQ ID NO:319)。在某些方面，肽接头还可以包括可切割接头。
在一个具体的实施方案中，用于本发明方法的GDF15融合体或缀合物包含通过接头连接至异源蛋白质/肽(例如HSA或Fc)或缀合物部分的GDF15部分(例如GDF15多肽，其包含与SEQ ID NO：5至少95％同一的氨基酸序列)，其中所述接头具有氨基酸序列GGSSEAAEAAEAAEAAEAAEAAE(SEQ ID NO：337)。接头的另外的非限制性实例描述在PCT公开号WO2015/197446中，例如SEQ ID NOs：4-13和24-38，该文献作为引用整体并入本文作为参考。
在用于本发明方法的GDF15缀合物(例如GDF15FA缀合物)方面，GDF15部分和缀合部分例如脂肪酸部分可以如下通过接头连接：
所述接头分隔开GDF15部分和缀合物部分，例如脂肪酸部分。在具体的实施方案中，其化学结构并不关键，因为它主要用作间隔基。
在一个具体的实施方案中，接头是化学部分，其包含两个反应性基团/官能团，其中之一可以与GDF15部分反应，而另一个与缀合物部分例如脂肪酸部分反应。接头的两个反应性基团/官能团通过连接部分或间隔基连接，其结构并不关键，只要它不干扰接头与GDF15部分和缀合物部分例如脂肪酸部分例如式A1、A2或A3的脂肪酸部分的偶联。
所述接头可以由彼此通过肽键连接的氨基酸构成。氨基酸可以是天然或非天然的氨基酸。在本发明的一些实施方案中，所述接头由通过肽键连接的1-20个氨基酸构成，其中氨基酸选自20种天然存在的氨基酸。在不同的实施方案中，1-20个氨基酸选自氨基酸甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、谷氨酸和赖氨酸或其酰胺衍生物，例如赖氨酰胺。在一些实施方案中，接头由无空间位阻的多个氨基酸构成，例如甘氨酸和丙氨酸。在一些实施方案中，接头为聚甘氨酸、聚丙氨酸、甘氨酸和丙氨酸的组合(例如聚(Gly-Ala))或甘氨酸和丝氨酸的组合(例如聚(Gly-Ser))。在一些实施方案中，接头由多个氨基酸构成，所述氨基酸选自组氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺和甘氨酸。在一些实施方案中，接头包含聚组氨酸部分。在其他实施方案中，接头包含谷氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸或赖氨酰胺(lysine amide)或其组合。
在一些实施方案中，接头可以具有多于两个可利用的反应性官能团，且由此可以用作连接一个以上脂肪酸部分的方式。例如，氨基酸例如谷氨酰胺、谷氨酸、丝氨酸或赖氨酸可以提供用于脂肪酸部分的几个连接点：氨基酸的侧链和N-末端或C-末端的官能团。
在一些实施方案中，接头包含1-20个氨基酸，其选自非天然氨基酸。尽管1-10个氨基酸残基的接头对于缀合脂肪酸部分是优选的，但本发明还关注任意长度或组成的接头。非天然氨基酸接头的实例是具有下式的8-氨基-3,6-二氧杂辛酸：
或其重复单元。
本文所述的接头是示例性的，且本发明还关注更长且包括另外的残基的接头。非肽接头也是本发明所关注的。
在其他实施方案中，接头包含一个或多个烷基、烯基、环烷基、芳基、杂芳基、杂环基、聚乙二醇和/或一个或多个天然或非天然氨基酸或其组合，其中烷基、烯基、环烷基、芳基、杂芳基、杂环基、聚乙二醇和/或天然或非天然氨基酸各自任选地组合和连接在一起，或通过化学基团连接至GDF15部分和/或连接至脂肪酸部分，所述化学基团选自–C(O)O-、-OC(O)-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、-O-、-NH-、-S-、-C(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)-O-、＝NH-O-、＝NH-NH-或＝NH-N(烷基)-。
包含烷基间隔基的接头是，例如–NH-(CH2)z-C(O)-或–S-(CH2)z-C(O)-或–O-(CH2)z-C(O)-、-NH-(CH2)z-NH-、-O-C(O)-(CH2)z-C(O)-O-、-C(O)-(CH2)z-O-、-NHC(O)-(CH2)z-C(O)-NH-等，其中可以使用z为2-20。这些烷基接头还可以被任意无空间位阻的基团取代，包括但不限于低级烷基(例如C1-C6)、低级酰基、卤素(例如Cl、Br)、CN、NH2或苯基。
接头还可以具有聚合物特性。该接头可以包括生物稳定性的或生物可降解的聚合物链或单元。带有重复键的聚合物在生理条件下可以具有不同的稳定度，视键的不稳定性而定。聚合物可以包含键，例如聚碳酸酯(-O-C(O)-O-)、聚酯(-C(O)-O-)、聚氨基甲酸酯(-NH-C(O)-O-)、聚酰胺(-C(O)-NH-)。这些键作为实例提供，且不用于限制本发明聚合物链或接头中可使用的键的类型。适合的聚合物包括，例如聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚氨基酸、聚乙烯基醚马来酸酐、N-(2-羟丙基)-甲基丙烯酰胺、葡聚糖、葡聚糖衍生物、聚丙二醇、聚氧乙基化多元醇、肝素、肝素片段、多糖、纤维素和纤维素衍生物、淀粉和淀粉衍生物、聚亚烷基二醇及其衍生物、聚亚烷基二醇的共聚物及其衍生物、聚乙烯基乙基醚等及其混合物。聚合物接头是，例如聚乙二醇(PEG)。PEG接头可以是直链或支链的。本发明中PEG接头的分子量不限于任意特定的大小，但某些实施方案具有100-5000道尔顿、例如500-1500道尔顿的分子量。
连接部分(或间隔基)在两末端包含合适的官能团-反应基团，其在肽或多肽/蛋白质的氨基(例如N-末端或赖氨酸的侧链)与脂肪酸部分上的官能团/反应基团(例如脂肪酸部分的羧酸官能团)之间形成桥。备选地，连接部分(或间隔基)在两末端包含合适的官能团-反应基团，其在肽或多肽/蛋白质的酸的羧基(例如C-末端)与脂肪酸部分上的官能团/反应基团(例如式A1、A2和A3的脂肪酸部分的羧酸官能团)之间形成桥。
接头可以包含不同性质的几个连接部分(或间隔基)(例如氨基酸、杂环基部分、PEG和/或烷基部分的组合)。在这种情况下，每一连接部分在两末端包含合适的官能团-反应基团，其在肽或多肽/蛋白质的氨基(例如N-末端或赖氨酸的侧链)和下一个不同性质的连接部分之间形成桥；和/或包含合适的官能团-反应基团，其在前一个不同性质的连接部分和脂肪酸部分之间形成桥。在其他的情况下，每一连接部分在两末端包含合适的官能团-反应基团，其在肽或多肽/蛋白质的酸羧基(例如C-末端)和下一个不同性质的连接部分之间形成桥；和/或包含合适的官能团-反应基团，其在前一个不同性质的连接部分和脂肪酸部分之间形成桥。
另外，连接部分可以具有2个以上末端官能团，且由此可以连接至一个以上脂肪酸部分。这些多官能团部分的实例为谷氨酸、赖氨酸或丝氨酸。氨基酸侧链也可以充当另一个脂肪酸部分的连接点。
修饰的肽或多肽和/或肽-多肽部分构建体(即连接至部分接头的肽/多肽)包括反应基团，其可以与脂肪酸部分上可利用的反应官能团(或修饰的脂肪酸部分：即已经连接至部分接头)反应，形成共价键。反应基团为能够形成共价键的化学基团。反应基团位于缀合的一个位置上，并且通常可以为羧基、磷酰基、酰基、酯或混合酸酐、马来酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、四嗪、炔、亚酰胺化物、吡啶-2-基-二硫烷基，由此能够与缀合的另一个位置上的官能团如氨基、羟基、烯基、肼基、羟基胺基团、叠氮基或硫氢基形成共价键。
GDF15部分缀合至接头和/或接头缀合至脂肪酸部分和/或缀合不同性质的各种连接部分在一起所特别关注的反应基团为N-羟基琥珀酰亚胺、炔(更具体地为环辛炔)。
官能团包括：1.与马来酰亚胺、甲苯磺酰基砜或吡啶-2-基二硫烷基反应的硫氢基；2.用于键合羧酸或活化羧酸的氨基(例如氨基酸的氨基官能团)(例如通过N-羟基琥珀酰亚胺化学形成酰胺键)、磷酰基、酰基或混合酸酐；3.与末端炔且更具体地为环辛炔进行Huisgen环加成的叠氮化物(更通常称作点击化学)；4.与羟基胺或肼反应分别形成肟或肼的羰基；5.在氮杂[4+2]加成中与四嗪反应的烯且更具体地为应变烯(strained alkene)。尽管本文描述了接头和官能团/反应基团的几个实例，但是本发明的方法也关注任意长度和组成的接头。
GDF15融合多肽
在具体的方面，本文所述用于本发明的治疗方法中的有用GDF15融合多肽可以包含GDF15部分和异源部分和任选的接头。在一个具体的实施方案中，本文所述用于本发明的治疗方法中的有用GDF15融合多肽可以包含GDF15部分和为α-1-抗胰蛋白酶(A1AT)或其变体的异源部分和任选的接头。例如，GDF15-A1AT融合多肽描述在PCT公开号WO2016/102580中，该文献通过引用以完整的形式并入本文作为参考。
在具体的方面，本文所述用于本发明的治疗方法中的有用GDF15融合多肽可以包含GDF15部分和血清白蛋白(SA)部分和任选的接头。在一个实施方案中，融合多肽是连续的氨基酸链，其中SA部分位于GDF15部分的N-端。SA部分的C-末端可以直接键合至GDF15部分的N-末端。优选地，SA部分的C-末端通过肽接头间接键合至GDF15部分的N-末端。
SA部分和GDF15部分可以来自任意期望的物种。例如，融合蛋白可以包含SA和GDF15部分，它们来自人、小鼠、大鼠、狗、猫、马或任意其它期望的物种。SA和GDF15部分通常来自相同的物种，但这样的融合肽也被本公开所涵盖，其中SA部分来自一个物种，且GDF15部分来自另一个物种(例如小鼠SA和人GDF15)。
在一些实施方案中，融合多肽包含小鼠血清白蛋白或其功能变体和成熟人GDF15肽或其功能变体。例如，融合蛋白可以具有任一SEQ ID NOS：9、10、12、13和18的氨基酸序列。
在优选的实施方案中，SA部分是HSA或其功能变体，且GDF15部分是成熟人GDF肽或其功能变体。当存在时，任选的接头优选为柔性肽接头。在具体的实施方案中，融合多肽包含：
A)SA部分，其选自HSA(25-609)(SEQ ID NO：4)和其中Cys34被Ser替代且Asn503被Gln替代的HSA(25-609)；和
B)选自如下的GDF15部分：
人GDF15(197-308)(SEQ ID NO:5)；
人GDF15(211-308)(SEQ ID NO:2的氨基酸211-308)；
人GDF15(197-308)(SEQ ID NO:5)，其中Cys203被Ser替代(C203S)，且Cys210被Ser替代(C210S)；和
人GDF15(197-308)(SEQ ID NO:5)，其中Cys273被Ser替代(C273S)。
如果期望，则融合多肽还可以包含使SA部分的C-末端连接至GDF15部分的N-末端的接头。优选地，接头选自(GGGGS)n(SEQ ID NO:303)和(GPPGS)n(SEQ ID NO:304)，其中n为1-约20。优选的接头包括((GGGGS)n(SEQ ID NO:303)和(GPPGS)n(SEQ ID NO:304)，其中n为1、2、3或4。
在更具体的实施方案中，融合多肽包含HSA或其功能变体、接头和成熟人GDF15多肽或其功能变体，并且具有与任一SEQ ID NOs：11、18、19、15具有至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
在甚至更具体的实施方案中，融合多肽具有SEQ ID NOs：11、14、15、16、17、20、21和22的氨基酸序列。
如果期望，则融合多肽可以包含另外的氨基酸序列。例如，可以包括亲和力标签以有利于检测和/或纯化融合多肽。
GDF15缀合物
GDF15缀合物、例如可以用于本发明的治疗方法的GDF15脂肪酸缀合物的不同实施方案如本文所述。将要认识到，在每个实施方案中指定的特征可以与其他所述的特征组合，得到其他实施方案。
在一个具体的实施方案中，用于本文提供的方法的GDF15缀合物包含与部分例如脂肪酸部分缀合的GDF15多肽或其功能变体，其任选地包含接头。在本发明的一些实施方案中，脂肪酸残基是亲脂性残基。
在另一个实施方案中，脂肪酸残基在生理pH下带负电荷。在另一个实施方案中，脂肪酸残基包含可以带负电荷的基团。可以带负电荷的一种优选基团为羧酸基团。
在本发明的另一个实施方案中，脂肪酸残基以非共价键形式键合至白蛋白或其它血浆蛋白。在本发明的另一个实施方案中，脂肪酸残基选自直链烷基、支链烷基、具有ω-羧酸基的基团、部分或完全氢化的环戊烷并菲骨架。
在另一个实施方案中，脂肪酸残基为cibacronyl残基。
在另一个实施方案中，脂肪酸残基具有6-40个碳原子、8-26个碳原子或8-20个碳原子。
在另一个实施方案中，脂肪酸残基是选自R-C(O)-的酰基，其中R为C4-38直链或支链烷基或C4-38直链或支链烯基，其中每个所述烷基和烯基任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基选自–CO2H、羟基、-SO3H、卤素和-NHC(O)C(O)OH。酰基(R-C(O)-)衍生自相应羧酸R-C(O)OH与GDF15多肽上的氨基的反应。
在另一个实施方案中，脂肪酸残基是选自CH3(CH2)r-CO的酰基，其中r是4-38的整数，优选4-24的整数，更优选地选自CH3(CH2)6CO-、CH3(CH2)8-CO-、CH3(CH2)10-CO-、CH3(CH2)12-CO-、CH3(CH2)14-CO-、CH3(CH2)16-CO-、CH3(CH2)18-CO-、CH3(CH2)20-CO和CH3(CH2)22-CO-。
在另一个实施方案中，脂肪酸残基是直链或支链烷α,ω二羧酸的酰基。
在另一个实施方案中，脂肪酸残基是选自HOOC-(CH2)sCO-的酰基，其中s是4-38的整数，优选4-24的整数，更优选地选自HOOC(CH2)14-CO-、HOOC(CH2)16-CO-、HOOC(CH2)18-CO-、HOOC(CH2)20-CO-和HOOC(CH2)22-CO-。
在另一个实施方案中，脂肪酸残基是式CH3-(CH2)x-CO-NH-CH(CH2CO2H)-C(O)-的基团，其中x是8-24的整数。
在另一个实施方案中，脂肪酸残基选自：CH3-(CH2)6-24-CO2H；CF3-(CF2)4-9-CH2CH2-CO2H；CF3-(CF2)4-9-CH2CH2-O-CH2-CO2H；CO2H-(CH2)6-24-CO2H；SO2H-(CH2)6-24-CO2H；其中脂肪酸连接至GDF15多肽上的氨基(N-末端或赖氨酸的侧链)或通过其羧酸官能团之一连接至接头上的氨基。
脂肪酸的具体实例为：
其中脂肪酸连接至GDF15的N-末端或GDF15的侧链上的氨基或通过其羧酸官能团之一连接至接头上的氨基。
特别关注，上述举出的脂肪酸与GDF15之间的接头包含赖氨酸、谷氨酸、如下的重复单元：
优选1-3；或其混合物。
更优选地，接头包含一个或多个谷氨酸氨基酸和CO2H-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-NH2的一个或多个重复单元。
连接至一个或两个谷氨酸氨基酸的脂肪酸的实例为：
其中手性碳原子独立地为R或S，且其中脂肪酸-接头部分连接至GDF15的N-末端或连接至GDF15侧链上的氨基或通过谷氨酸羧酸官能团之一连接至另一连接部分上的氨基。
另外特别关注，接头包含一个或多个赖氨酸或赖氨酰胺氨基酸和CO2H-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-NH2的一个或多个重复单元。
连接至赖氨酸或/和赖氨酰胺氨基酸的脂肪酸部分的实例为：
其中赖氨酸的伯氨基连接GDF15的C-末端或连接至GDF15侧链上的羧酸官能团；或连接至另一连接部分上的羧酸官能团。
与上述脂肪酸一起使用的接头的另一个具体实例为4-氨磺酰基丁酸：
连接至上述接头的脂肪酸的实例为：
其中脂肪酸-接头部分连接至GDF15的N-末端或连接至GDF15侧链上的氨基或通过氨磺酰基丁酸部分上的羧酸官能团连接至另一连接部分上的氨基。
另外，这类脂肪酸接头构建体还可以包含如下重复单元：
优选1-4个。
脂肪酸-接头构建体的另外的实例进一步公开在US 2013/0040884中，白蛋白-结合缀合物包含脂肪酸和PEG(Novo Nordisk)，该文献通过引用并入本文作为参考。
这类构建体优选通过羧酸官能团连接至GDF15的N-末端。
在实施方案1中，本发明涉及缀合物，其包含通过接头连接至脂肪酸部分的GDF15部分，其中脂肪酸部分具有下式A1、A2或A3：
R1是CO2H、H；
R2、R3和R4彼此独立地为H、OH、CO2H、-CH＝CH2或–C＝CH；
Ak为支链C6-C30亚烷基；
n、m和p彼此独立地为6-30的整数；或其酰胺、酯或其药学上可接受的盐。
在实施方案1A中，本发明涉及实施方案1的缀合物，其中脂肪酸部分属于式A1。在本实施方案的一个具体的方面，所述缀合物包含式A1的脂肪酸部分，其中n和m独立地为8-20，优选10-16。在本实施方案的另一个方面，本发明涉及实施方案1或1A的缀合物，其中脂肪酸部分具有式A1，且其中R2和R3的至少一个为CO2H。
在实施方案2中，本发明涉及实施方案1或1A的缀合物，其中脂肪酸部分选自下式：
其中Ak3、Ak4、Ak5、Ak6和Ak7独立地为(C8-20)亚烷基，R5和R6独立地为(C8-20)烷基。
在实施方案3中，本发明涉及实施方案1、1A或2的缀合物，其中脂肪酸部分选自下式：
在实施方案3A中，本发明涉及实施方案1、1A或2的缀合物，其中脂肪酸部分选自下式：
在实施方案3B中，本发明涉及实施方案1的缀合物，其中脂肪酸部分具有式A2或A3。在本实施方案的一个具体的方面，所述缀合物包含式A2的脂肪酸部分，其中p为8-20；或式A3的脂肪酸部分，其中Ak为C8-20亚烷基。
在实施方案3C中，本发明涉及实施方案1或3B的缀合物，其中脂肪酸部分选自下式：
其中Ak2为C8-20亚烷基。
在实施方案4中，本发明涉及前述缀合物实施方案任一项的缀合物，其中接头包含一个或多个烷基、烯基、环烷基、芳基、杂芳基、杂环基、聚乙二醇、一个或多个天然或非天然氨基酸或其组合，其中烷基、烯基、环烷基、芳基、杂芳基、杂环基、聚乙二醇和/或天然或非天然氨基酸各自任选地组合和连接在一起或通过化学基团连接至GDF15部分和/或脂肪酸部分，所述化学基团选自–C(O)O-、-OC(O)-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、-O-、-NH-、-S-、-C(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)-O-、＝NH-O-、＝NH-NH-或＝NH-N(烷基)-。
在实施方案5中，可以用于本发明治疗方法中的脂肪酸缀合物涉及前述缀合物实施方案任一项的缀合物，其中接头包含下式的无支链寡乙二醇部分：
其中y为0-34。
在实施方案6中，本发明涉及前述缀合物实施方案的任一项的缀合物，其中接头包含(或进一步包含)杂环部分，其选自下式：
包含这类杂环基的接头例如通过叠氮化物-炔Huisgen环加成(更通常称作点击化学)得到。更具体地，上述杂环基的一些因环炔与包含叠氮化物的部分反应得到。
环炔易于得自商业来源且由此可以通过与包含叠氮化物的官能团的部分(例如包含末端叠氮化物官能团的接头)环加成被官能化。蛋白质标记中环炔点击化学的应用的实例描述在US 2009/0068738中，该文献引用并入本文作为参考。
可以用于Huisgen环加成的环炔剂的非限制性实例为：
在实施方案6A中，本发明涉及脂肪酸缀合物，其中接头包含(或进一步包含)杂环基，其选自下式：
其中r是0-2的整数，且s是0-3的整数。
这类杂环接头可以通过烯或优选地应变烯例如环烷与如下部分的氮杂[4+2]环加成得到：
其中Rf为例如-CH2NH2、-OH、-CH2-CO2H、-S-CH2-CO2H、-(O-CH2)4-6-C(O)-OH–或
这类四嗪部分易于得自商业来源且可以与含烯的部分例如包含末端烯官能团的接头反应。
在实施方案6B中，本发明涉及脂肪酸缀合物，其中接头包含(或进一步包含)下式的杂环基：
这类杂环部分可以通过使马来酰亚胺与包含硫氢基的部分例如包含末端硫氢基官能团的接头反应得到。
这些易于得到和/或商购的试剂直接或通过如上所述的接头连接至目的肽或多肽。炔、马来酰亚胺或四嗪反应基团与存在于脂肪酸部分或接头-脂肪酸构建体(例如PEG-脂肪酸构建体)上的官能团(分别为叠氮化物、硫氢基和烯)反应。
在实施方案7中，本发明涉及前述缀合物实施方案的任一项的缀合物，其中接头包含或进一步包含一个或多个氨基酸，其独立地选自组氨酸,甲硫氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺和甘氨酸。在该实施方案的一个具体的方面，接头包含1-6个氨基酸，其选自组氨酸、丙氨酸和甲硫氨酸。
在实施方案8中，本发明涉及前述缀合物实施方案的任一项的缀合物，其中GDF15部分是人生长分化因子15(GDF15)或相关蛋白和同源物、变体、片段和其它修饰形式。在实施方案8A中，本发明涉及前述缀合物实施方案的任一项的缀合物，其中GDF15部分是人生长分化因子15(GDF15)变体。
在实施方案8B中，本发明还关注实施方案8A的缀合物，其中人GDF15变体通过用另一个残基替代成熟多肽的一个或多个氨基酸残基得到。在该实施方案的一个具体方面，人GDF15的N-末端上的最后2个氨基酸残基(即精氨酸198和丙氨酸197)已经被氨基酸序列XH替代，其中H为组氨酸且X是选自甲硫氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺和甘氨酸的氨基酸。在该实施方案的一个优选方面，hGDF15变体为MH(199-308)hGDF15或AH(199-308)hGDF15。
在实施方案8C中，人GDF15的N-末端上的最后3个氨基酸残基(即天冬酰胺199、精氨酸198和丙氨酸197)已经被氨基酸序列XHX’替代，其中H为组氨酸，且X’和X为独立地选自甲硫氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺和甘氨酸的氨基酸。在本实施方案的另一个方面，人GDF15的N-末端上的最后3个氨基酸残基(即天冬酰胺199、精氨酸198和丙氨酸197)已经被氨基酸序列AHX’替代，其中H为组氨酸，且X’是独立地选自甲硫氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺和甘氨酸氨基酸。在该实施方案的一个优选方面，修饰的GDF15蛋白质为MHA(200-308)hGDF15或AHA(200-308)hGDF15。
在一个实施方案中，本发明涉及包含属于式R-CO2H的脂肪酸的GDF15脂肪酸缀合物，其中R为C4-38直链或支链烷基或C4-38直链或支链烯基，其中每个所述烷基和烯基任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基选自–CO2H、羟基、-SO3H、卤素和-NHC(O)C(O)OH，但其中脂肪酸残基不是式A1、A2、A3的脂肪酸，且其中脂肪酸不是肉豆蔻酸。
在另一个实施方案中，本发明涉及实施方案7、8、8B、8C任一项的GDF15脂肪酸缀合物，其中GDF15脂肪酸缀合物不含式A1、A2或A3的脂肪酸且不含肉豆蔻酸。
在另一个实施方案中，本发明涉及实施方案1-8的GDF15-脂肪酸缀合物，其中GDF15脂肪酸缀合物不包含如下的氨基酸序列：
(i)SEQ ID NO:41；
(ii)
MHHHH HHAR NGDHC PLGPG RCCRL HTVRA SLEDL GWADW VLSPR EVQVT MCIGACPSQF RAANM HAQIK TSLHR LKPDT VPAPC CVPAS YNPMV LIQKT DTGVS LQTYD DLLAK DCHCI(M-(his)6-hGDF15(197-308))(SEQ ID NO:321),
(iii)
MHHHHHHMARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI(M-(his)6-M-hGDF15(197-308))(SEQID NO:322),
(iv)
MHHHHHHAHARDGCPLGEGRCCRLQSLRASLQDLGWANWVVAPRELDVRMCVGACPSQFRSANTHAQMQARLHGLNPDAAPAPCCVPASYEPVVLMHQDSDGRVSLTPFDDLVAKDCHCV(M-(his)6-dGDF15)(SEQ ID NO:323),
(v)
MHNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI(MH-hGDF15(199-308))(SEQ ID NO:324),
(vi)
MHAGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI(MHA-hGDF15(200-308))(SEQ ID NO:325),和
(vii)
AHNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI(AH-hGDF15(199-308)(SEQ ID NO:326)。
包含式A1、A2、A3的脂肪酸的脂肪酸GDF15缀合物的实例描述在PCT申请号WO2015/200080中。
与天然GDF15相比，GDF15变体使得能够选择性地标记N-末端的蛋白质(即缀合脂肪酸在GDF15的优选N-末端)。肽和蛋白质的选择性标记更详细地描述在PCT申请号WO2015/200078中。
核酸和宿主细胞
本发明还涉及编码本文所述的融合多肽的核酸，其用于本发明方法中的施用，包括可以用于产生融合多肽的载体。核酸是分离的和/或重组的。在某些实施方案中，核酸编码融合多肽，其中HSA或其功能变体位于人成熟GDF15或其功能变体的N-末端。如果期望，则核酸可以进一步编码接头(例如柔性肽接头)，其使HSA或其功能变体的C-末端键合至人成熟GDF15或其功能变体的N-末端。如果期望，则核酸还可以编码前导序列或信号序列以指导细胞加工和融合多肽分泌。
在优选的实施方案中，所述核酸编码融合多肽，其中SA部分是HSA或其功能变体，且GDF15部分是成熟人GDF肽或其功能变体。当存在时，任选的接头优选是柔性肽接头。在具体的实施方案中，所述核酸编码融合多肽，其包含A)SA部分，其选自HSA(25-609)(SEQ IDNO:4)和其中Cys34被Ser替代且Asn503被Gln替代的HSA(25-609)；和
B)GDF15部分，其选自：
人GDF15(197-308)(SEQ ID NO:5)；
人GDF15(211-308)(SEQ ID NO:2的氨基酸211-308)；
人GDF15(197-308)(SEQ ID NO:5)，其中Cys203被Ser替代(C203S)且Cys210被Ser替代(C210S)；和
人GDF15(197-308)(SEQ ID NO:5)，其中Cys273被Ser替代(C273S)。
如果期望，则编码的融合多肽还可以包含接头，其使SA部分的C-末端连接至GDF15部分的N-末端。优选地，所述接头选自(GGGGS)n(SEQ ID NO：303)和(GPPGS)n(SEQ ID NO:304)和(GPPGS)n(SEQ ID NO:304)，其中n为1-约20。优选的接头包括((GGGGS)n(SEQ IDNO:303)和(GPPGS)n(SEQ ID NO:304)，其中n为1、2、3或4。
为了在宿主细胞中表达，编码融合多肽的核酸可以存在于适合的载体中，并且在导入适合的宿主后，可以表达序列以便根据本领域已知的标准克隆和表达技术产生编码的融合多肽(例如如Sambrook,J.,Fritsh,E.F.和Maniatis,T.Molecular Cloning：ALaboratory Manual第2版,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989中所述)。本发明还涉及包含本发明核酸序列的这类载体。
可以设计重组表达载体以便在原核细胞(例如大肠杆菌(E.coli))或真核细胞(例如昆虫细胞、酵母细胞或哺乳动物细胞)中表达GDF15融合多肽。有代表性的宿主细胞包括许多大肠杆菌菌株、哺乳动物细胞系例如CHO、CHO-K1和HEK293；昆虫细胞，例如Sf9细胞；和酵母细胞，例如酿酒酵母(S.cerevisiae)和巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)。备选地，可以例如使用T7启动子调节序列和T7聚合酶和体外翻译系统体外转录和翻译重组表达载体。适合于宿主细胞和无细胞的体外系统中表达的载体是本领域众所周知的。通常，这类载体包含一个或多个表达控制元件，其有效连接至编码融合多肽的序列。表达控制元件包括，例如启动子、增强子、剪接位点、聚腺苷酸化信号等。通常，启动子位于上游且有效连接至编码融合多肽的核酸序列。载体可以包含任意适合的启动子、增强子和其它表达控制元件或与它们连接。这类元件的实例包括强表达启动子(例如人CMV IE启动子/增强子、RSV启动子、SV40启动子、SL3-3启动子、MMTV启动子或HIV LTR启动子、EF1α启动子、CAG启动子)和有效的多聚(A)终止序列。可以存在于载体中以有利于克隆和增殖的另外的元件包括，例如大肠杆菌中质粒产物的复制起点、抗生素抗性基因作为选择标记和/或便利的克隆位点(例如多接头)。
在本公开的另一个方面，提供了包含本文公开的核酸和载体的宿主细胞。在不同的实施方案中，将所述载体或核酸整合入宿主细胞基因组，在其他实施方案中，所述载体或核酸是染色体外的。如果期望，则可以分离宿主细胞。
提供了包含这类核酸、载体或任一或两者组合的重组细胞，例如酵母、细菌(例如大肠杆菌)和哺乳动物细胞(例如永生化哺乳动物细胞)。在多个实施方案中，提供了包含非整合核酸例如质粒、粘粒、噬菌粒或线性表达元件的细胞，其包含编码含有人血清白蛋白或其功能变体和人GDF15蛋白或其功能变体的融合多肽的用于表达的序列。
可以使用任意适合的方法例如通过转化、转染或转导将本文提供的包含编码GDF15融合多肽的核酸的载体导入宿主细胞。适合的方法是本领域众所周知的。在一个实例中，包含编码人血清白蛋白或其功能变体和人GDF15蛋白或其功能变体的融合多肽的核酸可以通过病毒载体定位在宿主细胞或宿主动物中和/或递送至它们。任意适合的病毒载体可以用于该能力中。
本发明还提供了用于生产本文所述的融合多肽的方法，包括在适合于重组核酸表达的条件下维持包含本发明重组核酸的重组宿主细胞，由此表达重组核酸并且产生融合多肽。在一些实施方案中，该方法还包括分离所述融合多肽。
治疗方法和药物组合物
本发明涉及在有需要的受试者中治疗非酒精性脂肪肝病(NAFLD)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)以及终末期肝病、肝脂肪变性(脂肪肝)、肝纤维化、肝炎、肝硬化、原发性胆汁性肝硬变(PBC)和肝细胞癌(HCC)的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用有效量的如本文所述的例如GDF15多肽、GDF15变体、GDF15融合多肽或GDF15FA缀合物(通常以药物组合物的形式)。
非酒精性脂肪肝病(NAFLD)是影响美国多达每3-5个成人中有1个人和10个儿童中有1个人的疾病，并且指的是几乎不饮酒或不饮酒的人的肝脏中过量脂肪积累的情况。NAFLD最常见的形式是称为肝脂肪变性(脂肪肝)的非严重病症，其中脂肪在肝细胞中累积；尽管不是生理正常状态，但作为肝脂肪自身本身不会损害肝脏。NAFLD自身最常出现在患有称为“代谢综合征”的一组危险因素的个体中，所述危险因素的特征在于空腹血糖(FPG)升高，伴随或不伴随餐后血糖不耐受，超重或肥胖，高血脂如胆固醇和甘油三酯(TGs)和低的高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平以及高血压；但并非所有的NAFLD患者都具有代谢综合征的所有表现。认为肥胖是NAFLD的最常见原因，一些专家估计约三分之二的肥胖成年人和一半肥胖儿童可能具有脂肪肝。大多数具有NAFLD的个体没有症状和正常的体格检查(尽管肝脏可能会轻度肿大)；儿童可能会出现例如腹痛和疲劳这样的症状，并可能出现斑片状深色皮肤变色(黑棘皮症)。NAFLD的诊断通常首先在超重或肥胖者中疑似，发现他们在常规检测中出现其肝脏血液检测的轻度升高；NAFLD可以存在于正常的肝脏血液检测中，然而或者偶然在例如腹部超声或CT扫描这样的成像检查中检测到。它通过影像学研究证实，最常见的是肝脏超声或核磁共振成像(MRI)，并且排除其他原因。
一些患有NAFLD的人可能会出现更严重的疾病，称为非酒精性脂肪性肝炎(NASH)：大约2-5％的成年美国人和多达20％的肥胖者可能患有NASH。在NASH中，肝脏中的脂肪堆积与炎症和不同程度的疤痕相关。NASH是一种潜在的严重疾病，具有进展为终末期肝病、肝硬化和肝细胞癌的实质性风险。一些发展为肝硬化的患者有发生肝衰竭的危险，且可能最终需要肝移植。
NAFLD可以通过NAFLD活动评分(NAS)与NASH区分开来，NAFLD活动评分(NAS)是用于肝脂肪变性(0至3)、小叶炎症(0至2)和肝细胞球囊化(0至2)的肝活组织检查的组织病理学评分的总和。NAS<3相当于NAFLD，3-4相当于临界NASH，且>5相当于NASH。将该活检对纤维化(0至4)评分。
非酒精性脂肪肝病(NAFLD)是肝脏中良性脂质蓄积(脂肪变性)到伴有炎症的脂肪变性的病症。后者被称为非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。NASH被认为是代谢综合征的肝脏要素。来自美国的估计是所有成年人中有5.7％至17％患有NASH，而17％至33％的美国人患有NAFLD[1,2]。由于肥胖和胰岛素抵抗在工业化国家达到流行比例，所以NAFLD和NASH的患病率正在增加，因此被认为是一种重大的健康危害[3]。单独的脂肪变性被认为是肝脏本身的一种相对良性的病症，并且也是一种可逆的病症。然而，向NASH过渡代表了发病机制中的关键步骤，因为它为肝脏进一步损伤设置了阶段，例如纤维化，肝硬化和肝癌。虽然导致脂肪变性的机制已被很好地描述，但对有关在进展至NASH的过程中驱动肝脏炎症的实际危险因素知之甚少。因此，难以进行治疗选择。
NASH是终末期肝病的主要原因；而NAFLD和甚至更大程度的NASH与包括胰岛素抵抗(前驱糖尿病)和2型糖尿病(T2DM)和腹部肥胖在内的代谢综合征状态密切相关。T2DM已成为NAFLD预后不良的最显著的预测指标，而升高的肝酶被视为是不可靠的。在存在长期T2DM时NASH更频繁地发生，和具有隐源性肝硬化的大部分患者存在肥胖和/或糖尿病。研究证实60％具有T2DM和NAFLD的患者具有活检证实的NASH，且晚期肝硬化在具有糖尿病和高血压的那些患者中占75％，而与之相比，没有上述任一病症之一的仅占7％。Haukeland,"Abnormal glucose tolerance is a predictor of nonalcoholic steatohepatitis andfibrosis in patients with non-alcoholic fatty liver disease",ScandJ.Gastroenterol.,40,1469-1477(2005)报道受损的葡萄糖耐量(IGT)和T2DM是严重性NAFLD和NASH的唯一独立风险因子，比值比(odds ratio)增加了几乎4-倍。Mofrad,"Clinical and histological spectrum of nonalcoholic fatty liver diseaseassociated with normal ALT levels",Hepatology,37,1286-1292(2003)报道了一项研究，其证实肝转氨酶升高的预测值缺乏，该预测值用于诊断具有NAFLD的患者中的NASH，并且发现T2DM为独立地与晚期纤维化风险增加相关的唯一因素。
因此，NASH是T2DM被忽略的并发症，其通常与纤维化相关并且约10％的患者导致肝硬化；而肝细胞癌的风险也在具有T2DM和NASH的患者中增加。具有NAFLD和NASH的患者通常表现出混合血脂异常和上述另外的代谢紊乱，包括主要由小致密颗粒组成的致动脉粥样硬化低密度脂蛋白(LDL)表型。代谢综合征和NAFLD/NASH的特征在于心血管炎症增加，如根据高敏感性C-反应蛋白(hsCRP)和其它炎性细胞因子升高所确定的。
“非酒精性脂肪性肝炎”或NASH是常见的肝脏疾病，其类似于酒精性肝病，但发生在几乎不饮或不饮酒的人群中。NASH中的主要特征是肝脏中的脂肪与伴有炎症和损伤。NASH可导致肝硬化，其中肝脏永久损伤和形成瘢痕，且不再能够正常工作。NASH影响美国人口的2％至5％。目前，没有针对NASH的特定疗法。另有10％至20％的美国人在他们的肝脏中有脂肪，但没有实质性的炎症或肝脏损伤，称为“非酒精性脂肪肝疾病”(NAFLD)的病症。尽管肝脏中的脂肪不正常，但它本身几乎不会造成伤害或永久性损伤。如果基于血液检查结果或肝脏扫描怀疑发现脂肪，则这个问题称为NAFLD。如果在这种情况下进行肝活检，则将显示有些人患有NASH，而另一些人患有NAFLD。
NASH通常首先在被发现包括在常规血液测试组中的肝试验中发现具有例如丙氨酸转氨酶(ALT)或天冬氨酸转氨酶(AST)升高的人。当进一步评估显示肝病无明显原因时(如药物治疗，病毒性肝炎或过度使用酒精)，以及当肝脏的X射线或影像学检查显示脂肪时，疑似有NASH。通过肝活检诊断NASH并与NAFLD分开。对于肝脏活组织检查，将一根针透过皮肤插入以取出一小片肝脏。当用显微镜检查组织时显示脂肪以及炎症和肝细胞受损，则诊断为NASH。如果组织显示脂肪而没有炎症和损伤，则诊断为NAFLD。从活检中得到的一条重要信息是瘢痕组织是否在肝脏发生。
NASH可能会缓慢地恶化，导致瘢痕形成或纤维化出现并积聚在肝脏中。随着纤维化恶化，肝硬化发展；肝脏变得出现严重瘢痕、硬化且无法正常起作用。一旦出现严重的瘢痕形成或肝硬化，则几乎没有治疗方法可以阻止其进展。具有肝硬化的患者会经历体液潴留，肌萎缩，肠道出血和肝功能衰竭。肝移植是治疗晚期肝硬化伴肝功能衰竭的唯一治疗方法，并且在具有NASH的患者中进行移植逐步增多。例如，NASH被列为美国肝硬化的主要原因之一，排在丙型肝炎和酒精性肝病之后。
目前没有批准用于预防或治疗NAFLD或NASH的药物。在NAFLD/NASH已经尝试了许多药物干预措施，但总体上有益性是有限的。抗氧化剂可以阻止脂质过氧化作用，并且细胞保护剂稳定磷脂膜，但活性剂迄今为止尝试的不成功或仅具有适度的益处包括熊去氧胆酸、维生素E(α-生育酚)和维生素C以及己酮可可碱等。与仅使用饮食和运动来达到体重减轻(“单独的体重减轻”)相比，减肥药如奥利司他没有显著的益处。NAFLD/NASH中的大多数体重减轻研究都是短期和有限成功的试验性研究，仅报告坏死性炎症或纤维化的适度改善。针对吡格列酮(一种噻唑烷二酮过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(PPARγ)激动剂和胰岛素致敏物)单独的体重减轻的一项随机、双盲、安慰剂对照的6个月试验(Belfort,"Aplacebo-controlled trial of pioglitazone in subjects with nonalcoholicsteatohepatitis",N.Engl.J.Med.,355、2297-2307(2006))没有显示单独的体重减轻的任何改善，但用吡格列酮治疗可改善胰岛素控制，胰岛素敏感性，全身炎症指标(包括hsCRP，肿瘤坏死因子-α和转化生长因子-β)以及具有NASH和IGT或T2DM患者的肝脏组织学。使用吡格列酮治疗也可改善脂肪、肝脏和肌肉IR，并且与坏死性炎症减少约50％(p<0.002)和纤维化减少37％(p＝0.08)相关。最近在另一项使用持续12个月期限的吡格列酮的对照试验中报告了肝细胞损伤和纤维化的改善。
相反，尽管用罗格列酮(另一种批准用于糖尿病治疗的噻唑烷二酮)在NASH中进行的第一次随机临床研究显示IR、血浆丙氨酸转氨酶(ALT)水平和脂肪变性减少，但罗格列酮治疗对坏死、炎症或纤维化没有显著影响。这项试验为期2年的开放标签随访的初步报告也令人失望，其中罗格列酮治疗没有明显益处。因此，在NASH中药效最强的药物是吡格列酮。令人遗憾地，吡格列酮还与体重增长、水肿、充血性心力衰竭和女性和男性中的骨质疏松性骨折的风险显著增加有关。
将有效量的融合多肽、通常是药物组合物的形式施用于有此需要的受试者。可以以单剂量或多剂量施用融合多肽，并且所施用的量和施用方案取决于所选择的特定融合蛋白、受试者病情的严重程度和其它因素。本领域普通临床医生可以基于许多因素决定适合的施用和剂量方案，例如个体年龄、敏感性、耐受性和总体健康感觉。
可以通过任意适合的途径，使用适合的方法进行施用，例如通过胃肠外(例如静脉内、皮下、腹膜内、肌内、鞘内注射或输注)、口服、局部、鼻内或通过吸入。通常优选胃肠外(Parental)施用。优选皮下施用。
本发明的GDF15缀合物或GDF15融合多肽可以单独或与一种或多种其它药剂一起施用于有此需要的受试者。当将融合多肽与另一种药剂一起施用时，该药剂可以同时或依次施用以提供药剂的治疗效果的叠加。可以与融合多肽组合施用的其它药剂的实例包括：
1.抗糖尿病药，例如胰岛素，胰岛素衍生物和模拟物；胰岛素促分泌剂如磺酰脲类(例如氯磺丙脲，妥拉磺脲，醋磺己脲，甲苯磺丁脲，格列本脲，格列美脲，格列吡嗪)；格列本脲和亚莫利；促胰岛素磺酰脲受体配体例如氯茴苯酸类，例如那格列奈和瑞格列奈；噻唑烷二酮类(例如，罗格列酮(AVANDIA)，曲格列酮(REZULIN)，吡格列酮(ACTOG)，巴格列酮，利格列酮，萘格列酮，曲格列酮，恩格列酮，环格列酮，adaglitazone，达格列酮(例如通过胰岛素致敏作用)，由此促进周围组织中的葡萄糖利用；蛋白质酪氨酸磷酸酶-1B(PTP-1B)抑制剂，例如PTP-112；胆固醇酯转移蛋白(CETP)抑制剂，例如托塞曲匹，GSK3(糖原合酶激酶-3)抑制剂，例如SB-517955，SB-4195052，SB-216763，NN-57-05441和NN-57-05445；RXR配体，例如GW-0791和AGN-194204；钠依赖性葡萄糖协同转运蛋白抑制剂，例如T-1095；糖原磷酸化酶A抑制剂，例如BAY R3401；双胍，例如二甲双胍和其它通过促进葡萄糖利用、减少肝葡萄糖产生和/或减少肠葡萄糖输出而起作用的药物；α-葡萄糖苷酶抑制剂，例如阿卡波糖和米格列托(migiitoi)和其它减缓碳水化合物消化、从而减缓肠道吸收和减少餐后高血糖的药剂；GLP-1(胰高血糖素样肽-1)，GLP-1类似物，例如Exendin-4和GLP-1模拟物；和DPPIV(二肽基肽酶IV)抑制剂，例如维格列汀；
2.降血脂药，例如3-羟基-3-甲基-戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂，例如，洛伐他汀，匹伐他汀，辛伐他汀，普伐他汀，西立伐他汀，美伐他汀，维洛他汀(velostatin)，氟伐他汀，达伐他汀，阿托伐他汀，rivastatin；鲨烯合酶抑制剂；FXR(法尼酯X受体)和LXR(肝X受体)配体；胆汁酸螯合剂例如考来烯胺和考来维仑；贝特类；烟酸和阿司匹林；
3.减肥药，例如奥利司他，利莫那班，芬特明，托吡酯，qnexa和locaserin；
4.抗高血压药，例如髓袢利尿剂，例如依他尼酸，呋塞米和托拉塞米；血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂，例如贝那普利，卡托普利，依那普利，福辛普利，赖诺普利，莫昔普利，培哚普利，喹那普利，雷米普利和群多普利；Na-K-ATP酶膜泵的抑制剂，例如地高辛；中性肽链内切酶(NEP)抑制剂，例如沙卡布曲(sacubitril)；ACE/NEP抑制剂，例如奥马曲拉，山帕曲拉和法西多曲；血管紧张素II拮抗剂，例如坎地沙坦，依普罗沙坦，厄贝沙坦，氯沙坦，替米沙坦和缬沙坦，特别是缬沙坦；NEP抑制剂和血管紧张素II拮抗剂例如沙卡布曲和缬沙坦(即Entresto)的组合；肾素抑制剂，例如地替吉仑，占吉仑，特拉吉仑，阿利吉仑，RO 66-1132和RO-66-1168；β-肾上腺素能受体阻断剂，例如醋丁洛尔，阿替洛尔，倍他洛尔，比索洛尔，美托洛尔，纳多洛尔，普萘洛尔，索他洛尔和噻吗洛尔；正性肌力药，例如地高辛，多巴酚丁胺和米力农；钙通道阻滞剂，例如氨氯地平，苄普地尔，地尔硫卓，非洛地平，尼卡地平，尼莫地平，硝苯地平，尼索地平和维拉帕米；醛固酮受体拮抗剂；和醛固酮合酶抑制剂；
5.过氧化物酶体增殖物激活剂受体激动剂(例如非诺贝特，吡格列酮，罗格列酮，替格列扎，BMS-298585，L-796449，专利申请WO 2004/103995中具体描述的化合物，即实施例1至35的化合物或权利要求21中具体列出的化合物或专利申请WO 03/043985中具体描述的化合物，即实施例1至7的化合物或权利要求19中具体列出的化合物，且特别是(R)-1-{4-[5-甲基-2-(4-三氟甲基-苯基)-唑-4-基甲氧基]-苯磺酰基}-2,3-二氢-1H-吲哚-2-甲酸或其盐；和
6.Expert Opin Investig Drugs 2003,12(4)：623-633,图1-7中描述的具体抗糖尿病化合物。
本发明还涉及药物组合物，其包含如本文所述的GDF15缀合物或GDF15融合多肽(例如，包含含有人血清白蛋白或其功能变体和人GDF15蛋白或其功能变体的融合多肽)。这类药物组合物可以包含治疗有效量的融合多肽和药学上或生理学上可接受的载体。一般对所述载体进行选择以适合于预期施用模式并且可以包括用于改变、维持或保护例如组合物的pH、摩尔渗透压浓度、粘度、澄明度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶出或释放速率、吸收或渗透性。典型地，这些载体包括水性溶液或醇/水溶液、乳剂或混悬液，包括盐水和/或缓冲介质。
包含在药物组合物中的适合的试剂包括但不限于氨基酸(例如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，精氨酸或赖氨酸)，抗微生物剂，抗氧化剂(例如抗坏血酸，亚硫酸钠或亚硫酸氢钠)，缓冲剂(例如硼酸盐，碳酸氢盐，Tris-HCl，柠檬酸盐，磷酸盐或其它有机酸)，填充剂(例如甘露糖醇或甘氨酸)，螯合剂(例如乙二胺四乙酸(EDTA))，络合剂(例如咖啡因，聚乙烯吡咯烷酮，β-环糊精或羟丙基-β-环糊精)，填充剂，单糖，二糖和其它碳水化合物(例如葡萄糖，甘露糖或糊精)，蛋白质(例如游离血清白蛋白，明胶或免疫球蛋白)，着色剂，调味剂和稀释剂，乳化剂，亲水聚合物(例如聚乙烯吡咯烷酮)，低分子量多肽，成盐抗衡离子(例如钠)，防腐剂(例如苯扎氯铵，苯甲酸，水杨酸，硫柳汞苯乙醇，对羟基苯甲酸甲酯，对羟基苯甲酸丙酯，氯己定，山梨酸或过氧化氢)，溶剂(例如甘油，丙二醇或聚乙二醇)，糖醇(例如甘露糖醇或山梨醇)，助悬剂，表面活性剂或润湿剂(例如普流罗尼类；PEG；山梨糖酯类；聚山梨醇酸酯，例如聚山梨酯20或聚山梨酸酯80；Triton；氨丁三醇；卵磷脂；胆固醇或泰洛沙泊(tyloxapal))，稳定增强剂(例如蔗糖或山梨醇)，张度增强剂(例如碱金属卤化物，例如氯化钠或氯化钾或甘露糖醇山梨糖醇)，递送载体，稀释剂，赋形剂和/或药物佐剂。
肠胃外媒介物(vehicle)包括氯化钠溶液，林格氏右旋糖，葡萄糖和氯化钠以及乳酸林格氏液。可以包括适合的生理上可接受的增稠剂，例如羧甲基纤维素，聚乙烯吡咯烷酮，明胶和藻酸盐。静脉内注射媒介物包括流体和营养补充剂和电解质补充剂，例如基于林格氏葡萄糖的补充剂。在一些情况下，优选包括调节组合物的张力的试剂，例如药物组合物中的糖，多元醇如甘露糖醇，山梨醇或氯化钠。例如，在许多情况下，期望组合物基本上是等渗的。也可能存在防腐剂和其它添加剂，例如抗菌剂，抗氧化剂，螯合剂和惰性气体。精确的配方将取决于施用途径。用于药物制剂的其它相关原理、方法和成分是众所周知的。(参见，例如Allen,Loyd V.Ed,(2012)Remington's Pharmaceutical Sciences,第22版)。
当考虑肠胃外施用时，药物组合物通常呈无菌、无热原、胃肠外可接受的组合物的形式。用于肠胃外注射的特别适合的媒介物是适当保存的无菌等渗溶液。药物组合物可以是冻干物形式，例如冻干饼状物。
在某些实施方案中，药物组合物用于皮下施用。用于皮下施用多肽治疗剂(例如抗体，融合蛋白等)的适合的制剂成分和方法是本领域已知的。参见例如公布的美国专利申请号2011/0044977和美国专利号8,465,739和美国专利号8,476,239。典型地，用于皮下施用的药物组合物含有适合的稳定剂(例如氨基酸，例如甲硫氨酸，和/或糖类，例如蔗糖)，缓冲剂和张力调节剂。
定义
如本文所用，术语“氨基酸模拟物”是指具有不同于氨基酸的一般化学结构、但按照与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的化学化合物。
“保守"氨基酸替代或取代是指用具有相似大小、形状和/或化学特征的侧链的另一种氨基酸替代一种氨基酸。保守氨基酸替代的实例包括用具有如下基团的另一种氨基酸替代一种氨基酸：1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)，甲硫氨酸(M)。
术语烷基是指完全饱和支链或无支链(或直链或线性)烃部分，其包含1-50个碳原子。优选地，烷基包含5-20个碳原子，且更优选10-15个碳原子。例如，C10-15烷基是指包含10-15个碳的烷基链。术语“亚烷基”是指如上述所定义的二价烷基。
术语“烯基”是指具有至少一个碳-碳双键的支链或无支链烃。例如，术语"C2-38-烯基"是指具有2-38个碳原子且包含至少一个碳-碳三键的烃。
术语环烷基是指3-12个碳原子、优选3-8或3-7个碳原子的饱和或不饱和、但为非芳族的单环、双环或三环烃。对于双环和三环环烷基系统，所有的环均为非芳族的。例如，环烷基涵盖环烯基和环炔基。术语“环烯基”是指3-12个碳原子的具有至少一个碳-碳双键的双环或三环烃基。术语“环炔基”是指3-12个碳原子的具有至少一个碳-碳三键的双环或三环烃基。
术语杂芳基包括单环或双环杂芳基，其包含5-10个环成员，它们选自碳原子和1-5个杂原子，并且每个杂原子独立地选自O、N或S，其中S和N可以被氧化成不同的氧化态。对于双环杂芳基系统，该系统为全芳族的(即所有的环均为芳族的)。
术语杂环基是指饱和或不饱和非芳族(部分不饱和，但非芳族)的单环、双环或三环环系，其包含至少一个选自O、S和N的杂原子，其中N和S还可以任选地被氧化成不同的氧化态。在一个实施方案中，杂环基部分表示包含5-7个环原子且任选地包含另一个选自O、S或N的杂原子的饱和单环。杂环可以被烷基、卤素、氧代、烷氧基、卤代烷基、卤代烷氧基取代。在其他实施方案中，杂环基是二-或三环。对于多环系统，一些环可以为芳族的并且与饱和或部分饱和环稠合。总稠合系统并非完全芳族的。例如，杂环系可以为芳族的杂芳基环，其与饱和或部分饱和的环烷基环系稠合。
术语芳基是指在环部分上具有6-10个碳原子的单环或双环芳族烃基。芳基的有代表性的实例为苯基或萘基。
术语“有效量”是指在施用条件下足以达到所需治疗效果的量，例如该量足以降低空腹血糖(FPG)，减轻体重，降低血脂如胆固醇和甘油三酯(TG)，降低肝酶，提高高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平和降低血压。例如，施用于患有表现出、患有或易患NASH或NAFLD的患者的GDF15治疗剂的“治疗有效量”是这样的量，其导致病理学症状，疾病进展，与之相关的生理状况改善或诱导对前述疾病进行的抵抗力。
“功能变体”和“生物活性变体”是指含有通过序列置换、缺失或添加得到(例如HSA或IgFc融合多肽)和/或添加非多肽部分(例如PEG，脂肪酸)、但保留参考多肽的期望功能活性与参考多肽(例如，HSA，人IgFc，人野生型成熟GDF15肽)不同的氨基酸序列的多肽。功能变体的氨基酸序列可以包括相对于参考多肽的一个或多个氨基酸置换、添加或缺失，并且包括保留所需活性的参考多肽的片段。
例如，与GDF15的半寿期相比，SA(例如HSA)的功能变体延长本文所述融合多肽的血清半寿期，同时保留参比GDF15(例如人GDF15)多肽的活性(例如体重减轻，食欲抑制，胰岛素释放，胰岛素敏感性和/或脂肪量减少)。虽然理论上生物活性多肽相对于其野生型蛋白质对应物(含有参考氨基酸序列的蛋白质)具有相似或增强的生物学性质，但相对于其野生型形式具有某种程度降低的活性水平的多肽变体仍可被认为是功能性或生物活性的多肽变体。
关于核酸或多肽分子的核苷酸或氨基酸序列，“同一性”是指两个这样的分子之间的总体相关性。两个序列的序列同一性百分比(核苷酸或氨基酸序列同一性)的计算例如可以通过比对两个序列以达到最佳比较目的来进行(例如，可以将空位导入第一个和第二个用于最佳序列比对的核酸或氨基酸序列)。然后比较相应位置的核苷酸或氨基酸。当第一序列中的位置与第二序列中相应的位置被相同的核苷酸或氨基酸占据时，则该分子在该位置是相同的。两个序列之间的同一性百分比是由序列共享的相同位置的数目的函数，从而考虑到空位的数目以及为了最佳比对两个序列需要导入的每个空位的长度。两个序列之间的序列比较和同一性百分比的确定可以使用数学算法来完成。例如，两个序列之间的同一性百分比可以使用例如National Center for Biotechnology Information(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)所述的那些方法来确定。例如，两个序列之间的同一性百分比可以使用Clustal 2.0多重序列序列对比程序和默认参数例来确定。Larkin MA等人(2007)“Clustal W and Clustal X 2.0版.”Bioinformatics 23(21)：2947-2948。
如本文所用，术语“部分(moiety)”是指如本文所述的融合多肽(例如HSA-GDF15)或脂肪酸缀合物(例如AHA-(200-308)-hGDF15)的部分。用于本发明方法中的融合蛋白包括，例如GDF15部分，其包含来源于GDF15的氨基酸序列；和SA部分，其包含来源于SA的氨基酸序列。用于本发明方法的脂肪酸缀合物包括，例如GDF15部分，其包含来源于GDF15的氨基酸序列；和脂肪酸部分，例如包含本文进一步描述的式之一的脂肪酸。术语“部分”还可以指接头或功能性分子(例如PEG)，其包含用于本发明方法的脂肪酸缀合物或融合蛋白。融合蛋白任选地包含接头部分，其连接融合多肽中的GDF15部分和SA部分。
不希望受到任何特定理论约束，认为GDF15部分赋予减少食欲、促进体重减轻和治疗肥胖和其它代谢病的生物功能，而SA部分延长本文所述的融合蛋白的血清半寿期，改善其表达和稳定性。
术语“天然存在的”在结合生物材料例如核酸分子、多肽、宿主细胞等使用时是指天然中发现的且不为人操纵的材料。类似地，如本文所用的“非天然存在的”是指并非在天然中发现或在结构上被人修饰或合成的材料。当结合核苷酸使用时，术语“天然存在的”是指碱基腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸线密度(T)和尿嘧啶(U)。当结合氨基酸使用时，术语“天然存在的”是指20种常用的氨基酸(即丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、赖氨酸(K)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、天冬酰胺(N)、脯氨酸(P)、谷氨酰胺(Q)、精氨酸(R)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)和酪氨酸(Y))以及硒代半胱氨酸、吡咯赖氨酸(PYL)和吡咯啉-羧基-赖氨酸(PCL)。
“非酒精性脂肪性肝炎(NASH)”是与饮酒无关的、特征在于肝细胞脂肪性改变、伴随小叶内炎症和纤维化的肝病。
NASH是常见的通常为"沉默的"肝病。其类似于酒精性肝病，但在几乎不饮酒或不饮酒的人中发生。NASH的主要特征在于肝中的脂肪与炎症和损害。具有NASH的大部分人感觉良好并且没有意识到他们存在肝问题。尽管如此，但是NASH可能是严重的且可以导致肝硬化，其中肝永久性地损伤和瘢痕化，且不再能够正常起作用。
NAFLD是常见于慢性肝病受试者中的脂肪肝病。过量的肝脂肪可以导致肝脏并发症。尽管与酒精无关，但是这些病症可能与肥胖、膳食和其它与健康相关的问题有关。
具有升高的肝酶的个体和/或具有脂肪肝的个体(例如根据超声或脂肪肝指标确定)被视为具有NASH或NAFLD。酶、脂肪或脂肪肝指标降低是改善或校正病症的指示物。
“酒精性脂肪性肝炎(ASH)”是为严重酒精性肝病并发症的酒精性脂肪性肝炎(ASH)。ASH的诊断需要脂肪变性的相关性、具有气球样变性的肝细胞损伤的证据和有关肝活检的多核中性白细胞浸润。
NASH和ASH是非酒精性脂肪肝病(NAFLD)和酒精性脂肪肝病(AFLD)的晚期阶段。NAFLD的特征在于肝脏中过度脂肪蓄积(脂肪变性)，没有任何其它慢性肝病(病毒性、自身免疫性、遗传性等)的明显原因且饮酒≤20-30g/天。相反，AFLD被定义为存在脂肪变性和饮酒>20-30g/天。主要NAFLD/NASH的大部分常见表型化表现为超重/肥胖、内脏性肥胖、2型糖尿病、高甘油三酯血症和高血压。
如本文所用，术语“变体”、“突变体”以及类似术语在涉及GDF15或SA或其特定形式(例如“GDF15变体”、“人GDF15变体”等)时定义蛋白质或多肽序列，其包含天然存在的(即野生型)蛋白质或多肽对应物或相应天然序列的修饰、截短、缺失或其他变体。例如，相对于如本文所述和文献中已知的野生型(即天然存在的)GDF15蛋白质描述“GDF15变体”。
“受试者”是施用GDF15融合多肽或GDF15缀合物(例如通常为药物组合物的形式)的个体。受试者优选是人，但“受试者”包括宠物和家畜类动物，例如奶牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、豚鼠、大鼠、小鼠或其它牛、羊、马、犬、猫科动物、啮齿动物或鼠类、家禽和鱼类。
如本文所用，术语“GDF15治疗剂”是指GDF15多肽、GDF15变体、GDF15融合蛋白或GDF15缀合物(例如GDF15脂肪酸缀合物)或包含它们的一种或多种的药物组合物，其施用于受试者以便治疗非酒精性脂肪肝病(NAFLD)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)以及相关病症，它们包括但不限于酒精性脂肪性肝炎(ASH)、终末期肝疾病、肝脂肪变性(脂肪肝)、肝纤维化、肝炎、肝硬化、原发性胆汁性肝硬变(PBC)和肝细胞癌(HCC)或类似病症。
术语“缀合物”和“脂肪酸缀合物”可以互换使用，并且用来指作为多肽或蛋白质(或其片段和/或变体)和脂肪酸部分任选地通过接头共价连接形成的实体。
"核糖核酸"(RNA)是核苷酸通过磷酸二酯键连接的聚合物，其中每个核苷酸包含核糖或其修饰物作为糖成分。每个核苷酸包含腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U)或修饰物作为碱基。在mRNA分子的核苷酸碱基序列中编码mRNA分子中的遗传信息，它们排列为由3个核苷酸碱基各自组成的密码子，每个密码子编码多肽的特定氨基酸，除外终止密码子，其终止翻译(蛋白质合成)。在活细胞内，mRNA被转运至核糖体，即蛋白质合成的位点，在那里它提供蛋白质合成的遗传信息(翻译)。有关更完整的描述，参见Alberts B等人(2007)Molecular Biology of the Cell,第5版,Garland Science。
如本文所用，术语"多肽"是指通过肽键连接的氨基酸残基的聚合物，无论是天然产生的还是合成的。小于约10个氨基酸残基的多肽通常称作"肽"。术语"肽"旨在表示通过肽键连接的两个或多个氨基酸的序列，其中所述氨基酸可以是天然的或非天然的。该术语涵盖术语多肽和蛋白质，其可以由通过共价相互作用例如半胱氨酸桥或非共价相互作用彼此结合的两个或多个肽组成。本领域公认的3字母或1字母缩写用于表示构成本发明肽和多肽的氨基酸残基。除了当在氨基酸之前使用“D”外，氨基酸是L-氨基酸。当1字母缩写是大写字母时，它是指D-氨基酸。当1字母缩写是小写字母时，它是指L-氨基酸。组或字符串或氨基酸缩写用于表示肽。肽用左侧上的N-末端表示，且序列从N-末端到C-末端书写。
本发明的肽包含非天然氨基酸(即天然不存在的化合物)，且其它氨基酸类似物是本领域已知的，可以备选地使用。
某些非天然氨基酸可以通过Deiters等人,J Am Chem Soc125:11782-11783,2003；Wang和Schultz,Science 301:964-967,2003；Wang等人,Science 292:498-500,2001；Zhang等人,Science 303:371-373,2004或美国专利号7,083,970所述的技术导入。简言之，这些表达系统中的一些系统牵涉位点定向诱变以便将无义密码子例如琥珀TAG导入编码本发明多肽的可读框。这类表达载体然后可以被导入宿主，其可以利用对导入的无义密码子具有特异性并且添加了选择的非天然氨基酸的tRNA。有益于缀合本发明的部分与多肽的目的的具体的非天然氨基酸包括带有乙炔和叠氮基测量的那些。
"蛋白质"是包含一个或多个多肽链的大分子。蛋白质还可以包含非肽成分，例如碳水化合物基团。碳水化合物和其它非肽取代基可以被细胞添加到蛋白质上，由此产生蛋白质并且根据细胞类型的不同而改变。蛋白质在其氨基酸骨架结构方面如本文所定义；取代基例如碳水化合物基团通常没有特别指定，尽管如此，但可以存在取代基。由非宿主DNA分子编码的蛋白质或多肽为"异源"蛋白质或多肽。
"分离的多肽或分离的蛋白质"是基本上不含细胞成分例如碳水化合物、脂质或其它实际上与多肽相关的蛋白质性质的杂质的多肽或蛋白质(例如GDF15)。典型地，分离的多肽或蛋白质制品包含高度纯化形式的多肽或蛋白质，即至少约80％纯，至少约90％纯，至少约95％纯，大于95％纯，例如96％、97％或98％或以上纯或大于99％纯。显示特定蛋白质制品包含分离多肽或蛋白质的一种方式在于蛋白质制品的十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳和该凝胶的考马斯亮蓝染色后出现单带。然而，术语"分离的"不会排除存在可选物理形式的相同多肽或蛋白质，例如二聚体或可选糖基化或衍生的形式。优选地，分离的多肽基本上不含任意其它污染的多肽或其它污染物，这些污染物在其天然环境中发现，而这种天然环境可以干扰其治疗、诊断、预防或研究用途。
本领域普通技术人员将理解，可以在本文所述的任何多肽或蛋白质的序列中进行各种氨基酸取代，例如保守氨基酸取代，而不一定降低其活性。如本文所用，“通常用作其替代物的氨基酸”包括保守取代(即用具有相差无几化学特性的氨基酸取代)。为了保守取代的目的，非极性(疏水)氨基酸包括丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸，甘氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，色氨酸和甲硫氨酸。极性(亲水性)、中性氨基酸包括丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电荷的(碱性)氨基酸包括精氨酸，赖氨酸和组氨酸。带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。氨基酸取代的实例包括用L-氨基酸取代其相应的D-氨基酸，用半胱氨酸取代高半胱氨酸或其它具有含硫醇侧链的非天然氨基酸，用赖氨酸取代高赖氨酸，二氨基丁酸，二氨基丙酸，鸟氨酸或其它具有含氨基侧链的非天然氨基酸或用丙氨酸取代正缬氨酸等。
如本文所用，术语“氨基酸”是指天然存在的氨基酸、非天然氨基酸、按照与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物，它们全部为D和L型立体异构体，条件是其结构允许这类立体异构体形式。氨基酸在本文中根据其名称、通常已知的3-字母符号或IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission推荐的1-字母符号表示。
术语“天然存在的”是指在天然中发现但并不由人操纵的材料。类似地，如本文所用，“非天然存在的”、“非天然的”等是指并非在天然中发现或在结构上被人修饰或合成的材料。当结合氨基酸使用时，术语“天然存在的”是指20种常用氨基酸(即丙氨酸(A或Ala)、半胱氨酸(C或Cys)、天冬氨酸(D或Asp)、谷氨酸(E或Glu)、苯丙氨酸(F或Phe)、甘氨酸(G或Gly)、组氨酸(H或His)、异亮氨酸(I或Ile)、赖氨酸(K或Lys)、亮氨酸(L或Leu)、甲硫氨酸(M或Met)、天冬酰胺(N或Asn)、脯氨酸(P或Pro)、谷氨酰胺(Q或Gln)、精氨酸(R或Arg)、丝氨酸(S或Ser)、苏氨酸(T或Thr)、缬氨酸(V或Val)、色氨酸(W或Trp)和酪氨酸(Y或Tyr))。
如本文所用，术语“非天然氨基酸”和“非天然的氨基酸”互换使用，旨在代表不能在任何生物体中使用未修饰或修饰的基因由任意生物体(无论相同还是不同)通过生物合成方式生成的氨基酸结构。该术语是指非天然存在的(野生型)蛋白质序列或本发明的序列的氨基酸残基。这些包括但不限于修饰的氨基酸和/或氨基酸类似物，它们不是20种天然存在的氨基酸中的一种，硒代丝氨酸、吡咯赖氨酸(Pyl)或吡咯啉-羧基-赖氨酸(Pcl，例如如PCT专利申请WO2010/48582中所述)。这类非天然氨基酸残基可以通过取代天然存在的氨基酸和/或通过将非天然氨基酸插入天然存在的(野生型)蛋白质序列或本发明的序列而导入。非天然氨基酸残基还可以被并入，使得期望的功能被传递给分子，例如连接官能部分(例如PEG)的能力。当结合氨基酸使用时，符号“U”应当是指如本文使用的“非天然氨基酸”和“非天然的氨基酸”。
如本文所用，涉及多肽或蛋白质的术语"类似物"是指修饰的肽或蛋白质，其中肽/蛋白质的一个或多个氨基酸残基被另外的氨基酸残基替代，和/或其中一个或多个氨基酸残基从肽/蛋白质中缺失，和/或其中一个或多个氨基酸残基被添加到肽/蛋白质上。这类氨基酸残基的添加或缺失可以发生在肽的N-末端上和/或肽的C-末端上。
术语"GDF15多肽"和"GDF15蛋白"可以互换使用并且是指在哺乳动物例如人或小鼠中表达的天然存在的野生型多肽。出于本公开的目的，术语"GDF15蛋白"可以互换使用以指任意全长的GDF15多肽，其由308个氨基酸残基组成；(NCBI Ref.Seq.NP_004855.2)包含20个氨基酸信号肽；167个氨基酸前-结构域；和被氟林蛋白酶样蛋白酶从前结构域上切下的112个氨基酸的成熟结构域。308个氨基酸的GDF15多肽称作“全长”GDF15多肽；112个氨基酸的GDF15多肽(例如氨基酸197-308)为“成熟”GDF15多肽。成熟GDF15肽包含形成半胱氨酸结基序(具有3个链内二硫键)和对于TGFβ超家族成员为典型的单一链间二硫键所需的7个保守半胱氨酸残基。成熟GDF15肽包含形成第4个链内二硫键和N-末端环的2个额外的半胱氨酸残基。GDF15蛋白或多肽因此还包括多聚体，更具体地为蛋白质的二聚体。
术语“GDF15变体”涵盖GDF15多肽，其中天然存在的GDF15多肽序列已经被修饰。这类修饰包括但不限于一个或多个氨基酸取代，包括用非天然存在的氨基酸、非天然存在的氨基酸类似物和氨基酸模拟物取代。
在一个方面，术语“GDF15变体”是指这样的GDF15蛋白质序列，其中通常在天然GDF15多肽的指定位置上发现的至少一个残基被缺失或被在天然GDF15序列中的该位置上不常见的残基替代。在一些情况中，期望通常天然GDF15多肽的指定位置上发现的单一残基被一个以上在该位置不常见的残基替代；在另外的情况中，期望维持天然GDF15多肽序列并且在蛋白质的指定位置处插入一个或多个残基；在另外的情况中，期望完全缺失指定的残基；全部这些构建体被术语"GDF15变体涵盖。本发明的方法还涵盖编码这类GDF15变体多肽序列的核酸分子。
在多个实施方案中，GDF15变体包含与天然存在的GDF15蛋白质具有至少约85％同一性的氨基酸序列。在其他实施方案中，GDF15多肽包含与天然存在的GDF15多肽氨基酸序列至少约90％或约95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。这类GDF15突变多肽优选地、但不一定具有野生型GDF15突变多肽的至少一种活性，例如，降低血糖、胰岛素、甘油三酯或胆固醇水平的能力；降体重的能力；或改善葡萄糖耐量、能量消耗或胰岛素敏感性的能力；治疗、预防或改善非酒精性脂肪肝病(NAFLD)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)以及终末期肝疾病、肝脂肪变性(脂肪肝)、肝纤维化、肝炎、肝硬化、原发性胆汁性肝硬变(PBC)和肝细胞癌(HCC)的能力。
尽管GDF15多肽和GDF15突变多肽和包含这类多肽的构建体主要在人GDF15方面公开，但是本发明不限于它们并且扩展至GDF15多肽和GDF15突变多肽和包含这类多肽的构建体，其中GDF15多肽和GDF15突变多肽来源于其它的物种(例如食蟹猴、小鼠和大鼠)。在一些情况中，GDF15多肽或GDF15突变多肽可以以GDF15突变多肽的成熟形式用于治疗或改善受试者的代谢疾病，所述GDF15突变多肽的成熟形式来源于与受试者相同的物种。
GDF15突变多肽优选为生物活性的。在多个相应实施方案中，GDF15多肽或GDF15突变多肽具有与成熟GDF15蛋白的天然存在形式的活性等同、大于或小于其活性的生物活性。生物活性的实例包括降低血糖、胰岛素、甘油三酯或胆固醇水平的能力；降体重的能力；或改善葡萄糖耐量、脂质平衡或胰岛素敏感性的能力；降低尿糖和蛋白质排泄的能力；治疗非酒精性脂肪肝病(NAFLD)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)以及终末期肝疾病、肝脂肪变性(脂肪肝)、肝纤维化、肝炎、肝硬化、原发性胆汁性肝硬变(PBC)和肝细胞癌(HCC)的能力。
如本文所用，在多肽或蛋白质结构的上下文中，术语"N-末端"(或"氨基末端")和"C-末端"(或"羧基末端")分别是指多肽的末端氨基和羧基末端。
如本文所用，术语"治疗多肽"或“治疗蛋白”是指正开发用于治疗用途或已经开发用于治疗用途的多肽或蛋白质。
实施例
提供下列实施例(包括进行的实验和得到的结果)仅用于示例目的，但不视为限制本发明。
实施例1：GDF15-缀合物改善肥胖小鼠的代谢病包括糖尿病和脂肪肝病的测量
给膳食诱导的肥胖小鼠每周一次施用媒介物或脂肪酸-GDF15(0.5mg/kg/s.c.)4周。首次剂量后2周测量未禁食葡萄糖和胰岛素，且首次剂量后4周测量过夜禁食血糖和胰岛素。脂肪酸-GDF15将未禁食葡萄糖降低23％(媒介物处理的为207.1mg/dl，相对脂肪酸-GDF15处理的160.4mg/dl；p<0.05)。与媒介物处理的小鼠相比，脂肪酸-GDF15将未禁食胰岛素水平降低了75％(2.1对8.7ng/ml；p<0.05)。在初始剂量后4周，脂肪酸-GDF15将空腹血糖降低28％(142.7对199.5mg/dl；p<0.05)，并且将空腹胰岛素降低78％(0.77对3.5ng/ml；p<0.05)。脂肪肝疾病的标志物也通过四次、每周一次的脂肪酸-GDF15剂量得到改善。脂肪酸-GDF15降低脂肪肝57.5％(11.36对26.73％肝脏脂肪，p<0.05)，且血清肝细胞损伤标志物丙氨酸氨基转移酶(ALT)的水平降低58％(46.2对110.5U/L；p<0.05)。此外，显示脂肪酸-GDF15降低进行性肝病中致病基因PNPLA3的肝脏表达77％(p<0.05)，并降低COL1A1或I型胶原蛋白的肝脏表达，其产生与肝纤维化相关，减少57％(p<0.05)。用小鼠血清白蛋白-GDF15融合蛋白(SEQ ID NO：9)治疗膳食诱导的肥胖小鼠给出了上述关于脂肪酸-GDF15的所有研究终点的类似结果。
实施例2：脂肪酸-GDF15缀合物改善瘦蛋白缺乏ob/ob小鼠中代谢病(包括脂肪肝) 的测量
瘦蛋白缺乏的肥胖(ob/ob)小鼠使用正常食物时易患肝脂肪变性。然而，在使用反式脂肪、果糖和胆固醇高的膳食时(例如D09100301，Research Diets，Inc.，NewBrunswick，NJ)，肝脂肪变性恶化并且肝纤维化发展。当给ob/ob小鼠喂食高反式脂肪、果糖和胆固醇膳食时，体重以及循环胆固醇和肝酶也增加。因此，这种小鼠品系和膳食组合已被研究作为对药理学干预的响应的人NAFLD和NASH的模型(Trevaskis JL等人(2012)Am JPhysiol Gastrointest Liver Physiol 302:G762-G772)。外源性GDF15诱导ob/ob小鼠的食欲过盛和体重减轻(Johnen H等人(2007)Nat Med13:1333-1340)。因此，我们测试了GDF15蛋白质施用对NAFLD和NASH诱导的使用高反式脂肪、果糖和胆固醇膳食的ob/ob小鼠中包括脂肪肝在内的代谢疾病测量的影响。
脂肪酸-GDF15在瘦蛋白-缺乏ob/ob小鼠中对高反式-脂肪、高果糖和高胆固醇膳 食的6周研究
给瘦蛋白缺乏型肥胖(ob/ob)小鼠饲喂高反式脂肪、果糖和胆固醇膳食(D09100301,Research Diets,Inc.,New Brunswick,NJ)6周。膳食2周后，每周一次给小鼠皮下注射媒介物(30mM NaOAc,pH 4.0)、0.0125mg/kg脂肪酸-GDF15缀合物或0.5mg/k脂肪酸-GDF15缀合物4周。每周测量一次体重和食物摄入量。在处理后两周和四周采集血清进行血清化学分析。在血清采集之前使动物经受4小时的禁食。第一次注射后4周，用0.0125mg/kg脂肪酸-GDF15缀合物处理导致3％媒介物调整的体重减轻，而用0.5mg/kg脂肪酸-GDF15缀合物处理导致15％媒介物调整的体重减轻(图1A)。在前2周处理期间，体重减轻与媒介物对照组相比在累积食物摄入量下降方面一致(0.0125mg/kg组为10％，0.5mg/kg组为30％)(图1B)。
与媒介物处理的小鼠相比，用0.0125mg/kg的脂肪酸-GDF15缀合物处理分别使的总肝重和肝脂肪变性(在Bruker minispec身体组成分析仪上测量)降低10％和5％，而用0.5mg/kg脂肪酸-GDF15缀合物分别使总肝脏重量和肝脂肪变性减少40％和20％(图2A-B)。与媒介物处理的动物相比，用0.0125mg/kg或0.5mg/kg脂肪酸-GDF15缀合物处理降低肝损伤血清标志物(ALT(分别降低30％和45％)，AST(分别降低29％和31％)和ALP(分别降低12％和28％)(使用Roche Diagnostics Cobas 6000系列分析仪测量的)(表2)。与媒介物处理的动物相比，用0.0125mg/kg或0.5mg/kg脂肪酸-GDF15缀合物处理也分别降低血浆甘油三酯(分别为13％和36％)和胆固醇水平(分别为4％和18％)(表3)。与媒介物处理的动物相比，0.5mg/kg组的葡萄糖水平降低了17％。
表2.末期血浆肝酶水平
表3.末期血浆葡萄糖、甘油三酯和胆固醇水平
脂肪酸-GDF15在瘦蛋白缺乏的ob/ob小鼠中对高的反式-脂肪、高果糖和高胆固醇 膳食的16周研究
给瘦蛋白缺乏型肥胖(ob/ob)小鼠饲喂高的反式脂肪、果糖和胆固醇膳食(D09100301,Research Diets,Inc.,New Brunswick,NJ)16周。在膳食8周后，每周一次给小鼠皮下注射媒介物(30mM NaOAc,pH 4.0)、0.0125mg/kg脂肪酸-GDF15缀合物或0.5mg/k脂肪酸-GDF15缀合物8周。每周测量一次体重和食物摄入量。在处理后2、5和8周采集血清进行血清化学分析。处理后8周时，在血清和组织采集之前给动物进行4小时禁食。首次注射后8周，用0.0125mg/kg脂肪酸-GDF15缀合物处理导致3％媒介物调整的体重减轻，而用0.5mg/kg脂肪酸-GDF15缀合物处理导致15％媒介物调整的体重减轻(图3)。与媒介物处理的小鼠(图4A)相比，用0.0125mg/kg或0.5mg/kg脂肪酸-GDF15缀合物处理减少了总肝重(分别为12％和35％)。与媒介物处理的对照相比，0.5mg/kg组的肝脂肪变性减少了16％(图4B)。如表4所示，与媒介物处理的对照相比，0.5mg/kg组的ALP水平也降低了10％。
表4.末期血浆碱性磷酸酶(ALP)水平
实施例3：HSA融合多肽的表达和纯化
A.哺乳动物细胞表达和纯化
在瞬时转染的HEK293F细胞中表达人GDF15的构建体。简言之，将1升HEK293F细胞、1mg DNA和3mg线性25kDa聚乙烯亚胺在100mL培养基中混合，在室温温育10分钟，然后加入到细胞中。转染后，将细胞在37℃，在80％湿度的8％CO2下以125rpm(50mm行程)温育5天。在4℃以6,000×g离心20分钟除去细胞。通过0.8/0.2μm滤膜过滤上清液并且用TFF缓冲液交换入100mM TRIS pH 8.0。将GDF15构建体捕获在Q琼脂糖阴离子交换柱上，并在100mM TRISpH 8.0中以0-400mM NaCl的10倍柱体积梯度洗脱。通过尺寸排阻色谱在1X DPBS,1.47mMKH2PO4、8.06mM Na2HPO4-7H2O、137.9mM NaCl、2.67mM KCl中进一步纯化含有GDF15的级分。将含有GDF15的级分在液氮中烧瓶冷冻并储存于-80℃。
HSA-GDF15融合体的哺乳动物细胞表达和纯化
在瞬时转染的HEK293F细胞中表达His-人GDF15融合蛋白的构建体。简言之，对每2.5升HEK293F细胞，将2.5mg DNA和7.5mg线性25kDa聚乙烯亚胺在250mL培养基中混合，在室温温育10分钟，然后加入细胞中。将细胞在转染后于37℃，在80％湿度的8％CO2下以125rpm(50mm行程)温育4天。在4℃以6,000×g离心20分钟除去细胞。上清液通过0.8/0.2μm膜过滤。将1M柠檬酸pH 3加入过滤的上清液至终浓度为135mM，将固体氯化钠加入至终浓度为2M，并且上清液通过0.22μm膜过滤。将5mL苯基琼脂糖凝胶树脂在100mM柠檬酸，2M NaCl，pH 3中平衡，并加入到上清液中。将树脂与上清液在室温温育2小时，并装入5cm重力柱中。将树脂用20mL 100mM柠檬酸，2M NaCl，pH 3；20mL 100mM柠檬酸，1.5M NaCl，pH 3；100mM柠檬酸，1M NaCl，pH 3；100mM柠檬酸，0.5M NaCl，pH 3；100mM柠檬酸，pH 3；100mM柠檬酸，20％乙醇，pH 3；和100mM柠檬酸，50％乙醇，pH 3洗涤。合并不含NaCl的清洗液。向苯基琼脂糖凝胶池中加入2M TRIS碱至终浓度为180mM，产生7.5的最终pH。加入5M NaCl至终浓度为150mM。将160μL的Ni琼脂糖HP树脂在PBS中平衡，加入到苯基琼脂糖凝胶池中并在室温温育1小时。将树脂装入1cm重力柱中，并用20mL PBS洗涤，然后用1mL PBS+100mM咪唑洗涤。用1mL PBS+500mM咪唑洗脱结合的蛋白质。将含有GDF15的级分在液氮中快速急冻并储存在-80℃。
B.酵母表达和纯化
使用甲醇诱导在巴斯德毕赤酵母中表达人GDF15的构建体。将质粒DNA用SacI线性化以用于转化。将线性化的DNA转化到巴斯德毕赤酵母菌株SMD1168中，并在30℃，200rpm(1英寸行程)下用1％(v/v)甲醇在pH 6的BMMY培养基中表达4天。表达过程中每天加入甲醇至终浓度为1％(v/v)。通过在4℃以5,000×g离心20分钟除去细胞，并且通过0.22μm膜过滤上清液。将等体积的1M柠檬酸，3M NaCl pH 2.75加入到过滤后的上清液中。将苯基琼脂糖6加入到上清液中，并在室温在搅拌下温育1小时使GDF15结合。将树脂填充到重力柱中，并除去流通物。将树脂用25倍柱体积的0.5M柠檬酸，1.5M NaCl pH 3，5个柱体积的100mM柠檬酸pH3和5个柱体积的100mM柠檬酸，20％乙醇pH 3洗涤。结合的蛋白质在5×1柱体积的100mM柠檬酸，50％乙醇，pH 3中洗脱。将含有GDF15的洗脱级分合并，以1:10稀释到25mM bis-TRISpH 5中并且通过0.22μm膜过滤。将SP琼脂糖阳离子交换树脂加入到GDF15中并在室温温育1小时。将树脂填充到重力柱中，并除去流通物。用50个柱体积的25mM bis-TRIS pH 5洗涤柱，并在10个柱体积的50mM磷酸钠，150mM NaCl pH 6.2中洗脱。
C.大肠杆菌表达
将大肠杆菌产生的GDF15与来自经典猪瘟病毒的经修饰的自体蛋白酶P20融合并在包涵体中表达。使用GDF15质粒DNA转化的大肠杆菌在30℃生长在ZYP-5052自动诱导培养基中60小时(Studier F.W.,Protein Expression and Purification 41(2005)207–234)。通过在18℃以5,000×g离心30分钟收获细胞沉淀。对每升培养物，将沉淀重悬于250mL100mM TRIS pH 8、150mM NaCl、3mM EDTA，0.01％(v/v)Triton X-100、1mg/mL溶菌酶中，并在室温和旋转下温育20分钟。加入250mL 100mM TRIS pH 8、150mM NaCl、20mM CaCl2、20mMMgCl2、0.25mg/mL DNase I，然后室温搅拌下温育20分钟。
将沉淀在18℃以5,000×g离心15分钟，弃去上清液。将沉淀重悬于500mL 2％(v/v)Triton X-100中，并在室温温育20分钟，旋转。将颗粒在18℃以5,000×g离心15分钟，弃去上清液。将沉淀重悬于500mL的500mM NaCl中，并在室温旋转下温育20分钟。将沉淀在18℃以5,000×g离心20分钟，弃去上清液。将沉淀重悬于500mL 100mM TRIS pH 8、150mMNaCl、20mM CaCl2、20mM MgCl2、0.25mg/mL DNase I中，并在室温温育20分钟，旋转。将沉淀在18℃以5,000×g离心20分钟，弃去上清液。将沉淀重新悬浮于500mL的80％(v/v)乙醇中，并在室温温育20分钟，旋转。将颗粒在18℃以5,000×g离心20分钟，弃去上清液。将沉淀重悬于500mL 100mM TRIS pH 8、500mM NaCl、8M脲中，并在室温温育1小时，旋转。加入10mLNi琼脂糖高效树脂并在室温孵育1小时，旋转。
将树脂填充到重力柱中并丢弃流通物。用25个柱体积的100mM TRIS pH 8、500mMNaCl、8M脲、25个柱体积的100mM TRIS pH 8、1M NaCl、2M脲洗涤树脂。将结合的蛋白质在2×5个体积的100mM TRIS pH 8、1M NaCl、2M脲、0.5M咪唑中洗脱。将洗脱的蛋白质以1:10稀释到1M TRIS碱，1M NaCl，0.2M组氨酸，10mM TCEP，pH 8.5中。短暂搅拌样品以混合并在室温无搅拌下温育过夜。将样品装载在6克HLB柱上，用100mL 0.1％(v/v)甲酸水溶液洗涤，并用50mL 0.1％(v/v)甲酸的异丙醇溶液洗脱。将HLB洗脱液1:20稀释到1升50mM HEPES，500mM NaCl，2mM TCEP，8M脲，pH 7.6中。加入10mL Ni琼脂糖高性能树脂，并在室温搅拌温育1小时。将树脂填充到重力柱中并保存流通。
将Ni流通物装载在6克HLB柱上，用100mL 0.1％(v/v)甲酸水溶液洗涤，并用50mL0.1％(v/v)甲酸的异丙醇溶液洗脱。将第二次HLB洗脱液以1:20稀释到1升100mM TRIS pH8，0.5M脲，2mM氧化谷胱甘肽，2mM还原型谷胱甘肽中。短暂搅拌样品以混合并在室温无搅拌温育过夜。加入100mL 5M NaCl使最终浓度为500mM，并将样品装载在6克HLB柱上。将柱用100mL 0.1％(v/v)甲酸的水溶液洗涤，并用25mL 0.1％(v/v)甲酸的乙醇溶液洗脱。通过加入75mL 50mM bis-TRIS pH 4.8按照1：4稀释HLB洗脱液并加入1mL SP琼脂糖树脂。将树脂与GDF15在室温温育1小时，并装入重力柱中。用1mL 50mM bis-TRIS pH 4.8洗涤树脂，并在3×1mL pH 6.4的PBS中洗脱。合并级分1和2，在液氮中快速冷冻并储存在-80℃。
动物研究
动物研究：本文件中描述的所有动物研究均由Novartis Institutes forBiomedical Research Animal Care and Use Committee根据当地和联邦法规和指南批准。从Taconic购买6周龄以后喂食标准实验室食物饮食或60％脂肪饮食(Research DietsD12492i)的雄性小鼠(C57BL/6NTac)。抵达时，通常在12h：12h逆向明-暗循环下将小鼠每笼饲养一只动物。在任何使用之前，动物都接受至少1周的适应。典型地在3-5个月龄时研究小鼠。在研究之前，基于体重将小鼠随机分组(典型地在实验期之前1天)，使得每组具有相似的平均体重。
流体动力学DNA注射：在研究当天，将小鼠置于新鲜笼中并除去旧食物。每个研究动物(膳食诱导的肥胖雄性小鼠)通过尾静脉接受单次流体动力注射质粒DNA。将DNA(典型地3微克/只小鼠)在无菌盐水中以动物体重的～6.5％的体积稀释，并在约5-10秒内快速注射。在注射后立即将预先称重的新鲜高脂肪膳食加入在上述程序结束时的每个笼中。在所示的时间点测量食物摄入量和体重。
重组GDF15类似物：在研究当天，将小鼠置于新鲜笼中并除去旧食物。约1h后和在黑暗周期之前，小鼠在所示时间接受皮下剂量的媒介物(1X PBS)或GDF15类似物。在所有注射完成后，对小鼠进行重新称重并返回一定量的食物(每只小鼠标准饲料或高脂膳食～50g)。在所示的时间内在研究过程中测量食物摄入量和体重。
血浆GDF15暴露：在如上所述处理的替代动物中，在所示的时间将血浆采集到EDTA包被的管中，并按照制造商的说明书(R&D Systems Quantikine HumanGDF15Immunoassay；DGD150)通过ELISA测量人GDF15水平。该测定法不识别内源性小鼠GDF15。
身体组成：在一些动物中，根据制造商的说明书通过NMR(Bruker MiniSpec ModelLF90ii)评估身体组成。使用MiniSpec软件V.2.59.rev.6计算脂肪组织、瘦型组织和自由流体的质量。
结果
除使用人CD8A信号肽分泌的小鼠白蛋白结构域1融合体和非3x4GS接头(SEQ IDNO：300)外，使用小鼠Igκ链V-III区MOPC 63信号肽分泌所有哺乳动物细胞表达的构建体。使用修饰的交配因子α-1信号肽分泌酵母表达的构建体。
GDF15可以在小鼠中引起或促进体重减轻。然而，GDF15的特征使天然存在的肽不适合于用作人的治疗剂，例如野生型人肽的短寿血浆半寿期(～1h)和哺乳动物细胞中差的表达水平(Fairlie WD等。(Gene)(2000)254：67-76)。为了帮助理解GDF15是否可以修饰以改善其性质，例如延长其血浆半寿期，发明人解析了该蛋白质的晶体结构。与含有9个保守半胱氨酸残基的TGFβ超家族的其它成员例如TGFB1-3和抑制素β相比，GDF15晶体结构揭示了GDF15的独特二硫键模式(Galat A Cell.Mol.Life Sci.(2011)68:3437–3451)。为了测试这些二硫键的功能重要性，构建了编码蛋白质的哺乳动物表达载体，其中构成二硫键的每个保守半胱氨酸残基分别突变为丝氨酸残基。如材料和方法部分所述，通过流体动力学DNA注射将表达构建体递送至饮食诱导的肥胖小鼠。与注射空载体的小鼠相比，用编码天然存在的GDF15的表达载体注射的小鼠食用食物减少31.1％，并且处理后3周31.3％更轻。接受编码C203S、C210S或C273S上突变的表达载体的小鼠分别比接受空载体的对照小鼠食用食物减少27.9％、28.0％和33.9％，并且体重减轻分别为25.5％、20.4％和30.3％。接受编码C203S、C210S和C273S的表达载体的小鼠分别比接受空载体的对照小鼠减少27.9％，28.0％和33.9％的食物，并且分别重量减少25.5％，20.4％和30.3％。空载体处理的小鼠和用编码C211S、C240S、C244S、C274S、C305S或C307S的表达载体处理的小鼠的食物摄入量和体重相似。这些数据表明，C203与C210之间的第一个二硫键不是功效所必需的，并且启示可以操纵成熟GDF15的氨基末端。有意义地，形成链间二硫键的C273对于GDF15的效能也不是必需的。
结合来自半胱氨酸诱变研究的功能性数据的结构数据表明GDF15的氨基末端和潜在的羧基末端可以被修饰以延长GDF15的半寿期。为了测试这一点，构建了编码N-末端Fc-GDF15和C-末端融合蛋白以及成熟GDF15蛋白的哺乳动物表达载体。接受编码成熟GDF15的表达载体的单个流体动力注射的小鼠比接受空载体的流体动力注射的小鼠食用的食物一致性地少约25％(表5)。到4周结束时，这些小鼠比对照小鼠体重减少28.9％(表6)。注射编码N-末端Fc-GDF15融合蛋白的载体的小鼠比空载体处理的小鼠在前两周内减少约25％的食用的食物；然而，截止到第3周，Fc-GDF15处理的小鼠食用与对照相似量的食物。
经Fc-GDF15处理的小鼠的体重也开始减少，但随后开始反弹，使得截止到注射后4周，Fc-GDF15小鼠仅比空载体处理的小鼠体重减少9.8％。相反，注射编码C-端GDF15-Fc融合蛋白的载体的小鼠在整个实验期间消耗类似水平的食物并增加体重，与空载体处理的小鼠完全一样。对于成熟GDF15处理组，在注射后1和3周时检测到高血浆GDF15水平(分别为2.6和1.8nM)。在注射编码Fc-GDF15的载体后3周，血浆GDF15水平在施用后一周为2.8nM，但是在注射编码Fc-GDF15的载体后3周不可测到。总之，这些数据表明GDF15的C-末端融合是无活性的，而GDF15的N-末端融合是有活性的。然而，GDF15在Fc-GDF15融合组中的表达损失启示与GDF15的Fc融合体可能不是适合的治疗剂。
表5.
平均值±SEM(相对于空载体的百分比改变)
表6
平均值±SEM
基于Fc和GDF15的相反的二聚化取向和Fc-GDF15组中可检测到的血浆GDF15的损失，我们怀疑Fc-GDF15融合蛋白易于聚集，可能导致动物针对Fc-GDF15融合蛋白的免疫应答。为了确定Fc-GDF15融合蛋白是否易于聚集，在HEK293细胞中表达Fc-GDF15融合蛋白。当表达Fc-GDF15融合蛋白时，当在非还原条件下在聚丙烯酰胺凝胶上分析时，大部分蛋白质迁移靠近原点，与该蛋白质的聚集一致。(图1a)通过尺寸排阻色谱的进一步分析证实蛋白质聚集。
在鉴定GDF15融合蛋白的研究中，所述GDF15融合蛋白是活性的但不聚集，将编码N-末端人血清白蛋白-[GGGGS]3-GDF15(HSA-GDF15)融合蛋白和小鼠血清白蛋白-[GGGGS]3-GDF15(MSA-GDF15)的哺乳动物表达载体转染到HEK293细胞中。与Fc-GDF15融合蛋白不同，当在非还原条件下在聚丙烯酰胺凝胶上和通过尺寸排阻色谱分析时，HSA-GDF15和MSA-GDF15以预期的分子量迁移。(图1b)令人意外地，在哺乳动物细胞中这两种白蛋白-GDF15融合蛋白的表达也比成熟GDF15蛋白高约1000X。
为了确定白蛋白与GDF15的N-末端的融合是否产生活性蛋白质，给予瘦型小鼠单次皮下注射媒介物或99微克(～0.6nmol二聚体)MSA-GDF15(197-308)，MSA-GDF15(197-308，C203S，C210S)，MSA-GDF15(211-308)或MSA-GDF15(197-308，C273S)。与接受媒介物处理的动物相比，接受MSA-GDF15(197-308)，MSA-GDF15(197-308，C203S，C210S)，MSA-GDF15(197-308，C273S)和MSA-GDF15(211-308)的动物中，食物摄取量分别减少了34、34、42和25％。这些数据清楚地表明白蛋白与GDF15的N-末端融合产生生物活性蛋白质。
与成熟GDF15相比，白蛋白融合到GDF15的N-末端也显著增加了血浆半寿期。成熟GDF15的血浆半寿期为～1h，而N-端血清白蛋白-GDF15融合蛋白的血浆半寿期为～50h。与相当剂量(0.6nmol二聚体/小鼠,s.c.)的成熟GDF15相比，一旦每周施用MSA-GDF15连续3周，则大大增强了肥胖小鼠的体重减轻。首次剂量后28天和之前的剂量后2周，经MSA-GDF15处理的小鼠的起始体重减少了12.8％，而在相同的持续时间内，媒介物处理和经GDF15处理的小鼠分别额外增加了其起始体重10.9％和5.6％。身体组成分析表明，MSA-GDF15诱导的体重减轻主要来自脂肪质量，而不是瘦质量。在开始给药后第23天，经MSA-GDF15处理的小鼠的脂肪质量为18.3％，与之相比，媒介物和GDF15处理的小鼠的脂肪质量分别为25.2％和24.5％。经MSA-GDF15处理的小鼠中瘦质量为其体重的55.6％，相比之下，媒介物处理和GDF15处理的小鼠分别为51.5％和52％。
HSA-GDF15融合体也具有生物活性。接受单次皮下剂量(3mg/kg s.c.)的HSA-GDF15的肥胖小鼠比媒介物处理的对照食用的食物在24h内减少31％，而MSA-GDF15处理的小鼠比媒介物对照的食用食物减少27％。在白蛋白与GDF15之间具有不同肽接头的HSA-GDF15融合体也具有生物活性。与载体处理的小鼠相比，使用单次皮下剂量(3mg/kg s.c.)的HSA-无接头-GDF15，HSA-GGGGS-GDF15，HSA-GPPGS处理的肥胖小鼠24h食用的食物量减少22、27和21％。总之，这些数据表明白蛋白与具有不同接头的GDF15的N-末端融合是有生物活性的。
GDF15的氨基末端含有可能不利地影响治疗性白蛋白-GDF15融合蛋白的发展(例如稳定性)的潜在蛋白水解位点(R198)和脱酰胺位点(N199)。为了确定这些位点是否为GDF15活性所需，制备了一系列白蛋白-GDF15突变体并测试其体内活性。用HSA-GDF15、HSA-GDF15(R198H)、HSA-GDF15(N199E)或HSA-GDF15(R198H，N199A)的单次皮下剂量(3mg/kgs.c.)处理肥胖小鼠。与媒介物对照相比，用HSA-GDF15处理的小鼠在6天期间的累积食物摄入减少了29％。相对于对照，在用HSA-GDF15(R198H)、HSA-GDF15(N199E)或HSA-GDF15(R198H，N199A)处理的肥胖小鼠中，相同时间段的食物摄入减少35、28和25％。在6天期间，经媒介物处理的动物的体重增加了6.1％，而HSA-GDF15处理的小鼠的体重减少了4.7％。分别用HSA-GDF15(R198H)、HSA-GDF15(N199E)或HSA-GDF15(R198H，N199A)处理的肥胖小鼠体重减少5.2、4.4和3.2。因此，在GDF15的氨基末端含有这些潜在的翻译后修饰位点突变的融合蛋白保留了生物活性。
因为GDF15的受体是未知的，所以设计了一系列结构引导的位点定向突变体以阐明对于功能必需的和易于修饰的结构域和残基。GDF15包含手指结构域，指节结构域，手腕结构域，新发现的N末端环结构域和手背结构域。破坏GDF15新发现的氨基末端区的GDF15类似物，例如MSA-GDF15(211-308)和MSA-GDF15(C203S，C210S)仍然保留生物学活性，这表明该环不是活性所必需的。已知TGFβ超家族成员的指节、手指和手腕区对于受体结合和信号传导是重要的。为了确定GDF15的这些区域是否对活性至关重要，将关键表面残基突变为包含氨基酸精氨酸的大侧链，以尝试诱导功能丧失。产生在GDF15残基亮氨酸294(指节)、天冬氨酸289(手指)、谷氨酰胺247(手腕)和丝氨酸278(手背)中含有突变的MSA-GDF15融合蛋白，然后皮下施用于肥胖小鼠(3mg/kg sc)。
与媒介物对照相比，MSA-GDF15的单次皮下注射在7天的过程中减少了30％的食物摄取。相对于媒介物对照，食物摄取在手指区突变体(D289R)、手腕突变体(Q247R)和手背突变体(S278R)也分别减少22、14和24％。相反，指节区域突变体(L294R)相对于对照增加了17％的食物摄取。在7天的过程中，媒介物和L294R处理的小鼠体重增加(分别为2.2和6.3％)，而MSA-GDF15、MSA-GDF15(D289R)、MSA-GDF15(Q247R)和MSA-GDF15(S278R)处理的小鼠中，体重分别降低6.6、5.7、5.7和5.4％。这些数据表明GDF15的L294和指节区域对于活性是关键的并且可能与GDF15受体相互作用。GDF15其它区域中的突变是耐受的。
实施例4：缀合至脂肪酸的hGDF15(AHA-hGDF15)的变体
中间体1：AHA-(200-308)-hGDF15
AHAGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI(SEQ ID NO:41).
LCMS：计算的质量(二聚体)：24430：观测的质量(二聚体)：24432
人GDF-15蛋白在大肠杆菌细胞中的表达
分别用构建体51-56和构建体MAHA-(200-308)-hGDF15将大肠杆菌菌株BL21(DE3)Gold(Stratagene)和Rosetta(DE3)pLysS细胞(Novagen)转化，克隆入pET26b载体。使转化的细胞在抗生素选择下生长，首先在3ml、然后在50ml Luria肉汤中(细菌用胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 5/L，葡萄糖6g/L)，直到达到OD600为1.5。预培养物用于接种2个填充极端肉汤培养基(Terrific Broth medium)(NH4SO4 1.2g/L,H2PO40.041g/L,K2HPO40.052g/L,细菌用胰蛋白胨12g/L,酵母提取物24g/L)的1-L发酵罐。当pH增加高于7.1时，通过自动添加1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)诱导培养物。其它发酵参数为：温度＝37℃；pH 7.0+/-0.2，通过添加2N NaOH/H2SO4调整；pO2>30％，使用串联搅拌器速度，气流和氧添加。诱导后5小时，将培养物冷却至10℃并且通过离心收获细胞。
GDF15变体的纯化和再折叠
包涵体
将表达目的蛋白质的重组大肠杆菌沉淀在4℃重新悬浮于(5％w/v)50mM NaH2PO4/150mM NaCl/5mM苄脒.HCl/5mM DTT,pH 8.0中，匀化并且通过经弗氏压碎器(800和80巴)2代裂解。通过在4℃以12000rpm离心60min分离包涵体(IB)。
粗的未折叠蛋白的纯化
将IB溶于(5％w/v)6M胍/100mM NaH2PO4/10mM Tris/20mMβ-巯基乙醇pH 8.0，在室温搅拌2小时。通过以12000rpm离心除去碎片。用Ni-NTA-Superflow进一步纯化增溶的IB(无His标记的构建体因高组氨酸含量也结合树脂)。在用6M胍/100mM NaH2PO4/10mM Tris/5mMβ-巯基乙醇pH 8.0基线洗涤后，用调整至pH 4.5的相同缓冲液洗脱结合的物质。将洗脱液调整至pH 8.0，加入100mM DTT，将该溶液在4℃搅拌过夜。然后通过添加三氟乙酸(TFA,10％在水中的储备溶液)将pH调整至2，用0.1％TFA水溶液按照1:1进一步稀释该溶液。通过RP-HPLC(Poros)，使用0-50％乙腈梯度进一步纯化粗蛋白质溶液，历时50min。合并包含GDF-15的级分，并冻干。
蛋白质折叠
方法1：将冻干物质以2mg/ml溶于100mM乙酸中，用折叠缓冲液(100mM CHES/1MNaCl/30mM CHAPS/5mM GSH/0.5mM GSSG/20％DMSO,pH 9.5,4℃)稀释15-20倍，并在4℃将该溶液在3天内适度搅拌。3天后，加入3个体积的100mM乙酸，并通过超滤(5kDa截止值)将溶液浓缩至约100-200ml，用100mM乙酸稀释10倍并再浓缩。在50℃运行的Vydac C4柱(缓冲液A：0.1％TFA水溶液；缓冲液B：0.05％TFA的乙腈溶液)上通过制备型RP-HPLC进一步纯化再折叠物质。加载后，用15％缓冲液B洗涤柱并在50分钟内用15％B至65％B的梯度洗脱。用等体积的缓冲液A稀释含有感兴趣的蛋白质的收集级分并冻干。两种蛋白质的重折叠收率约为25％。
方法2：方案遵循方法1使用折叠缓冲液进行：100mM CHES,pH 9.4,0.9M精氨酸,0.5M NaCl,1mM EDTA,2.5mM GSH,1mM GSSG(终浓度).
中间体2：脂肪酸构建体的合成
步骤1：18-(苄氧基)-18-氧代十八烷酸，二苄基十八烷二酸酯
将十八烷二酸(100mg,0.318mmol)在THF(体积：5mL)中的溶液冷却至0°，加入EDC(0.084mL,0.477mmol)和DMAP(3.89mg,0.032mmol)。缓慢滴加苄醇(0.030mL,0.286mmol)，将该反应体系缓慢地温热至室温(r.t.)，搅拌16小时。LCMS分析显示25％的期望的产物，通过ELSD发现38％+2(方法A(参见下表7有关本实施例中引述的这种和全部方法)),Rtprod＝1.18min,M+H 405.1；Rt+2prod＝1.49min,M+H2O 512.4)。除去反应混合物溶剂，将粗物质溶于DCM。用1M HCl(水溶液)(25mL x 3)洗涤有机层，得到白色固体。然后用饱和碳酸钠水溶液(25mL x 3)洗涤有机层，使用盐水辅助分离。用Na2SO4干燥有机层，过滤，浓缩至得到白色薄膜状物。
将粗物质溶于少量2:1ACN/DMSO，上样于20g C1815uM柱用于反相色谱。用0-100％ACN/H2O(0.1％TFA)24min梯度纯化。合并具有期望的产物的级分，浓缩，冷冻，冻干，得到38.3mg白色粉末(28％)。将该物质鉴定为期望的产物18-(苄氧基)-18-氧代十八烷酸(1)。LCMS方法B,Rt＝2.39min,M+H 405.4).1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.39–7.32(m,5H),5.11(s、2H)、2.35(t,J＝7.6Hz,4H),1.67–1.61(m,4H),1.36–1.21(m、24H).
步骤2：18-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)十八烷二酸1-苄酯
向(1,38.8mg,0.096mmol)在THF(体积：2mL)中的溶液中加入N-羟基琥珀酰亚胺(13.24mg,0.115mmol)、EDC(0.025mL,0.144mmol)和DMAP(1.172mg,9.59μmol)。将该反应体系在r.t.在N2气氛中搅拌16小时。LCMS分析原料完全耗尽，形成期望的产物(方法A,Rt＝1.25min,M+H502.4)。除去溶剂，将反应混合物溶于少量ACN，上样于20g C1815uM柱用于反相色谱。用0-100％ACN/H2O(0.1％TFA)24min梯度纯化。合并具有期望的产物的级分，浓缩，冷冻，冻干。得到白色固体细粉(35.9mg,71％)。LCMS方法B,Rt＝2.51min,M+H 502.5,M+H2O519.5.1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.41–7.32(m,5H),5.11(s、2H)、2.83(s,4H)、2.60(t,J＝7.4Hz,2H)、2.35(t,J＝7.5Hz,2H),1.73(m,J＝7.6Hz,4H),1.25(d,J＝3.6Hz,24H).
步骤3：(S)-5-((苄氧基)羰基)-1-(9H-芴-9-基)-3,8-二氧代-2,12,15-三氧杂-4,9-二氮杂十七烷-17-酸
向N-α-Fmoc-L-谷氨酸α-苄酯(250mg,0.544mmol)在THF(体积：9mL,比例：9)中的溶液中加入N-羟基琥珀酰亚胺(75mg,0.653mmol)、EDC(0.144mL,0.816mmol)和DMAP(6.65mg,0.054mmol)。将该反应体系在r.t.在N2气氛中搅拌3小时。LCMS分析显示存在原料(方法C,SM Rt＝1.23min,M+H 460.2；prod Rt＝1.30min,M+H 557.2)，由此加入0.25eq N-羟基琥珀酰亚胺，将该反应体系在r.t.在N2气氛中搅拌16小时。LCMS分析显示完全转化成NHS酯产物(方法C,Rt＝1.30min,M+H 557.2)。将2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙酸(98mg,0.598mmol)溶于水(体积：1.000mL,比例：1.000)，加入到反应混合物中，然后加入DIPEA(0.442mL,2.72mmol)。将该反应混合物在r.t.在N2气氛中搅拌16小时。LCMS分析显示形成具有一些水解的谷氨酸的期望的产物(方法C,Rt＝1.15min,M+H605.3)。将该反应混合物(189mg)溶于5％MeOH/EtOAc，转入分液漏斗，然后用50mL部分的0.1N HCl洗涤3x。用50mL5％MeOH/EtOAc将合并的水层萃取1次，用Na2SO4干燥合并的有机层，过滤，浓缩至得到无色薄膜状物(130mg,69％)。LCMS分析显示物质中的主要产物(方法D,Rt＝2.43min,M+H605.3)。将物质不经进一步纯化进行下一步。
步骤4：(S)-4-氨基-3,7-二氧代-1-苯基-2,11,14-三氧杂-8-氮杂十六烷-16-酸
将3溶于20％4-甲基哌啶/DMF溶液(1mL/100mg物质)。将该反应体系在r.t.搅拌1小时，然后上样于20g C1815uM柱用于反相色谱。用0-100％ACN/H2O(0.1％TFA)24min梯度纯化粗物质。合并具有期望的产物的级分，浓缩，冷冻，冻干。
步骤5：(S)-22-((苄氧基)羰基)-3,20,25-三氧代-1-苯基-2,29,32-三氧杂-21,26-二氮杂三十四烷-34-酸
向用N2吹扫的4在THF中的溶液中(12mmolar,9:1THF/H2O)加入18-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)十八烷二酸1-苄酯(2,1.2eq.)在水中的溶液。加入DIPEA(5eq.)，将该反应体系在N2气氛中在r.t.搅拌16小时。除去溶剂，将粗物质溶于少量ACN，然后上样于20g C1815uM柱用于反相色谱。用0-100％ACN/H2O(0.1％TFA)24min梯度纯化粗物质。合并具有期望的产物的级分，浓缩，冷冻，冻干。
步骤6：(S)-22-((苄氧基)羰基)-3,20,25,34-四氧代-1-苯基-2,29,32,38,41-五氧杂-21,26,35-三氮杂四十三烷-43-酸
在N2气氛中将5溶于THF(0.02摩尔)，加入N-羟基琥珀酰亚胺(1.2eq.)、EDC(1.5eq.)和DMAP(0.1eq.)。将该反应体系在N2气氛中在r.t.搅拌16小时，得到NHS-酯中间体。将2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙酸(1.1eq.)在水(9:1THF/H2O)和DIPEA(5eq.)中的溶液加入到NHS-酯中间体中。将该反应体系在r.t.在N2气氛中搅拌16小时。除去溶剂，将粗物质溶于少量ACN，然后上样于20g C1815uM柱用于反相色谱。用0-100％ACN/H2O(0.1％TFA)24min梯度纯化粗物质。合并具有期望的产物的级分，浓缩，冷冻，冻干。
步骤7：(S)-9,18,23-三氧代-2,5,11,14-四氧杂-8,17,22-三氮杂三十九烷-1,21,39-三甲酸21,39-二苄基1-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)酯
在N2气氛中向6在无水THF中的溶液(0.02摩尔)中加入N-羟基琥珀酰亚胺(1.2eq.)。将该反应体系在N2气氛中在r.t.搅拌16小时。蒸发反应溶剂，将粗物质溶于少量ACN，然后上20g C1815uM柱用于反相色谱。用0-100％ACN/H2O(0.1％TFA)24min梯度纯化粗物质。合并具有期望的产物的级分，浓缩，冷冻，冻干。
步骤8：(S)-22-羧基-1-((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)-1,10,19,24-四氧代-3,6,12,15-四氧杂-9,18,23-三氮杂四十一烷-41-酸
向用N2吹扫的7在无水THF中的溶液(0.2摩尔)中加入Pd/C(10％在活性炭上活化，0.1当量)。将该反应体系在室温N2气氛中搅拌10分钟。然后关闭N2源并将氢加入到反应烧瓶中。然后去除氢源，并返回N2流。将该反应体系在室温搅拌16小时。将该反应混合物通过溶剂-硅藻土湿垫过滤，并用过量THF冲洗3次，浓缩得到的滤液。将粗物质溶解在最少量的ACN/水中，并装载到20g C18 15uM柱上用于反相色谱。粗物质经0-100％ACN/H2O(0.1％TFA)24min梯度纯化。合并具有所需产物的级分，浓缩，冷冻和冻干。
实施例4A：蛋白质与脂肪酸构建体(中间体2)的缀合:
一般蛋白质缀合方法：
制备10mg/mL脂肪酸-NHS酯在水中的溶液。用30mM NaOAc pH4.6稀释AHA-hGDF15溶液(1.0eq)，得到最终反应浓度为0.88mg/mL。将脂肪酸溶液(10eq.10mg/mL)加入到蛋白质溶液中，将反应体系在r.t.振摇16小时。纯化该反应混合物。
鉴于hGDF15的同二聚化性质，可以得到AHA-hGDF15+1脂肪酸和AHA-hGDF15+2脂肪酸的混合物。脂肪酸构建体(中间体2)连接在单体单元中的一个或两个单体单元的N-末端。这类缀合物混合物可以表示如下：
其中2个AHA-hGDF15单元之间的线为二硫键。
表7-表征GDF15缀合物的脂肪酸的方法
实施例5A：与中间体37缀合的His-hGDF15(I-59)
将His-GDF15(0.493ml,0.026μmol,1.42mg/ml)加入到1.5ml 30mM乙酸钠pH＝4缓冲液中，将nhs脂肪酸(0.221mg,0.132umol,10mg/mL)加入到该溶液中。过夜，反应未完成，由此加入2.5以上当量的脂肪酸NHS(0.110mg,0.066umol,10mg/mL)，5小时后，Maldi显示+2缀合物为主要产物。通过用amicon超滤10kD洗涤5次纯化产物，得到565ug缀合物，76％收率.MALDI：sm(18％),预测质量：26468；观测的质量：26553；+1脂肪酸(38％)预测质量：28022；观测的质量：28099；+2脂肪酸(40％)预测质量：29576；观测的质量：29649；+3脂肪酸(4％)预测质量：31130；观测的质量：31201.
实施例5B：与中间体37缀合的AHA-hGDF15
制备10mg/mL中间体37在分子生物学级水中的溶液。向AHA-hGDF15(中间体57,6.67mg/mL在30mM NaOAc pH 4.0中的溶液,5.247mL,1.433μmol)中加入30mM NaOAc pH4.6(可接受范围4.5-5.0)，得到最终蛋白质浓度为0.88mg/mL。加入中间体37(10eq.,2.39mL,0.014mmol)，将该反应体系在r.t.混合18小时。在反应小瓶中形成沉淀。在4x15mL10kDa Amicon离心过滤器中分开该反应混合物，用30mM NaOAc pH 4.0将它们各自稀释至15mL。将该物质4x缓冲交换入30mM NaOAc pH 4.0，合并样品至体积为25.6mL，在洗涤之间用吸管端在过滤器中搅拌沉淀。沉淀保留在溶液中，将该混合物保持在4℃静置过夜。通过A280(30040cm-1M-1、27538g/mol)将浓度测定为1.62mg/mL(100％)。UPLC分析显示+1和+2产物的收率为60％(方法J)。
将实施例5B粗混合物在体内测试并且报告在表8中：
表8
种类 ％观测值
AHA-GDF15 29
AHA-GDF15+1FA 27
AHA-GDF15+2FA 33
AHA-GDF15+3FA 11
AHA-hGDF15+1FA(脂肪酸)相当于GDF15同二聚体的一个分子上的N-末端氨基官能团处的反应。
AHA-hGDF15+2FA(脂肪酸)相当于GDF15同二聚体的第二个分子上的N-末端氨基官能团处的反应。
AHA-hGDF15+3FA(脂肪酸)相当于GDF15同二聚体的某其他位置处的非选择性反应。
纯化：
通过反相色谱法纯化粗产物(缓冲液A 0.1％TFA的水溶液；缓冲液B0.1M TFA的ACN溶液梯度；99％-80％缓冲液A)，使用Waters BEH3003.5μm,4.6mmX100mm，流速为2.5ml/min。
级分1：未反应的AHA-hGDF15：Rt＝17.33min
级分2：(19B1)：AHA-GDF15+1FA：Rt＝20.2min(约15％收率)
级分3：(19B2)：AHA-GDF15+2FA：Rt＝21.6min(约15％收率)
级分4：(19B3)：AHA-GDF15+3FA：Rt＝23.0min(约5％收率)
制备1:1之比的19B1和19B2的混合物并且测试(19Bm)。
备选地，该反应可以在10mM Na2HPO4-7H2O和30mM NaOAc在pH为4.73进行：制备10mg/mL中间体37在分子生物学级水中的溶液。向AHA-hGDF15(中间体57,12.04mg/mL在30mM NaOAc pH 4.0中的溶液,4.15μL,0.002μmol)中加入30mM NaOAc 10mM Na2HPO4–7H2OpH 4.73，得到最终蛋白质浓度为0.88mg/mL。加入中间体37(20eq.,6.83μL,0.041μmol)，将该反应体系在r.t.混合18小时。该反应混合物变浑浊，形成沉淀。UPLC分析显示58％+1和+2产物(方法J)。
表9
种类 ％观测值
AHA-GDF15 0
AHA-GDF15+1FA 11
AHA-GDF15+2FA 47
AHA-GDF15+3FA 34
AHA-GDF15+4FA 7
该反应还可以在30mM NaOAc和10mM K2HPO4pH 4.6中进行：制备10mg/mL中间体37在分子生物学级水中的溶液。向AHA-hGDF15(中间体57,6.21mg/mL在30mM NaOAc pH 4.0中的溶液,5.261mL,1.337μmol)中加入30mM NaOAc 10mM K2HPO4pH 4.6(可接受范围4.5-5.0)，得到最终蛋白质浓度为0.88mg/mL。加入中间体37(10eq.,68.3μL,0.409μmol)，将该反应体系在r.t.混合7小时。该反应混合物变浑浊，形成沉淀。将该反应混合物在15mL10kDa Amicon离心过滤器中分成4个9mL的部分，用30mM NaOAc pH 4.0稀释至15mL。将该物质进行缓冲交换4x入30mM NaOAc pH 4.0，每次洗涤之间用吸管端搅拌沉淀。将该反应混合物浓缩至75mL体积。沉淀保留，由此将该物质储存在4℃2天。通过A280(30040cm-1M-1、27538g/mol)将浓度测定为0.4mg/mL(97％)。UPLC分析显示+1和+2产物的收率为61％。
表10
种类 ％观测值
AHA-GDF15 34
AHA-GDF15+1FA 34
AHA-GDF15+2FA 27
AHA-GDF15+3FA 5
参比例1：缀合至中间体PEG-肉豆蔻酸构建体的His-hGDF15BCN(I-58)：
步骤1：
向叠氮基-PEG23-胺(30mg,0.027mmol)和肉豆蔻NHS酯(Toronto ResearchChemicals,目录#S69080)(12mg,0.037mmol)的混合物中加入DCM(1mL)和DIPEA(13uL)，将该混合物在r.t.搅拌过夜。通过硅胶色谱法纯化该混合物，用EtOAc/庚烷(0-100％)、然后用MeOH/DCM(0-10％)洗脱，得到澄清产物，约为5％MeOH/DCM.LCMS：(梯度：40-98％B，1.4min–流速1mL/min洗脱液A：水+0.05％甲酸+3.75mM乙酸铵,洗脱液B：乙腈+0.04％甲酸)LCMS：rt＝2.20(方法C)质量+H计算值：1354.71，质量观测值：1354.4。
步骤2：
向BCN-hGDF15溶液(I-52：800uL,0.25mg/mL)中加入(2mg/mL的DMSO溶液,6.3uL,10eq)，将该混合物在r.t.搅拌过夜。定量收率1.1mL0.20mg/mL。(Maldi：+1质量计算值：28223质量观测值：28640；+2质量计算值：29543；质量观测值:29962,+3质量计算值：30863，质量观测值:31426,+4质量计算值：32183，质量观测值:32911).
参比例2：his-hGDF15-PEG23
表11
标记度 计算值 测定值 ％
His-hGDF15 26468 26360.3 5
His-hGDF15-BCN 26644 n/a 0
His-hGDF15+1PEG23 27567 28178.6 15
His-hGDF15+2PEG23 28666 29385.1 46
His-hGDF15+3PEG23 29765 30547.2 28
His-hGDF15+4PEG23 30864 31731.8 5
向His-hGDF15BCN(I59：427μL,1.17mg/mL,0.019μmol)在30mM NaOAc pH 4.0(427μL)中的溶液中加入叠氮基-dPEG23-胺(Quanta Biodesign,104μg,0.094μmol)。将该反应体系在r.t.混合16小时，在此点使用10kDa MWCO Amicon离心过滤器，通过将样品稀释和浓缩5倍至140μL体积将该混合物交换入30mM NaOAc pH 4.0。MALDI分析显示完全转化成+1-+4产物。通过A280(29090M-1cm-1、27600g/mol)将浓度测定为2.099mg/mL(57％)。

Claims (24)

1.治疗非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、终末期肝疾病、肝脂肪变性(脂肪肝)、肝纤维化、肝炎、肝硬化、原发性胆汁性肝硬变(PBC)或肝细胞癌(HCC)的方法，通过施用治疗有效量的GDF15治疗剂来进行，所述GDF15治疗剂包含GDF15变体、GDF15融合蛋白或GDF15缀合物的一种或多种。
2.权利要求1的方法，其中GDF15治疗剂是GDF15缀合物。
3.权利要求1的方法，其中GDF15治疗剂是HSA-GDF15融合蛋白或Fc-GDF15融合蛋白。
4.权利要求1的方法，其中GDF15治疗剂选自表1。
5.治疗非酒精性脂肪肝病(NAFLD)或非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的方法，通过施用治疗有效量的GDF15治疗剂来进行，所述GDF15治疗剂包含GDF15蛋白、变体、突变体、融合体或缀合物的一种或多种。
6.权利要求5的方法，其中GDF15治疗剂是脂肪酸-GDF15缀合物或PEG-GDF15缀合物。
7.权利要求5的方法，其中GDF15治疗剂是HSA-GDF15融合蛋白或Fc-GDF15融合蛋白。
8.权利要求5的方法，其中GDF15治疗剂选自表1。
9.治疗非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、终末期肝疾病、肝脂肪变性(脂肪肝)、肝纤维化、肝炎、肝硬化、原发性胆汁性肝硬变(PBC)或肝细胞癌(HCC)的方法，通过施用治疗有效量的包含GDF15治疗剂的药物组合物来进行，所述GDF15治疗剂包含GDF15蛋白、变体、突变体、融合体或缀合物的一种或多种。
10.权利要求9的方法，其中GDF15治疗剂是脂肪酸-GDF15缀合物或PEG-GDF15缀合物。
11.权利要求9的方法，其中GDF15治疗剂是HSA-GDF15融合蛋白或Fc-GDF15融合蛋白。
12.权利要求9的方法，其中GDF15治疗剂选自表1。
13.治疗非酒精性脂肪肝病(NAFLD)或非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的方法，通过施用治疗有效量的包含GDF15治疗剂的药物组合物来进行，所述GDF治疗剂包含GDF15蛋白、变体、突变体、融合体或缀合物的一种或多种。
14.权利要求13的方法，其中GDF15治疗剂是脂肪酸-GDF15缀合物或PEG-GDF15缀合物。
15.权利要求13的方法，其中GDF15治疗剂是HSA-GDF15融合蛋白或Fc-GDF15融合蛋白。
16.权利要求13的方法，其中GDF15治疗剂选自表1。
17.权利要求1-16中任一项所述的方法，其中GDF15治疗剂不包含含有SEQ ID NO：41的氨基酸序列的GDF15多肽。
18.权利要求1-17中任一项所述的方法，其中GDF15治疗剂不是包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列的脂肪酸-GDF15缀合物。
19.权利要求1、2、4、5、6、8、9、10、12-14和16中任一项所述的方法，其中GDF15治疗剂是脂肪酸缀合物，其不包含如下的氨基酸序列：
(i)SEQ ID NO:41；
(ii)MHHHH HHAR NGDHC PLGPG RCCRL HTVRA SLEDL GWADW VLSPR EVQVT MCIGACPSQF RAANM HAQIK TSLHR LKPDT VPAPC CVPAS YNPMV LIQKT DTGVS LQTYD DLLAK DCHCI(M-(his)6-hGDF15(197-308))(SEQ ID NO:321),
(iii)MHHHHHHMARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI(M-(his)6-M-hGDF15(197-308))(SEQ ID NO:322),
(iv)MHHHHHHAHARDGCPLGEGRCCRLQSLRASLQDLGWANWVVAPRELDVRMCVGACPSQFRSANTHAQMQARLHGLNPDAAPAPCCVPASYEPVVLMHQDSDGRVSLTPFDDLVAKDCHCV(M-(his)6-dGDF15)(SEQ IDNO:323),
(v)MHNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI(MH-hGDF15(199-308))(SEQ ID NO:324),
(vi)MHAGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI(MHA-hGDF15(200-308))(SEQ ID NO:325),或
(vii)AHNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI(AH-hGDF15(199-308)(SEQ ID NO:326)。
20.权利要求1-17中任一项所述的方法，其中GDF15治疗剂不是包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列的白蛋白-GDF15融合体，例如人血清白蛋白-GDF15融合体。
21.权利要求1-16中任一项所述的方法，其中GDF15治疗剂包含以下任意一种的氨基酸序列：SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：42-63、SEQ IDNO：69-107、SEQ ID NO：148、SEQ ID NO：149和SEQ ID NO：320；或以下任意一种的氨基酸序列：SEQ ID NO：42-63、SEQ ID NO：69-107、SEQ ID NO：148、SEQ ID NO：149和SEQ ID NO：320。
22.权利要求1-16中任一项所述的方法，其中GDF15治疗剂不包含以下氨基酸序列之一：
(i)MHHHH HHAR NGDHC PLGPG RCCRL HTVRA SLEDL GWADW VLSPR EVQVT MCIGA CPSQFRAANM HAQIK TSLHR LKPDT VPAPC CVPAS YNPMV LIQKT DTGVS LQTYD DLLAK DCHCI(M-(his)6-hGDF15(197-308))(SEQ ID NO:321),
(ii)SEQ ID NO:6,
(iii)SEQ ID NO:7,
(iv)MHHHHHHMARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI(M-(his)6-M-hGDF15(197-308))(SEQ ID NO:322),
(v)MHHHHHHAHARDGCPLGEGRCCRLQSLRASLQDLGWANWVVAPRELDVRMCVGACPSQFRSANTHAQMQARLHGLNPDAAPAPCCVPASYEPVVLMHQDSDGRVSLTPFDDLVAKDCHCV(M-(his)6-dGDF15)(SEQ IDNO:323),
(vi)MHNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI(MH-hGDF15(199-308))(SEQ ID NO:324),
(vii)MHAGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI(MHA-hGDF15(200-308))(SEQ ID NO:325),
(viii)SEQ ID NO:41,和
(ix)AHNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI(AH-hGDF15(199-308)(SEQ ID NO:326)。
23.权利要求1、2、4、5、6、8、9、10、12-14和16中任一项所述的方法，其中GDF15治疗剂是脂肪酸-GDF15缀合物，其不包含任一式A1、A2和A3的脂肪酸：
R1是CO2H或H；
R2、R3和R4彼此独立地为H、OH、CO2H、-CH＝CH2或–C＝CH；
Ak是支链C6-C30亚烷基；
n、m和p彼此独立地为6-30的整数；且不包含十四烷酸。
24.权利要求1、2、4、5、6、8、9、10、12-14、16和22中任一项所述的方法，其中GDF15治疗剂是脂肪酸-GDF15缀合物，其不包含一种或多种以下脂肪酸：
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111333505A (zh) * 2020-03-31 2020-06-26 东莞市东阳光生物药研发有限公司 制备长链脂肪二酸单苄酯的方法及其应用
WO2021139763A1 (zh) * 2020-01-08 2021-07-15 上海翰森生物医药科技有限公司 Fgf21突变体蛋白及其融合蛋白
CN113474363A (zh) * 2018-11-20 2021-10-01 詹森药业有限公司 用于降低体重和/或减少食物摄取量的gdf15类似物和方法
CN113767112A (zh) * 2019-04-23 2021-12-07 株式会社Lg化学 包含免疫球蛋白Fc区和GDF15的融合多肽
WO2022089435A1 (en) * 2020-10-27 2022-05-05 Beijing Ql Biopharmaceutical Co., Ltd. Fusion proteins of gdf15 and use thereof

Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX343729B (es) 2011-04-08 2016-11-18 Amgen Inc Factor de diferenciación de crecimiento 15 (gdf-15) y composiciones del mismo para usarse en el tratamiento o mejoramiento de trastornos metabólicos.
CA2862516C (en) 2012-03-27 2023-02-14 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Compositions and methods of use for treating metabolic disorders
US9161966B2 (en) 2013-01-30 2015-10-20 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. GDF15 mutein polypeptides
CN105980400B (zh) 2013-07-31 2021-05-07 美国安进公司 生长分化因子15(gdf-15)构建体
US10588980B2 (en) 2014-06-23 2020-03-17 Novartis Ag Fatty acids and their use in conjugation to biomolecules
MD20170020A2 (ro) 2014-07-30 2017-07-31 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Compoziţii şi metode utilizate pentru tratamentul tulburărilor metabolice
US10004596B2 (en) 2014-07-31 2018-06-26 Lensgen, Inc. Accommodating intraocular lens device
NZ730054A (en) 2014-10-31 2023-11-24 Ngm Biopharmaceuticals Inc Compositions and methods of use for treating metabolic disorders
SG11201803359VA (en) * 2015-10-23 2018-05-30 Merus Nv Binding molecules that inhibit cancer growth
US10548941B2 (en) * 2016-11-13 2020-02-04 Imagine Pharma Compositions and methods for treating diabetes, hypertension and hypercholesterolemia
TWI710377B (zh) * 2017-05-23 2020-11-21 丹麥商諾佛 儂迪克股份有限公司 Ｍｉｃ－１化合物及其用途
CN111163795A (zh) 2017-09-10 2020-05-15 诺沃挪第克公司 用于治疗肥胖症的mic-1和glp-1
TWI724392B (zh) * 2018-04-06 2021-04-11 美商美國禮來大藥廠 生長分化因子15促效劑化合物及其使用方法
JP7058670B2 (ja) * 2018-04-09 2022-04-22 アムジエン・インコーポレーテツド 増殖分化因子１５融合タンパク質
WO2020009740A2 (en) * 2018-04-25 2020-01-09 Washington University Compositions and methods of use thereof for treatment of metabolic diseases and related disorders
EP3833974A2 (en) 2018-08-10 2021-06-16 Novartis AG Gfral extracellular domains and methods of use
WO2020152367A1 (en) 2019-01-25 2020-07-30 Ospedale San Raffaele S.R.L. Inhibitor of dux4 and uses thereof
WO2021067655A1 (en) 2019-10-04 2021-04-08 Amgen Inc. Use of gdf15 for treating cardiometabolic syndrome and other conditions
CN115260313B (zh) 2019-12-31 2023-07-18 北京质肽生物医药科技有限公司 Glp-1和gdf15的融合蛋白以及其缀合物
KR102569644B1 (ko) * 2020-10-30 2023-08-23 가톨릭대학교 산학협력단 Gdf15를 유효성분으로 함유하는 면역질환의 예방 및 치료용 조성물
WO2022219495A1 (en) 2021-04-12 2022-10-20 Novartis Ag 2-((4-((s)-2-(4-chloro-2-fluorophenyl)-2-methylbenzo[d][1,3]dioxol-4-yl)piperidin-1-yl)methyl)-1-(((s)-oxetan-2-yl)methyl)-1h-imidazole derivatives as activators of the glp1 receptor for the treatment of obesity
EP4351628A1 (en) 2021-05-21 2024-04-17 Yuhan Corporation Composition for preventing or treating non-alcoholic fatty liver disease or non-alcoholic steatohepatitis comprising growth differentiation factor-15 variant
TW202342014A (zh) 2022-02-10 2023-11-01 瑞士商諾華公司 １，３－苯并二氧戊環衍生物
WO2023154953A1 (en) 2022-02-14 2023-08-17 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Gdf15 polypeptides for treating and preventing autoimmune diseases

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103533951A (zh) * 2011-04-08 2014-01-22 安姆根有限公司 使用生长分化因子15(gdf-15)治疗或改善代谢障碍的方法
CN103945695A (zh) * 2011-09-16 2014-07-23 卡莱克汀医疗有限公司 用于治疗非酒精性脂肪性肝炎和非酒精性脂肪肝病的半乳糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯组合物
WO2014120619A2 (en) * 2013-01-30 2014-08-07 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Compositions and methods of use in treating metabolic disorders
CN104204218A (zh) * 2012-01-26 2014-12-10 安姆根有限公司 生长分化因子15 (gdf-15)多肽
CN107073130A (zh) * 2014-06-23 2017-08-18 诺华股份有限公司 脂肪酸及其在与生物分子缀合中的用途

Family Cites Families (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8725529D0 (en) 1987-10-30 1987-12-02 Delta Biotechnology Ltd Polypeptides
ATE92107T1 (de) 1989-04-29 1993-08-15 Delta Biotechnology Ltd N-terminale fragmente von menschliches serumalbumin enthaltenden fusionsproteinen.
US5288931A (en) * 1991-12-06 1994-02-22 Genentech, Inc. Method for refolding insoluble, misfolded insulin-like growth factor-I into an active conformation
WO1997000958A1 (en) 1995-06-22 1997-01-09 St. Vincent's Hospital Sydney Limited NOVEL TGF-β LIKE CYTOKINE
WO1998019523A1 (fr) * 1996-11-01 1998-05-14 Shionogi & Co., Ltd. Souris modele pour maladies affectant l'homme
GB9912350D0 (en) * 1999-05-26 1999-07-28 European Molecular Biology Lab Embl Modified cytokine
EP1274720A4 (en) 2000-04-12 2004-08-18 Human Genome Sciences Inc ALBUMIN FUSED PROTEINS
EP2322631B1 (en) 2001-04-19 2014-11-12 The Scripps Research Institute Methods and compositions for the prodcution of orthogonal tRNA-aminoacyl-tRNA synthetase pairs
FI117667B (fi) * 2001-07-05 2007-01-15 Univ Zuerich Farmaseuttinen koostumus, joka soveltuu käytettäväksi ortopediassa ja hammaslääketieteessä
ES2392073T3 (es) 2001-11-08 2012-12-04 Abbott Biotherapeutics Corp. Formulación farmacéutica líquida estable de anticuerpos IGG
TW200303742A (en) 2001-11-21 2003-09-16 Novartis Ag Organic compounds
CA2484556A1 (en) 2001-12-21 2003-07-24 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
EP1638963B1 (en) 2003-05-20 2009-09-09 Novartis AG N-acyl nitrogen heterocycles as ligands of peroxisome proliferator-activated receptors
BRPI0414539B8 (pt) 2003-09-19 2021-05-25 Novo Nordisk As composto, composição farmacêutica, e, uso de um composto
BRPI0507026A (pt) 2004-02-09 2007-04-17 Human Genome Sciences Inc proteìnas de fusão de albumina
US8431558B2 (en) 2004-11-01 2013-04-30 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for modification of biomolecules
TW201008595A (en) 2005-12-20 2010-03-01 Bristol Myers Squibb Co Stable protein formulations
US20110044909A1 (en) * 2008-05-06 2011-02-24 Stephanie Tozzo Animal model for diabetes
EA021001B1 (ru) 2008-10-24 2015-03-31 Новартис Аг Биосинтетический пирролинкарбоксилизин и сайт-специфичные модификации белка за счет химической модификации остатков пирролинкарбоксилизина и пирролизина
US9345661B2 (en) 2009-07-31 2016-05-24 Genentech, Inc. Subcutaneous anti-HER2 antibody formulations and uses thereof
US9732143B2 (en) * 2011-02-03 2017-08-15 Xoma Technology Ltd. Methods and materials for enhancing functional protein expression in bacteria
CA2862516C (en) 2012-03-27 2023-02-14 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Compositions and methods of use for treating metabolic disorders
US9161966B2 (en) 2013-01-30 2015-10-20 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. GDF15 mutein polypeptides
CN105980400B (zh) 2013-07-31 2021-05-07 美国安进公司 生长分化因子15(gdf-15)构建体
WO2015196145A1 (en) * 2014-06-20 2015-12-23 Aveo Pharmaceuticals, Inc. Treatment of chronic kidney disease and other renal dysfunction using a gdf15 modulator
WO2015198199A1 (en) 2014-06-23 2015-12-30 Novartis Ag Hsa-gdf-15 fusion polypeptide and use thereof.
EP3157942B1 (en) 2014-06-23 2020-06-17 Novartis AG Site specific protein modifications
WO2015197446A1 (en) 2014-06-24 2015-12-30 Novo Nordisk A/S Mic-1 fusion proteins and uses thereof
JP2018502908A (ja) 2014-12-22 2018-02-01 ノヴォ ノルディスク アー／エス アルファ‐１‐ アンチトリプシン（ａ１ａｔ）融合タンパク質及びその使用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103533951A (zh) * 2011-04-08 2014-01-22 安姆根有限公司 使用生长分化因子15(gdf-15)治疗或改善代谢障碍的方法
CN103945695A (zh) * 2011-09-16 2014-07-23 卡莱克汀医疗有限公司 用于治疗非酒精性脂肪性肝炎和非酒精性脂肪肝病的半乳糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯组合物
CN104204218A (zh) * 2012-01-26 2014-12-10 安姆根有限公司 生长分化因子15 (gdf-15)多肽
WO2014120619A2 (en) * 2013-01-30 2014-08-07 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Compositions and methods of use in treating metabolic disorders
CN107073130A (zh) * 2014-06-23 2017-08-18 诺华股份有限公司 脂肪酸及其在与生物分子缀合中的用途

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HSIAO E.C.等: "Characterization of growth-differentiation factor 15, a transforming growth factor β superfamily member induced following liver injury", 《MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY》 *
李岩: "《消化系统与疾病》", 30 April 2008 *
林三仁: "《实用临床消化病学》", 31 October 2007 *

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113474363A (zh) * 2018-11-20 2021-10-01 詹森药业有限公司 用于降低体重和/或减少食物摄取量的gdf15类似物和方法
CN113767112A (zh) * 2019-04-23 2021-12-07 株式会社Lg化学 包含免疫球蛋白Fc区和GDF15的融合多肽
WO2021139763A1 (zh) * 2020-01-08 2021-07-15 上海翰森生物医药科技有限公司 Fgf21突变体蛋白及其融合蛋白
CN111333505A (zh) * 2020-03-31 2020-06-26 东莞市东阳光生物药研发有限公司 制备长链脂肪二酸单苄酯的方法及其应用
WO2021197303A1 (zh) * 2020-03-31 2021-10-07 东莞市东阳光生物药研发有限公司 制备长链脂肪二酸单苄酯的方法及其应用
CN111333505B (zh) * 2020-03-31 2022-07-26 东莞市东阳光生物药研发有限公司 制备长链脂肪二酸单苄酯的方法及其应用
WO2022089435A1 (en) * 2020-10-27 2022-05-05 Beijing Ql Biopharmaceutical Co., Ltd. Fusion proteins of gdf15 and use thereof
CN115244076A (zh) * 2020-10-27 2022-10-25 北京质肽生物医药科技有限公司 Gdf15融合蛋白及其用途
US11884711B2 (en) 2020-10-27 2024-01-30 Beijing Ql Biopharmaceutical Co., Ltd. Fusion proteins of GDF15 and use thereof

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Publication number Publication date
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