CN104662038B - 胰高血糖素类似物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及胰高血糖素类似物及其医疗用途，例如在治疗低血糖中的用途。特别地，本发明涉及适于以液体制剂使用的稳定的胰高血糖素类似物。

Description

胰高血糖素类似物
技术领域
本发明涉及胰高血糖素类似物及其医疗用途，例如在治疗低血糖中的用途。特别地，本发明涉及适于以液体制剂使用的稳定的胰高血糖素类似物。
背景技术
人前胰高血糖素原(preproglucagon)是158个氨基酸的前体多肽，其在组织中被差异性加工而形成多种结构上相关的胰高血糖素原衍生肽，包括胰高血糖素(Glu或GCG)、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、胰高血糖素样肽-2(GLP-2)和胃泌酸调节素(OXM)。这些分子参与多种生理功能，包括葡萄糖内稳态、胰岛素分泌、胃排空和肠生长，以及食物摄取调节。
天然胰高血糖素是29个氨基酸的肽，其对应于前胰高血糖素原的53至81位氨基酸。胰高血糖素帮助维持血液中的葡萄糖水平，这通过与肝细胞上的胰高血糖素受体结合并经由糖原分解而使肝释放以糖原形式储存的葡萄糖来实现。随着这些储存的耗尽，胰高血糖素还刺激肝通过糖异生合成额外的葡萄糖。这些葡萄糖被释放到血流中，防止发生低血糖。
由于天然胰高血糖素本身相对低的物理和化学稳定性，目前市场上可以得到的主要在缓解接受了过高剂量胰岛素的糖尿病对象中的急性低血糖的“营救”情形中使用的胰高血糖素产品以冻干固体制剂形式提供，以用于在临使用前于合适的液体介质中重构。降血糖对象尤其可能表现出头晕和/或错乱，在一些情况下可能失去意识或部分意识，导致他们不能进行或完成所需的初始液体重构和随后所讨论葡萄糖制剂的注射。因此，这种重构和注射可能必须由另一位没有产品处理经验的人在出现过多的胰高血糖素聚集之前有限的可利用时间内进行。
尽管天然胰高血糖素在液体溶液中的稳定类似物是期望的，但是没有市售的任何这样的胰高血糖素类似物的稳定液体制剂。
在此基础上，很明显还强烈需求这样的胰高血糖素类似物，其除了对胰高血糖素受体具有令人满意的高活性外，在水性液体介质中还充分可溶(尤其是在生理pH下，在此pH下天然胰高血糖素不可溶)和稳定(物理地和化学地)。这些类似物(i)可有利地以适合于即时注射的即用型液体药物制剂的形式提供，以及(ii)在使用前可以令人满意地长时间储存(包括由所讨论的对象或患者储存在环境条件下)。
发明内容
在一些实施方案中，本发明提供了具有式I的化合物：
R1-Z-R2 (I)
或者其可药用盐或溶剂合物；
其中
R1是氢、C1-4烷基、乙酰基、甲酰基、苯甲酰基或三氟乙酰基；
R2是OH或NH2；以及
Z是衍生自式Ia序列的氨基酸序列：
His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Glu-Asn-Thr (Ia)
并且还包含如下仅在选自2、3、4、9、10、15、16、17、20、21、24、28和29的氨基酸序列位置(用X表示)处的至少4个氨基酸替换或缺失：
X2选自Aib和Ala；
X3选自His、Pro、Dab(Ac)、Dap(Ac)和Gln(Me)；
X4是DAla；
X9是Glu；
X10选自Val、Leu、N-Me-Tyr和N-Me-DTyr；
X15是Glu；
X16选自Aib、Lys、Glu、Leu、Val、DVal、Phe、His、Arg、Pro、DPro、N-Me-Ser和N-Me-DSer；
X17选自Ala和Ser；
X20选自Glu和Lys；
X21选自Glu、Lys和Ser；
X24选自Lys、Ser、Glu和Ala；
X28选自Ser、Glu和Lys，或者不存在；
X29选自Ser和Ala，或者不存在；
前提是Z并非选自：
HSQGTFTSDYSKYLDSARAEDFVKWLEST；和
HSQGTFTSDYSKYLESRRAKEFVEWLEST。
在一些实施方案中，本发明提供了具有式I的化合物：
R1-Z-R2 (I)
或者其可药用盐或溶剂合物；
其中
R1是氢、C1-4烷基、乙酰基、甲酰基、苯甲酰基或三氟乙酰基；
R2是OH或NH2；以及
Z是衍生自式Ia序列的氨基酸序列：
His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Glu-Asn-Thr (Ia)
并且还包含如下仅在选自2、3、9、10、15、16、17、20、21、24、28和29的氨基酸序列位置处的至少4个氨基酸替换或缺失：
X2选自Aib和Ala；
X3选自His和Pro，；
X9是Glu；
X10选自N-Me-Tyr和N-Me-DTyr；
X15是Glu；
X16选自Aib、Lys、Glu、Leu、Val、DVal、Phe、His、Arg、Pro、DPro、N-Me-Ser和N-Me-DSer；
X17选自Ala和Ser；
X20选自Glu和Lys；
X21选自Glu、Lys和Ser；
X24选自Lys、Ser、Glu和Ala；
X28选自Ser和Lys，或者不存在；
X29选自Ser和Ala，或者不存在；
前提是Z并非选自：
HSQGTFTSDYSKYLDSARAEDFVKWLEST；和
HSQGTFTSDYSKYLESRRAKEFVEWLEST。
在一些实施方案中，在选自式I化合物之2、3、4、9、10、15、16、17、20、21、24、28和29的氨基酸序列位置(用X表示)处的至少4个氨基酸的替换或缺失如下：
X2选自Aib和Ala；
X3选自His和Pro、Dab(Ac)、Dap(Ac)和Gln(Me)；
X4是DAla；
X9是Glu；
X10选自Val、Leu、N-Me-Tyr和N-Me-DTyr；
X15是Glu；
X16选自Aib、Lys、Glu、Leu、Val、Phe、His和Arg；
X17选自Ala和Ser；
X20选自Glu和Lys；
X21选自Glu、Lys和Ser；
X24选自Lys、Ser、Glu和Ala；
X28选自Ser、Glu和Lys，或者不存在；
X29选自Ser和Ala，或者不存在。
在一些实施方案中，至少4个氨基酸的替换或缺失在选自式I化合物之2、3、4、10、15、16、17、20、21、24、28和29的氨基酸序列位置(用X表示)处，并且如下：
X2是Ala；
X3是Dab(Ac)、Dap(Ac)和Gln(Me)；
X4是DAla；
X10选自Leu和Val；
X15是Glu；
X16选自Aib、Lys、Glu、Leu和Val；
X17是Ala；
X20选自Glu和Lys；
X21选自Glu和Ser；
X24选自Lys、Ser和Glu；
X28选自Ser、Glu和Lys；
X29是Ala，或者不存在。
在一些实施方案中，至少4个氨基酸的替换或缺失在选自式I化合物之2、3、4、16、17、20、21、24、28和29的氨基酸序列位置(用X表示)处，并且如下：
X2是Ala；
X3是Dab(Ac)、Dap(Ac)、Gin(Me)或His；
X4是DAla；
X16选自Aib、Lys、Glu；
X17是Ala；
X20选自Glu和Lys；
X21选自Glu和Ser；
X24选自Lys、Ser和Glu；
X28选自Ser、Glu和Lys；
X29是Ala，或者不存在。
应理解的是，任何一个所述分子都与式Ia的序列具有至少4个差异，这些差异可以是所提供限定内允许的至少4个替换和缺失的任意组合。
与式Ia的氨基酸序列相比，肽序列Z可具有最多4个替换和缺失(考虑了组合)，最多5个替换和缺失，最多6个替换和缺失，最多7个替换和缺失，最多8个替换和缺失，最多9个替换和缺失，最多10个替换和缺失，最多11个替换和缺失，最多12个替换和缺失或最多13个替换和缺失。
例如，化合物可具有4至11个替换和缺失，6至11个替换和缺失，4至9个替换和缺失，或6至9个替换和缺失。
本发明化合物具有胰高血糖素激动剂活性。
与天然胰高血糖素相比，本发明化合物具有提高的溶解度和/或稳定性。
提高的溶解度可以包括或者是在pH 4(例如，在100mM pH4的醋酸盐缓冲液中)、pH5(例如，在100mM pH5的醋酸盐缓冲液中)、pH 6(例如，在100mM pH6的磷酸盐缓冲液中)、pH7(例如，在100mM pH7的磷酸盐缓冲液中)和/或pH 7.5(例如，在100mM pH7.5的磷酸盐缓冲液中)下与天然胰高血糖素相比提高的溶解度。可以在实施例4中给出的条件下进行测定。可以期望溶解度≥1mg/ml。
提高的稳定性可以包括或者是与天然人胰高血糖素相比提高的物理稳定性和/或提高的化学稳定性。
提高的物理稳定性可以包括或者是聚集例如形成可溶性或不溶性聚集体(例如，原纤维)的趋势降低。可以在例如pH 7.5和40℃下以溶解肽1mg/ml的起始浓度测定聚集(例如，原纤维形成)。可使用任何合适的时间段，例如，24小时、48小时或96小时。可以在实施例5给出的条件下测定聚集，同时进行搅拌或不进行搅拌。
提高的化学稳定性可以包括或者是在水性缓冲液(通常不存在污染性蛋白酶或肽酶活性)中肽被切割或降解的趋势降低。可以在例如pH 4.0或7.5和40℃下以溶解肽1mg/ml的起始浓度测定稳定性。评估可包括在孵育合适的时间段后测定剩余的完整肽。这可包括按照实施例6中所限定来测定完整肽纯度。孵育可进行任何合适的时间段，例如，1天、7天或14天。可以在实施例6给出的条件下测定稳定性。
本发明的另外一些实施方案包括但不限于：
本发明的化合物或者其可药用盐或溶剂合物用于治疗(例如，治疗急性或慢性低血糖)；
药物组合物，所述药物组合物包含可药用载体和本发明的化合物或者其可药用盐或溶剂合物；
治疗有此需要之对象的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗有效量的本发明的化合物或者其可药用盐或溶剂合物，或者本发明的药物组合物；
本发明的化合物或者其盐或溶剂合物或者本发明的药物组合物在制备用于治疗(例如，治疗急性或慢性低血糖)的药物中的用途；
核酸构建体(例如，DNA或RNA构建体)，所述核酸构建体编码本发明的化合物(肽)或肽Z；
表达载体，所述表达载体包含本发明的核酸构建体；以及
宿主细胞，所述宿主细胞包含本发明的核酸构建体或表达载体。
在一些实施方案中，待利用本发明的化合物或方法治疗的疾病或病症选自：低血糖、急性低血糖、慢性低血糖、2型糖尿病、糖耐量减低、1型糖尿病、肥胖、冠心病、动脉粥样硬化、高血压、血脂异常、肝脂肪变性、β-受体阻滞剂中毒、胰岛素瘤和冯吉尔克病(VonGierkes disease)。在一些特定实施方案中，所述疾病或病症是低血糖。在某些实施方案中，低血糖选自：糖尿病性低血糖、急性胰岛素诱发的低血糖、非糖尿病性低血糖、反应性低血糖、空腹低血糖、药物诱发的低血糖、醇诱发的低血糖、胃旁路术诱发的低血糖和妊娠期间发生的低血糖。
在一些实施方案中，本发明包括化合物或者其可药用盐或溶剂合物用于治疗低血糖。
附图简述
图1是对禁食5小时的血糖正常的经麻醉雄性Sprague-Dawley大鼠，分别单次皮下施用载剂(PBS，pH 7.4)、人胰高血糖素(20nmol/kg体重)或本发明的化合物14(20和60nmol/kg体重)在120分钟内对血糖水平的影响。数据为平均值与SEM(n＝6只/组)。
发明详述
除非本文另有定义，否则本申请中使用的科学技术术语具有本领域一般技术人员通常理解的含义。通常来说，本文所描述的化学、分子生物学、细胞和癌生物学、免疫学、微生物学、药理学以及蛋白质和核酸化学有关的术语是本领域中公知并且通常使用的。
本申请引用的所有出版物、专利和公开的专利申请均明确地通过引用并入本文。在冲突的情况下，以本说明书(包括其特定定义)为准。
本文描述的本发明每一个实施方案均可单独使用，或者与本发明的一个或更多个其他实施方案组合使用。
定义
除非另有说明，为本文使用的特定术语提供了以下定义。
在说明书通篇中，词语“包括”或类似用语如“包含”或“含有”应理解为意指包括所述整体(或组分)或整体(或组分)的组，但是不排除任何其他整体(或组分)或整体(或组分)的组。
没有数量词限定的名词包括复数指示对象，上下文另外明确说明的除外。
术语“包括”用于指“包括但不限于”。“包括”和“包括但不限于”可互换使用。
术语“患者”、“对象”和“个体”可互换使用，并且均指人或非人动物。这些术语包括哺乳动物，例如人、灵长类动物、家畜动物(例如，牛、猪)、宠物(例如，狗、猫)和啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。
除了上文对本说明书中使用的某些术语和表达的含义提供的解释外，还使用了以下定义/表达：
术语“可药用载体”包括任何标准药用载体或稀释剂，例如用于适于经口、肺、直肠、鼻、局部、皮下、肌内、静脉内、腹膜内、皮内、透皮或阴道内施用的组合物或制剂中使用的那些。用于治疗用途的可药用载体是药学领域中公知的，并描述在例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro编.1985)中。液体组合物通常使用未缓冲的或缓冲的水溶液作为载体。例如，可使用弱酸性、弱碱性或生理pH下的无菌盐水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。相关pH缓冲剂(其中一些已经在上文关于药物组合物提到了)包括磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)、N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)、碳酸氢铵、二乙醇胺、组氨酸(其经常是优选的缓冲剂)、精氨酸和赖氨酸，以及其混合物。该术语还包括在美国药典中所列的用于动物或人的任何其他试剂。
本发明上下文中的术语“可药用盐”是指对待利用其进行治疗的患者或对象无害的盐。这样的盐通常是酸加成盐或碱式盐。酸加成盐包括无机酸盐和有机酸盐。合适的酸加成盐的非限制性实例包括盐酸盐、磷酸盐、甲酸盐、乙酸盐、三氟乙酸盐和柠檬酸盐。碱式盐的实例包括其中阳离子选自以下的盐：碱金属离子(例如钠离子和钾离子)、碱土金属离子(例如钙离子)以及经取代的铵离子(例如NR(R’)3 +型)，其中R和R’独立地表示任选经取代的C1-6烷基、任选经取代的C2-6烯基、任选经取代的芳基或任选取代的杂芳基。可药用盐的其他实例描述在Remington’s Pharmaceutical Sciences，第17版，Alfonso R.Gennaro(编)，Mack Publishing Company，Easton，PA，U.S.A.，1985和更新的版本中，以及Encyclopaedia of Pharmaceutical Technology中。
本发明上下文中的术语“溶剂合物”是指由限定化学计量的溶质(在这种情况下为本发明的化合物或者其可药用盐)和溶剂形成的复合物。相关溶剂(尤其是在可药用溶剂合物的情况下)包括但不限于水、乙醇和乙酸。其中所讨论的溶剂分子是水的溶剂合物通常称为“水合物”。
本发明上下文中(尤其是在本发明化合物的上下文中)使用的术语“治疗有效量”和“治疗有效剂量”是指足以治愈、缓解或部分阻止或者以其他方式促进给定病症(紊乱、疾病)或损伤以及优选地由它们引起的并发症的治愈或康复的量或剂量。对于特定目的有效的量或剂量取决于疾病或病症的严重程度以及待治疗对象或患者的体重和总体状况。合适的量或剂量的确定在经过训练的一般技术的医生(或兽医)的能力范围之内。
本发明上下文中使用的术语“治疗”是指用于获得有益的或期望的临床结果的方法。就本发明目的而言，有益的或期望的临床结果包括但不限于缓解症状、减轻疾病程度、稳定(即，不恶化)疾病状态、延迟或减缓疾病发展、改善或缓和疾病状态以及(部分或全部地)消除(remission)，无论是可检出的还是不可检出的。“治疗”还可以指与未接受治疗时的预期存活相比延长存活期。“治疗”是以防止疾病发生或改变疾病病理状况为目的而进行的介入。因此，“治疗”是指治疗性处理和预防性或防护性手段二者。如在预防性或防护性手段的上下文中使用的，化合物未必完全防止疾病或病症发生。需要治疗的对象包括已经患病和需要预防疾病发生的对象。“治疗”也指与不进行治疗的情况相比抑制或减少病理状况或症状(例如，体重增加或低血糖)的增加，并且未必暗示相关病症的完全终止。
本发明上下文中使用的术语“激动剂”是指激活所讨论的受体类型的物质(配体)。
在本说明书通篇中，使用天然氨基酸的常规单字母和三字母代码。除非另有说明，否则本文提到的氨基酸指的是L-型同分异构体。
Dab(Ac)：4-N-乙酰基-2，4-二氨基丁酸、(2S)-4-(乙酰氨基)-2-氨基丁酸或4-(乙酰氨基)-2-氨基丁酸(L型)。
Dap(Ac)：3-N-乙酰基-2，3-二氨基丙酸或3-(乙酰氨基)-2-氨基丙酸(L型)
Gln(Me)：N-δ-甲基-L-谷氨酰胺
N-Me-Tyr：α-氮甲基化的酪氨酸
N-Me-DTyr：α-氮甲基化的D-酪氨酸
N-Me-Ser：α-氮甲基化的丝氨酸
N-Me-DSer：α-氮甲基化的D-丝氨酸
Aib：α-氨基异丁酸
术语“天然胰高血糖素”是指具有以下序列的天然人胰高血糖素：
Hy-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-OH(SEQ ID NO：1).
本文公开的序列是这样的序列，其在序列的氨基端(N-端)引入了“Hy-”部分，在序列的羧基端(C-端)引入了“-OH”部分或“-NH2”部分。在这种情况下，除非另有说明，否则所讨论序列N端的“Hy-”部分表示氢原子[即，在式I和Ia中，R1＝氢＝Hy-；相当于在N端存在游离伯氨基或仲氨基]，而序列C端的“-OH”或“-NH2”部分分别表示羟基[例如，在式I和Ia中，R2＝OH；相当于在C端存在羧基(COOH)]或氨基[例如，在式I和Ia中，R2＝NH2；相当于在C端存在酰胺基(CONH2)]。在本发明的每一个序列中，C端“-OH”部分可以替换成C端的“-NH2”，反之亦然。
本发明的一些实施方案涉及具有式I的化合物：
R1-Z-R2 (I)
或者其可药用盐或溶剂合物；
其中
R1是氢、C1-4烷基、乙酰基、甲酰基、苯甲酰基或三氟乙酰基；
R2是OH或NH2；以及
Z是衍生自式Ia序列的氨基酸序列：
His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Glu-Asn-Thr (Ia)
并且还包含如下仅在选自2、3、4、9、10、15、16、17、20、21、24、28和29的氨基酸序列位置(用X表示)处的至少4个氨基酸替换或缺失：
X2选自Aib和Ala；
X3选自His、Pro、Dab(Ac)、Dap(Ac)和Gln(Me)；
X4是DAla；
X9是Glu；
X10选自Val、Leu N-Me-Tyr和N-Me-DTyr；
X15是Glu；
X16选自Aib、Lys、Glu、Leu、Val、DVal、Phe、His、Arg、Pro、DPro、N-Me-Ser和N-Me-DSer；
X17选自Ala和Ser；
X20选自Glu和Lys；
X21选自Glu、Lys和Ser；
X24选自Lys、Ser、Glu和Ala；
X25选自Arg、Lys、His、Ile、Leu、Ala、Met、Cys、Asn、Val、Ser、Glu、Asp、Gln、Thr和(p)Tyr；
X28选自Ser、Lys和Glu，或者不存在；
X29选自Ser和Ala，或者不存在；前提是Z并非选自：
HSQGTFTSDYSKYLDSARAEDFVKWLEST；以及
HSQGTFTSDYSKYLESRRAKEFVEWLEST。
本发明的一些实施方案涉及具有式I的化合物：
R1-Z-R2 (I)
或者其可药用盐或溶剂合物；
其中
R1是氢、C1-4烷基、乙酰基、甲酰基、苯甲酰基或三氟乙酰基；
R2是-OH或-NH2；以及
Z是衍生自式Ia序列的氨基酸序列：
His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Glu-Asn-Thr (Ia)
并且还包含如下仅在选自2、3、9、10、15、16、17、20、21、24、28和29的氨基酸序列位置(用X表示)处的至少4个氨基酸替换或缺失：
X2选自Aib和Ala；
X3选自His和Pro；
X9是Glu；
X10选自N-Me-Tyr和N-Me-DTyr；
X15是Glu；
X16选自Aib、Lys、Glu、Leu、Val、DVal、Phe、His、Arg、Pro、DPro、N-Me-Ser和N-Me-DSer；
X17选自Ala和Ser；
X20选自Glu和Lys；
X21选自Glu、Lys和Ser；
X24选自Lys、Ser、Glu和Ala；
X25选自Arg、Lys、His、Ile、Leu、Ala、Met、Cys、Asn、Val、Ser、Glu、Asp、Gln、Thr和(p)Tyr；
X28选自Ser和Lys，或者不存在；
X29选自Ser和Ala，或者不存在；
前提是Z并非选自：
HSQGTFTSDYSKYLDSARAEDFVKWLEST；以及
HSQGTFTSDYSKYLESRRAKEFVEWLEST。
在一些实施方案中，在选自式I化合物之2、3、4、9、10、15、16、17、20、21、24、28和29的氨基酸序列位置(用X表示)处的至少4个氨基酸的替换或缺失如下：
X2选自Aib和Ala；
X3选自His和Pro、Dab(Ac)、Dap(Ac)和Gln(Me)；
X4是DAla；
X9是Glu；
X10选自Val、Leu、N-Me-Tyr和N-Me-DTyr；
X15是Glu；
X16选自Aib、Lys、Glu、Leu、Val、Phe、His和Arg；
X17选自Ala和Ser；
X20选自Glu和Lys；
X21选自Glu、Lys和Ser；
X24选自Lys、Ser、Glu和Ala；
X28选自Ser、Glu和Lys，或者不存在；
X29选自Ser和Ala，或者不存在。
在一些实施方案中，至少4个氨基酸的替换或缺失在选自式I化合物之2、3、4、10、15、16、17、20、21、24、28和29的氨基酸序列位置(用X表示)处，并且如下：
X2是Ala；
X3是Dab(Ac)和Gln(Me)；
X4是DAla；
X10选自Leu和Val；
X15是Glu；
X16选自Aib、Lys、Glu、Leu和Val；
X17是Ala；
X20选自Glu和Lys；
X21选自Glu和Ser；
X24选自Lys、Ser和Glu；
X28选自Ser、Glu和Lys；
X29是Ala，或者不存在。在一些实施方案中，X3选自Dab(Ac)和Gln(Me).
在一些实施方案中，至少4个氨基酸的替换或缺失在选自式I化合物之2、3、4、16、17、20、21、24、28和29的氨基酸序列位置(用X表示)处，并且如下：
X2是Ala；
X3是Dab(Ac)、Dap(Ac)、Gln(Me)或His；
X4是DAla；
X16选自Aib、Lys、Glu；
X17是Ala；
X20选自Glu和Lys；
X21选自Glu和Ser；
X24选自Lys、Ser和Glu；
X28选自Ser、Glu和Lys；
X29是Ala，或者不存在。
在一些实施方案中，X17是Ala。
在一些实施方案中，X25选自Arg、His或Lys。在一些实施方案中，本发明化合物可包含在25位的替换，例如WO2011/117417中描述的那些，其通过引用并入本文。但是，25位的这些替换在本发明中未必获得胰高血糖素类似物的提高的物理稳定性。
在一些实施方案中，X27选自Ser、Lys、Glu和Asp。在一些实施方案中，X27选自：Glu和Asp。在一些实施方案中，X27是Glu。
在一些实施方案中，X28和/或X29可以是上文所公开的那些以外的氨基酸残基。在一些实施方案中，替换可以是亲水替换(例如，Arg、Lys、Asn、His、Gln、Asp、Ser或Glu)。在一些实施方案中，X28和/或X29可以选自：Glu、Asp、Lys、Arg、Ser、Leu、Ala和Gly。在一些实施方案中，X28是Glu或Asp。在一些实施方案中，X29是Glu或Asp。在一些实施方案中，X28是Glu，并且X29是Glu。
在一些实施方案中，X17是Ala，并且X27是Glu。在一些实施方案中，X20是Glu，并且X27是Glu。在一些实施方案中，X17是Ala，X20是Glu，并且X27是Glu。在一些实施方案中，X16是Aib，并且X27是Glu。在一些实施方案中，X16是Aib，X21是Ser，并且X27是Glu。在一些实施方案中，X16是Aib，X21是Ser，X27是Glu，并且X28是Ser。
除了用选自His、Pro、Dab(Ac)和Gln(Me)的氨基酸残基替换式Ia中3位的氨基酸残基(X3)的可能性之外，也可以用谷氨酰胺类似物替换3位，所述谷氨酰胺类似物通常是非天然氨基酸(即，不是天然存在于哺乳动物蛋白质中的氨基酸)，例如Dap(Ac)[即，X3＝Dap(Ac)]。但是，在本文提供的所有定义中，本发明还包括其中X3不允许是Dap(Ac)的用相同通式限定的化合物。
在本发明化合物的一些实施方案中，Z选自：
和
HS-[Dap(Ac)]-GTFTSDYSKYLD-Aib-ARAEEFVKWLEST (SEQ ID NO：41)。
本发明的具体化合物包括：
以及其可药用盐和溶剂合物。
每一个后面这些具体化合物(肽)以及其可药用盐和溶剂合物进一步构成了本发明的单独的实施方案。因此，在一个实施方案中，本发明化合物是
Hy-HSQGTFTSDYSKYLDSARAESFVKWLEST-OH
或者其可药用盐或溶剂合物。
在另一个实施方案中，本发明化合物是
Hy-HSQGTFTSDYSKYLDSARAEDFVKWLEET-OH
或者其可药用盐或溶剂合物。
在另一个实施方案中，本发明化合物是
Hy-HSQGTFTSDYSKYLDKARAEDFVKWLEST-OH
或者其可药用盐或溶剂合物。
在另一个实施方案中，本发明化合物是
Hy-HSQGTFTSDYSKYLDSARAEDFVAWLEST-OH
或者其可药用盐或溶剂合物。
在另一个实施方案中，本发明化合物是
Hy-HSQGTFTSDYSKYLDEARAKDFVEWLEKT-OH
或者其可药用盐或溶剂合物。
在另一个实施方案中，本发明化合物是
Hy-HSQGTFTSDYSKYLDSARAEDFVEWLEST-OH
或者其可药用盐或溶剂合物。
在另一个实施方案中，本发明化合物是
Hy-HSQGTFTSDYSRYLESARAEDFVKWLEST-OH
或者其可药用盐或溶剂合物。
在另一个实施方案中，本发明化合物是
Hy-HSQGTFTSDYSKYLESARAEDFVKWLEST-OH
或者其可药用盐或溶剂合物。
在另一个实施方案中，本发明化合物是
Hy-HSQGTFTSDYSKYLDSARAEEFVKWLEST-OH
或者其可药用盐或溶剂合物。
在另一个实施方案中，本发明化合物是
Hy-HSQGTFTSDYSKYLDSARAEDFVSWLEST-OH
或者其可药用盐或溶剂合物。
在另一个实施方案中，本发明化合物是
Hy-HSQGTFTSDLSKYLDSARAEDFVKWLEST-OH
或者其可药用盐或溶剂合物。
在另一个实施方案中，本发明化合物是
Hy-HSQGTFTSDYSKYLD-Aib-ARAEDFVKWLEST-OH
或者其可药用盐或溶剂合物。
在另一个实施方案中，本发明化合物是
Hy-HSQGTFTSDYSKYLDSARAEDFVKWLES-OH
或者其可药用盐或溶剂合物。
在另一个实施方案中，本发明化合物是
Hy-HSQGTFTSDYSKYLDEARAEDFVKWLEST-OH
或者其可药用盐或溶剂合物。
在另一个实施方案中，本发明化合物是
Hy-HSQGTFTSDYSKYLD-Aib-ARAESFVKWLEST-OH
或者其可药用盐或溶剂合物。
在另一个实施方案中，本发明化合物是
Hy-HSQGTFTSDYSKYLESARAESFVKWLEST-OH
或者其可药用盐或溶剂合物。
在另一个实施方案中，本发明化合物是
Hy-HSQGTFTSDYSKYLDLARAEDFVKWLEST-OH
或者其可药用盐或溶剂合物。
在另一个实施方案中，本发明化合物是
Hy-HSQGTFTSDYSKYLDKRRAEDFVSWLEST-OH
或者其可药用盐或溶剂合物。
在另一个实施方案中，本发明化合物是
Hy-HSQGTFTSDYSKYLDVARAESFVKWLEST-OH
或者其可药用盐或溶剂合物。
在另一个实施方案中，本发明化合物是
Hy-HAQGTFTSDYSKYLD-Aib-ARAESFVKWLEST-OH
或者其可药用盐或溶剂合物。
在另一个实施方案中，本发明化合物是
Hy-HSQGTFTSDYSKYLD-Aib-ARAEEFVKWLEST-OH
或者其可药用盐或溶剂合物。
在另一个实施方案中，本发明化合物是
Hy-HSQ-DAla-TFTSDYSKYLD-Aib-ARAESFVKWLEST-OH
或者其可药用盐或溶剂合物。
在另一个实施方案中，本发明化合物是
Hy-HSQGTFTSDVSKYLD-Aib-ARAESFVKWLEST-OH
或者其可药用盐或溶剂合物。
在另一个实施方案中，本发明化合物是
Hy-HS-[Dab(Ac)]-GTFTSDYSKYLD-Aib-ARAESFVKWLEST-NH2
或者其可药用盐或溶剂合物。
在另一个实施方案中，本发明化合物是
Hy-HSQGTFTSDYSKYLD-Aib-RRAESFVKWLEST-OH
或者其可药用盐或溶剂合物。
在另一个实施方案中，本发明化合物是
Hy-HS-[Gln(Me)]-GTFTSDYSKYLD-Aib-ARAESFVKWLEST-OH
或者其可药用盐或溶剂合物。
在另一个实施方案中，本发明化合物是
Hy-HSQGTFTSDYSKYLDEARAKSFVEWLEKT-OH
或者其可药用盐或溶剂合物。
在另一个实施方案中，本发明化合物是
Hy-HSQGTFTSDYSKYLDEARAKSFVEWLEST-OH
或者其可药用盐或溶剂合物。
在另一个实施方案中，本发明化合物是
Hy-HSQGTFTSDYSKYLD-Aib-ARAKSFVEWLEKT-OH
或者其可药用盐或溶剂合物。
在另一个实施方案中，本发明化合物是
Hy-HSQGTFTSDYSKYLD-Aib-ARAESFVKWLESA-OH
或者其可药用盐或溶剂合物。
在另一个实施方案中，本发明化合物是
Hy-HSQGTFTSDYSKYLD-Aib-ARAESFVKWLEST-NH2
或者其可药用盐或溶剂合物。
在另一个实施方案中，本发明化合物是
Hy-HS-[Dab(Ac)]-GTFTSDYSKYLD-Aib-ARAESFVKWLEST-OH
或者其可药用盐或溶剂合物。
在另一个实施方案中，本发明化合物是
Hy-HSQGTFTSDYSKYLD-Aib-ARAEEFVSWLEKT-OH
或者其可药用盐或溶剂合物。
在另一个实施方案中，本发明化合物是
Hy-HSQGTFTSDYSKYLD-Aib-ARAEKFVEWLEST-OH
或者其可药用盐或溶剂合物。
在另一个实施方案中，本发明化合物是
Hy-HSQGTFTSDYSKYLD-Aib-ARAEEFVAWLEST-OH
或者其可药用盐或溶剂合物。
在另一个实施方案中，本发明化合物是
Hy-HSQGTFTSDYSKYLD-Aib-ARAEEFVKWLEET-OH
或者其可药用盐或溶剂合物。
在另一个实施方案中，本发明化合物是
Hy-HSQGTFTSDYSKYLE-Aib-ARAEEFVKWLEST-OH
或者其可药用盐或溶剂合物。
在另一个实施方案中，本发明化合物是
Hy-HSHGTFTSDYSKYLD-Aib-ARAEEFVKWLEST-NH2
或者其可药用盐或溶剂合物。
在另一个实施方案中，本发明化合物是
Hy-HS-[Dab(Ac)]-GTFTSDYSKYLD-Aib-ARAEEFVKWLEST-OH
或者其可药用盐或溶剂合物。
在另一个实施方案中，本发明化合物是
Hy-HS-[Dab(Ac)]-GTFTSDYSKYLD-Aib-ARAEEFVKWLEST-NH2
或者其可药用盐或溶剂合物。
在另一个实施方案中，本发明化合物是
Hy-HS-[Dap(Ac)]-GTFTSDYSKYLD-Aib-ARAEEFVKWLEST-NH2
或者其可药用盐或溶剂合物。
本发明化合物可在肽序列内具有一个或更多个分子内桥。每一个这样的桥均在序列内通常被三个其他氨基酸残基隔开的两个氨基酸残基的侧链之间(即，氨基酸A的侧链和氨基酸A+4的侧链之间)形成。
例如，这样的桥可以在12和16、16和20、20和24或24和28位的氨基酸残基对的侧链之间形成。所讨论的两个侧链可以通过离子相互作用或通过共价键彼此连接。因此，这样的氨基酸残基对可以例如包含带相反电荷的能够形成盐桥或者产生离子相互作用的侧链。在这种情况下，所讨论的氨基酸残基中的一个可以是例如Glu或Asp，而另一个可以是例如Lys或Arg。Lys和Glu配对或者Lys和Asp配对还可导致形成内酰胺环。
药物组合物
在一些实施方案中，本发明涉及包含本发明的化合物(或者其可药用盐或溶剂合物)和可药用载体的药物组合物。这样的药物组合物可以通过常规技术制备，例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第19版，1995中描述的。
本发明液体药物组合物的某些实施方案可包含以下浓度的本发明化合物：约0.01mg/ml至约25mg/ml，例如约1mg/ml至约10mg/ml，例如，约1mg/ml至约5mg/ml。在一些实施方案中，组合物的pH为2.0至10.0。本发明的药物组合物还可包含缓冲体系、防腐剂、等张剂、螯合剂、稳定剂和/或表面活性剂。本发明液体药物组合物的特别有用的实施方案是水性组合物，即含有水的组合物。这样的组合物可以是例如水溶液或水悬液的形式。本发明水性药物组合物的优选实施方案是水溶液。在本发明上下文中，术语“水性组合物”通常是指含有至少50重量％(50％w/w)水的组合物。同样地，术语“水溶液”通常是指含有至少50％w/w水的溶液，术语“水悬液”通常是指含有至少50％w/w水的悬液。
在一些实施方案中，本发明药物组合物包含以0.1mg/ml或更高浓度存在的本发明化合物(或者其可药用盐或溶剂合物)的水溶液以及缓冲剂，所述组合物的pH为约2.0至约10.0，例如pH为约6.0至约8.5，例如约6.5至约8.5，例如约7.0至约8.5，或者约6.5至约8.0。
在本发明药物组合物的另一些实施方案中，组合物的pH选自：2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、S.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.8、9.9和10.0。本发明组合物的pH与本发明化合物组分的等电点可以相差(即，高或低)至少1个pH单位，例如与本发明化合物胰高血糖素类似物的等电点相差(即，高或低)至少2个pH单位。
在本发明含缓冲剂的药物组合物的另一些实施方案中，缓冲剂或缓冲物质选自：醋酸盐缓冲剂(例如，醋酸钠)、碳酸钠、柠檬酸盐(例如，柠檬酸钠)、双甘氨肽、组氨酸、甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、磷酸盐(例如，选自磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和磷酸三钠)、TRIS(即，三(羟甲基)氨基甲烷)、HEPES(即，4-(2-羟乙基)-1-哌嗪-乙磺酸)、BICINE(即，N，N-二(2-羟乙基)甘氨酸)和TRICINE(即，N-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸)，以及琥珀酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、富马酸盐、酒石酸盐和天冬氨酸盐缓冲剂，以及其混合物。
在本发明药物组合物的另一些实施方案中，组合物包含可药用防腐剂。相关防腐剂包括选自以下的防腐剂：苯酚、邻甲酚、间甲酚、对甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、2-苯氧基乙醇、2-苯基乙醇、苯甲醇、乙醇、氯丁醇、硫柳汞、溴硝醇(bronopol)、苯甲酸、咪脲(imidurea)、氯已定、脱氢乙酸钠、氯甲酚、苄索氯铵(benzethonium chloride)、氯苯甘醚[即，3-(对-氯苯氧基)丙烷-1，2-二醇]及其混合物。防腐剂可以如下浓度存在于最终的液体组合物中：0.1mg/ml至30mg/ml，例如0.1mg/ml至20mg/ml(例如，0.1mg/ml至5mg/ml，或者5mg/ml至10mg/ml，或者10mg/ml至20mg/ml)。在药物组合物中使用防腐剂是技术人员公知的。在这一点上，可参考Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第19版，1995。
在另一些实施方案中，本发明药物组合物包含等张剂(即，为了使组合物等张而包含在组合物中的可药用试剂)。在一些实施方案中，通过注射将组合物施用于患者。相关等张剂包括选自以下的试剂：盐(例如，氯化钠)、糖和糖醇、氨基酸(包括甘氨酸、精氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸和苏氨酸)、糖醇(包括甘油、丙二醇(即，1，2-丙二醇)、1，3-丙二醇和1，3-丁二醇)、聚乙二醇(包括PEG400)以及其混合物。合适的糖包括单糖、二糖和多糖，以及水溶性葡聚糖如果糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、右旋糖酐、普鲁兰多糖、糊精、环糊精、可溶性淀粉、羟乙基淀粉和羧甲基纤维素钠盐。在一些实施方案中，可使用蔗糖。合适的糖醇包括羟基化C4-C8烃，包括甘露醇、山梨醇、肌醇、卫康醇(galacititol)、半乳糖醇、木糖醇和阿拉伯糖醇。在一些实施方案中，可使用甘露醇。上述糖或糖醇可单独使用或组合使用。所使用的等张剂的量没有固定限制，只要其在液体制剂中可溶、建立等张性并且不会不利地影响组合物的稳定性即可。最终液体组合物中等张剂(例如，糖或糖醇)的浓度可以是例如约1mg/ml至约150mg/ml，例如1mg/ml至50mg/ml。在一些特定实施方案中，浓度可以是1mg/ml至7mg/ml，或者8mg/ml至24mg/ml，或者25mg/ml至50mg/ml。在药物组合物中使用等张剂是技术人员公知的。在这一点上，可以参考Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第19版，1995。
在本发明药物组合物的另一些实施方案中，组合物包含螯合剂。相关螯合剂包括乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸或天冬氨酸的盐，以及其混合物。螯合剂可以以0.1mg/ml至5mg/ml，例如0.1mg/ml至2mg/ml或者2mg/ml至5mg/ml的浓度合适地存在于最终的液体组合物中。在药物组合物中使用螯合剂是技术人员公知的。在这一点上，可以参考Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第19版，1995。
在本发明药物组合物的另一些实施方案中，组合物包含稳定剂。在药物组合物使用稳定剂是技术人员公知的，在这一点上，可以参考Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第19版，1995。本发明特别有用的药物组合物是稳定的液体组合物，其治疗活性成分包含本发明的化合物(例如，本发明的肽)，这些化合物在其他情况下可能在液体介质中储存期间表现为聚集体形成(aggregate formation)。在这种情况下，“聚集体形成”是指肽分子之间导致形成较大装配体的物理相互作用，所述装配体在溶液中经受一定程度地可见沉淀。本文使用的“在液体介质中储存期间”是指液体组合物一旦制备就被储存，而未必立即施用于对象。而在制备之后，可以将其以液体形式、冻结状态或者干粉形式包装储存，所述干粉形式用于随后重构成液体形式或其他适合于向对象施用的形式。本文使用的“干粉形式”是指已经通过冷冻干燥(即，冻干)、喷雾干燥或风干干燥的初始液体药物组合物或制剂。在液体药物组合物储存期间肽聚集体形成可不利地影响所讨论肽的生物活性，导致失去药物组合物的治疗效力。另外，聚集体形成可引起其他问题，例如如果使用输注系统施用这种含肽药物组合物，则会堵塞管道、膜或泵。因此，本发明的肽可有利地克服这些问题。
适合掺入到本发明药物组合物中的稳定剂的实例包括但不限于以下：游离碱形式或盐形式的氨基酸，例如，具有带电侧链的氨基酸，如精氨酸、赖氨酸、天冬氨酸或谷氨酸，或者氨基酸如甘氨酸或甲硫氨酸(因为掺入甲硫氨酸可额外地抑制对氧化敏感的含有至少一个甲硫氨酸残基的肽中甲硫氨酸残基的氧化)；某些聚合物(例如，聚乙二醇(例如，PEG3350)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和羧基/羟基纤维素及其衍生物)；环糊精；含硫物质(例如，单硫代甘油、巯基乙酸和2-甲基硫代乙醇)；以及表面活性剂(例如，非离子表面活性剂，包括泊洛沙姆(Poloxamer)或聚山梨醇酯(Polysorbate，Tween)型非离子表面活性剂。在药物组合物中使用表面活性剂是技术人员公知的。在这一点上，可以参考Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第19版，1995。
本发明的药物组合物中还可以存在其他类型的成分。这些类型成分的非限制性实例包括湿润剂、乳化剂、抗氧化剂、填充剂(bulking agent)、油性载体和蛋白质(例如，人血清白蛋白或明胶)。
可以向有这种治疗需要之患者的多个部位施用本发明的药物组合物，例如在绕过吸收的部位施用，例如在动脉中或静脉中或者心脏中，以及涉及吸收的部位，例如皮肤内、皮肤下、肌内或腹膜内。更一般地，可以通过多种施用途径来施用本发明的药物组合物，例如或者示例性为肠胃外、表皮、真皮或透皮途径。在一些实施方案中，其他途径如经舌、舌下、颊、口服、阴道内或直肠可能是有用的。
本发明的组合物可以以多种剂型施用，例如溶液剂、混悬剂或乳剂，并且可用于配制受控、持续、延长、延迟或缓慢释放药物递送系统。更特别但是不排外地，本发明药物组合物可用于与本领域技术人员公知的肠胃外受控释放和持续释放系统结合。这一点一般可以参考Handbook of Pharmaceutical Controlled Release(Wise，D.L.，编，Marcel Dekker，New York，2000)和Drugs and the Pharmaceutical Sciences，第99卷：Protein Formulation and Delivery(MacNally，E.J.编，Marcel Dekker，New York，2000)。
可以借助注射器(适宜地钢笔样注射器)例如通过皮下、肌内、腹膜内或静脉内注射来进行肠胃外施用(本发明的液体药物组合物)。或者，可以借助输液泵来进行肠胃外施用，例如由对象或患者负荷的包括含本发明液体组合物的容器和用于向对象或患者递送/施用组合物的输液泵形式的装置或系统，或者适合于植入到对象或患者体内相应小型化设备的形式。
本文使用的术语“稳定组合物”是指具有提高的物理稳定性、提高的化学稳定性或者提高的物理和化学稳定性的组合物。本文使用的术语“物理稳定性”是指对肽(例如，本发明的化合物)形成可溶性或不溶性肽聚集体的趋势的量度，例如由于肽暴露于应力和/或与不稳定的界面和表面(例如，疏水表面和界面)相互作用引起的。水性肽组合物的物理稳定性可通过外观检查和/或浊度测量来评估，在组合物暴露后，将其填充在合适的容器(例如，筒(catridge)或小瓶)中，在不同的温度下在机械/物理应力(例如，搅拌)下进行不同的时间段。当组合物表现出可见的浊度时，可以将组合物归类为在肽聚集方面物理不稳定。或者，可通过本领域技术人员公知的简单的浊度测量来评估组合物的浊度。也可使用充当肽构象状态的光谱学探针的试剂来评估水性肽组合物的物理稳定性。优选地，探针是优先与肽的非天然构象异构体结合的小分子。这些小分子光谱学探针的一个实例是ThioflavinT，这是一种被广泛用于检测淀粉样原纤维的荧光染料。在原纤维以及可能的其他肽构型的存在下，当Thioflavin T与原纤维形式的肽结合时，其在约450nm产生新的激发最大值，并且在约482nm产生增强的发射。在所讨论的波长下，未结合的Thioflavin T基本没有荧光。
本文使用的术语“化学稳定性”是指在肽结构中的共价化学变化方面的肽稳定性，所述共价化学变化将导致形成与天然肽结构相比具有潜在的较低生物学效力和/或潜在的提高的免疫原性的化学降解产物。根据天然肽的类型和详细性质以及肽所暴露的环境，可能形成多种化学降解产物。在实践中，一般无法完全避免肽组合物的化学降解的消除，而且在这些组合物的储存和使用过程中通常可以看到增加量的化学降解产物，这是本领域技术人员公知的。许多肽对于谷氨酰胺酰基或天冬酰胺酰基残基中的侧链酰胺基水解而形成游离羧酸的降解过程敏感。另一些降解途径涉及形成高分子量转化产物，其中两个或更多个肽分子通过转酰胺基作用和/或二硫化物相互作用而彼此共价结合，导致形成共价结合的寡聚物和聚合物降解产物(参见，例如Stability of Protein Pharmaceuticals，Ahern.T.J.和Manning M.C.，Plenum Press，New York 1992)。氧化(例如，甲硫氨酸残基的氧化)是肽的另一种形式的化学降解。可通过在肽组合物暴露于不同的环境条件(例如，降解产物的形成通常因为温度的升高而加速)后测量不同时间点化学降解产物的量来评估肽组合物的化学稳定性。可通过分离降解产物来测定每一种单独降解产物的量，所述分离根据分子大小和/或电荷使用多种色谱技术(例如SEC-HPLC和/或RP-HPLC)进行。
胰高血糖素本身在低pH下的化学不稳定性主要是由于天冬氨酸残基的异构化和切割、谷氨酰胺残基的脱酰胺和甲硫氨酸的氧化。一般来说，Asn和Gln在高pH下脱酰胺，在约pH 7.4的生理pH下，其通过环状亚胺的环中间物而具有显著的速率，所述环状中间物可打开从而分别产生L-Asp和L-异Asp或者L-Glu和L-异Glu。环状亚胺环状中间物也可导致形成少量相应的D-异构体，表明环状亚胺具有缓慢的外消旋作用。
在低于生理pH的pH值下，Asn和Gln的脱酰胺速率降低，但是由Asp和Glu形成环状亚胺和因此异构化的速率随着pH的降低而提高。在pH 4和pH 6之间，环状亚胺的形成最大。环状亚胺中间物的形成也可导致肽序列的切割。
如上所述，“稳定组合物”因此可以指具有提高的物理稳定性或提高的化学稳定性或提高的物理和化学稳定性的组合物。一般来说，组合物在使用和储存(根据推荐的使用和储存条件)的过程中应该至少在到达规定的有效期之前是稳定的。
在本发明药物组合物(例如，液体组合物)的某些实施方案中，所述组合物能够稳定地使用至少2周以及储存至少6个月。在另一些实施方案中，所述组合物能够稳定地使用至少2周以及储存至少1年。在另一些实施方案中，所述组合物稳定地使用至少2周以及储存至少2年。在另一些实施方案中，所述组合物稳定地使用至少4周以及储存至少2年，或者甚至使用至少4周以及储存超过3年。本发明这样的药物组合特别有用的实施方案是稳定地使用至少6周，储存至少3年。在这一点上，这一段中的术语“使用”是指为了将组合物用于治疗而从储库中取出药物组合物，并因此使其遭受不同的环境条件(光、暗、温度、搅拌等条件)，这一段中的术语“储存”是指在冰箱或冷库中于不超过约5℃的温度下储存在非搅拌条件下。本领域技术人员将理解，这些药物组合物可能遭受的通常使用和储存条件范围。
核酸、表达载体和宿主细胞
本发明提供了编码本发明化合物或者本发明化合物的肽序列Z的核酸分子(例如，分离的核酸分子)。
应理解，本发明化合物或肽序列Z通常仅在肽序列Z仅包含天然氨基酸(即哺乳动物蛋白质中天然存在的20种氨基酸)时可由核酸序列编码。
如上文讨论的，本发明尤其涉及包含本发明的核酸构建体序列和任选地指导所述核酸构建体序列的表达的一个或更多个序列组合的表达载体，和包含本发明的表达载体的宿主细胞。优选地，所述宿主细胞能够表达和分泌本发明的化合物或者具有本发明化合物的肽序列Z的化合物。在一些实施方案中，本发明提供了本发明化合物的制备方法，其中所述方法包括在适于所述化合物表达的条件下培养宿主细胞以及纯化由此产生的化合物。或者，所述方法可包括表达具有本发明化合物的肽序列Z的化合物，以及随后修饰N和/或C端以获得本发明化合物。本发明还提供了：(i)本发明的核酸，(ii)本发明的表达载体，和(iii)能够表达和任选地分泌本发明化合物的宿主细胞，它们均用于医疗方法。本发明的核酸、表达载体和宿主细胞可用于治疗本文描述的任何可以用本发明化合物本身治疗的疾病。因此，提到的包含本发明化合物的药物组合物、施用本发明化合物或者其任何治疗用途应解释为包括等效使用本发明的核酸、表达载体或宿主细胞，上下文另外要求除外。
肽合成
本发明的肽可通过标准化学合成方法或者使用重组表达系统或任何其他合适的现有技术方法来制备。因此，胰高血糖素类似物可以以多种方式合成，尤其包括以下方法：
(a)采用固相或液相方法逐步地或通过片段组装来合成肽，分离和纯化最终的肽产物；或者
(b)在宿主细胞中表达编码该肽的核酸构建体，从宿主细胞培养物中回收表达产物；或者
(c)对编码所述肽的核酸构建进行无细胞体外表达，回收表达产物；或者利用(a)、(b)和(c)中方法的任意组合来获得肽片段，随后连接(例如，结合)所述片段以获得完整的肽，以及回收所述肽。
可优选通过固相或液相肽合成来合成本发明化合物，其方法为肽合成领域一般技术人员所公知。在这一点上，也可以参考例如WO 98/11125和Fields，G.B.等，2002，“Principles和practice of solid-phase peptide synthesis”.Synthetic Peptides(第二版)以及其中提供的实例。
对于重组表达，可以将本发明的核酸构建体插入到合适的载体中以形成携带本发明的核酸构建体的克隆或表达载体(这些载体也构成了本发明的方面)。根据应用目的和类型，载体可以是质粒、噬菌体、粘粒、小染色体或病毒，但是仅在某些细胞中瞬时表达的裸DNA也可以是重要的载体。本发明的优选克隆和表达载体(质粒载体)能够复制，因此能够产生用于高水平表达的高拷贝数或用于后续克隆的高水平复制。
一般来说，表达载体可包括在5′→3′方向上有效连接的以下特征：用于驱动本发明的核酸片段表达的启动子，任选地编码使得能够分泌表达产物(分泌到细胞外相中或适用时分泌到周质(periplasma)中)的前导肽的核酸序列，编码本发明肽的核酸序列，和任选地编码终止子的核酸序列。表达载体还可包含额外的特征，例如选择标记和复制起点。当利用表达载体在生产菌株或细胞系中操作时，可优选载体能够整合到宿细胞基因组中。技术人员将熟悉合适的载体，并且能够根据所讨论的具体需要设计表达载体。
本发明的载体可用于转化宿主细胞以产生本发明的化合物。这些转化细胞构成了本发明的实施方案，可以是用于本发明的核酸片段和载体增殖或者可以用于重组产生本发明的肽的培养细胞或细胞系。
在一些实施方案中，本发明的转化细胞是微生物，例如细菌(例如埃希氏菌属(Escherichia)的菌种(例如，E.coli)、芽孢杆菌属(Bacillus)(例如，枯草芽孢杆菌(B.subtilis))、沙门氏菌属(Salmonella)或分支杆菌属(Mycobacterium)(优选非病原的，例如牛分支杆菌(M.bovis)BCG)))、酵母(例如，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或毕赤酵母(Pichia pastoris))或原生动物。或者，转化细胞可来源于多细胞生物，例如，细胞可以是真菌细胞、昆虫细胞、藻类细胞、植物细胞或动物细胞如哺乳动物细胞。为了克隆和/或优化表达，转化细胞可能能够复制本发明的核酸构建体。表达核酸构建体的细胞是本发明的有用实施方案，可用于小规模或大规模制备本发明的肽。
当采用转化细胞产生本发明的肽时，方便但并非必要的是，将表达产物分泌到培养基中。
效力
本发明的化合物具有胰高血糖素激动剂活性。
相关化合物与胰高血糖素(Glu或GCG)受体的结合可用作激动剂活性的指示。在一些可选实施方案中，也可使用测量由化合物与受体结合引起的细胞内信号转导的生物测定。例如，胰高血糖素受体激动剂对胰高血糖素受体的活化将刺激细胞环AMP(cAMP)的形成。因此，可使用合适的表达受体的细胞中cAMP的产生来监测受体活性。
本领域技术人员将知晓合适的测定形式，在下文提供了实例。例如，测定可使用原始登记号GI：4503947(NP_000151.1)或原始登记号P47871的人胰高血糖素受体(GCG-R)。技术人员将理解，在这种情况下，当提到前体蛋白的序列时，可使用缺少信号序列的成熟蛋白质进行测定。合适的细胞通常是哺乳动物细胞，例如啮齿类或灵长类动物细胞，例如大鼠、小鼠或仓鼠细胞，或者人细胞，如HEK293细胞。这些细胞可表达它们的内源胰高血糖素受体，或者可能被改造成表达胰高血糖素受体(例如，具有上述人序列)。可使用实施例3中给出的材料并且在所述条件下进行测定。
可使用EC50值作为对给定受体的激动剂效力的数值量度。EC50值是在特定测定中对于所讨论受体实现化合物最大活性的一半时所需的该化合物浓度的测量值。
治疗用途
本发明化合物(及其可药用盐或溶剂合物)以及本发明的药物组合物可用于治疗或预防多种疾病或病症。任选地，所述化合物(及其可药用盐或溶剂合物)可与一种或更多种其他治疗活性物质组合使用。相关治疗用途因此包括：治疗或预防低血糖(急性和慢性二者)、2型糖尿病(包括2型糖尿病的疾病进展)、糖耐量减低、1型糖尿病、肥胖(包括超重或肥胖相关的疾病或状态)、冠心病、动脉粥样硬化、高血压、血脂异常、肝脂肪变性、β-受体阻滞剂中毒、胰岛素瘤和冯吉尔克病；防止对象超重；减轻体重；减少食物摄取；增加能量消耗；延迟糖耐量减低(IGT)向2型糖尿病发展；延迟2型糖尿病向需要胰岛素的疾病发展；调节食欲或诱导饱腹感(包括治疗暴食症和治疗暴饮暴食)；以及在体重减轻成功后防止体重反弹。一般而言，本发明化合物(及其可药用盐或溶剂合物)以及本发明的药物组合物可用于控制血糖水平。
能够根据本发明治疗或预防的低血糖形式包括糖尿病性低血糖(包括急性胰岛素诱发的低血糖)、非糖尿病性低血糖、反应性低血糖、空腹低血糖、药物诱发的低血糖、醇诱发的低血糖、胃旁路术诱发的低血糖和妊娠期间发生的低血糖。
本发明化合物(及其可药用盐或溶剂合物)以及本发明药物组合物的其他应用包括用作平滑肌松弛剂(解痉剂)，其与成像程序(例如，X-射线、计算机断层扫描(CT)或磁共振(MR)成像)相关，例如腹部成像。
联合治疗
如上文已经指出的，利用本发明化合物(及其可药用盐或溶剂合物)的治疗可与一种或更多种其他药理学活性物质或药剂联合进行，所述其他药理学活性物质或药剂例如选自抗糖尿病剂、减肥药、食欲调节剂、抗高血压药、治疗和/或预防糖尿病引起或与糖尿病相关的并发症的药剂，以及用于治疗和/或预防由肥胖引起或与肥胖相关的并发症和疾病的药剂。在本文中，表述“抗糖尿病剂”包括用于治疗和/或预防胰岛素抵抗和其中胰岛素抗性是病理生理学机制的疾病的化合物。
这些药学活性物质的实例是胰岛素和胰岛素类似物、GLP-1激动剂、磺酰脲类(例如，甲苯磺丁脲、格列苯脲、格列吡嗪和格列齐特)、双胍类(例如，二甲双胍)、氯茴苯酸类(meglitinide)、葡萄糖苷酶抑制剂(例如，阿卡波糖)、胰高血糖素拮抗剂、二肽基肽酶IV(DPP-IV)抑制剂、参与糖异生和/或糖原分解的肝酶的抑制剂、葡萄糖摄取调节剂、噻唑烷二酮类如曲格列酮和环格列酮、调节脂类代谢的化合物如抗高血脂剂(例如，HMG CoA抑制剂(他汀类))、降低食物摄取的化合物、RXR激动剂和作用于β细胞的ATP依赖的钾通道的药剂，例如格列苯脲、格列吡嗪、格列齐特和瑞格列奈；考来烯胺(cholestyramine)、考来替泊、氯贝丁酯、吉非贝齐、洛伐他汀、普伐他汀、辛伐他汀、普罗布考、右旋甲状腺素、那格列奈、瑞格列奈；β-受体阻滞剂，例如阿普洛尔、阿替洛尔、噻吗洛尔、吲哚洛尔、普萘洛尔和美托洛尔，ACE(血管紧张素转换酶)抑制剂如贝那普利、卡托普利、依那普利、福辛普利、赖诺普利、alatriopril、喹那普利和雷米普利，钙通道阻滞剂，如硝苯地平、非洛地平、尼卡地平、依拉地平、尼莫地平、地尔硫卓和维拉帕米，以及α-受体阻滞剂，例如多沙吡嗪、乌拉地尔、哌唑嗪和特拉唑嗪；CART(可卡因安非他明调节的转录物)激动剂、NPY(神经肽Y)拮抗剂、MC4(黑皮质素4)激动剂、食欲肽拮抗剂、TNF(肿瘤坏死因子)激动剂、CRF(促皮质素释放因子)激动剂、CRF BP(促肾上腺皮质激素释放因子结合蛋白)拮抗剂、尿皮质素(urocortin)激动剂、β3激动剂、MSH(黑色素细胞刺激素)激动剂、MCH(黑色素细胞浓集激素)拮抗剂、CCK(胆囊收缩素)激动剂、血清素再摄取抑制剂、血清素和去甲肾上腺素再摄取抑制剂、混合的血清素和去甲肾上腺素化合物、5HT(血清素)激动剂、蜕皮素激动剂、甘丙肽拮抗剂、生长激素、生长激素释放化合物、TRH(促甲状腺激素释放激素)激动剂、UCP 2或UCP3(解偶联蛋白2或3)调节剂、瘦素激动剂、DA激动剂(例如，溴麦角环肽(bromocryptin)、doprexin)、脂肪酶/淀粉酶抑制剂、RXR(维甲类X受体)调节剂、TRβ激动剂和组胺H3拮抗剂。
本发明的一种或更多种化合物与一种或更多种上述化合物以及任选地一种或更多种另外的药理学活性物质的任何合适的组合也在本发明的范围内。
实验方法
下文使用的缩写如下：
COMU：1-[(1-(氰基-2-乙氧基-2-氧代亚乙基氨基氧基)-二甲氨基-吗啉代亚甲基)]六氟磷酸甲胺
DCM：二氯甲烷
DMF：N，N-二甲基甲酰胺
DIPEA：二异丙基乙胺
EtOH：乙醇
Et2O：乙醚
HATU：N-[(二甲基氨基)-1H-1，2，3-三唑[4，5-b]吡啶-1-基亚甲基]-N-甲基六氟磷酸甲胺N-氧化物
HPLC：高效液相色谱
IBMX：3-异丁基-1-甲基黄嘌呤
MeCN：乙腈
MS：质谱
PBS磷酸盐缓冲盐水
RP：反相
TFA：三氟乙酸
TIS：三异丙基硅烷
胰岛素类似物的一般合成程序
在微波辅助合成仪中，使用DMF中的标准Fmoc策略在聚苯乙烯树脂(TentaGel SRam或Tentagel S PHB-Thr(tBu))上进行固相肽合成(SPPS)。使用HATU或COMU作为偶联剂，DIPEA作为碱。使用哌啶(DMF中20％)去保护。在适用的情况下使用假脯氨酸：Fmoc-Phe-Thr(ΨMe，Me pro)-OH、Fmoc-Asp-Ser(Ψ，Me，Me pro)-OH和Fmoc-Glu-Ser(Ψ，Me，Me pro)-OH(购自NovaBiochem)。使用本文所述合成方法和纯化程序类似地合成并且纯化人胰高血糖素。
切割
通过在室温下用95/2.5/2.5％(v/v)TFA/TIS/水处理2小时来从树脂上切割粗制肽。在减压下除去大部分TFA，使粗制肽沉淀并用乙醚洗涤，在环境温度下干燥。
肽纯化
通过标准RP HPLC利用梯度缓冲液A(0.1％水性TFA)和缓冲液B(含0.1％TFA和90％MeCN的水溶液)纯化粗制肽。利用分析型HPLC和MS分析级分，合并相关级分并冻干。
通过制备型RP HPLC使用梯度缓冲液A’(0.1％水性甲酸)和缓冲液B’(含有0.1％甲酸和90％MeCN的水溶液)对肽进一步纯化。添加TFA以收集级分，之后冻干。最终产物通过分析型HPLC和MS表征。
分析型HPLC方法
通过分析型HPLC方法使用梯度缓冲液A’(见上文)和缓冲液B’(见上文)分析肽。
实施例1
合成化合物7
在CEM Liberty肽合成仪上使用Tentagel S PHB-Thr(tBu)树脂(1.13g，0.24mmol/g)合成化合物7(SEQ ID NO：8)，其中使用COMU作为偶联剂，DMF作为溶剂，使用上述Fmoc化学进行。在序列中使用假脯氨酸Fmoc-Phe-Thr(ΨMe，Me pro)-OH(6/7位)和Fmoc-Glu-Ser(Ψ，Me，Me pro)-OH(15/16位)。
如上所述从树脂上切下肽，在Gemini-NX柱(5cm，C18，10微米)上利用流量为35ml/分钟的缓冲液A(见上文)和缓冲液B(见上文)的混合物进行纯化。产物用线性梯度的20-50％的缓冲液B洗脱47分钟，通过分析型HPLC和MS分析相关级分。将合并的级分冻干并且再溶解在水中，之后在Gemini-NX柱(2.12×25cm，C18(110A)；10微米)上利用流量为10ml/分钟的缓冲液A’(见上文)和缓冲液B’(见上文)的混合物进一步纯化。产物用线性梯度的5-40％的缓冲液B’洗脱47分钟，通过分析型HPLC和MS分析相关级分。向合并的级分中添加TFA，将其冻干得到112mg。通过分析型HPLC(见上文)测定的纯度为99％，通过MS测定的单一同位素质量为3409.55Da(计算值为3409.58Da)。
实施例2
表达人胰高血糖素受体的细胞系的制备
由cDNA克隆BC104854(MGC：132514/IMAGE：8143857)克隆编码人胰高血糖素受体(胰高血糖素-R)(原始登记号：P47871)的cDNA。通过PCR使用编码用于亚克隆之末端限制性位点的引物扩增编码胰高血糖素-R的DNA。5’端引物额外编码近Kozak共有序列以确保有效翻译。通过DNA测序来验证编码胰高血糖素-R的DNA的精确度。将编码胰高血糖素-R的PCR产物亚克隆到含有新霉素(G418)抗性标记的哺乳动物表达载体中。通过标准磷酸钙转染法将编码胰高血糖素-R的哺乳动物表达载体转染到HEK293细胞中。转染48小时后，接种细胞以有限稀释克隆并且利用1mg/ml G418在培养基中选择。三周后，挑取12个存活的胰高血糖素-R表达细胞的群落，繁殖并且如下文所述测定胰高血糖素-R效力。选择一种胰高血糖素-R表达克隆用于化合物性能分析。
实施例3
胰高血糖素受体测定
将表达人胰高血糖素-R的HEK293细胞以60,000细胞每孔接种到涂覆有0.01％聚L赖氨酸的96孔微量滴定板上，在100μl生长培养基中培养生长1天。为了分析由胰高血糖素-R诱导的cAMP，根据制造商的说明书来使用来自Perkin Elmer的cAMP测定试剂盒。在分析当天，除去培养基并且将细胞用200ml包含IBMX的测定缓冲液洗涤一次。将细胞在含有升高浓度受试肽的100ml测定缓冲液/IBMX中于37℃孵育15分钟。然后除去肽/测定缓冲液，并且通过添加每孔80ml裂解缓冲液并在室温孵育至少10分钟来裂解细胞。从每一个孔中，将10ml细胞裂解物转移到384孔OptiPlate中并且与供体珠和受体珠混合，在室温下孵育1小时。在Envision平板阅读器上测量cAMP含量。通过计算机辅助曲线拟合来评估EC50以及与参考化合物(胰高血糖素)相比的相对效力。
实施例4
溶解度评估
在脱盐水(demineralized water)中制备受试肽的储液(2mg/ml；通过测量溶液在280nm的吸光度来测定，该测量基于肽中色氨酸和络氨酸含量的理论扩展系数(theoretical extension coefficient))，用HCl调节至pH 2.5，将等分试样分别以1：1在100mM乙酸盐缓冲液(pH 4.0)和100mM磷酸盐缓冲液(pH 7.5)中稀释，并且加样到标准平底无菌96孔UV微孔板上。在预热到环境温度的基于吸光度的平板阅读器上测量样品(单个样品，n＝1)在280nm和325um的吸光度。溶解度≥1mg/ml的肽的浊度吸光度标准为325nm下≤0.02吸光度单位(为平板中8个缓冲样品的标准偏差的5至6倍)的吸光度。
本发明的多种化合物在4至7.5的pH范围、更特别地pH 4至pH 5(例如，在乙酸盐缓冲液中)以及pH 6、pH 7和pH 7.5(例如，在磷酸盐缓冲液中)下表现为溶解度≥1mg/ml。
实施例5
物理稳定性评估
使用淀粉样蛋白特异性染料Thioflavin T(ThT)检测原纤维形成形式的聚集体，这是经常用来证明溶液中存在原纤维的染料(参见，例如Groenning，M.，J.Chem.Biol.3(1)(2010)，第1-18页；Groenning等，J.Struct.Biol.158(2007)第358-369页；以及Levine，H.，III，Protein Sci.2(1993)第404-410页)。将所有受试肽溶解于经HCl调节到pH 2.5的环境温度的脱盐水中。含有1mg/ml肽、40μM ThT和50mM pH 7.5的磷酸盐缓冲液的溶液一式三份地添加到96孔黑色荧光平板(底部透明)中。在40℃的96小时的时期中，以10分钟的固定间隔收集数据，每次收集前自动混合(搅拌)300秒。重复整个实验，但是不搅拌。以形成原纤维的滞后时间(小时)表示的物理稳定性定义为代表初始稳定阶段和生长阶段的两个线性回归之间的交叉。
实施例6
化学稳定性评估
分别在50mM乙酸盐缓冲液(pH 4.0)和50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.5)中制备每一种受试肽(1mg/ml；通过测量溶液在280nm的吸光度来测定，该测量基于肽中色氨酸和络氨酸含量的理论扩展系数)储液。将样品放在玻璃小瓶中并且在40℃孵育。通过反相HPLC在C18柱上分析样品，使用乙腈/三氟乙酸/水洗脱液系统进行梯度洗脱。在孵育时间T＝t(相对于T＝0)之后，利用UV分光光度计在220nm检测主峰的面积百分比(面积％)。
首先如下测定纯度：
纯度(面积％)＝(主峰面积/所有峰的总面积)×100。
然后通过为给定肽设定每一pH值下时间0(T＝0)至100之间的纯度来使时间点之间的纯度归一化，如下所示：
时间t的归一化面积％(T＝t)＝[面积％(T＝t)/面积％(T＝0)]×100。
体外活性结果(表示为EC50值)和溶解度的评估结果总结在表1(下文)中，物理和化学稳定性评估结果总结在表2(下文)中。在孵育14天后测定表2中的归一化纯度值。
实施例7
急性葡萄糖释放
在血糖正常的Sprague-Dawley大鼠(Taconic，Lille Skensved，Denmark，9-10周龄)上研究本发明化合物14(剂量分别为20和60nmol/kg体重)对急性葡萄糖释放的影响，并且与天然人胰高血糖素(剂量20nmol/kg)比较。在给药之前，对大鼠禁食5小时。对动物(n＝6/组)皮下(SC)注射载剂(PBS，pH 7.4)、受试化合物或胰高血糖素一次。在给药(t＝0)之前以及给药后2小时内每15分钟使用5μl毛细管从尾巴静脉采集血液。在实验过程中将动物麻醉(利用标准hypnorm/dormicum混合物)以确保稳定的基线血糖水平。使用Biosen葡萄糖分析仪(EKF-diagnostic GmbH，Germany)测定血糖浓度。数据总结在图1中。
实施例8
药代动力学
在小鼠、大鼠和狗中对天然人胰高血糖素和本发明的代表性化合物的药代动力学评估进行比较。例如，在半衰期(t1/2)和体积分布方面，两种化合物表现出类似的药代动力学特性。
表1.本发明化合物的EC50和溶解度数据
#所有值均取两位有效数字
表2.本发明化合物的物理和化学稳定性数据
＊FND＝未检测到原纤维形成(fibrillation)。

Claims (13)

1.化合物：
（SEQ ID NO: 22）或者其可药用盐或溶剂合物。
2.药物组合物，其包含可药用载体以及根据权利要求1所述的化合物或者其可药用盐或溶剂合物。
3.根据权利要求1所述的化合物或者其可药用盐或溶剂合物在制备用于治疗以下疾病或病症的药物中的用途：其中所述疾病选自低血糖、2型糖尿病、1型糖尿病、肥胖、冠心病、动脉粥样硬化、高血压、β-受体阻滞剂中毒、胰岛素瘤和冯吉尔克病；并且所述病症选自糖耐量减低、血脂异常和肝脂肪变性。
4.根据权利要求3所述的用途，其中所述疾病选自急性低血糖和慢性低血糖。
5.根据权利要求3所述的用途，其中所述低血糖是糖尿病性低血糖。
6.根据权利要求3所述的用途，其中所述低血糖是急性胰岛素诱发的低血糖。
7.根据权利要求3所述的用途，其中所述低血糖是非糖尿病性低血糖。
8.根据权利要求3所述的用途，其中所述低血糖是反应性低血糖。
9.根据权利要求3所述的用途，其中所述低血糖是空腹低血糖。
10.根据权利要求3所述的用途，其中所述低血糖是药物诱发的低血糖。
11.根据权利要求3所述的用途，其中所述低血糖是醇诱发的低血糖。
12.根据权利要求3所述的用途，其中所述低血糖是胃旁路术诱发的低血糖。
13.根据权利要求3所述的用途，其中所述低血糖是妊娠期间发生的低血糖。
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