PT717635E - Metodos para regulacao da motilidade gastrintestinal - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "Métodos para regulação da motilidade gastrintestinal"

Campo da invenção A presente invenção refere-se a métodos para a regulação da motilidade gastrintestinal. Mais particularmente, a invenção refere-se à utilização de uma amilina ou um agonista de amilina, que não seja um CGRP nem uma calcitonina, no fabrico de medicamentos para o tratamento de desordens que poderão beneficiar com agentes úteis para retardar e/ou atrasar o esvaziamento gástrico. A invenção refere-se também à utilização de antagonistas de amilina no fabrico de medicamentos para acelerar o esvaziamento gástrico, por exemplQ,. ,r»o tratamento de hipomotilidade gástrica e desordens associadas. -: -«

Antecedentes

Amilina

A amilina é uma proteína hormonal de 37 aminoácidos. Foi isolada, purificada e quimicamente caracterizada como o principal componente de depósitos amilóides nos ilhéus de pancreases de diabéticos humanos do Tipo 2 (Cooper etal., Proc. Natl. Acad. Sei., USA. 84:8628-8632 (1987)). A molécula de amilina possui duas modificações pós-tradução importantes: o terminal C é amidado, e as cisteínas nas posições 2 e 7 sofrem ligação cruzada para formar uma volta no terminal N. A sequência da estrutura de leitura aberta do gene da amilina humano mostra a presença do sinal de clivagem proteolítica dibásico de aminoácidos Lys-Arg, antes do códão do terminal N para Lys, e o de Gly antes do sinal proteolítico Lys-Arg na posição terminal CLAIMS, uma sequência típica para amidação pela enzima de amidação de proteínas, PAM (Cooper et a!., Biochem. Biophvs. Acta. 1014:247-258 (1989)). A amilina é o objecto do pedido de patente do Reino Unido No. De série 8709871, apresentado em 27 de Abril, 1987, e dos correspondentes pedidos norte-americanos apresentados em 27 de Abril, 1988, 23 de Novembro, 1988 e 2 de Maio, 1989.

Na diabetes do Tipo 1, verificou-se que a amilina estava deficiente e foi. proposta a substituição combinada, por insulina, como um tratamento preferido-ao tratamento apenas com insulina, por exemplo para limitar os episódiossr-' hipoglicémicos. A utilização de amilina para o tratamento de diabetes me//itus ^L·^ o objecto do pedido de patente do Reino Unido N° de série 872011 ST ^ 84 764

EPO 717 635/PT apresentado em 26 de Agosto, 1987, por G.J.S. Cooper, e apresentado nos Estados Unidos em 26 de Agosto, 1988, como pedido de patente N° de série 236 985. São descritas composições farmacêuticas contendo amilina e amilina com insulina, na Patente dos Estados Unidos No. 5 124 314, concedida em 23 de Junho, 1992.

A acção de amilina em excesso imita características chave da diabetes do Tipo 2 e foi proposto o bloqueio com amilina como uma nova estratégia terapêutica. Foi revelado no pedido de patente norte-americano copendente, N° de série 275 475, apresentado em 23 de Novembro, 1988, co-propriedade de Cooper, G.J.S. et aí., cujo teor é aqui incorporado para referência, que a amilina causa a redução da incorporação de glúcósé'marcada, tanto de base como estimulada por insulina, no glicogénio no músculo esquelético. O último efeito foi também descrito como sendo partilhado pelo CGRP (veia-se também Leighton, B. e Cooper, G.J.S., Nature. 335:632-635 (1988)). A amilina e o CGRP eram aproximadamente equipotentes, apresentando marcada actividade nas concentrações de 1 a 10 nM. Também foi reportado que a amilina reduz a captação estimulada por insulina de glucose pelo músculo esquelético e reduz o teor de glicogénio (Young et a/., Amer. J. Phvsiol.. 259:457-461 (1990)). É descrito o tratamento da diabetes do Tipo 2 e da resistência à insulina com antagonistas de amilina.

Afirmou-se que tanto a estrutura química como a sequência do gene da amilina, suportam a determinação de que é uma molécula biologicamente activa ou "mensageira". A estrutura química é praticamente 50% idêntica à dos péptidos relacionados com o gene da calcitonina (CGRP), também proteínas com 37 aminoácidos que são neurotransmissores largamente difundidos com muitas acções biológicas potentes, incluindo a vasodilatação. A amilina e os CGRP partilham a ponte de dissulfureto 2Cys-7Cys e a amida do terminal C, ambos essenciais para a completa actividade biológica (Cooper et al., Proc. Natl. Acad. Sei.. 85-7763-7766 (1988)). A amilina pode ser um membro de uma família de péptidos relacionados que inclui CGRP, insulina, factores de crescimento semelhantes a insulina e as relaxinas, e que partilham heranças genéticas comuns (Cooper, G.J.S., et a/., Pron- Growth Factor Research 1:99-105 (1989)). Os dois péptidos, calcitonina e CGRP-1, partilham parentescos comuns no gene da calcitonina, onde um

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EPO 717 635/PT processamento alternativo do transcrito primário de ARNm conduz à geração dos dois péptidos distintos, que partilham apenas limitada homologia de sequências (cerca de 30%) (Amara, S.G. et al., Science. 229:1094-1097 (1985)). A sequência do gene da amilina é típica para uma proteína mensageira segregada, codificando o ARNm um pré-propéptido com locais de processamento para a produção da proteína segregada no interior dos grânulos secretores ou de Golgi. A amilina está principalmente co-localizada com insulina em grânulos celulares beta e pode partilhar as enzimas de processamento proteolítico que geram insulina a partir de pro-insulina. t A amilina é sintetizada principalmente nas células beta pancreáticas e é segregada em resposta a^éstímulos de nutrientes tais como glucose e arginina. Estudos com linhas de células tumorais beta clonadas (Moore et al., Biochem. Biophvs. Res. Commun.. 179(1) (1991)), ilhéus isolados (Kanatsuka et al., FEBS Lett.. 259(1), 199-201 (1989)) e pancreases de rato depois de perfusão (Ogawa et al., J. Clin. Invest.. 85:973-976 (1990)) mostraram que pulsos curtos, 10 a 20 minutos, de nutrientes promotores de secreção de tais como glucose e arginina, estimulam a libertação de amilina bem como de insulina. A razão molar de amiiina:insulina das proteínas segregadas varia entre preparações de cerca de 0,01 a 0,4, mas parece não variar muito com diferentes estímulos em qualquer uma das preparações. Contudo, durante estimulação prolongada com elevado nível de glucose, a razão amilina:insulina pode aumentar progressivamente (Gedulin et al., Biochem. Biophvs. Res. Commun.. 180(1):782-789 (1991)). Assim, talvez devido à expressão genética e a taxa de tradução serem independentemente controladas, a amilina e a insulina não são sempre segregadas numa razão constante. A imunorreactividade semelhante a amilina foi medida na circulação sanguínea em roedores e humanos através de vários radioimunoensaios, todos utilizando anti-soro de coelho anti-amilina, e a maioria utilizando um procedimento de extracção e de concentração para aumentar a sensibilidade do ensaio. Em humanos normais, foram reportados níveis de amilina em jejum de 1 a 10 pM e pós-prandial ou após níveis de glucose de 5 a 20 pM (e.g., Hartter et al., Diabetoloqia. 34:52-54 (1991)); Sanke et al., Diabetologia, 34:129-132 (1991)); Koda et a/., The Lancet. 339:1179-1180 (1992)). Em indivíduos obesos, resistentes à insulina, os níveis de amilina após alimentação podem subir mais, atingindo até cerca de 50 pM. Em comparação, os valores de

84 764 ΕΡ Ο 717 635/ΡΤ insulina em jejum e pós-prandial são de 20 a 50 pM e de 100 a 300 pM, respectivamente, em indivíduos saudáveis, com níveis talvez 3 a 4 vezes mais elevados nos indivíduos resistentes à insulina. Na diabetes do Tipo 1, onde são destruídas células beta, os níveis de amilina estão aos níveis, ou abaixo dos níveis de detecção e não aumentam em resposta à glucose (Koda et a!., The Lancet, 339:1179-1180 (1992)). Em ratinhos e ratos normais, os níveis de base de amilina foram reportados como sendo de 30 a 100 pM, enquanto foram medidos valores até 600 pM em certas linhas de roedores diabéticos e resistentes à insulina (e.g., Huang et a/., Hvpertension. 19:1-101-1-109 (1992); Gill et a/., Life Sciences. 48:703-710 (1991)). ” Vèrificou-se que certas acções da amilina são semelhantes -a acções não metabólicas conhecidas de CGRP e da calcitonina; contudo, as acções metabólicas da amilina reveladas durante as investigações desta nova proteína recentemente identificada parecem reflectir o seu principal papel biológico. Pelo menos algumas destas acções metabólicas são imitadas pelos CGRP, não obstante em doses que são marcadamente vasodilatadoras (veia-se. e.g. Leighton et ai., Nature. 335:632-635 (1988); Molina et ai., Diabetes. 39:260-265 (1990)). A primeira acção revelada da amilina foi a redução da incorporação de glucose estimulada por insulina no glicogénio no músculo esquelético de rato (Leighton et a/., Nature. 335:632-635 (1988)); o músculo ficou "resistente à insulina". Trabalhos subsequentes com músculo solhar de rato ex-vivo e in vitro indicaram que a amilina reduz a actividade da glicogénio-sintetase, promove a conversão de glicogénio-fosforilase a partir da forma b inactiva para a forma a activa, promove a perda bruta de glicogénio (na presença ou na ausência de insulina), aumenta os níveis de glucose-6-fosfato e pode aumentar a produção de lactato (veia-se. e.g., Deems et ai., Biochem. Biophvs. Res. Commun.. 181(1):116-120 (1991)); Young et ai., FEBS Letts. 281(1,2):149-151 (1991)). Se a amilina interfere no transporte de glucose per se é incerto (veia-se e.g., Young et ai., Am. J. Phvsiol.. 259:E457-E461 (1990); Zlerath et a!.,

Diabetoloaia. 35:26-31 (1992)). Estudos de relações de resposta a dose da amilina e da insulina mostram que a amilina actua como um antagonista não competitivo ou funcional da insulina no músculo esquelético (Young et al., Am. J. Phvsiol.. 263(2):E274-E281 (1992)). Não existe evidência de que a amilina interfira na ligação da insulina aos seus receptores, ou na subsequente 84 764 ΕΡ Ο 717 635/ΡΤ 5 activação da tirosina-quinase do receptor de insulina (Follett et a!., Clinicai Research 39(1):39A (1991); Koopmans et al., Diabetoloaia. 34, 218-224 (1991)). As acções da amilina no músculo esquelético assemelham-se às da adrenalina (epinefrina). Contudo, embora se pense que as acções da adrenalina são grandemente mediadas por AMPc, alguns investigadores concluíram que as acções da amilina não são mediadas por AMPc (veia-se Deems et al., Biochem. Biophvs. Res. Commun.. 181(1):116-120 (1991)), enquanto outros ainda reportaram que a amilina activa a adenilciclase e aumenta o AMPc no músculo esquelético (Moore. e Rink, Diabetes. 42:5821 Junho (1993)), consistente com a transdução do seu efeito sobre o metabolismo do glicogénio por via de fosforilação com proteína-quinase dependente de AMPc de sintetase e fosforilase. * * ^

Crê-se que a amilina actua através de receptores presentes em membranas plasmáticas. Foi reportado que a amilina trabalha no músculo esquelético através de um mecanismo mediado por receptores que promove a glicogenólise, activando a enzima limitante da taxa de decomposição do glicogénio, a fosforilase a (Young, A. et al., FEBS Letts. 281:149-151 (1991)). Estudos de amilina e CGRP, e do efeito do antagonista 8'37CGRP, sugerem que a amilina actua através do seu próprio receptor (Wang et al., FEBS Letts. 219:195-198 (1991 b)), contrariamente à conclusão de outros investigadores de que a amilina poderia actuar principalmente nos receptores de CGRP (e.g., Chantry et al., Biochem. J.. 277:139-143 (1991); Galeazza et al., Peptides. 12:585-591 (1991); Zhu et al., Biochem. Biophvs. Res. Commun.. 177(2):771776 (1991)). Recentemente, foram descritos receptores de amilina e a'sua utilização em vários métodos para a pesquisa e ensaio de compostos agonistas e antagonistas de amilina, no Pedido Internacional Número PCT/US92/02125, publicado em 1 de Outubro, 1992, e intitulado "Receptor-Based Screening Methods for Amylin Agonists and Antagonists".

Embora a amilina tenha marcados efeitos sobre o metabolismo do combustível hepático in vivo, não existe um consenso geral sobre quais as acções da amilina que são observadas em hepatócitos isolados ou fígado depois de perfusão. Os dados disponíveis não suportam a ideia de que a amilina promova a glicogenólise hepática, i.e., não actua como o glucagon (e.g., Stephens et al.. Diabetes. 40:395-400 (1990)); Gomez-Foix et a!., Biochem J.. 276:607-610 (1991)). Foi sugerido que a amilina actua sobre o fígado para 84 764

EPO 717 635/PT 6 promover a conversão de lactato em glicogénio e para aumentar a quantidade de glucose que pode ser libertada pelo glucagon (veia-se Roden et a/., Diabetoloqia. 35:116-120 (1992)). Assim, a amilina poderia actuar como um parceiro anabólico da insulina no fígado, em contraste com a sua acção catabólica no músculo. O efeito da amilina sobre acções hemodinâmicas regionais, incluindo O fluxo sanguíneo renal, em ratos conscientes, foi recentemente reportado (Gardiner et al., Diabetes. 40:948-951 (1991)). Os autores notaram que a infusão de amilina de rato estava associada com uma maior vasodilatação renal e menor vasoconstrição mesentérica relativamente ao que é observado com infusão de α-CGRP humano. Concluíram que, promovendo a hiperemia renal - t para uma maior extensão do que o fazia o α-CGRP, a amilina de rato poderia causar uma estimulação menos marcada do sistema renina-angiotensina e assim, menos vasoconstrição secundária mediada por angiotensina II. Notou-se também, contudo, que durante a co-infusão de a-8'37CGRP humano e amilina de rato, as vasoconstrições renal e mesentérica não eram mascaradas, presumivelmente devido a efeitos vasoconstritores não opostos da angiotensina II, e que esta verificação é semelhante ao que é observado durante a co-infusão de Α-CGRP humano e a-837CGRP humano (id. Em 951).

Em células de gordura, contrariamente à sua acção semelhante à da adrenalina no músculo, a amilina não possui acções detectáveis na captação de glucose estimulada por insulina, na incorporação de glucose no triglicérido, na produção de C02 (Cooper et al., Proc. Natl. Acad. Sei.. 85:7763-7766 (1988)), na lipólise estimulada por epinefrina ou na inibição da lipólise pela insulina (Lupien J.R. e Young, A.A., "Diabetes Nutrition and metabolism - Clinicai and Experimental", Vol. 6(1), páginas 13-18 (Fevereiro de 1993)). A amilina exerce assim efeitos específicos de tecidos, com acção directa sobre o músculo esquelético, marcados efeitos indirectos (através do fornecimento de substrato) e talvez directos sobre o fígado, enquanto que os adipócitos parecem "cegar" à presença ou ausência de amilina. Não foram reportados quaisquer efeitos directos da amilina sobre tecidos do rim.

Foi também reportado que a amilina pode possuir marcados efeitos sobre a secreção de insulina. Em ilhéus isolados (Ohsawa et a!., Biochem. Biophvs.

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Res. Commun.. 160(2):961-967 (1989)), no pâncreas depois de perfusão (Silvestre et ai, Req. Pept.. 31-23-31 (1990), e no rato intacto (Young et ai, Mol. Cell. Endocrinol.. 84:R1-R5 (1992)), algumas experiências indicaram que a amilina regula no sentido de diminuir a secreção de insulina. As experiências no pâncreas depois de perfusão apontam para uma regulação selectiva, no sentido de diminuir, da resposta secretora à glucose com escassez de resposta a arginina. Outros investigadores, foram contudo incapazes de detectar efeitos de amilina em células β isoladas, em ilhéus isolados ou no animal completo (veia-se Broderick et ai, Biochem Biophvs. Res. Comm.. Vol. 177:932-938 (1991) e suas referências). O efeito mais surpreendente da amilina in vivo é a estimulação de um brusco aumento de lactato no plasma, seguido de um aumento de glucose no plasma (Young et ai, FEBS Letts.. 281(1,2):149-151 (1991)). As evidências indicam que o aumento do lactato proporciona substrato para a produção de glucose e que as acções da amilina podem ocorrer independentemente das alterações na insulina e no glucagon. Em experiências de "fixação de glucose", infusões de amilina causam "resistência à insulina", tanto por redução da disponibilidade de glucose periférica como por limitação da supressão mediada por insulina da produção de glucose hepática (e.g., Frontoni et ai, Diabetes. 40:568-573 (1991); Koopmans et ai, Diabetoloaia. 34, 218-224 (1991)).

Em ratos ligeiramente anestesiados que estiveram em jejum durante 18 horas para esgotar as suas armazenagens de glicogénio hepático, injecções de amilina estimularam aumentos de lactato no plaspna de cerca de 0,5 a 1,5 mM seguidos por uiin aumento prolongado dos níveis de glucose no plasma de cerca de 6 para 11 mM. Observaram-se estes efeitos com injecções tanto intravenosas como subcutâneas (Young et ai, FEBS Letts.. 281(1,2):149-151 (1991)). Os efeitos da amilina em animais alimentados difere quantitativamente dos seus efeitos em animais em jejum. Em ratos alimentados, presumivelmente com armazenagens normais de glicogénio no fígado, a amilina causa um aumento mais pronunciado e mais prolongado do lactato no plasma; contudo, há apenas um modesto aumento de glucose no plasma. Foi sugerido que a amilina promove o "ramo de retorno" do ciclo de Cori, i.e., o glicogénio do músculo através de decomposição em lactato proporciona substrato para gluconeogénese hepática e produção de glicogénio e provavelmente síntese de triglicéridos. A insulina promove o ramo directo, i.e., a captação de glucose para 84 7Θ4

EPO 717 635/PT 8 o músculo e a produção de glicogénio no músculo. A insulina e a amilina podem portanto ser consideradas parceiros na regularização da via "indirecta" da reposição de armazenagem de glicogénio hepático pós-prandial. A "resistência à insulina" no músculo e no fígado podem estar sob regulação fisiológica normal pela amilina.

As acções não metabólicas da amilina incluem efeitos vasodilatadores que podem ser mediados por interacção com receptores vasculares de CGRP. Testes in vivo publicados sugerem que a amilina é pelo menos cerca de 100 a 1000 vezes menos potente que os CGRP, como vasodilatadores (Brain et al., Eur. J. Pharmacol.. 183:2221 (1990); Wang et al., FEBS Letts.. 291:195-198 (1991)). Injectada no cérebro,'a-amilina foi reportada como suprimindo a captação de alimentos (e.g., Chance et al., Brain Res.. 539, 352-354 (1991)), uma acção partilhada com os CGRP e a calcitonina. As concentrações eficazes nas células que medeiam esta acção não são conhecidas. A amilina foi também reportada como possuindo efeitos tanto sobre osteoclastos isolados onde causou quiescência celular, como in vivo onde foi reportado que diminuía o cálcio no plasma até 20% em ratos, em coelhos e em humanos com a doença de Paget (veia-se. e.g., Gilbey et a!., J. Bone Mineral Res.. S293 (1991). Dos dados disponíveis, a amilina parece ser 10 a 30 vezes menos potente do que a calcitonina humana relativamente a estas acções. De forma interessante, foi reportado que a amilina parecia aumentar a produção de AMPc pelos osteoclastos mas não aumentar o Ca2+ citosólico, enquanto que a calcitonina aumenta ambos (Alam et al., Biochem. Biophvs. Res. Commun.. 179(1):134-139 (1991)). Foi sugerido, apesar de não estabelecido, que a calcitonina pode actuar através de dois tipos de receptores e que a amilina pode interactuar com um deles. A infusão de antagonistas do receptor de amilina pode ser utilizada para alterar a glucorregulação. O 837CGRP é um bloqueador de amilina demonstrado tanto in vitro como in vivo (Wang et ai., Biochem. Biophvs. Res. Commun.. 181(3):1288-1293 (1991)), e verificou-se que alterava a glucorregulação após uma infusão de arginina em ratos alimentados (Young et al., Mol. Cell. Endocrinol., 84:R1-R5 (1992)). O aumento inicial da concentração de glucose é atribuído à secreção de glucagon estimulada por arginina a partir de células alfa de ilhéus; o subsequente restabelecimento da glucose de base é atribuído à acção da insulina conjuntamente com alterações em outras hormonas

84 764 ΕΡ Ο 717 635/ΡΤ 9 glucorreguladoras. Quando a acção da amilina é bloqueada por pré-infusão de 8'37hCGRP, o aumento inicial da glucose não é significativamente diferente, mas existe uma subsequente queda na concentração de glucose para um nível bem abaixo do nível de base, que é restabelecido apenas após uns 80 minutos. Assim, a glucorregulação após este desafio com um promotor de secreção dos ilhéus foi alterada por infusão de um antagonista do receptor de amilina. Adicionalmente, mediram-se concentrações de insulina com intervalos de meia hora e verificou-se que a concentração de insulina, 30 minutos após a infusão de arginina, era quase duas vezes mais elevada erp animais que tinham recebido a infusão com um antagonista do receptor de amilina do que nos controlos normais. 0 8_37CGRP é também um antagonista de CGRP eficaz. Contudo, obserVaram’-se resultados muito semelhantes com outro antagonista de<amilina, o AC66, que é selectivo para os receptores de amilina em relação a récèptores de CGRP (Young et al., Mol. Cell. Endocrino.. 84:R1-R5 (1992)). Afirmou-se que estes resultados suportavam a conclusão de que o bloqueio da acção da amilina pode exercer importantes benefícios terapêuticos na diabetes do Tipo 2.

Reportou-se que pacientes com diabetes do Tipo 1, em adição a uma falta de insulina, tinham uma marcada deficiência em amilina. Como anteriormente notado, os dados mostram que a expressão e a secreção de amilina por células beta pancreátricas está ausente ou bem abaixo do normal na diabetes do Tipo 1. Em vários modelos animais de diabetes do Tipo 1, a secreção e a expressão genética de amilina são diminuídas (Cooper et a!., Diabetes. 497-500 (1991); Ogawa et al., J. Clin. Invest.. 85:973-976 (1990)). Medições de amilina plasmática em pacientes de diabetes do Tipo,1 mostram que a amilina está em deficiência1 nestes pacientes após uma noite de jejum, e que uma carga de glucose não evoca qualquer aumento nos níveis de amilina (Koda et al., The Lancet. 339:1179-1180 (1992)).

Verificou-se também que, de modo surpreendente tendo em conta as suas propriedades previamente descritas de vasodilatadora renal e outras, a amilina aumenta marcadamente a actividade da renina no plasma em ratos intactos quando dada subcutaneamente de um modo que evite qualquer perturbação da pressão sanguínea. Isto é importante porque uma pressão sanguínea diminuída constitui um forte estímulo para a libertação de renina. Podem-se utilizar antagonistas de amilina, tais como antagonistas do receptor de amilina, incluindo os que são selectivos para receptores de amilina em

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EPO 717 635/PT relação a receptores de CGRP e/ou de calcitonina, para bloquear o aumento evocado pela amilina da actividade de renina no plasma. Estas verificações inesperadas suportam a determinação de que antagonistas de amilina reduzirão a actividade da renina no plasma com consequente benefício terapêutico na hipertensão e na insuficiência cardíaca e outras desordens associadas a actividade de renina elevada, inapropriada ou indesejada. Adicionalmente, a capacidade adicional de antagonistas de amilina para modular favoravelmente a resistência à insulina e outras desordens metabólicas comuns frequentemente associadas a hipertensão e doença cardíaca proporciona um perfil terapêutico particularmente desejável.

Hipomotilidade gástrica * A hipomotilidade gástrica com esvaziamento retardado de conteúdo líquido e/ou sólido é uma componente de várias desordens gastrintestinais. Para uma discussão genérica, veja-se Goodman and Gilman's The Pharmacoloaical Basis of Therapeutics. Capítulo 38 (Pergamon Press, Oitava edição, 1990). Os sintomas destas desordens podem incluir náuseas, vómitos, azia, desconforto pós-prandial, e indigestão. O refluxo gastroesofágico é frequentemente evidente e pode originar ulceração esofágica; podem também haver sintomas respiratórios ou dor subesternal intensa que podem ser confundidos com asma ou enfarte do miocárdio, respectivamente. Apesar de a causa ser desconhecida na maioria dos pacientes, a estase gástrica ou hipomotilidade é frequentemente uma consequência de neuropatia diabética; esta condição está também frequentemente presente em pacientes com anorexia nervosa ou acloridria ou após cirurgia gástrica. Id. Na página 928. A gestão médica de pacientes com hipomotilidade gástrica inclui usualmente a administração de um agente procinético. Apesar de as fenotiazinas antieméticas e o betanocol poderem proporcionar algum alívio, estas drogas não aceleram o esvaziamento gástrico na vasta maioria de pacientes e produzem frequentemente efeitos laterais inaceitáveis. Presentemente, os agentes procinéticos disponíveis incluem metoclopramida e cisapride, mas estão outros em avaliação (e.g., domperidona). A metoclopramida diminui a relaxação receptora na porção superior do estômago e aumenta as contracções antrais. O piloro e o duodeno estão relaxados, enquanto o tom do esfíncter esofágico inferior está aumentado. Estes

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EPO 717 635/PT efeitos combinam-se para acelerar o esvaziamento do conteúdo gástrico e para reduzir o refluxo a partir do duodeno e do estômago para o esófago. Em adição, o tempo de transição do material do duodeno para a válvula ileocecal é reduzido em resultado da peristalse jejunal aumentada. A metoclopramida tem pouco efeito sobre a secreção gástrica ou sobre a motilidade colónica. Id. Na página 928.

Em geral, os agonistas dopaminérgicos produzem o padrão oposto de efeitos, e estes são mediados por receptores D2 que estão localizados, pelo menos em parte, no interior do tracto gastrintestinal, Id. O mecanismo ‘dè acção da metoclopramida é pouco entendido, mesmo sendo claramente um antagonista dopaminérgico e poder bloquear os efeitos gastrintestinais causados pela administração local ou sistémica de agonistas dopaminérgicos. Embora a vagotomia não elimine os efeitos da metoclopramida, as suas acções procinéticas podem ser bloqueadas por atropina ou outros antagonistas muscarínicos. Adicionalmente, nem todos os antagonistas dopaminérgicos aceleram o esvaziamento gástrico. Pensa-se que a droga promove a libertação de acetilcolina a partir de neurónios mientéricos, apesar de faltarem evidências directas desta acção. Uma vez que o betanocol pode aumentar os efeitos de metoclopramida, pode estar também envolvida uma capacidade de resposta aumentada à acetilcolina. Id. nas páginas 928-929. A domperidona é um derivado de benzimidazolo que possui tanto propriedades procinéticas como antieméticas. É um antagonista dopaminérgico e produz marcada hiperprolactinemia; os seus efeitos sobre a motilidade gastrintestinal assemelham-se também estreitamente aos da metoclopramida. No entanto, ao contrário da metoclopramida, estes efeitos não são antagonizados pela atropina; e a explicação para esta diferença não foi ainda adiantada. A domperidona atravessa a barreira hemato-encefálica apenas numa extensão limitada e apenas raramente causa efeitos laterais extrapiramidais. Como resultado, não interfere no tratamento da doença de Parkinson e pode ser útil contra os distúrbios gastrintestinais causados por levodopa e bromocriptina. Até agora, a droga parece ter a mesma utilidade terapêutica que a metoclopramida no tratamento de pacientes com hipomotilidade gástrica. Contudo, tem menos actividade antiemética. Id. na página 929. A domperidona parece ser rapidamente absorvida após administração oral, mas a sua

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EPO 717 635/PT 12 biodisponibilidade é de apenas cerca de 15%; a maior parte da droga e dos seus metabolitos são excretados nas fezes. O meio-tempo para a sua eliminação do plasma é de cerca de 7 a 8 horas. Id. A domperidona não está de um modo geral disponível nos Estados Unidos; está disponível noutros lados como MOTILIUM. A dosagem óptima não foi estabelecida, mas têm sido utilizadas doses orais diárias de 40 a 120 mg no tratamento de hipomotilidade gástrica. Id. na página 929. O cisapride é uma benzamida e o.s seus efeitos sobre a motilidade do estômago e do intestino delgado assemelham-se estreitamente às da metoclopramida e da domperidona; contudo, ao contrário destas drogas, auifiêntam também a motilidade colónica e podem causar diarreia, O mecanismo das suas acções gastrintestinais é pouco conhecido. Tal como a metoclopramida, estas acções são bloqueadas por atropina e podem envolver a libertação de acetilcolina mientérica. O cisapride parece destituído de actividade bloqueadora dopaminérgica e não influencia a concentração de prolactina no plasma nem causa sintomas extrapiramidais. A droga liga-se e bloqueia receptores dopaminérgicos de 5-HTz no íleo de rato, mas a relação desta acção com os seus efeitos no homem não foi estabelecida. Id. Até agora a eficácia da droga no tratamento de desordens de hipomotilidade gástrica parece ser igual às da metoclopramida e da domperidona sem os efeitos laterais que resultam do bloqueio dopaminérgico. Adicionalmente, o cisapride pode ser útil no tratamento de pacientes com obstipação idiopática crónica ou com hipomotilidade colónica devida a danos na medula espinal. Id. na página 929.

Em contraste com o que se descreveu acima, agentes que servem para retardar o esvaziamento gástrico encontraram lugar na medicina bem como, em particular, como auxiliares de diagnóstico em exames radiológicos gastrintestinais. Por exemplo, o glucagon é uma hormona polipeptídica que é produzida pelas células alfa dos ilhéus pancreáticos de Langerhans. É um agente hiperglicémico que mobiliza glucose através da activação de glicogenólise hepática. Pode, em menor grau, estimular a secreção de insulina pancreática. O glucagon é administrado na forma de cloridrato de glucagon; as doses são geralmente expressas como glucagon. O glucagon é utilizado no tratamento de hipoglicemia induzida por insulina quando a administração de glucose por via intravenosa não é possível. É dada

84 704 ΕΡ 0 717 635/ΡΤ por injecção subcutânea, intramuscular ou intravenosa numa dose de 0,5 a 1 mg (unidade), repetida se necessário após 20 minutos. Contudo, como o glucagon reduz a motilidade do tracto gastrintestinal, é utilizado como um auxiliar de diagnóstico em exames radiológicos gastrintestinais. A via de administração depende do procedimento de diagnóstico. Uma dose de 1 a 2 mg (unidades) administrada intramuscularmente, tem um início de acção de 4 a 14 minutos e uma duração de efeito de 10 a 40 minutos; 0,2 a 2 mg (unidades) dadas intravenosamente produzem um efeito ao fim de um minuto que dura 9 a 25 minutos. , O glucagon tem sido utilizado em vários estudos para tratar várias desordens gastrintestinais dolorosas associadas a espasmos. Daniel et al., (Br. Med. J.. 1974, 3, 720) reportaram alívio sintomático mais rápido de diverticulite aguda em pacientes tratados com glucagon em comparação os que tinham sido tratados com analgésicos ou anti-espasmódicos. Uma revisão de Glauser et al., (J. Am. Coll. Emeraencv Phvsns. 1979, 8, 228) descreveu alívio de obstrução alimentar esofágica aguda após terapia com glucagon. Noutro estudo, o glucagon aliviou significativamente as dores e tendura em 21 pacientes com doença no tracto biliar em comparação com 22 pacientes tratados com placebo (M. J. Stower et al·, Br. J. Surg.. 1982, 69, 591-2). Franken et al·, contudo, (Radioloav. 1983, 146. 687) não conseguiram mostrar qualquer vantagem do glucagon sobre o placebo na redução hidrostática de intussuscepção ileocólica num estudo com 30 crianças, e Webb et al·, (Med. J. Aust.. 1986, 144, 124) concluíram que o glucagon foi ineficaz na gestão de cólica uretérica num departamento de acidentes. · * t v '

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Verificámos agora que, surpreendentemente tendo em conta as suas propriedades hiperglicémicas anteriormente descritas, a amilina e agonistas de amilina, incluindo os que são aqui descritos, por exemplo, o análogo agonista de amilina 26'2a,2ePro-h-amilina (também referida como "AC-0137"), podem reduzir a motilidade gástrica e retardar o esvaziamento gástrico, como evidenciado pela capacidade destes compostos para reduzir os níveis de glucose no plasma pós-prandial. A presente invenção refere-se à utilização de uma amilina ou um agonista

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EPO 717 635/PT de amilina, por exemplo, o análogo agonista de amilina 25'28,29Pro-h-amilina (AC-0137), no fabrico de medicamentos para a redução da motilidade gástrica e para retardar o esvaziamento gástrico, em que o referido agonista de amilina não é um CGRP nem uma calcitonina). Estes medicamentos serão úteis no tratamento de, por exemplo, hiperglicemia pós-prandial, uma complicação associada a diabetes mellitus do tipo 2 (não dependente de insulina).

No termo "amilina" pretende-se incluir compostos tais como os definidos por Young e Cooper na Patente norte-americana No. 5 234 906, concedida em 10 de Agosto, 1993, para "Hyperglycemic Compositions", por exemplo, inclui a hormona peptídica humana, e espécies suas variações, referidas como amilina e segregadas a partir das células beta do pâncreas. "Agonistas de amilina--é.-,;· também uma expressão conhecida na arte, e refere-se a compostos que imitam os efeitos da amilina. Assim, a própria amilina e análogos agonistas de amilina podem também ser referidos de forma ampla como agonistas de amilina. A expressão "análogo agonista de amilina" pretende referir derivados de uma amilina que actuam como agonistas de amilina, normalmente, acredita-se presentemente, em virtude de ligação ou de outra interacção directa ou indirecta com um receptor de amilina ou outro receptor ou receptores com os quais a própria amilina possa interactuar para evocar as propriedades biológicas referidas anteriormente. Em adição ao que anteriormente se descreveu, são identificados outros análogos agonistas de amilina úteis, num Pedido Internacional, WPI Acc. No. 93-182488/22, intitulado "New Amylin Agonist Peptides Used for Treatment and Prevention of Hypoglycemia and Diabetes Mellitus".

Num primeiro aspecto, a invenção proporciona a utilização de uma amilina ou de um agonista de amilina para o fabrico de um medicamento para a regulação benéfica da motilidade gastrintestinal, em que o referido agonista de amilina não é CGRP nem uma calcitonina. Preferencialmente utiliza-se um análogo agonista de amilina. Numa concretização, a utilização de acordo com a presente invenção refere-se a medicamentos para a redução da motilidade gástrica. Numa outra concretização, a utilização refere-se a medicamentos para o retardamento do esvaziamento gástrico. A presente invenção pode ser útil em relação a um indivíduo submetido a um procedimento de diagnóstico gastrintestinal, por exemplo um exame 04 764

EPO 717 635/PT 15 radiológico ou imageologia por ressonância magnética. Alternativamente, a invenção pode ser útil em relação à redução da motilidade gástrica num indivíduo que sofre de uma desordem gastrintestinal, por exemplo, espasmo (que pode estar associada a diverticulite aguda, uma desordem do tracto biliar ou uma desordem do Esfíncter de Oddi).

Noutro aspecto, a invenção refere-se à utilização de um agonista de amilina para o fabrico de um medicamento para o tratamento de síndrome jejunal ("dumping syndrome") pós-prandial.

Noutro aspecto, a invenção refere-se à utilização de uma amilina ou um agonista de amilina para o fabrico de um medicamento.-para o tratamento de hiperglicemia pós-prandial incluindo hiperglicemía pós-prandial. Numa concretização preferida, a hiperglicemia pós-prandial é uma consequência da diabetes mellitus do Tipo 2.

Os agonistas de amilina preferidos incluem 25,28,29Pro-h-amilina. Os análogos agonistas de amilina preferidos incluem também 25,28-29Pro-h-amilina.

Noutro aspecto, a presente invenção refere-se à utilização de um antagonista de amilina para o fabrico de um medicamento para o tratamento de hipomotilidade gástrica ou para a aceleração do esvaziamento gástrico. Em concretizações preferidas, esta utilização pode ser empregue onde a hipomotilidade é uma consequência de neuropatia diabética ou onde a hipomotilidade é uma consequência de anorexia nervosa. A hipomotilidade pode também ocorrer: como consequência de acloridria ou como consequência de cirurgia gástrica.

Antagonista de amilina pretende significar um composto que interfere com os efeitos da amilina, por exemplo, um composto que por si só não tenha actividade farmacológica significativa mas cause efeitos por inibição da acção de um agonista específico e.y., por competição para locais de ligação de agonistas. Preferivelmente, o antagonista de amilina utilizado nestes métodos é um antagonista de receptor de amilina. Um antagonista preferido é a acetil-11,18Arg, 30Asn, 32Tyr9'32calcitonina (salmão).

Noutro aspecto, a invenção refere-se à utilização de uma amilina ou um

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EPO 717 635/PT agonista de amilina que não seja um CGRP ou uma calcitonina, para o fabrico de um medicamento para o tratamento de ingestão de uma toxina, tratamento este que compreende: (a) administração de uma quantidade de uma amilina ou de um agonista de amilina eficaz para prevenir ou reduzir a passagem de conteúdos do estômago para os intestinos; e (b) aspiração dos conteúdos do estômago.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A FIGURA 1 mostra o efeito de amilina sòbre os níveis de glucose no plasma em cães após uma carga oral de glucose, comparado com um controlo. A FIGURA 2 mostra os perfis de glucose pós-prandial de voluntários clínicos humanos a quem se administrou placebo ou um boJus IV de 30 pg de AC-0137. ‘ A FIGURA 3 mostra os perfis de glucose pós-prandial de voluntários clínicos humanos a quem se administrou placebo ou um bo/us IV de 100 pg de AC-0137. A FIGURA 4 mostra os perfis de glucose pós-prandial de voluntários clínicos humanos a quem se administrou placebo ou um bo/us IV de 300 pg de AC-0137. A FIGURA 5 mostra os perfis de glucose pós-prandial de voluntários clínicos humanos a quem se administrou placebo ou uma infusão IV de 2 horas de AC-0137, a 15 pg/hora. A FIGURA 6 mostra os perfis de glucose pós-prandial de voluntários clínicos humanos a quem se administrou placebo ou uma infusão IV de 2 horas de AC-0137, a 50 pg/hora. A FIGURA 7 mostra os perfis de glucose pós-prandial de voluntários clínicos humanos a quem se administrou placebo ou uma infusão IV de 2 horas de AC-0137, a 150 pg/hora.

As FIGURAS 8a-8b mostram os perfis de glucose após uma refeição de Sustacal® em testes de tolerância à refeição de Sustacal® na linha de base (1

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EPO 717 635/PT dia), no 7° dia e no 14° dia, de voluntários clínicos humanos a quem se administrou 30 pg de triPro-amilina (AC-0137) três vezes por dia antes das refeições ao longo de um período de 14 dias.

As FIGURAS 9a-9c mostram as concentrações de glucose no plasma (mg/dl), triPro-amilina no plasma (pM) e insulina livre no plasma (pU/ml) a partir de 60 minutos antes do início de uma infusão IV de 25 pg/h de triPro-amilina. A refeição de Sustacal® foi dada 60 minutos após o início da infusão de triPro-amilina.

As FIGURAS 10a-10c mostram as concentrações de glucose no plasma (mgVdl)7 triPro-amilina no plasma (pM) e insulina livre no plasma (U/ml) a partir de 60 minutos antes do início de uma infusão IV de 50 pg/h de triPro-amilina. A refeição de Sustacal® foi dada 60 minutos após o início da infusão de triPro-amilina.

As FIGURAS 11a-11c mostram as concentrações de glucose no plasma (mg/dl), triPro-amilina no plasma (pM) e insulina livre no plasma (pU/ml) a partir de 60 minutos antes do início de uma infusão IV de 50 pg/h de triPro-amilina. Foi dada uma carga IV de glucose (300 mg/kg) 60 minutos após o início da infusão de triPro-amilina.

As FIGURAS 12a-12b mostram os perfis de glucose e os níveis de triPro-amilina após refeições de Sustacal® para testes de tolerância a refeições de Sustacal® na linha de base (1 dia), no 7° dia e no 14° dia, de voluntários clínicos humanos a quem se administrou 100pg de triPro-amilina (AC-0137) três vezes por dia antes das refeições ao longo de um período de 14 dias.

As FIGURAS 13a-13b mostram os perfis de glucose e os níveis de triPro-amilina (AC 0137) após refeições de Sustacal® para testes de tolerância a refeições de Sustacal® na linha de base (1 dia), no 7o dia e no 14° dia, de voluntários clínicos humanos a quem se administrou 300 pg de triPro-amilina (AC-0137) três vezes por dia antes das refeições ao longo de um período de 14 dias. A FIGURA 14 mostra efeitos de resposta à dose de injecção subcutânea

84 7Θ4 ΕΡ Ο 717 635/ΡΤ 18 de amilina de rato, sobre a retenção dos conteúdos gástricos 20 minutos após administração por sonda de ratos normais e diabéticos BB (n= 3-9 para cada ponto). Os símbolos representam a média ± SEM e as curvas definem as funções logísticas que melhor se ajustam. "Zero" indica a fracção dos conteúdos gástricos retida em ratos normais e diabéticos não tratados com amilina (diferente a P <0,001). A FIGURA 15 mostra a concentração de amilina no plasma medida após a injecção subcutânea de 1 pg ou 10 pg de amilina de rato sintética (n = 3 por grupo). Os símbolos representam as médias ± SEM. A FIGURA 16 representa trítio derivado' dè''glucose no plasma (cpm/10 pl) após administração por sonda de solução salina ou AC-0187. * indica a significância estatística. O traçado inferior ("ruído de fundo" marcado a tracejado) é proveniente de 4 ratos anestesiados alimentados por sonda após laparotomia e ligação pilórica. Indica que foi absorvido pouco trítio directamente através das paredes do estômago e que a captação de trítio reflecte a passagem de glucose para a circulação a partir do intestino delgado. A FIGURA 17 representa a glucose no plasma (mg/dl) após administração por sonda de solução salina ou AC-0187.

DESCRICÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A nomenclatura de vários compostos, análogos agonistas de amilina úteis na presente invenção pode ser utilizada para indicar tanto o péptidò no qual é baseada a sequência como as modificações feitas a qualquer sequência peptídica básica de amilina, tal como amilina humana. Um aminoácido precedido por um número em expoente indica que esse aminoácido substitui o aminoácido normalmente presente na posição de aminoácido do expoente na sequência básica de aminoácidos. Por exemplo, "18Arg25,28Pro-h-amilina" refere-se a um péptido baseado na sequência de "h-amilina" ou "amilina humana" possuindo as seguintes substituições: Arg a substituir His no resíduo 18, Pro a substituir Ala no resíduo 25 e Pro a substituir Ser no resíduo 28. 0 termo "des-1Lys-h-amilina" refere-se a um péptido baseado na sequência da amilina humana, com o primeiro aminoácido, ou aminoácido do terminal N, delecionado. 84 764 ΕΡ0 717 635/ΡΤ 19

Os análogos agonistas de amilina da presente invenção são úteis sob o ponto de vista das suas propriedades farmacológicas. A actividade como agentes agonistas de amilina pode ser indicada por actividade no ensaio de ligação a receptores e no ensaio do músculo solhar descritos abaixo. A actividade de agonista de amilina dos compostos pode também ser avaliada pela sua capacidade para induzir hipercalcemia e/ou hiperglicemia em mamíferos ou para reduzir os níveis pós-prandiais de glucose no plasma, como aqui descrito.

Os compostos análogos agonistas de amilina preferidos des-1Lys-h-amilina, 28Pro-h-amilina, 25,28,29Pro-h-amilina, 18Arg25,28Pro-h-amilina e des^Lys^Arg^^Pro-h-amilina, apresentam todos actividade de amilina in vivo em animais de teste tratados, provocando marcada hipercalcemia seguida por hiperglicemia. Em adição a possuírem actividades características da amilina, verificou-se também que certos compostos preferidos possuem características de solubilidade e de estabilidade mais desejáveis quando comparados com a amilina humana. Estes compostos preferidos incluem 25Pro26Val28,29Pro-h-amilina, 25,28,29pro_h_ami|jna (também aqui referido como "AC-0137") e 18Arg25'28Pro-h-amilina. 0 método de acordo com a presente invenção pode empregar um agonista de amilina, incluindo amilina ou um análogo agonista de amilina, por exemplo, análogos agonistas de receptores de amilina tais como 18Arg2S,28Pro-h-amilina, des-lLys18Arg25,28Pro-h-amilina, 18Arg25'28,29Pro-h-amilina, des-1Lys18Arg25'28'29Pro-h-amilina, 25'28'29Pro-h-amilina, des-H.ys25'28'29?^--h-amilina e 25Pro26Va.l25,28Pro-h-amilina. Exemplos de outros análogos agonistas de amilina adequados incluem: 23Leu25Pro26Val28,29Pro-h-amilina; 23Leu25Pro26Val28Pro-h-amilina; des-1Lys23Leu25Pro26Val-28Pro-h-amilina; 18Arg23Leu25Pro26Val-28Pro-h-amilina; 18Arg23Leu25,28,29Pro-h-amilina; 18Arg23Leu,R,8Pro-h-amilina; 17lle23Leu25,28,29Pro-h-amilina; 17||e25'28'29Pro-h-amilina; des^Lys^lle^Leu^^^Pro-h-amilina; 17lle18Arg23Leu-h-amilina; l7lle18Arg23Leu26Val29Pro-h-amilina; 84 764 ΕΡ Ο 717 635/ΡΤ 20 sir**' 17lle18Arg23Leu25Pro26Val28,29Pro-h-amilina; 13Thr21His23Leu2eAla28Leu29Pro31Asp-h-amilina; 13Thr21His23Leu26Ala29Pro31Asp-h-amilina; des-1Lys13Thr21His23Leu26Ala28Pro31Asp-h-amilina; 13Thr18Arg2,His23Leu26Ala29Pro31Asp-h-amilina; ,3Thr18Arg21His23Leu28,29Pro31Asp-h-amilina; e 13Thr18Arg21His23Leu25Pro26Ala28'29Pro31Asp-h-amilina.

Estão ainda descritos mais agonistas de amilina incluindo análogos agonistas de amilina, em WPI Acc. No. 93-182488/22, "New Amylin Agonist Peptides Used for Treatment and Prevention of Hypoglycemia and Diabetes Mefíitus". A actividade de agonistas de amilina pode ser avaliada utilizando certos ensaios biológicos aqui descritos. O ensaio de ligação a receptores pode identificar tanto candidatos a agonistas como a antagonistas de amilina e pode ser utilizado para avaliar a ligação, enquanto o ensaio do músculo solhar distingue entre agonistas e antagonistas de amilina. Os efeitos de amilinas ou agonistas de amilina sobre a motilidade gástrica podem ser identificados, avaliados ou pesquisados utilizando os métodos descritos nos Exemplos que se seguem, ou outros métodos conhecidos na arte ou equivalentes, para a determinação da motilidade gástrica.

Um destes métodos para utilização na identificação ou avaliação da capacidade de um composto para retardar a motilidade gástrica compreende: (a) colocar em contacto uma amostra de teste e um sistema de teste, compreendendo a referida amostra de teste um ou mais compostos de teste e compreendendo o referido sistema de teste um sistema para avaliar a motilidade gástrica, sendo o referido sistema caracterizado por exibir, por exemplo, elevado nível de glucose no plasma em resposta à introdução no referido sistema de glucose ou de uma refeição; e (b) determinar a presença ou a grandeza de um aumento de glucose no plasma no referido sistema. Podem-se também utilizar controlos positivos e/ou negativos. Opcionalmente, pode-se adicionar ao sistema de teste uma quantidade predeterminada de antagonista de amilina (e.g. 8'32calcitonina de salmão).

Preferivelmente, os compostos agonistas exibem actividade no ensaio de

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ligação a receptores na ordem de menos de cerca de 1 a 5 nM, preferivelmente menos de cerca de 1 nM e mais preferivelmente menos de cerca de 50 pM. No ensaio do músculo solhar estes compostos apresentam preferivelmente valores de EC50 da ordem de menos de cerca de 1 a 10 micromolar. O ensaio de ligação a receptores é descrito no Pedido Internacional Número PCT/US92/02125, publicado em 1 de Outubro, 1992. O ensaio de ligação a receptores é um ensaio de competição que mede a capacidade de compostos para se ligarem especificamente a receptores de amilina ligados q membranas. Uma fonte preferida das preparações de membranas utilizadas no ensaio é o prosencéfalo basal que compreende membranas dos nuc/eus accumbens e regiões circundantes. Os compostos a ensaiar competem para a ligação a estas preparações de receptores com amilina de rato 125l Bolton Hunter. Analisam-se em computador as curvas de competição, em que a quantidade ligada (B) é representada em gráfico em função do log da concentração de ligando, utilizando análises de regressão não linear com ajustamento a uma equação logística de 4 parâmetros (programa Inplot; GraphPAD Sotfware, San Diego, Califórnia) ou o programa ALLFIT de DeLean et al., (ALLFIT, Versão 2.7 (NIH, Bethesda, MD 20892)). Munson, P. e Rodbard, D., Anal. Biochem. 107:220-239 (1980).

Os ensaios de actividade biológica de agonistas de amilina, incluindo preparações de análogos agonistas de amilina no músculo solhar são realizados utilizando métodos previamente descritos (Leighton, B. e Cooper, G.J.S., Nature. 335:632-635 (1988); Cooper, G.J.S., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 85:7763-7766 (1988)). Em resumo, a actividade de agonista de amilina é avaliada medindo a inibição da síntese de glicogénio estimulada por insulina no músculo solhar. A actividade de antagonista de amilina é avaliada medindo o recomeço da síntese de glicogénio estimulada por insulina na presença de 100 nM de amilina de rato e um antagonista de amilina. As concentrações de péptido dissolvido em tampões isentos de transportador são determinadas por análise quantitativa de aminoácidos, como aqui descrito. A capacidade de compostos para actuar como agonistas neste ensaio é determinada medindo valores de EC50. Os erros padrão são determinados pelo ajustamento de curvas de resposta à dose sigmóides utilizando uma equação logística de 4 parâmetros (DeLean, A., Munson, P.J., Guardabasso, V. e Rodbard, D. (1988) ALLFIT, Versão 2.7, National Institute of Child Health and Human Development, N.I.H. 22 84 784

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Bethesda, MD, disquete 1). Foram caracterizados vários agonistas de amilina utilizando estes ensaios biológicos. Verificou-se que todos os compostos 18Arg25,28Pro-h-amilina, desYys^Arg25^“Pro-h-amilina, '8Arg2S-28,23Pro-h-amilina, des-’Lys18Arg25'28-29Pro-h-amilina, 25,28'29Pro-h-amilina, des1Lys25,28,29Pro-h-amilina e 25Pro26Val25,28Pro-h-amilina( competem com a amilina no ensaio de ligação a receptores. Estes compostos têm actividade de antagonista desprezável conforme medido pelo ensaio do músculo solhar r mostrou-se que actuavam como agonistas de amilina. Obtiveram-se resultados semelhantes com outros compostos agonistas listados acima.

Os compostos antagonistas de amilina úteis em métodos de tratamento de hipomotilidade gástrica incluem os compostos descritos no pedido de patente-, dos Estados Unidos número de série 07/794 288, apresentado em 19 de Novembro, 1991.

Os compostos como os que acima se descreveram são preparados utilizando técnicas Standard de síntese de péptidos em fase sólida e preferivelmente um sintetizador de péptidos automático ou semi-automático. Tipicamente, acoplam-se um aminoácido protegido com <x-N-carbamoílo e um aminoácido ligado à cadeia peptídica em crescimento sobre uma resina, à temperatura ambiente e num solvente inerte tal como dimetilformamida, N-metilpirrolidinona ou cloreto de metileno, na presença de agentes de acoplamento tais como diciclo-hexilcarbodiimida e 1-hidroxibenzotriazolo na presença de uma base tal como uma diisopropiletilamina. O grupo protector <x-N-carbamoílo é removido da resina-péptido resultante utilizando um reagente tal como ácido trifluoroacético ou piperidina, e a reacção de acoplamento é repetida com o aminoácido protegido em N que se pretende adicionar em seguida à cadeia peptídica. Os grupos protectores de N adequados são bem conhecidos na arte, sendo aqui preferidos o t-butiloxicarbonilo (tBoc) e o fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc).

Os solventes, os derivados de aminoácidos e a resina 4-metilbenzidrilamina utilizados no sintetizador de péptidos foram adquiridos de Applied Biosystems Inc. (Foster City, CA), a menos que indicado em contrário. Os aminoácidos com as cadeias laterais protegidas utilizados e adquiridos a Applied Biosystem, Inc. incluíam os seguintes: Boc-Arg(Mts), Fmoc-Arg(Pmc), Boc-Thr(Bzl), Fmoc-Thr(t-Bu), Boc-Ser(Bzl), Fmoc-Ser(t-Bu), Boc-Tyr(BrZ), 84 764 ΕΡ Ο 717 635/ΡΤ 23

Fmoc-Tyr(t-Bu), Boc-Lys(CI-Z), Fmoc-Lys(Boc), Boc-Glu(Bzl), Fmoc-Glu(t-Bu), Fmoc-His(Trt), Fmoc-Asn(Trt) e Fmoc-Gln(Trt). O Boc-His(BOM) foi adquirido a Applied Biosystems, Inc. ou Bachem Inc. (Torrance, CA). O anisolo, o metilsulfureto, o fenol, o etanoditiol e o tioanisolo foram obtidos de Aldrich Chemical Company (Milwaukee, Wl). A Air Products and Chemicals (Allentown, PA) forneceu HF. O éter etílico, o ácido acético e o metanol foram adquiridos a Fisher Soientific (Pittsburgh, PA).

A síntese de péptidos em fase sólida foi realizada com um sintetizador de péptidos automático (Modelo 430A, Applied Biosystems Inc., Foster City, CA) utilizando o sistema NMP/HOBt (Opção 1) e a química do tBoc ou do Fmoc (veja-se, Applied Biosystems User's Manual for-^the ABI 430A Peptide Synthetizer, Versão 1.3B, 1 de Julho, 1988, secção* 6, páginas 49-70, Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) com extremidades. Clivaram-se as resinas do Boc-péptido com HF (-5°C a 0°C, 1 hora). Extraiu-se o péptido da resina alternando água e ácido acético, e liofilizaram-se os filtrados. Clivaram-se as resinas do péptido-Fmoc de acordo com os métodos Standard (Introdution to Cleavaae Techniaues. Applied Biosystems, Inc., 1990, páginas 6-12). Alguns péptidos foram também montados utilizando um sintetizador Advanced Chem Tech Synthetizer (Modelo MPS 350, Louisville, Kentucky). Purificaram-se os péptidos por HPLC de fase inversa (preparativa e analítica) utilizando um sistema Waters Delta Prep 3000. Utilizou-se uma coluna preparativa C4, C8 ou C18 (10 μ, 2,2x25 cm; Vydac, Hesperia, CA) para isolar os péptidos e determinou-se a pureza utilizando uma coluna analítica C4, C8 ou C18 (5 μ, 0,46x25 cm; Vydac). Forneceram-se os solventes*(A = TFA a 0,1%/água e B = TFA a 0,1 %/CH3CN) à coluna analítica com um caudal de 1,0 ml/min e à coluna preparativa a 15 ml/min. As análises dos aminoácidos foram realizadas no sistema Waters Pico Tag e processadas utilizando o programa Maxima. Hidrolisaram-se os péptidos por hidrólise ácida em fase de vapor (115°C, 20-24 h). Derivatizaram-se os hidrolisados e analisaram-se por métodos Standard (Cohen, S.A., Meys, M., e Tarrin, T.L. (1989), The Pico Tag Method: A Manual of Advanced Techniaues for Amino Acid Analvsis. páginas 11-25, Millipore Corporation, Milford, MA). A análise por bombardeamento atómico rápido foi realizada por M-Scan, Incorporated (West Chester, PA). A calibração de massas foi realizada utilizando iodeto de césio ou iodeto de césio/glicerol. A análise de ionização de dessorção de plasma utilizando tempo de detecção da trajectória foi realizada num espectrómetro de massa Bio-lon 20 de Applied Biosystems.

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Os compostos peptídicos úteis na invenção podem também ser preparados utilizando técnicas de ADN recombinante, utilizando métodos agora conhecidos na arte. Veia-se. e.g., Sambrook et ai, Molecular Clonina: A Laboratorv Manual. 2a Ed., Cold Spring Harbor (1989).

Os compostos acima referidos formam sais com vários ácidos e bases inorgânicos θ orgânicos. Estes sais incluem sais preparados com ácidos orgânicos e inorgânicos, por exemplo, HCI, HBr, H2S04, H3P04, ácido trifluoroacético, ácido acético, ácido fórmico, ácido metanossulfónipo, ácido toluenossulfónico, ácido maleico, ácido fumárico e ácido canforsulfónico. Os sais preparados com bases incluem sais de amónio, sais de metais alcalinos, e.g., sais de sódio e de potássio','"e sais de alcalino-terrosos, e.g., sais de cálcio e de magnésio. São preferidos os sais acetato, cloridrato e trifluoroacetato. Os sais podem ser formados por meios convencionais, como por reacção das formas de ácido ou base livres do produto com um ou mais equivalentes da base ou do ácido apropriado num solvente ou meio em que o sal seja insolúvel, ou num solvente tal como água que é depois removida in vacuo ou por criodessecagem ou por permuta dos iões de um sal existente por outro ião numa resina de permuta iónica adequada.

Os compostos acima descritos são úteis sob o ponto de vista das suas propriedades farmacológicas. Em particular, os compostos de acordo com a invenção possuem actividade como agentes para retardar o esvaziamento gástrico, como evidenciado pela capacidade para reduzir os níveis pós-prandiais de glucose em mamíferos. . i

Tal como se descreve no Exemplo 1, avaliaram-se os efeitos da amilina sobre os testes de tolerância à glucose oral em cães. Surpreendentemente, verificou-se que a amilina, que anteriormente tinha sido descrita como um agente hiperglicémico (/.e., causador de elevado nível de glucose), em vez disso diminuía os níveis plasmáticos pós-prandiais de glucose nestes animais de teste. A amilina, em todas as taxas de dosagem testadas, reduziu tanto a taxa de aumento de glucose no plasma como também o pico de glucose no plasma no teste de tolerância à glucose oral. 0 Exemplo 2 descreve os efeitos do agonista de amilina, AC-0137, sobre os níveis pós-prandiais de glucose no plasma em ensaios clínicos em humanos.

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Com infusão intravenosa de AC-0137, tanto em bolus como contínua, observou-se uma redução dependente da dose na hiperglicemia pós-prandial em indivíduos com diabetes me/litus com início na juventude. O Exemplo 3 descreve o efeito de uma infusão contínua de AC-0137 (triPro-amilina) sobre os níveis plasmáticos de glucose após refeição de Sustacal® e após uma carga IV de glucose. Com a carga IV de glucose, os níveis de glucose no plasma em indivíduos tratados com 50 pg/h de AC-0137 não foram significativamente diferentes dos indivíduos tratados com placebo. Contudo, em indivíduos a quem se deu uma refeição de Sustacal® tratados com uma infusão IV de 25 pg/h ou 50 pg/h de AC-0137, os níveis de glucose no plasma'foram' reduzidos em indivíduos tratados com AC-0137 em comparação com o placebo. O AC-0137 reduziu as concentrações pós-prandiais de glucose no plasma em pacientes diabéticos dependentes de insulina após nutrição oral, mas não teve um efeito mensurável sobre os níveis de glucose no plasma após a administração de uma carga intravenosa de glucose.

Como se descreve no Exemplo 4, num estudo clínico controlado com placebo, em dupla ocultação, de 14 dias, os pacientes com diabetes iniciada na juventude que tinham continuado a sua terapia usual com insulina e se auto-injectavam com triPro-amilina (AC-0137) três vezes por dia, tinham níveis médios de glucose no sangue mais baixos após uma refeição de teste do que pacientes que receberam insulina e placebo. Após 14 dias, observou-se um efeito de "alisamento" de glucose (medido como a área sob a curva da glucose) estatisticamente significativo (P= 0,02) para 30 microgramas, as concentrações plasmáticas de pico de triPro-amilina estavam dentro da gama da amilina encontrada no sangue de indivíduos não diabéticos. As reduções induzidas pela triPro-amilina na ASC acompanharam reduções médias de 45 mg/dl a 60 mg/dl nas concentrações de pico de glucose no sangue nos indivíduos.

Como se descreve no Exemplo 5, mediu-se o esvaziamento gástrico em ratos BB espontaneamente diabéticos tratados com insulina e normais utilizando a retenção de um gel calórico de metilcelulose contendo Vermelho de Fenol fornecido por sonda. Determinou-se espectroscopicamente o teor de corante nos estômagos removidos após sacrifício 20 minutos mais tarde e comparou-se com o de ratos sacrificados imediatamente após a administração do gel por

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EPO 717 635/PT sonda para avaliar o esvaziamento. Os ratos diabéticos tiveram um esvaziamento gástrico marcadamente superior (passou 90,3 ±1,7%) em comparação com ratos Harlan Sprague Dawley normais (passou 49,1 ± 4,7%; P<0,001) e ratos BB não diabéticos (passou 61,1 ± 9,2%; P<0,001). O péptido de células β pancreáticas, amilina, que é deficiente em IDDM, inibiu de forma dependente da dose o esvaziamento em ratos normais e diabéticos. A ED50 da resposta foi «1 pg tanto em ratos normais como em ratos diabéticos, uma dose que resultou numa concentração de pico de amilina de 76 pM, 20 minutos após a injecção'. Estas concentrações estão dentro da gama observada in vivo. Estes resultados suportam a determinação de que a amilina participa no controlo fisiológico da entrada de nutrientes no duodeno.

Como se descreve no Exemplo 6, mediu-se a captação de cargas de glucose marcada ingeridas em ratos LA/N corpulentos, conscientes e em jejum. A pré-injecção com o antagonista do receptor de amilina, AC-0187, acelerou o aparecimento de trítio derivado da glucose no plasma. Adicionalmente, a pré-injecção com antagonista de amilina resultou num superior aumento da glucose no plasma 15 minutos após administração por sonda e num declínio mais precoce dos níveis de glucose no plasma. Estes dados são consistentes com o facto de o antagonista de amilina AC-0187 ter contrariado um efeito de amilina segregada endogenamente, acelerando desse modo o esvaziamento gástrico.

Em estudos adicionais em ratos anestesiados, veríficou-se que a amilina não afecta a absorção de glucose pelo sangue a partir do intestino delgado. Nestas experiências, os ratos anestesiados foram submetidos a infusão contínua de amilina de rato (0,35 nm/kg/min) ou solução salina, no caso dos animais de controlo, durante 3 horas. Após uma hora de infusão de amilina, aplicou-se uma infusão de um boius de glucose (1 g/kg) no estômago ou no duodeno através de um tubo inserido através do esófago. Uma vez que os estudos envolviam ratos anestesiados e não ratos conscientes, não foram considerados na análise da motilidade gástrica, e.g., taxa de esvaziamento dos conteúdos do estômago para o duodeno. Contudo, os estudos indicam que a absorção de glucose a partir do duodeno para o sangue não foi retardada pela amilina. Utilizou-se uma preparação diferente para determinar mais directamente se a amilina afectou o trânsito de glucose a partir do lúmen do intestino delgado para o sangue. Em

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ratos anestesiados, um segmento de intestino delgado, ainda ligado ao animal através do seu fornecimento de sangue, foi exteriorizado e inseriram-se cânulas de modo a que se pudesse efectuar a perfusão do intestino delgado com soluções de glucose de composição controlada. Aplicaram-se cânulas nos animais também através de um artéria (para amostragem de sangue) e através de uma veia (para infusão de amilina, insulina e glucose). Efectuou-se a perfusão do lúmen com uma solução de glucose marcada com trítio. Mediu-se a passagem de glucose do lúmen do intestino para o rato através do aparecimento do marcador trítio no plasma. A suposição de que este aparecirçento de trítio no plasma media realmente a captação de glucose a partir do intestino foi testada por administração do bloqueador do transporte de glucose, floridzina. A floridzina evitou grandemente o trânsito de marcador do lúmen do intestino para o plasma. Para assegurar que o gradiente de glucose entre o lúmen do intestino e o plasma permanecia constante, durante as infusões de amilina, a glucose no plasma foi "fixada" por uma infusão de glucose que variou em resposta a alterações na glucose no plasma. Nesta preparação, as infusões intravenosas de amilina não tiveram efeito sobre a taxa à qual a glucose marcada que se apresentou ao intestino delgado entrou no plasma. Estes resultados mostram que a glucose no sangue diminuída observada em indivíduos tratados com amilina nos estudos acima descritos provavelmente não é devida a uma diminuição na absorção a partir do intestino delgado, mas sim a uma taxa diminuída de transferência dos conteúdos do estômago para o duodeno, i.e., devido a esvaziamento gástrico retardado.

As composições úteis na invenção podem ser convenientemente „ proporcionadas na forma de formulações adequadas para administração parentérica (incluindo intravenosa, intramuscular e subcutânea) ou nasal ou oral.

Em alguns casos, será conveniente proporcionar um agonista de amilina e outro agente anti-esvaziamento, tal como glucagon, numa única composição ou solução para administração conjunta. Noutros casos, pode ser mais vantajoso administrar outro agente anti-esvaziamento separadamente da referida amilina ou análogo agonista de amilina. Um formato de administração adequado pode ser determinado do melhor modo por um médico para cada paciente individualmente. Os transportadores farmaceuticamente aceitáveis adequados e sua formulação estão descritos em compêndios de formulação Standard, e.g., Reminqto^s Pharmaceutical Sciences por E.W. Martin. Veia-se também Wang, Y.J. e Hanson, M.A. "Parenteral Formulations of Proteins and Peptides: Stability 84 764

EPO 717 635/PT 28 and Stabilizers", Journal of Parenteral Science and Technology. Relatório Técnico N°. 10, Supl. 42:2S (1988). São conhecidas na arte formulações adequadas incluindo agentes hipoglicémicos tais como sulfonilureias.

Podem ser proporcionados compostos úteis na invenção na forma de composições parentéricas para injecção ou infusão. Podem, por exemplo, ser suspensos num óleo inerte, adequadamente um óleo vegetal tal como óleo de sésamo, de amendoim, azeite ou outro transportador aceitável. Preferivelmente, são suspensos num transportador aquoso, por exemplo, numa solução tampão isotónica a um pH de cerca de 5,6 a 7,4. Estas composições podem ser esterilizadas através de técnicas de esterilização convencionais, ou podem ser esterilizadas por filtração. As composições podem conter substâncias auxiliares farmaceuticamente aceitáveis conforme necessário para as aproximar das condições fisiológicas, tais como agentes tamponantes de pH. Os tampões úteis incluem por exemplo tampões de acetato de sódio/ácido acético. Pode ser utilizada uma forma de preparação de receptáculo ou "depósito" de libertação lenta de modo a que quantidades terapeuticamente eficazes da preparação sejam fornecidas à corrente sanguínea ao longo de muitas horas ou dias após a injecção transdérmica ou o fornecimento. A isotonicidade desejada pode ser conseguida utilizando cloreto de sódio ou outros agentes farmaceuticamente aceitáveis tais como dextrose, ácido bórico, tartarato de sódio, propilenoglicol, polióis (tais como manitol e sorbitol), ou outros solutos inorgânicos ou orgânicos. 0 cloreto de sódio é particularmente preferido para tampões contendo iões sódio.

Se desejado, podem-se espessar soluções das composições anteriores com um agente espessante tal como metilcelulose. Podem ser preparadas numa forma emulsionada, de água em óleo ou de óleo em água. Podem ser empregues quaisquer de vários agentes emulsionantes farmaceuticamente aceitáveis incluindo, por exemplo, goma arábica em pó, um tensioactivo não iónico (tal como um Tween), uu um tensioactivo iónico (tal como sulfatos ou sulfonatos de polieter-álcool alcalinos, e.g., um Triton).

As composições úteis na invenção são preparadas por mistura dos ingredientes seguindo procedimentos de um modo geral aceites. Por exemplo, os componentes seleccionados podem ser simplesmente misturados numa

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EPO 717 635/PT 29 misturadora ou noutro aparelho Standard para produzir uma mistura concentrada que pode depois ser ajustada para a concentração e viscosidade finais por adição de água ou de agente de espessamento e possivelmente um tampão para controlar o pH ou um soluto adicional para controlar a tonicidade.

Para utilização pelos médicos, as composições serão proporcionadas na forma da unidades de dosagem contendo uma quantidade de uma amilina ou um agonista de amilina, por exemplo, um composto análogo agonista de amilina com ou sem outro agente anti-esvaziamento que será eficaz numa dose ou em doses múltiplas para controlar o açúcar no sangue no nível seleccionado. As quantidades terapeuticamente eficazes de uma amilina ou um agonista de amilina, tal como um análogo agonista·der· amilina, para utilização no controlo de esvaziamento gástrico e em condições em que o esvaziamento gástrico é beneficamente retardado ou regulado são as que diminuem os níveis pós-prandiais de glucose no sangue, preferivelmente para não mais do que cerca de 8 ou 9 mM ou tais que os níveis de glucose no sangue sejam reduzidos conforme desejado. Em indivíduos diabéticos ou intolerantes de glucose, os níveis de glucose no plasma são mais elevados do que em indivíduos normais. Nestes indivíduos, pode ser obtida uma redução benéfica ou "alisamento" dos níveis pós-prandiais de glucose no sangue. Tal como o reconhecerão os peritos na arte, uma quantidade eficaz de agente terapêutico variará com muitos factores incluindo a idade e o peso do paciente, a condição física do paciente, o nível de açúcar no sangue ou a diminuição da acção da amilina a obter, e outros factores.

Tais composições farmacêuticas são úteis para provocar hipomotilidade gástrica num indivíduo e podem também ser utilizadas em outras desordens em que a motilidade gástrica é beneficamente reduzida. A dose diária eficaz anti-esvaziamento dos compostos incluindo 18Arg25,28Pro-h-amilina, des-1Lys18Arg25-28Pro-h-amilina, 18Arg25,28,29Pro-h-amilina, des-1Lys10Arg25'2®'2°Pro-h-amilina, 2B,282ePro-h-amilina, des-^ys^-^^Pro--h-amilina e 25Pro26Val25,28Pro-h-amilina, estará tipicamente na gama de 0,01 ou 0,03 a cerca de 5 mg/dia, preferivelmente cerca de 0,01 ou 0,5 a 2 mg/dia e mais preferivelmente cerca de 0,01 ou 0,1 a 1 mg/dia, para um paciente de 70 kg, administrada numa dose única ou em doses divididas. A dose exacta a administrar é determinada pelo médico assistente e depende de onde o 84 7Θ4 ΕΡ Ο 717 635/ΡΤ 30 composto em particular se estende na gama acima referida, bem como da idade, peso e condição do indivíduo. A administração deverá iniciar-se ao primeiro sinal de sintomas ou pouco depois do diagnóstico de diabetes mel/itus. A administração pode ser por injecção, preferivelmente subcutânea ou intramuscular. Os compostos oralmente activos podem ser tomados oralmente, no entanto as dosagens devem ser aumentadas 5-10 vezes.

De um modo geral, no tratamento ou prevenção de níveis pós-prandiais elevados, inapropriados ou indesejados de glucose no sangue, os compostos da presente invenção podem ser administrados a pacientes com necessidade de tal tratamento em gamas de dosagem semelhantes às anteriormente mencionadas, contudo, os Compostos são administrados mais frequentemente, por exemplo·, ··:· uma, duas ou três vezes por dia.

Os antagonistas de amilina úteis no tratamento de hipomotilidade gástrica podem ser administrados numa dosagem de 0,1 a 30 mg/dia, preferivelmente 0,3 a 10 mg/dia e preferivelmente de 0,1 a 3 mg/dia. A administração pode ser, por exemplo, por injecção subcutânea ou intramuscular. Os compostos oralmente activos podem ser tomados oralmente, contudo as dosagens devem ser aumentadas 5-10 vezes.

Para auxiliar o entendimento da presente invenção, incluem-se os seguintes Exemplos que descrevem os resultados de uma série de experiências. As experiências relacionadas com a presente invenção não devem, evidentemente, ser consideradas como limitando especificamente a inve.nção e variações da invenção, actualmente conhecidas ou mais tarde desenvolvidas, que fazem parte do conhecimento do perito na arte são consideradas dentro do âmbito da invenção como aqui descrito e posteriormente reivindicado. EXEMPLO 1

Estudos prévios demonstraram que injecções intravenosas de amilina a ratos alimentados e em jejum nas condições do teste de tolerância à glucose podem diminuir o declínio da glucose no plasma e aumentar o lactato no plasma de uma maneira dependente da dose. As respostas à insulina são também significativamente deprimidas pelas infusões de amilina em animais em jejum.

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Contudo, os estudos e as experiências seguintes mostraram que a infusão de amilina diminuiu os níveis de glucose no plasma em cães, em resposta a um nível de glucose oral. As finalidades destes estudos foram: (1) avaliar as alterações da glucose, do lactato e da insulina, no plasma, em resposta a uma carga oral de glucose; (2) avaliar os efeitos de amilina administrada intravenosamente sobre estas variáveis; e (3) avaliar a eficácia do antagonista de amilina AC-0253 (acetil-",18Arg30Asn32Tyr-9'32calcitonina (salmão)) para inverter quaisquer alterações induzidas por amilina na glucose do plasma do sangue.

Utilizaram-se neste estudo cães Mongrel (9 machos, gama de pesos de 12-17 kg). Todos os animais estiveram em jejum durante a noite anterior a cada estudo. Cada animal serviu como seu próprio controlo em todos os protocolos. Deixaram-se equilibrar os animais durante 30-60 minutos antes do início de cada protocolo.

Para t= -30, iniciou-se veículo ou amilina ± AC-0253. As taxas de dosagem de amilina foram de 50, 100 e 300 pmol/kg/min. As taxas de dosagem de AC-0253 foram de 500 e 1500 pmol/kg/min. Administrou-se glucose a 25% (1 g/kg) pela boca a t= 0 minutos. Interrompeu-se a amilina ± AC-0253 a t= 120 minutos. Obtiveram-se amostras para determinação da insulina, da glucose e do lactato com 15 minutos de intervalo desde t= -45 até t= 180 minutos. Recolheram-se amostras para determinação da amilina de rato e de AC-0253 a t= 60 e 120 minutos.

Em cães normais, o pico de glucose no plasma ocorre entre 30-45 minutos após uma carga oral de glucose nos cães conscientes. Apesar de haver uma considerável variabilidade entre os cães, os padrões de resposta foram reprodutíveis em cada cão individual. A amilina, em todas as taxas de dosagem testadas, reduziu tanto a taxa de aumento da glucose no plasma como o pico de glucose no plasma. Durante a infusão de amilina, a glucose no plasma pareceu atingir um patamar, para uma glucose no plasma significativamente inferior à das experiências de controlo, a 30 a 45 minutos e começou a aumentar novamente após ter terminado a infusão de amilina. Não houve diferenças nas alterações de glucose no plasma entre as taxas de dosagem de amilina de 50, 100 e 300 pmol/kg/min. A Fig. 1 mostra o efeito da amilina (50 pmol/kg/min) sobre os níveis de glucose no plasma após uma carga oral de glucose.

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Seleccionou-se uma taxa de dosagem de amilina de 50 pmol/kg/min para as experiências realizadas para avaliar a eficácia do AC-0253 para inverter as alterações induzidas pela amilina na glucose do plasma. O AC-0253 até 1500 pmol/kg/min não inverte completamente os efeitos da amilina (50 pmol/kg/min). O AC-0253 sozinho não produziu efeito sobre as alterações na glucose no plasma. Os efeitos da amilina e do AC-0253 sobre o lactato no plasma foram desprezáveis. EXEMPLO 2

Vinte e quatro indivíduos macho com diabetes mellitus dependente de insulina participaram num estucjõ clínico do agonista de amilina AC-0137. Cada indivíduo foi atribuído aleatoriamente a um de quatro grupos de tratamento que receberam placebo, 30, 100 ou 300 pg de AC-0137. Os indivíduos de cada grupo de dosagem foram submetidos a um ensaio cruzado de dois períodos ("two period crossover") para examinar o bolus intravenoso (IV) versus infusão IV da droga. Cada período consistiu num confinamento de três dias à unidade de estudo. Em cada ocasião, o dia inicial de confinamento foi deixado para ambientação à unidade de estudo. O segundo e terceiro dias constituíram um ensaio cruzado interno ("imbedded crossover") de placebo versus medicação activa. Por exemplo, aos indivíduos escolhidos aleatoriamente para receber primeiro o bolus IV foi adicionalmente destinado receber um bolus de AC-0137 IV num dia e um bolus IV de placebo no outro dia (ou na ordem oposta, o bolus de placebo seguido pelo bolus de AC-0137). Após duas semanas, os indivíduos foram readmitidos para receber a mesma dose de AC-0137 através do meio oposto de administração, i.e., por infusão IV. Foi‘empregue um projecto de ensaio cruzado interno para a administração de droga e placebo nos Dias 2 e 3 desta admissão, de uma maneira semelhante à utilizada durante a primeira admissão. Os seis indivíduos destinados ao grupo do placebo receberam placebo em cada um dos dias do estudo.

Nos dias do estudo, inseriram-se cateteres intravenosos pelo menos 30 minutos antes do início do estudo. Quinze minutos antes da dosagem, os indivíduos tomaram a sua dose usual de insulina por injecção subcutânea. No tempo 0, os indivíduos receberam ou uma injecção de bolus IV da dose atribuída de AC 0137 ou de placebo, ao longo de dois minutos, ou iniciou-se uma infusão contínua de AC-0137 ou de placebo que se continuou durante duas horas. A

84 764 ΕΡ Ο 717 635/ΡΤ taxa de infusão foi projectada para administrar a quantidade atribuída de droga ao longo do período de duas horas. Trinta minutos mais tarde, os indivíduos ingeriram os seus pequenos-almoços normais. Recolheram-se amostras de sangue entre -30 e 300 minutos para a medição dos níveis de AC-0137 no plasma e dos níveis de glucose no plasma.

Tal como mostrado nas Fig. 2-4, os níveis da droga no plasma seguiram o curso esperado, ocorrendo o pico pouco depois da injecção de bolus e depois desaparecendo do compartimento do plasma com uma cinética aparente de primeira ordem. Em contraste, tal como mostrado nas Fig. 5-7, as infusões contínuas conduziram a níveis que se aproximaram do estado estacionário em 30 minutos e se mantiveram depois nesse nível durante o tempó^restante da infusão. Quando terminou a infusão, os níveis no plasma decaíram de uma maneira semelhante à observada com a administração IV de bolus.

Os perfis de glucose no plasma revelaram alguns resultados inesperados e interessantes. Como se pode observar dos indivíduos que receberam placebo em cada ocasião, os níveis de glucose no plasma elevaram-se acima da linha de base aos 60-90 minutos e permaneceram elevados pelo menos durante 240 minutos. A administração de bolus IV de AC-0137 não resultou em nenhuma alteração aparente nos níveis de glucose após a dose de 30 pg. Com o bolus de 100 pg, o aumento pós-prandial na glucose foi claramente retardado e menos pronunciado. Após o bolus de 300 pg, o aumento pós-prandial nos níveis de glucose foi essencialmente eliminado.

Com a infusão ' intravenosa contínua, observou-se uma redução dependente da dose na hiperglicemia pós-prandial. Os dados da infusão de 15 pg/h são altamente sugestivos de um efeito, e à medida que a taxa de infusão aumentou para 50 e 150 pg/h, a redução do aumento pós-prandial nos níveis de glucose é notável. Foram aparentes tendências semelhantes nos estudos que empregaram a administração de bolus da droga. EXEMPLO 3

Realizou-se um estudo num ensaio cruzado de dois períodos, controlado com placebo e em ocultação simples, com um mínimo de descanso de 15 horas

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EPO 717 635/PT entre tratamentos, para demonstrar adicionalmente o efeito da triPro-amilina (AC-0137) na redução da hiperglicemia pós-prandial e para confirmar que a redução na hiperglicemia pós-prandial é principalmente um efeito gastrintestinal. Vinte e sete indivíduos com diabetes mellitus dependente de insulina foram distribuídos numa combinação de dois grupos de níveis de dosagem e dois tipos de testes de tolerância. Os indivíduos receberam tratamento com uma bomba de micro-infusão contínua de AC-0137 e placebo, de acordo com o projecto do ensaio de cruzado. Os indivíduos foram divididos em três grupos com nove indivíduos por grupo, como se segue: o Grupo A recebeu refeições de Sustacal® e uma dose de 25 pg/h de AC-0137. O Grupo B recebeu refeições de Sustacal® e uma dose de 50 pg/h de AC-0137. O Grupo C recebeu uma carga intravenosa de glucose e uma dose de 50 pg/h de AC-OÍ 37. ‘ -

Os indivíduos permaneceram na clínica durante três dias. No primeiro dia de confinamento, os indivíduos foram ambientados à clínica. Nos Dias 2 e 3 os indivíduos completaram um projecto de ensaio cruzado de dois períodos de AC-0137 versus placebo. Em adição, os indivíduos receberam uma refeição de Sustacal® ou um teste de tolerância à glucose iv, tal como determinado pela atribuição ao grupo.

Durante o primeiro dia, estabilizou-se a absorção usual de insulina e calórica do indivíduo e cada indivíduo seguiu então este regime de insulina e dieta ao longo do confinamento na clínica.

Aproximadamente às 0700h (T = 0), iniciou-se a infusão contínua da medicação em estudo. Para T = 30 minutos, administrou-se aos' indivíduos a sua dose habitual AM de insulina. Para T = 60 minutos, deu-se aos indivíduos uma refeição de Sustacal® normalizada contendo 355 calorias, para beber, ou uma carga iv de glucose de 300 mg/kg, administrada como uma infusão i.v. de D50W ao longo de cinco minutos utilizando uma bomba de infusão. O tipo de teste de tolerância foi determinado de acordo com o esquema de escolha aleatória. Colheram-se amostras de sangue em intervalos regulares para a medição das concentrações de glucose, de lactato e de insulina e para a determinação das concentrações de AC-0137 no plasma. Terminou-se a administração da droga em estudo a t= 300 minutos.

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Na manhã do terceiro dia, colocaram-se novamente as linhas iv de uma maneira semelhante á do Dia 2. Administrou-se aos indivíduos a sua dose habitual de insulina antes do pequeno-almoço como no Dia 2. Os indivíduos receberam placebo ou a medicação em estudo de um modo cruzado utilizando a mesmo via iv e o mesmo regime que no dia anterior (i.e., os indivíduos que receberam infusão de AC-137 no segundo dia receberam infusão de placebo no terceiro dia). Administrou-se novamente uma carga iv de glucose ou de tolerância à refeição de Sustacal® normalizada idênticas à que receberam no Dia 2. No final do período de amostragem removeram-se as linjias iv.

Tal como mostrado na Figura 11, com uma carga IV de glucose, os níveis de glucose no plasma*'nós indivíduos tratados com 50 pg/h de AC-0137 não foram significativamente diferentes dos indivíduos tratados com placebo. Estas diferenças nas concentrações de glucose após a injecção foram estatisticamente significativas quando a área sob as curvas de glucose, corrigidas para os valores da linha de base, foram comparados (P= 0,0015). Assim, a observação de hiperglicemia pós-prandial reduzida durante a administração de AC-0137 foi confirmada empregando uma refeição normalizada na presença de concentrações médias de AC-0137 no plasma significativamente mais baixas do que as previamente utilizadas.

Contudo, tal como mostrado nas Figuras 9 e 10, nos indivíduos a que se deu a refeição de Sustacal® tratados com 25 pg/h ou 50 pg/h de infusão IV de AC-0137, os níveis de glucose no plasma eram reduzidos em indivíduos tratados com AC-0137 em comparação com o placebo. ; >> O AC-0137, em doses farmacologicamente toleráveis, reduziu as concentrações de glucose no plasma pós-prandiais em pacientes diabéticos dependentes de insulina após nutrição oral, mas não teve efeitos mensuráveis nas concentrações de glucose no plasma após a administração de uma carga intravenosa de glucose. Estes resultados são consistentes com a ideia de que o AC-0137 modifica a captação de nutrientes orais a partir do intestino, e indicam que uma alteração na taxa de esvaziamento gástrico é responsável por pelo menos uma parte deste efeito.

84 764 ΕΡ Ο 717 635/ΡΤ EXEMPLO 4

Tomou-se um grupo paralelo, controlado com placebo, em dupla ocultação, aleatório, para determinar o efeito de triPro-amilina (AC-0137) sobre os níveis de glucose no plasma após ingestão de uma refeição normalizada de Sustacal® (Mead-Johnson). Participaram 72 indivíduos com diabetes mellitus dependente de insulina num ensaio clínico de 14 dias. Cada indivíduo foi atribuído aleatoriamente a um de quatro grupos de tratamento, que receberam placebo, 30, 100 ou 300 pg de triPro-amilina por injecção subcutânea, três vezes por dia, durante 14 dias. Os indivíduos permaneceram também com o seu regime habitual de insulina ao longo do estudo. Nos dias 1 (linha de base), 7 e T4, realizaram-se testes de tolerância a refeições normalizadas? -

Para os testes de tolerância a refeições normalizadas, deu-se aos indivíduos uma refeição líquida de Sustacal® (360 ml contendo 360 calorias) às 0800h. Os indivíduos tinham sido mantidos em abstenção de alimentos e bebidas (excepto água) desde as 2200h da noite anterior. Os indivíduos apenas administraram a sua dose habitual da manhã de insulina 30 minutos antes da refeição de Sustacal®. Para um teste de linha de base, no primeiro dia, apenas se administrou triPro-amilina (ou placebo) após o teste estar completo. Nos dias 7 e 14, administrou-se triPro-amilina (ou placebo) numa injecção separada, ao mesmo tempo que a dose de insulina habitual da manhã. Colheram-se amostras para determinação de níveis de glucose no soro a -30, 0, 30, 60, 120 e 180 minutos em relação ao início do desafio. Considerou-se o tempo zero como sendo o tempo em que o indivíduo começou a beber a refeição de Sustacal®.

Tal como ilustrado na Tabela 1 que se segue, e nas Figuras 8, 12 e 13, após 14 dias, observou-se um efeito estatisticamente significativo (p= 0,02) de "alisamento" do nível de glucose (medido como a área sob a curva de glucose) para os níveis de dosagem de 30 pg e 100 pg. As reduções induzidas por triPro-amilina (AC-0137) na área sob a curva (ASC) acompanharam reduções médias de 45 mg/dl a 60 mg/dl nas concentrações de pico de glucose no sangue dos indivíduos.

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Tabela 1

Alteração na glucose após a refeição (ASC) após 14 dias de triPro-amilina

Dose de triPro-amilina (tomada 3 vezes Dor dia) Dlacebo 30 microqramas 100 microaramas 300 microaramas Número de pacientes Testados nos 14 dias 21 15 22 12 Glucose após a refeição: Média de alterações na ASC (mg/dl*min) (a) + 229 -6,645 -6,412 -7,316 Valores "p" vs placebo (b) - 0,02 0,02 0,11 Picos de triPro-amilina no Plasma (picomoles/litro) ... 22±4 44±14 173±40 (a) ASC á a área sob a curva de concentração de glucose relativamente ao valor de glucose antes da refeição, entre o inicio da refeição de teste e 3 horas depois. A alteração da ASC é o valor antes da dosagem menos o valor no dia 14 para cada indivíduo testado em ambos os dias. (bl Valores p obtidos a partir de um teste não paramétrico de Wilcoxon. EXEMPLO 5

Realizou-se o seguinte estudo para examinar os efeitos de agonistas de amilina sobre o esvaziamento gástrico num modelo em roedor de diabetes auto-imune espontânea, o rato BB tratado com insulina.

Obtiveram-se ratos Harlan Sprague Dawley (HSD) macho (161-244 g) e ratos Biobreeding (BB) (181-405 g) de uma colónia própria derivada originalmente de Mollegârd Breeding Center, Dinamarca, em 1989. Quando se confirmou que os ratos BB eram diabéticos por glicosúria em pelo menos 2 dias, trataram-se com injecções s.c. diárias de insulina humana recombinante ultralente (Humulin-U, Eli Lilly, Indianapolis). A terapia com insulina tinha como objectivo a manutenção dos níveis de glucose mas minimizando cetonas na urina, de modo a evitar mortes por hipoglicemia. De facto, estava presente glicosúria em 88% das medições e cetonúria em 52%. A duração média da diabetes foi de 53±5 dias, e as necessidades diárias de insulina eram de 4,7+0.3 unidades. Todos os animais foram alojados a 22,7+0,8 C com um ciclo de luz:escuridão de 12:12 horas (sendo as experiências realizadas durante o

84 764 ΕΡ Ο 717 635/ΡΤ ciclo de luz) e foram alimentados e tiveram água ad libitum (Dieta LM-485, Teklad, Madison, Wl). A determinação do esvaziamento gástrico pelo método descrito abaixo tem sido realizada normalmente após um jejum de ~20 horas para assegurar que o estômago não continha quimo que pudesse interferir com as medições espectrofotométricas de absorvância. Contudo, os ratos diabéticos tratados com insulina Ultralente não podiam estar em jejum durante 20 horas. Períodos de jejum superiores a 6 horas resultavam em- hipoglicemia. Estes animais estiveram portanto em jejum apenas durante 6 horas antes da medição do esvaziamento gástrico. Os ratos não diabéticos foram privados de alimentos durante 6 ou 20 horas antes da experiência. Notámos que mesmo os' ratos BB não diabéticos tinham elevadas concentrações de hemoglobina glicolada, possivelmente indicando insulite sub-clínica. Tanto os ratos Harlan Sprague Dawley não diabéticos como os ratos BB não diabéticos foram portanto utilizados em comparações com ratos diabéticos. Assim, havia 5 grupos de tratamento: (1) Ratos Harlan Sprague Dawley não diabéticos, com 6 horas de jejum, n = 8. (2) Ratos BB não diabéticos, com 6 horas de jejum, n = 6. (3) Ratos BB diabéticos, com 6 horas de jejum, n = 10. (4) Ratos Harlan Sprague Dawley não diabéticos, com 20 horas de jejum, n = 20. (5) Ratos BB não diabéticos, com 20 horas de jejum, n = 7.

Os ratos, conscientes, rècébéram através dè sonda, 1,5 ml de um gel acalórico contendo 1,5% de metilcelulose (M-0262, Sigma Chemical Co., St.Louis, MO) e 0,05% de indicador vermelho de fenol. Vinte minutos após a administração por sonda, anestesiaram-se os ratos utilizando halotano a 5%, expuseram-se os estômagos e fixaram-se nos esfíncteres esofágico inferior e pilórico utilizando fórceps arteriais, removeram-se e abriram-se numa solução alcalina que foi perfeita até um volume determinado. O conteúdo do estômago foi estimado a partir da intensidade do vermelho de fenol na solução alcalina, medida por absorvância a um comprimento de onda de 560 nm. Na maioria das experiências o estômago estava limpo. Noutras experiências, centrifugaram-se os conteúdos gástricos particulados para limpar a solução para as medições de absorvância. Quando o conteúdo gástrico diluído permanecia turvo, a

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EPO 717 635/PT absorvância espectroscópica devida ao Vermelho de Fenol foi estimada como a diferença entre a que estava presente na solução alcalina vs no diluente acidificado. Em experiências separadas em 7 ratos, excisaram-se o estômago e o intestino delgado e abriram-se para uma solução alcalina. A quantidade de vermelho de fenol que pôde ser recuperada do tracto gastrintestinal superior 20 minutos após a administração por sonda foi de 89±4%. Para ter em conta uma recuperação máxima de corante inferior a 100%, o conteúdo do estômago que permanecia após 20 minutos foi expresso como uma fracção do conteúdo gástrico recuperado a partir dos ratos de controlo sacrificados imediatamente após a administração por sonda na mesma experiência.

Em estudos para a linha de base (onde não" foi 'injectada amilina) o KV; esvaziamento gástrico ao longo de 20 minutos foi determinado nos 5 grupos de tratamento acima descritos. Em estudos de resposta à dose, administrou-se amilina de rato (Bachem, Torrance, CA) dissolvida em solução salina 0,15 M, como um bo/us subcutâneo de 0,1 ml em doses de 0, 0,01, 0,1, 1, 10 ou 100 pg, 5 minutos antes da administração por sonda a 46 ratos Harlan Sprague Dawley (não diabéticos) em jejum durante 20 horas (n= 17, 2, 8, 8, 6, 5 respectivamente) e a 29 ratos BB diabéticos em jejum durante 6 horas (n= 10, -3, 3, 3, 3, 10 respectivamente).

Numa experiência separada para avaliar a alteração das concentrações de amilina no plasma que uma dose subcutânea eficaz de amilina produzia, colheram-se amostras de sangue das caudas de 6 ratos anestesiados com halotano após injecção s.c. de bolus de 1 pg (n= 3) ou 10 pg (n = 3) de amilina de rato. Noutra experiência, compararam-se as concentrações de amilina' no plasma em ratos Harlan Sprague Dawley que não jejuaram (n = 8) e em ratos BB diabéticos que não jejuaram (n= 5). Separou-se e congelou-se a -20°C o plasma de amostras de 250 pl colhidas com 10 minutos de intervalo, para análise num ensaio imuno-enzimométrico de 2-locais desenvolvido por nós.

Para realizar o imunoensaio, revestiram-se placas de microtítulo pretas (Dynatech, Chantilly, VA) com o anticorpo F024-4.4 [Phelps JL, Blase E, Koda JE, não publicado] por incubação de um dia para o outro a 4°C com 20 ug de anticorpo por ml em carbonato 50 mM a pH 9,6. Lavaram-se as placas com Tris 0,05 M/cloreto de sódio 0,15 M/azida de sódio a 0,02%/ Tween 20 a 0,1% 40 84 764 EPO 717 635/ΡΤ (TBS/Tween), e bloquearam-se com leite em pó seco a 1,0% sem gorduras no mesmo tampão de carbonato durante uma hora à temperatura ambiente. Descongelaram-se amostras em gelo e diluíram-se em BSA a 4%/supertrato de colesterol bovino 200 mg/dl (reagentes Miles Pentex, Miles Laboratories, Kankakee IL) se necessário. Adicionaram-se amostras ou padrões às placas revestidas e bloqueadas e incubou-se durante uma hora à temperatura ambiente. Após lavagem, adicionou-se o anticorpo de detecção F025-27 conjugado com fosfatase alcalina. Realizou-se o acoplamento anticorpo-enzima utilizando o estojo de conjugação de maleimida fosfatase alcalina de Pierce Immunpchemical Co (Rockford IL). Incubou-se o conjugado durante três horas à temperatura ambiente, após o que se lavaram as placas cuidadosamente com solução salina tamponada com Tris. Detectòu-Se a enzima ligada por incubação das placas com o substrato fluorescente fosfato de 4-metilumbeliferilo a 50 ug/ml em dietanolamina 1 M/MgCI 0,5 mM, pH 9,8 durante 49 minutos à temperatura ambiente. Mediu-se o sinal fluorescente com um leitor de placas Dynatech Microfluor, e analisaram-se os dados com o software Multicalc (Wallac, Gaithersburg MD). As concentrações de amilina em amostras de plasma foram determinadas por comparação com uma curva padrão obtida no mesmo ensaio. Quando realizado desta maneira, o ensaio tem uma concentração mínima detectável de 2 pM.

As curvas de resposta à dose para o esvaziamento gástrico foram ajustadas a um modelo logístico de 4 parâmetros utilizando uma rotina iterativa de mínimos quadrados (ALLFIT, v2.7, NIH, MD) para calcular as ED50. Como a ED50 é log normalmente distribuída, é expressa ± erro padrão do logaritmo. Fizeram-se os testes de comparações aos pares utilizando análise de uma via da variância e as comparações múltiplas de Student-Newman-Keuls (Instat v2.0, GraphPad Software, San Diego) utilizando P<0,05 como nível de significância.

Em 8 ratos Harlan Sprague Dawley que não jejuaram as concentrações de amilina em circulação eram de 11,7±1,4pM (95% Cl 8,4-14,9 pM). Em comparação, as concentrações de amilina em 5 ratos BB espontaneamente diabéticos e que não jejuaram não foram detectáveis.

As fracções de corante que permaneceu 20 minutos após a administração por sonda com Vermelho de Fenol, juntamente com comparações estatisticamente relevantes, estão apresentadas na Tabela 2. Tanto em ratos

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Harlen Sprague Dawley como em ratos BB não diabéticos, o esvaziamento de corante após 20 minutos foi igual quer os animais tivessem jejuado 6 horas ou 20 horas. Isto é, o período de jejum (dentro da gama de 6 a 20 horas) não pareceu afectar significativamente o esvaziamento gástrico medido através desta técnica.

Tahela 2

Conteúdos gástricos que permanecem 20 minutos após a administração por sonda HSD não diabéticos BB não diabéticos r BB diabéticos 20 h de jejum 54,9±3,0% n = 20 27,0±3,8% n = 7 Não realizado 6 h de jejum 50,9±4,7% n = 8a 38,9±9,2 n = 6a 9,7+1,7% n = 10bc

Os conteúdos gástricos são expressos como uma fracção daqueles que ^poidem ser recuperados imediatamente após a administração por sonda em 2-3 ratos separados no mesmo ensaio. a= não diferentes de ratos que jejuaram 20 horas b= diferente de ratos HSD que jejuaram 6 horas (P< 0,001) e= diferente de ratos BB não diabéticos que jejuaram 6 horas (P<0,001)

Vale a pena notar que o esvaziamento gástrico em ratos BB diabéticos foi significativamente mais rápido (P<0,01-0,001) do que em quaisquer dos outros 4 grupos de tratamento (i.e. animais não diabéticos). A observação de que os ratos BB diabéticos têm uma taxa de esvaziamento gástrico superior à de ratos BB não diabéticos sugere que a observação está relacionada com a presença de diabetes e não está meramente associada à estirpe BB.

Devido aos constrangimentos do método acima identificados, os efeitos da amilina foram explorados em ratos Harlan Sprague Dawley não diabéticos que jejuaram 20 horas, e em ratos BB diabéticos que jejuaram 6 horas. Quando se deram as injecções subcutâneas de amilina 5 minutos antes da administração por sonda de indicador Vermelho de Fenol, houve uma supressão dependente da dose do esvaziamento gástrico. A supressão do esvaziamento gástrico foi tal que o corante recuperável de ratos HSD normais aos quais se administrou 1 pg de amilina, e de ratos diabéticos aos quais se administraram 10 pg, foi igual ao recuperável imediatamente após a administração por sonda (P = 0,22, 0,14). A dose para a qual 50% da alteração máxima no esvaziamento gástrico (ED50) foi observada em ratos normais foi de 0,43 pg (0,60 nmol de amilina/kg de peso corporal) ± 0,19 unidades logarítmicas. Em ratos diabéticos a ED50 para

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EPO 717 635/PT supressão do esvaziamento gástrico foi de 2,2 pg (2,3 nmol/kg) ±0,18 unidades logarítmicas. A partir das curvas ajustadas apresentadas na Figura 14, pode-se estimar que uma dose de amilina de ~2 pg administrada a um rato diabético podia restabelecer o esvaziamento gástrico na taxa observada em ratos normais aos quais não se tinha administrado amilina.

Tal como mostrado na Fig. 15, quando 3 ratos foram injectados subcutaneamente com 1 pg de amilina de rato, a concentração no plasma medida 10 minutos mais tarde foi de 66+10 pM e o pico de concentração, aos 20 minutos, foi de 74±26 pM. Em 3 ratos injectados com um bolus s.c. de 10 pg, as concentrações correspondentes aos 10 e 20 min foram de 347±'43 pM e 301 ±57 pM, respectivamente:,„Uma dose subcutânea de 1 pg de amilina, que inibe o esvaziamento gástrico em ~50% ao longo de 20 minutos (ED50), tem de começar a actuar logo após a injecção para ter efeito 20 minutos mais tarde. Um efeito que se inicie a cerca de 20 min após a injecção, por exemplo, não seria detectável neste sistema. Logo, as concentrações no plasma 50% eficazes na inibição do esvaziamento gástrico (o EDB0) ocorreram bem antes dos picos de concentração no plasma de 74 pM serem atingidos, e portanto foram consideravelmente inferiores a 74 pM.

Os resultados destas experiências mostram que a amilina inibe de um modo potente e dependente da dose, o esvaziamento gástrico. EXEMPLO 6

As experiências descritas neste exemplo foram realizadas para examinar os efeitos de um antagonista de receptores de amilina sobre a tolerância à glucose oral e sobre a absorção de trítio derivado de uma carga oral de glucose marcada.

Mediu-se em 11 ratos LA/N corpulentos (500-600 g), conscientes, que jejuaram 24 horas, a captação de uma carga de glucose marcada ingerida, em duas ocasiões, distanciadas 14 dias. Numa ocasião, os ratos foram injectados subcutaneamente com 3 pg do antagonista de amilina selectivo AC-0187 (ac-,0N32Y832 calcitonina de salmão, 3 minutos antes da administração por sonda. Na outra ocasião, pré-injectaram-se os ratos apenas com veículo salino. 43 84 764 ΕΡ Ο 717 635/ΡΤ

Administraram-se aos ratos, por sonda, 5 pCi de [33H]glucose em 1 ml de glucose a 50%. Colheram-se amostras de sangue das caudas dos ratos anestesiados 0, 15, 30, 60 90 e 120 minutos após a administração por sonda que se ensaiaram quanto ao trítio derivado da glucose e à glucose.

Tal como mostrado na Fig. 16, a pré-injecção com o antagonista de amilina, AC-0187, acelerou o aparecimento de trítio derivado de glucose no plasma em 48% após 15 minutos depois da administração por sonda (P<0,02), ev em 45% (P< 0,001) após 30 minutos depois da administração por sonda (teste t emparelhado). Tal como mostrado na Fig. 17, a pré-injecção com AC-0187 resultou também num maior aumento da glucose no plasma 15 minutos após a administração por sonda de 0,5 g de glucose (5,89±0,17 a 8,33±0,28 mM vs 5,83+0,22 a 6,83±0,28 mM, P<0,001, teste t emparelhado). Adicionalmente, em animais tratados com AC-0187, a glucose no plasma diminuiu mais cedo (6,89±0,28 mM vs 8,17±0,39 mM após administração por sonda 60 minutos após a administração por sonda de glucose, P<0,001, teste t emparelhado).

Assim, no rato LA/N corpulento, um antagonista de amilina selectivo aumentou a tqxa de aparecimento no plasma de glucose marcada após,uma carga oral de glucose, e também aumentou a taxa de aumento e queda da concentração no plasma de glucose não marcada. Estes dados são consistentes com o antagonista de amilina ter contrariado um efeito de amilina segregada endogenamente, acelerando o esvaziamento gástrico.

Lisboa, tâ· JAN. 2UL1

Por AMYLIN PHARMACEUTICALS, INC. - O AGENTE OFICIAL -

Claims (15)

1. 84 764 EPO 717 635/PT 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de uma amilina ou de um agonista de amilina para o fabrico de um medicamento para a regulação benéfica da motilidade gastrintestinal, em que o referido agonista de amilina não é um CGRP nem uma calcitonina.
2. 2. Utilização de acordo com a reivindicação em que a referida regulação benéfica da motilidade gastrintestinal compreende a redução da motilidade gástrica ou o retardamento do esvaziamento gástrico.
3. 3. Utilização de acordo com a reivindicação 1 em que a referida regulação benéfica da motilidade gastrintestinal compreende o tratamento de um indivíduo submetido a um procedimento de diagnóstico gastrintestinal ou o tratamento de um indivíduo com uma desordem gastrintestinal.
4. 4. Utilização de acordo com a reivindicação 3 em que o referido procedimento de diagnóstico gastrintestinal é um exame radiológico ou imageologia por ressonância magnética.
5. 5. Utilização de acordo com a reivindicação 3 em que a referida desordem gastrintestinal é espasmo incluindo diverticulite aguda ou uma desordem no tracto biliar ou uma desordem do Esfíncter de Oddi ou é o síndrome jejunal pós-prandial.
6. 6. Utilização-de uma amilina ou de um agonista de amilina para o fabrico de um medicamento para o tratamento de hiperglicemia pós-prandial.
7. 7. Utilização de acordo com a reivindicação 6 em que a hiperglicemia pós-prandial é uma consequência de diabetes mellitus do Tipo 2.
8. 8. Utilização de acordo com a reivindicação 6 ou 7 em que a referida amilina é amilina de rato.
9. 9. Utilização de acordo com a reivindicação 6 ou 7 em que o referido agonista de amilina não é um CGRP nem uma calcitonina. 84 764 ΕΡ Ο 717 635/ΡΤ 2/2
10. 10. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7 em que o referido agonista de amilina é 25,28,29Pro-h-amilina.
11. 11. Utilização de uma amilina ou de um agonista de amilina que não é um CGRP nem uma calcitonina, para o fabrico de um medicamento para o tratamento da ingestão de uma toxina, tratamento este que compreende: (a) a administração de uma quantidade de uma amilina ou de um agonista de amilina, eficaz para evitar ou reduzir a passagem de conteúdos do estômago para os intestinos; e (b) a aspiração dos conteúdos do estômago.
12. 12. Utilização de um antagonista de amilina para o fabrico de um medicamento para o tratamento de hipomotilidade gástrica ou para a aceleração do esvaziamento gástrico.
13. 13. Utilização de acordo com a reivindicação 12 em que a referida hipomotilidade é uma consequência de neuropatia diabética ou de anorexia nervosa.
14. 14. Utilização de acordo com a reivindicação 12 ou 13 em que o referido antagonista de amilina é um antagonista de receptores de amilina.
15. 15. Utilização de acordo com a reivindicação 14 em que o antagonista de receptores de amilina é acetil-1,,18Arg, 30Asn,32Tyr-932calcitonina (de salmão). Lisboa, 18. JAU 2001 o ADJUNTO Por AMYLIN PHARMACEUTICALS, INC. - O AGENTE OFICIAL -

    ENG.· ANTÔNIO JOAO IA CUNHA FERREIRA A§. 0|. Pr. In4. Re· 4es Piores, 74 - 4.· 1BOO LISBOA