SK31496A3 - Use of amylin, amylin agonists and amylin antagonists for regulating gastrointestinal motility - Google Patents

Description

Vynález sa týka použitia amylínu a agonistov amylínu na prípravu liečiv určených na priaznivú reguláciu gastrointestinálnej motility jedincov, konkrétne na liečbu liečbe porúch, na ktoré by priaznivo pôsobili prostriedky, ktoré sú schopné zdržať alebo/a spomaliť vyprázdnenie žalúdka. Vynález sa tiež týka použitia antagonistov amylínu na urýchlenie vyprázdnenia žalúdka, napríklad pri liečbe hypomotility žalúdka a iných sprievodných porúch.

Doterajší stav techniky

Amylín je hormón na báze proteínu s 37 aminokyselinami. Bol izolovaný, vyčistený a charakterizovaný chemicky ako hlavná zložka škrobovitých usadenín v ostrovčekoch podžalúdkových žliaz diabetikov typu 2 (Cooper a kol., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 8628 - 8632 (1987)). Molekula amylínu má dve dôležité posttranslačné modifikácie: C-koniec je amidovaný a cysteíny v polohách 2 a 7 sú zosieťované tak, že tvoria N-terminálnu slučku. Sekvencia otvoreného čítacieho rámca ľudského amylínového génu vykazuje prítomnosť proteolytického štiepneho materiálu dvojsýtnej aminokyseliny Lys-Arg pred N-terminačným kodónom pre Lys a Gly pred proteolytiokým signálom Lys-Arg v terminálnej pozícii CLAIM, čo je typická sekvencia pre amidáciu enzýmom amidujúcim proteín, PAM (Cooper s kol., Biochem. Biophys. Acta, 1014, 247 - 258 (1989)). Amylín je predmetom GB patentovej prihlášky č. 8709871, podanej 27. apríla 1987, a zodpovedajúcich US patentových prihlášok podaných 27. apríla 1988, 23 novembra 1988 a 2. mája 1989.

U diabetikov typu 1 bol dokázaný nedostatok amylínu a bola navrhnutá jeho kombinovaná náhrada inzulínom ako výhodná liečba oproti inzulínu samotnému napríklad na obmedzenie hypoglykemických príhod. Použitie amylínu na liečbu diabetes mellitus je predmetom GB patentovej prihlášky č. 8720115, podanej 26. augusta G.J.S. Cooperom a podanej ako patentová prihláška č. 236 985 v Spojených štátoch 26. augusta 1988.

Farmaceutické prostriedky obsahujúce amylín plus inzulín sú opísané v US patente č. 5 124 314, vydanom 23. júna 1992.

Pôsobenie nadbytočného amylínu imituje kľúčové rysy diabetu typu 2 a blokáda amylínu bola navrhnutá ako nová terapeutická stratégia. V súvisiacej patentovej prihláške USA č. 275 475, podanej 23. novembra 1988, G. J. S. Cooperom a kol., sa opisuje, že amylín spôsobuje zníženie ako bazálnej tak inzulínom stimulovanej inkorporácie značenej glukózy do glykogénu v kostrovom svalstve. Bolo opísané, že tento účinok tiež spôsobuje CGRP (pozri tiež Leighton, B. a Cooper, G. J. S., Náture, 335, 632 - 635 (1988)). Amylín a CHRP boli približne rovnako účinné, vykazovali význačnú účinnosť pri 1 až 10 nm. 0 amylíne je tiež známe, že znižuje obsah glykogénu (Young a kol., Amer. J. Physiol., 259, 457 - 461 (1990)). Je opísaná liečba diabetu typu 2 a inzulínovej rezistencie antagonistami amylínu.

Bolo uvedené, že ako chemická štruktúra, tak génová sekvencia amylínu podporuje zistenie, že je to biologicky aktívna alebo mediátorová molekula. Chemická štruktúra je takmer na 50 % identická s peptidmi príbuznými génovo s kalcitonínom (CHRP), tiež s proteínmi s 37 aminokyselinami, ktoré sú rozšírenými neurotrasmitérmi s mnohými silnými biologickými účinkami vrátane vazodilatácie. Amylín a CGRP majú spoločný disulfidový mostík ^aCys-⁷Cys a C-terminálny amid, ktoré obidva sú podstatne dôležité pre plnú biologickú účinnosť (Cooper a kol., Proc. Natl. Acad. Sci., 85, 7763 - 7766 (1988)).

Amylín môže byť jedným členom skupiny príbuzných peptidov, ktorá zahrňuje CGRP, inzulín, rastové faktory príbuzné inzulínu, a ktoré majú spoločný genetický pôvod (Cooper, G. J. S. a kol., Prog. Growth Factor Research 1, 99 105 (1989)). Obidva peptidy kalcitonín a CGRP-1 majú spoločný pôvod v kalcitonínovom géne, kde alternatíve spracovanie primárneho transkriptu mRNA vedie k vytvoreniu dvoch rozdielnych peptidov, ktoré majú spoločnú iba obmedzenú sekvenčnú homológiu (asi 30 %) (Amara, S. G. a kol., Science, 229, 1094

- 1097 (1985)). Génová sekvencia amylínu je typická pre secernovaný mediátorový proteín, pričom MRNA kóduje prepropeptid s miestami pre produkciu secernovaného proteínu v Golgiho alebo sekrečných granuliach beta-buniek a môže mať spoločné proteolyticky pracujúce enzýmy, ktoré vytvárajú inzulín z proinzulínu.

Amylín sa primárne syntetizuje v pankreatických betabunkách a vylučuje sa ako odozva na stimuly živín, ako glukózy a arginínu. Štúdia s klonovanými líniami nádorových betabuniek (Moore a kol., Biochem. Biophys. Res. Commun., 179 (1) (1991)), izolovanými ostrovčekmi (Kanatsuka a kol., FEBS Lett., 259 (1), 199 - 201, (1989)) a perfundovanými pankreatmi krýs (Ogawa a kol., J. Clin. Invest., 85, 973 - 976, (1990)) ukázali, že krátke impulzy 10 až 20 minút nutričných stimulácií sekrécie, ako glukózy a arginínu, stimulujú uvoľňovanie amylínu ako aj inzulínu. Molárny pomer amylín/inzulín secernovaných proteínov sa pohybuje medzi prostriedkami asi od 0,01 do 0,4, ale javí sa, že sa príliš nemení s rôznymi stimulmi v ktoromkoľvek prostriedku. Avšak počas dlhšej stimulácie vyšším množstvom glukózy môže pomer amylín : inzulín progresívne narastať (Gedulin a kol., Biochem. Biophys. Res. Commun. 180 (1) 782 - 789, (1991). Možno preto, že expresia génu a rýchlosť translácie sú riadené nezávisle, amylín a inzulín nie sú vždy secernované konštantnou rýchlosťou.

Imunoreaktivita podobná amylínu sa zmerala v cirkulujúcej krvi hlodavcov a ľudí rôznymi rádioimunologickými testami, z ktorých všetky používajú králičie antiamylínové antisérum a väčšina z nich používa postup extrakcie a koncentrácie na zvýšenie citlivosti pokusu. U normálnych ľudí sa konštatovali pri hladovke amylínové hladiny od 1 do 10 pM a postprandiálne alebo postglukózové hladiny od 5 do 20 pM (napr. Harter a kol., Diabetológia, 34, 52 - 54, (1991), Sánke a kol., Diabetológia, 34, 129 - 132 (1991), Koda a kol., The Lancet, 339, 1179 - 1180 (1992)). U obéznych jedincov, rezistentných voči inzulínu môžu byť postprandiálne hladiny amylínu vyššie, dosahujúce až asi 50 pM. Pre porovnanie, hodnoty inzulínu pri hladovke a postprandiálneho inzulínu sú 20 až 50 pM a 100 až

300 pM u zdravých ľudí s hladinami možno 3 až 4-krát vyššími u ľudí rezistentných voči inzulínu. Pri inzulíne typu 1, kde sú beta-bunky zničené, sú hladiny amylínu na alebo pod hladinami detekcie a nestúpajú ako odozva na glukózu (Koda a kol., The Lancet, 339, 1179 - 1180, (1992)). Pre normálne myši a krysy boli opísané základné hladiny amylínu 30 až 100 pM, zatial čo u niektorých diabetických kmeňov hlodavcov, rezistentných voči inzulínu, sa namerali hodnoty až 600 pM (napr. Huang a kol., Hypertension, 19, I-101-I-109, (1992), Gill a kol., Life Sciences, 48, 703 - 710 (1991)).

Bolo objavené, že niektoré účinky amylínu sú podobné známym nemetabolickým účinkom CGRP a kalcitonínu. Metabolické účinky amylínu objavené počas skúmania tohto novo identifikovaného proteínu zrejme odrážajú jeho primárnu biologickú úlohu. Aspoň niektoré z týchto účinkov sú imitované CGRP, i keď v dávkach, ktoré sú zreteľne vazodilatačné (pozri napr. Leighton a kol., Náture, 335, 612 - 635 (1988), Molina a kol., Diabetes, 39, 260 - 265, (1990)).

Prvým objaveným účinkom amylínu bolo zníženie inzulínom stimulovanej inkorporácie glukózy do glykogénu v kostrovom svale krysy (Leighton a kol., Náture, 335, 632 - 635, (1988)). Sval sa stal rezistentným voči inzulínu. Ďalšie práce s musculus soleus krysy ex vivo a in vitro ukázali, že amylín znižuje aktivitu glykogén-syntázy, urýchľuje konverziu fosforylázy glykogénu z inaktívnej formy b na aktívnu formu a, urýchľuje čistú stratu glykogénu (v prítomnosti alebo neprítomnosti inzulínu), zvyšuje hladiny glukóza-6-fosfátu a môže zvýšiť produkciu laktátu (pozri napr. Deems a kol., Biochem Biophys. Res. Commun., 181 (1), 116 - 120, (1991), Young a kol., FEBS Letts. 281 (1,2), 149 - 151 (1991)). Či amylín zasahuje do transportu glukózy sám o sebe, nie je isté (pozri napr. Young a kol., Am. J. Physiol., 259, E457 - E461, (1990), Zierath a kol., Diabetológia, 35, 26 - 31, (1992)). Štúdia vzťahov odozvy na dávku amylínu a inzulínu ukazujú, že amylín pôsobí ako nekonkurenčný funkčný antagonista inzulínu v kostrovom svalstve (Young a kol., Am. J. Physiol., 263 (2), E274 - E281, (1992)). Nie je žiadny dôkaz o tom, že by amylín nepriaznivo ovplyvňoval väzbu inzulínu na jeho receptory alebo nasledujúcu aktiváciu receptora inzulínu tyrozínkinázu (Follett a kol., Clinical Research 39 (1), 39A, (1991), Koopmans a kol., Diabetológia, 34, 218 - 224, (1991)). Účinky amylínu na kostrové svalstvo sa podobajú týmto účinkom adrenalínu (epinefrin). Avšak, zatiaľ čo sa má za to, že účinky adrenalínu sú sprostredkované do značnej miery cAMP, niektorí pracovníci prišli k záveru, že účinky amylínu nie sú sprostredkované pomocou cAMP (pozri Deems a kol., Biochem. Biophys. Res. Commun. 181 (1), 116 - 120, (1991)), pričom ďalší pracovníci uvádzajú, že amylín aktivuje adenylcyklázu a zvyšuje obsah cAMP v kostrovom svalstve (Moore a Rink, Diabetes 42, 5,821 jún (1993)) v súlade s uskutočnením jeho účinkov na metabolizmus glykogénu cestou fosforylácie syntázy a fosforylázy pomocou CAMP dependentnej proteín kinázy.

Má sa za to, že amylín účinkuje prostredníctvom receptorov prítomných v membránach plazmy. Bolo opísané, že amylín pôsobí v kostrovom svalstve pomocou receptorom sprostredkovaného mechanizmu, ktorý podporuje glykogenolýzu aktiváciou enzýmu limitujúceho rýchlosť pre degradáciu glykogénu, fosforylázy a (Young, A. a kol., FEBS Letts, 281, 149 - 151, (1991)). Štúdia amylínu a CGRP a účinku antagonistu ³⁷CGRP naznačujú, že amylín pôsobí prostredníctvom svojho vlastného receptora (Wang a kol. FEBS Letts, 219, 195 - 198, (1991 b)), čo je v rozpore so záverom ostatných pracovníkov, že amylín môže pôsobiť v prvom rade na receptoroch CGRP (napr. Chatry a kol., Biochem. J., 277, 139 - 143, (1991), Galeazza a kol., Peptides, 12, 585 - 591, (1991), Zhu a kol., Biochem. Biophys. Res. Commun., 177 (2), 771 - 776, (1991)). Nedávno boli opísané receptory amylínu a ich použitie pri rôznych metódach skríningu a analýzy zlúčenín agonistov amylínu v medzinárodnej prihláške č. PCT/US/02125, zverejnenej 1. októbra 1992 s názvom Skríningové metódy pre agonistov a antagonistov amylínu na báze receptorov”.

Zatiaľ čo amylín má výrazné účinky na metabolickú činnosť pečene, neexistuje všeobecný súhlasný názor na to, aké účinky amylínu sú zjavné v izolovaných hepatocytoch alebo perfundova6 nej pečeni. Dostupné údaje nepodporujú myšlienku, že amylín zvyšuje hepatickú glukogenolýzu, t.j. nepôsobí ako glukagón (nap. Stephens a kol., Diabetes, 40, 395 - 400, (1991), GomezFoix a kol., Biochem. J., 276, 607 - 610, (1991)). Bol vyslovený názor, že amylín môže pôsobiť na pečeň tak, že sa vyvolá konverzia laktátu na glykogén a zvýši sa množstvo glukózy, ktorá sa môže uvoľniť glukagónom (pozri Roden a kol., Diabetológia, 35, 116 - 120, (1992)). Amylín môže teda pôsobiť ako anabolický partner inzulínu v pečeni na rozdiel od jeho katabolického pôsobenia vo svale.

Vplyv amylínu na regionálne hemodynamické účinky vrátane renálneho krvného prietoku u krýs, ktoré sú pri vedomí, pred nedávnom opísal (Cardinger a kol., Diabetes, 40, 948 - 951, (1991)). Autori uviedli, že infúzia amylínu krýs bola spojená s väčšou renálnou vazodilatáciou a menšou mezenterickou vazokonstrikciou než aká sa pozoruje pri infúzii ludského alfa-CGRP. Došli k záveru, že vyvolaním renálnej hyperémie vo väčšom rozsahu, než spôsobil alfa-CGRP, by mohol amylín krýs spôsobiť menej zreteľnú stimuláciu systému renín-angiotenzín a teda menej sekundárnu angiotenzínom II sprostredkovanú vazokonstrikciu. Bolo však tiež poznamenané, že v priebehu spoločnej infúzie ľudského alfa-^s-3'⁷CGRP a amylínu krýs boli zistené renálne a mezenterické vazokonstrikcie, pravdepodobne vzhľadom k vazodilatačným účinkom angiotenzínu II, ktoré neboli potláčané, a že toto zistenie sa podobá tomu, ktoré sa pozorovalo počas spoločnej infúzie ľudského A-CGRP a ľudského alfa-^e”^3VCGRP (pozri vyššie 951).

V tukových bunkách nemá amylín na rozdiel od svojho účinku na spôsob adrenalínu vo svale žiadne detegovateľné účinky na inzulínom stimulovaný príjem glukózy, inkorporáciu glukózy do triglyceridu, tvorbu oxidu uhličitého (Cooper a kol., Proc. Natl. Acad. Sci., 85, 7763 - 7766, (1988)), epinefrínom stimulovanú lipolýzu alebo inzulínom potlačenú lipolýzu (Lupien, J. R. a Young, A. A., Diabetes Nutrition and Metabolism - Clinical and Experimental, zv. 6 (1), str. 13 - 18, (február 1993)). Amylín teda uplatňuje špecifické účinky na tkanivo s priamym pôsobením na kostrové svalstvo, výraznými nepriamymi (spôsob dodania substrátu) a možno aj priamymi účinkami na pečeň, zatiaľ čo adipocyty sa javia slepé voči prítomnosti alebo neprítomnosti amylínu. Neboli opísané žiadne priame účinky amylínu na tkanivo obličiek.

mať výrazné účinky na izolovanými ostrovčekmi Commun., 160 (2), 961 Bolo opísané, že amylín môže sekréciu inzulínu. Niektoré pokusy s (Ohsawa a kol., Biochem. Biophys. Res.

967, (1989)), s perfundovaným pankreasom (Silvestre a kol., Reg. Pept. 31 - 23 - 31 (1990)) a s inaktívnou krysou (Young a kol., Mol. Celí. Endocrinol., 84, R1 - R5, (1992)) naznačujú, že amylín znižuje sekréciu inzulínu. Pokusy s perfundovaným pankreasom poukazujú na selektívne zníženie sekrečnej odozvy na glukózu bez ovplyvnenia odpovede na arginín. Iní pracovníci však nezistili účinky amylínu na izolované beta bunky, izolované ostrovčeky alebo celé zviera (pozri Broderick a kol., Biochem. Biophys. Res. Commun., 177, 932 - 938, (1991) a tu uvedené odkazy).

Najvýraznejším účinkom amylínu in vivo je stimulácia prudkého zvýšenia laktátu v plazme, nasledovaného zvýšením glukózy v plazme (Young a kol., FEBS Letts. 281 (1,2), 149 151, (1991)). Dôkazy naznačujú, že zvýšený obsah laktátu tvorí substrát pre tvorbu glukózy a že k účinkom amylínu môže dochádzať nezávisle na zmenách inzulínu alebo glukagónu. Pri pokusoch s glukózovým zovretím infúzie amylínu spôsobujú rezistenciu inzulínu ako znížením periférneho uloženia glukózy, tak tiež obmedzením inzulínom sprostredkovanej tvorby hepatickej glukózy (napr. Frontoni a kol., Diabetes, 40, 568 - 573, (1991), Koopmas a kol., Diabetológia, 34, 218 - 224, (1991)).

U ľahko anestézovaných krýs, ktoré sa nechali hladovať 18 hodín, aby sa spotrebovali ich zásoby hepatického glykogénu, injekcie amylínu stimulovali zvýšenie obsahu laktátu v plazme asi od 0,5 do 1,5 mM, nasledované dlhotrvajúcim zvýšením hladín glukózy v plazme asi od 6 do 11 mM. Tieto účinky sa pozorovali ako pri intravenóznych tak i pri subkutánnych injekciách (Young a kol., FEBS Letts., 281 (1,2), 149 - 151, (1991)). Účinky amylínu pri kŕmených zvieratách sa líšia kvantitatívne od jeho účinkov pri zvieratách podrobených hladovke. Pri kŕmených krysách s predpokladane normálnymi zásobami glykogénu v pečeni spôsobuje amylín výraznejšie a dlhšie pretrvávajúce zvýšenie obsahu laktátu v plazme, je tu však len mierne zvýšenie obsahu glukózy v plazme. Bol vyslovený predpoklad, že amylín podporuje spätný oblúk Coriho cyklu, t.j. prívod glukózy do svalu a tvorbu svalového glykogénu. Inzulín a amylín sa môžu teda pokladať za partnerov pri riadení nepriamej cesty doplnenia postprandiálneho hepatického glykogénu. Inzulínová rezistencia vo svalstve a v pečeni sa môže amylínom normálne, fyziologicky regulovať.

Nemetabolické účinky amylínu zahrňujú vazodilatačné pôsobenia, ktoré môžu byť sprostredkované interakciou s vaskulárnymi receptormi CGRP. Publikované testy in vivo naznačujú, že amylín je najmenej asi 100 až 1000-krát účinnejší ako CGRP ako vazodilatačné činidlo (Brain a kol., Eur. J. Pharmacol., 183, 2221, (1990), Wang a kol., FEBS Letts., 291, 195 - 198, (1991)). Ako bolo publikované, potláča amylín pri injekčnej aplikácii do mozgu príjem potravy (napr. Chance a kol., Brain Res., 939, 352 - 354, (1991)), čo je účinok spoločný s CGRP a kalcitonínom. Účinné koncentrácie v bunkách, ktoré sprostredkovávajú tento účinok, nie sú známe. Bolo referované, že amylín má účinky ako na izolované osteoklasty, kde spôsobuje stav kľudu buniek, tak in vivo, kde, ako bolo opísané, znižuje obsah vápnika až na 20 % u krýs, u králikov a u ľudí s Pagetovou chorobou (pozri Gilbey a kol., J. Bone Minerál Res., S293, (1991)). Z dostupných údajov vyplýva, že by amylín mohol byť pre tieto účely 10 až 30-krát menej účinný ako ľudský kalcitonín. Zaujímavé bolo konštatovanie, že amylín, ako sa zdá, zvyšuje tvorbu CAMP osteoklastov, ale nezvyšuje cytosolický Ca²*, zatiaľ čo kalcitonín zvyšuje oboje (Alam a kol., Biochem. Biophys. Res. Commun., 197 (1), 134 - 139, (1991)). Bol vyslovený názor, ktorý ale nebol dokázaný, že kalcitonín môže pôsobiť prostredníctvom dvoch receptorov a že amylín môže spolupôsobiť s jedným z nich.

Infúzia antagonistov receptora amylínu sa môže použiť na zmenu glukoregulácie. ^3-3-7 CGRP je dokázaným blokátorom amylínu in vitro a in vivo (Wyng a kol., Biochem. Biophys. Res. Commun., 181 (3), 1288 - 1293, (1991)) a zistilo sa, že mení glukoreguláciu po infúzii arginínu u kŕmených krýs (Young a kol., Mol. Celí Endocrinol., 84, R1-R5, (1992)). Počiatočné zvýšenie koncentrácie glukózy sa pripisuje vylučovaniu glukagónu z alfa buniek ostrovčekov, stimulovanému arginínom. Nasledujúca reštaurácia bazálnej glukózy sa pripisuje pôsobeniu inzulínu spolu so zmenami v ostatných glukoregulačných hormónoch. Keď je pôsobenie amylínu blokované predchádzajúcou infúziou ^e-37hCGRP, nie je počiatočné zvýšenie glukózy významne rozdielne, ale nasleduje zníženie koncentrácie glukózy významne pod základnú hladinu, ktorá sa obnoví až asi po 80 minútach. Glukoregulácia nasledujúca po tomto teste so sekretalógom ostrovčekov bola obmenená infúziou antagonistov receptora amylínu. Dodatočne sa zmerali koncentrácie v polhodinových intervaloch a zistilo sa, že koncentrácia inzulínu 30 minút po infúzii arginínu bola takmer dvakrát tak vysoká u zvierat, ktorým sa aplikoval infúziou antagonista receptora amylínu ako u normálnych kontrolných zvierat. ^3-3-7 CGRP je tiež účinný antagonista CGRP. Veľmi podobné výsledky sa však pozorovali pri inom antagoniste amylínu AV66, ktorý je selektívny pre receptory amylínu v porovnaní s receptormi CGRP (Young a kol., Mol. Celí. Endocrinol., 84, R1 - R5, (1992)). 0 týchto výsledkoch sa uvádza, že potvrdzujú záver, že blokáda pôsobenia amylínu môže mať dôležité priaznivé liečebné účinky na diabetes typu 2.

U pacientov s diabetom typu 1 sa okrem nedostatku inzulínu uvádza zreteľný nedostatok amylínu. Ako je uvedené vyššie, namerané hodnoty ukazujú, že pri diabetes typu 1 expresia a sekrécia amylínu pankreatickými beta-bunkami chýba alebo je značne pod normálom. Pri rade modelov zvierat s diabetom typu 1 je sekrécia amylínu a expresia génu znížená (Cooper a kol., Diabetes, 497 - 500, (1991), Ogawa a kol., J. Clin. Invest., 85, 973 - 976, (1990)). Meranie amylínu v plazme pacientov s diabetom typu 1 ukazujú, že amylín chýba u týchto pacientov po hladovaní cez noc a že podanie glukózy nevyvoláva zvýšenie

The Lancet, 339, 1179 - 1180, hladín amylínu (Koada a kol., (1992)).

Bolo tiež objavené, prekvapujúco vzhľadom k jeho prv opísaným renálnym vazodilatačným a iným vlastnostiam, že amylín zreteľne zvyšuje aktivitu renínu plazmy u intaktných krýs pri subkutánnej aplikácii spôsobom zamedzujúcim poruchám krvného tlaku. To je dôležité, pretože nižší krvný tlak je silným stimulom pre uvoľnenie renínu. Antagonisti amylínu, ako antagonisti receptora amylínu, vrátane tých, ktoré sú selektívne pre receptory amylínu v porovnaní s receptormi CGRP alebo/a kalcitonínu, sa môžu použiť na blokovanie amylínom vyvolaného zvýšenia aktivity renínu plazmy. Tieto neočakávané nálezy podporujú zistenie, že antagonisti amylínu znížia aktivitu renínu v plazme s následným priaznivým terapeutickým účinkom pri hypertenzii a kardiálnom zlyhaní a iných poruchách súvisiacich so zvýšenou, neprimeranou alebo nežiadúcou aktivitou renínu. Okrem toho ďalšia schopnosť antagonistov amylínu priaznivo modulovať rezistenciu inzulínu a iných zvyčajných metabolických porúch často spojených s hypertenziou a kardiálnym ochorením poskytuje zvlášť žiadúci terapeutický profil.

Žalúdočná hypomotilita s oneskoreným vyprázdňovaním kvapalného alebo tuhého obsahu je súčasťou radu gastrointestinálnych porúch, pozri Goodman a Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, kapitola 38 (Pergamon Press, 8. vydanie 1990). Symptómy týchto porúch môžu zahrňovať nauzeu, zvracanie, pálenie záhy, postprandiálnu nevoľnosť a bolenie žalúdka. Často je zjavný gastroezofágový reflux, ktorý môže viesť k ezofágovej ulcerácii. Tiež sa môžu vyskytovať respiračné symptómy alebo intenzívna substernálna bolesť, ktorá sa môže zamieňať s astmou alebo infarktom myokardu. I keď u väčšiny pacientov je príčina neznáma, stázy alebo hypomotilita žalúdka je často dôsledkom diabetickej neuropatie. Tento stav je často prítomný u pacientov s anorexia nervosa alebo achlohydria alebo po operácii žalúdka. Pozri vyššie na strane 928.

Liečba pacientov so žalúdočnou hypomotilitou zvyčajne zahrňuje aplikáciu prokinetického prostriedku. I keď antiemetic11 ké fenotiazíny alebo bethanechol môžu poskytovať určitú úľavu, tieto lieky neurýchľujú vyprázdňovanie žalúdka pri veľkej väčšine pacientov a často majú neprijateľné vedľajšie účinky. V súčasnom období prokinetické prostriedky, ktoré sú k dispozícii, zahrňujú metoklopramid a cisaprid, avšak iné (napr. domperidon sa vyhodnocujú. Pozri vyššie.

Metoklopramid znižuje receptívnu relaxáciu v hornej časti žalúdka a zvyšuje antrálne kontrakcie. Pylorus a duodenum sú relaxované, zatiaľ čo tonus spodného ezofágového sfinktera je zvýšený. Tieto účinky sa spájajú a urýchľujú tak vyprázdňovanie obsahu žalúdka a znižujú reflux z duodena a žalúdka do ezofágu. Okrem toho je znížená doba prechodu materiálu z duodena do ileocekálnej chlopne ako výsledok jejunálnej peristaltiky. Metoklopramid má malý účinok na sekréciu žalúdka alebo motilitu čriev. Pozri vyššie na strane 928.

Vo všeobecnosti vytvárajú dopamínergickí antagonisti obrátený obraz účinkov a tieto sú sprostredkované receptormi D₂, ktoré sú umiestnené aspoň sčasti vo vnútri gastrointestinálneho traktu. Pozri vyššie.

Mechanizmus pôsobenia metoklopramidu je málo známy, i keď je to jasne dopamínergický antagonista a môže blokovať gastrointestinálne účinky spôsobené lokálnym alebo systémovým podávaním dopamínergických antagonistov. I keď sa vagotómiou neodstránia účinky metoklopramidu, jeho prokinetické účinky môžu byť blokované atropínom alebo muskarínovými antagonistami. Okrem toho nie všetkými dopamínergickými antagonistami sa dosiahne urýchlenie vyprázdnenia žalúdka. Predpokladá sa, že tento liek urýchľuje uvoľňovanie acetylcholínu z myenterických neurónov, i keď priamy dôkaz pre toto pôsobenie chýba. Pretože bethanechol môže zvyšovať účinky metoklopramidu, môže byť prítomný tiež sklon ku zvýšenej odozve na acetylcholín. Pozri vyššie na stranách 928 - 929.

Domperidon je derivát benzimidazolu, ktorý má ako prokinetické, tak aniemetické vlastnosti. Je to dopamínenergický antagonista a vytvára zreteľnú hyperprolaktinémiu. Jeho účinky na gastrointenstinálnu motilitu sa tiež veľmi podobajú účinkom metoklopramidu. Avšak na rozdiel od metoklopramidu nie sú tieto účinky antagonizované atropínom. Vysvetlenie pre tento rozdiel nebolo doteraz podané. Domperidon prekračuje len v obmedzenom rozsahu vedľajšie účinky. V dôsledku toho nezasahuje rušivo do liečby Parkinsonovej choroby a môže pôsobiť užitočne proti gastrointestinálnym poruchám spôsobeným levodopmi a brómkriptínom. Pri súčasnom stave sa javí, že tento liek ná rovnakú terapeutickú využiteľnosť ako metoklopramid pri liečbe pacientov trpiacich hypomotilitou žalúdka. Má však menší antiemetický účinok. Pozri vyššie na strane 929. Javí sa, že domperidon sa rýchle absorbuje po orálnej aplikácii, ale jeho biologická dostupnosť je len asi 15 %. Väčšina liekov a jeho metabolitov sa vylučuje stolicou. Polčas pre jeho odstránenie z plazmy je asi 7 až 8 hodín. Pozri vyššie. Domperidon nie je všeobecne dostupný v Spojených štátoch. Inde je prístupný pod názvom MOTILIUM. Optimálne dávkovanie nebolo stanovené, ale pri liečbe hypomotility žalúdka sa použili denné dávky 40 až 120 mg. Pozri vyššie na strane 929.

Cisaprid je benzamid a jeho účinky na motilitu žalúdka a tenkého čreva sa celkom podobajú účinkom metoklopramidu a domperidonu, avšak na rozdiel od týchto liekov zvyšuje tiež motilitu čriev a môže spôsobiť hnačku. Mechanizmus jeho gastrointestinálnych účinkov je málo jasný. Ako pri metoklopramide sú tieto účinky blokované atropínom a môžu zahrňovať uvoľnenie myenterického acetylcholínu. Javí sa, že cispramid nemá dopamínenergickú blokovaciu účinnosť a neovplyvňuje koncentráciu prolaktínu v plazme alebo nespôsobuje extrapyramidálne symptómy. Liek sa viaže na a blokuje tryptamínergické receptory 5—HT_a v ileu krysy, ale vzťah medzi týmto pôsobením a jeho účinkami u človeka sa nezistil. Pozri vyššie. Nateraz sa javí účinnosť tohto lieku pri liečbe porúch hypomotility žalúdka rovnaká ako účinnosť metoklopramidu a domperidonu bez vedľajších účinkov, ktoré sú výsledkom dopamínegrickej blokády. Okrem toho môže byť cispramid užitočný pri liečbe pacientov s chronickou idiopatickou zápchou alebo s hypotitolitou čriev v dôsledku poranenia miechy. Pozri vyššie na strane 929.

Na rozdiel od vyššie uvedeného našli v liečbe svoje miesto tiež prostriedky, ktoré slúžia na oddialenie vyprázdnenia žalúdka, predovšetkým ako diagnostické pomocné prostriedky pri gastrointestinálnych rôntgenových vyšetreniach. Napríklad glukagón je polypeptidový hormón, ktorý vytvárajú alfa-bunky Langerhansových pankreatických ostrovčekov. Je to hyperglykemický prostriedok, ktorý mobilizuje glukózu aktiváciou hepatickej glykogenolýzy. Môže v menšej miere stimulovať sekréciu pankreatického inzulínu. Glukagón sa aplikuje vo forme hydrochloridu glukagónu. Dávky sa zvyčajne vyjadrujú ako glukagón.

Glukagón sa používa pri liečbe inzulínom vyvolanej hypoglykémie, keď intravenózna aplikácia glukózy nie je možná. Podáva sa subkutánnou, intramuskulárnou alebo intravenóznou injekciou v dávke 0,5 až 1 mg (jednotka), opakovanej prípadne po 20 minútach. Avšak, pretože glukagón znižuje motilitu gastrointestinálneho traktu, používa sa ako diagnostický pomocný prostriedok pri gastrointestinálnom rôntgenovom vyšetrení. Dávka 1 až 2 mg (jednotky) aplikovaná intramuskulárne má začiatok účinku 4 až 14 minút a trvanie účinku 10 až 40 minút. 0,2 až 2 mg (jednotky), podané intravenózne, poskytujú účinok v priebehu jednej minúty, ktorý trvá 9 až 25 minút.

Glukagón sa používal v rôznych štúdiách na liečbu rôznych bolestivých gastrointestinálnach porúch spojených so spazmom. Daniel a kol., (Br. Med. J., 3, 720, (1974)) referoval o rýchlejšej symtomatickej úľave pri akútnej divertikulitíde u pacientov liečených glukagónom v porovnaní s pacientami, ktorí boli liečení analgetikami alebo antispazmatikami. Glauser a kol. (J. Am. Coll. Emergency Physns. 8, 228, (1979)) referoval o úľave pri akútnej ezofágovej obštrukcii potravy po liečbe glukagónom. Podľa inej štúdie glukagón významne odstránil bolesť a citlivosť u 21 pacientov s ochorením žlčových ciest v porovnaní s 22 pacientami, ktorým sa podalo placebo (M. J. Stower a kol., Br. J. Surg. 69, 591 - 592, (1982)). Franken a kol. však (Radiology, 146, 687, (1983)) neboli schopní preukázať žiadnu výhodu glukagónu voči placebu pri hydrostatickom znížení ileokolickej intussuscepcie v štúdii s 30 deťmi a Webb a kol. (Med. J. Aust. 144, 124, (1986)) došli k záveru, že glukagón bol neúčinný pri zvládaní kolitídy močovodu.

Podstata vynálezu

Teraz sa zistilo, s prekvapením vzhľadom k jeho prv opísaným hyperglykemickým vlastnostiam, že amylín a agonisti amylínu vrátane tých, ktoré tu boli opísané, napríklad analóg agonistu amylínu ' · Pro-h-amylín (uvádzaný tiež ako AC-0137), sú schopné znížiť žalúdočnú motilitu a spomaliť vyprázdňovanie žalúdka, ako je preukázané schopnosťou takýchto zlúčenín znížiť postprandiálne hladiny glukózy v plazme.

Predmetom vynálezu je použitie amylínu, agonistov amylínu na prípravu liečiv určených na priaznivú reguláciu gastrointestinálnej motility . Jedná sa o prípravu liečiv na báze amylínu alebo agonistu amylínu, napríklad analógu agonistu amylínu AC-0137 ktoré sú užitočné napríklad pri liečbe postprandiálne j hyperglykémie, t.j. komplikácie v spojitosti s diabetes mellitus typu 2 (nezávislom na inzulíne).

Pod výrazom amylín sa rozumejú zlúčeniny ako sú tie, ktoré definovali Cooper a Young v US patente č. 5 234 906, vydanom 10. augusta 1993 na Hyperglykemické zlúčeniny. Zahrňuje napríklad ľudský peptidový hormón a jeho druhové variácie označované ako amylín a vylučované z beta-buniek pankreasu. Agonisti amylínu je taktiež výraz známy v odbore a týka sa zlúčenín, ktoré napodobňujú účinky amylínu. Samotný amylín a analógy agonistov amylínu sa teda môžu označovať v širokom zmysle slova tiež ako agonisti amylínu. Výraz analóg agonistu amylínu je treba chápať tak, že sa týka derivátov amylínu, ktoré majú účinok ako agonisti amylínu na základe toho, že sa, ako sa v súčasnom období predpokladá, viažu na alebo inak priamo alebo nepriamo spolupôsobia s receptorom amylínu alebo s iným receptorom alebo receptormi, s ktorými môže spolupôsobiť sám amylín, aby sa dosiahli vyššie uvedené biologické vlastnosti. Okrem tých, ktoré sú tu opísané, sú inak užitočné analógy agonistov amylínu identifikované v medzinárodnej prihláške WPI Acc, č. 93-182488/22 s názvom Nové peptidy agonistov amylínu na liečbu a prevenciu hypoglykémie a diabetes mellitus”.

Hlavným význakom vynálezu je spôsob priaznivej regulácie gastrointestinálnej motility u pacienta tým, že sa tomuto pacientovi aplikuje terapeuticky účinné množstvo amylínu alebo agonistu amylínu, s výhodou analógu agonistu amylínu. Podľa jedného význaku sa spôsoby podľa vynálezu týkajú zníženia motility žalúdka. Podľa iného význaku sa vynález týka spôsobov oddialenia vyprázdnenia žalúdka.

Tieto spôsoby sa môžu aplikovat na pacienta, ktorý sa podrobí gastrointestinálnemu diagnostickému vyšetreniu, napríklad rôntgenovému vyšetreniu alebo zobrazeniu magnetickou rezonanciou. Tieto spôsoby sa môžu tiež použiť na zníženie motility žalúdka u pacienta trpiaceho gastrointestinálnou poruchou, napríklad spazmom (ktorý môže byť spojený s akútnou divertikulitídou, poruchou žlčových ciest alebo poruchou sfinktera Oddi).

Podľa iného význaku sa vynález týka spôsobu liečby postprandiálneho dumping syndrómu u pacienta tým, že sa pacientovi aplikuje terapeuticky účinné množstvo agonistu amylínu.

Podľa ešte iného význaku sa vynález týka spôsobu liečby postprandiálnej hyperglykémie tým, že sa pacientovi aplikuje terapeuticky účinné množstvo agonistu amylínu. Postprandiálna hyperglykémia je zrejme dôsledok diabetes mellitus typu 2.

K výhodným agonistom amylínu patrí ^as,2e'²⁹Pro-h-amylí_n. K výhodným analógom agonistu amylínu patrí tiež ^2S'^2S·^a9Pro-h-amylín.

Podľa iného význaku sa vynález týka spôsobu liečby žalúdočnej hypomotility u pacienta tým, že sa pacientovi aplikuje terapeuticky účinné množstvo antagonistu amylínu. Vo výhodných uskutočneniach sa môžu tieto spôsoby použiť tam, kde je hypomotilita dôsledkom diabetickej neuropatie alebo tam, kde je hypomotilita dôsledkom anorexia nervosa. Hypomotilita môže byť tiež dôsledkom achlorhydrie alebo dôsledkom operácie žalúdka.

Podľa iného význaku sa vynález týka spôsobu urýchlenia vyprázdňovania žalúdka u pacienta tým, že sa pacientovi aplikuje terapeuticky účinné množstvo antagonistu amylínu. Antagonistom amylínu sa rozumie zlúčenina, ktorá ruší účinky • amylínu, napríklad zlúčenina, ktorá samotná nemá významnú farmakologickú účinnosť, ale vyvoláva účinky inhibíciou • pôsobenia špecifického agonistu, napr. konkurenciou o väzbové miesta agonistu. Antagonistom amylínu, používaným pri týchto spôsoboch, je s výhodou antagonista receptora amylínu. Výhodným antagonistom je acetyl-^i:L'^ieArg,^3oAsn,³²Tyr^9_3a- kalcitonín (lososí).

Podľa iného význaku sa vynález týka spôsobu liečby požitia toxínu tým, že sa aplikuje množstvo amylínu alebo agonistu amylínu, ktoré je účinné na zamedzenie alebo obmedzenie priechodu obsahu žalúdka do čriev, a obsah žalúdka sa odsaje.

Priložené výkresy slúžia na objasnenie vynálezu.

Obr. 1 znázorňuje účinok amylínu na hladinu glukózy v plazme u psov po orálnej dávke glukózy v porovnaní s kontrolou. Na osi x sú vynesené minúty po orálnej glukóze, na osi y mM glukózy v plazme.

Obr. 2 znázorňuje postprandiálne hladiny glukózy ľudských • klinických dobrovoľníkov, ktorým sa aplikovalo placebo alebo jednorázovo intravenózne 30 pq AC-0137. Na osi x je vynesený čas v minútach a na osi y množstvo glukózy v plazme v mg/dl.

V čase medzi 30 a 60 minútami sa dobrovoľníkom podalo jedlo.

V diagrame vynesená krivka plnou čiarou sa týka placeba, zatiaľ čo prerušovanou čiarou vynesená krivka sa týka podania AC-0137. Hodnoty použité v diagrame sú stredné hodnoty ± štatistická odchýlka.

Obr. 3 predstavuje postprandiálne hladiny glukózy ľudských klinických dobrovoľníkov, ktorým sa aplikovalo placebo alebo jednorázovo intravenózne 100 Mg AC-0137. Na osi x je vynesený čas v minútach a na osi y množstvo glukózy v plazme v mg/dl. V čase medzi 30 a 60 minútami sa dobrovoľníkom podalo jedlo. V diagrame plnou čiarou vynesená krivka sa týka placeba, zatiaľ čo prerušovanou čiarou vynesená krivka sa týka aplikácie AC-0137. Hodnoty použité v diagrame sú stredné hodnoty ± štatistická odchýlka.

Obr. 4 znázorňuje postprandiálne hladiny glukózy ľudských klinických dobrovoľníkov, ktorým sa aplikovalo placebo alebo jednorázovo intravenózne 300 gg AC-0137. Na osi x je vynesený čas v minútach a na osi y množstvo glukózy v plazme v mg/dl.

V čase medzi 30 a 60 minútami sa dobrovoľníkom podalo jedlo.

V diagrame plnou čiarou vynesená krivka sa týka placeba, zatiaľ čo prerušovanou čiarou vynesená krivka sa týka aplikácie AC-0137. Hodnoty použité v diagrame sú stredné hodnoty ± štatistická odchýlka.

Obr. 5 predstavuje postprandiálne hladiny glukózy ľudských klinických dobrovoľníkov, ktorým sa aplikovalo placebo alebo ktorí dostali dvojhodinovú intravenóznu infúziu AC-0137 rýchlosťou 15 gg za hodinu. Na osi x diagramu je vynesený čas v minútach a na osi y množstvo glukózy v plazme v mg/dl. V čase medzi 30 a 60 minútami sa dobrovoľníkom podalo jedlo. V diagrame plnou čiarou vynesená krivka sa týka placeba, zatiaľ čo prerušovanou čiarou vynesená krivka sa týka AC-0137. V diagrame použité hodnoty sú stredné hodnoty ± štatistická odchýlka.

Obr. 6 predstavuje postprandiálne hladiny glukózy ľudských klinických dobrovoľníkov, ktorým sa podalo placebo alebo ktorí dostali dvojhodinovú intravenóznu infúziu AC-0137 rýchlosťou 50 gg za hodinu. Na osi x diagramu je vynesený čas v minútach a na osi y množstvo glukózy v plazme v mg/dl. V čase medzi 30 a 60 minútami sa dobrovoľníkom podalo jedlo.

V diagrame plnou čiarou vynesená krivka sa týka placeba, zatiaľ čo prerušovanou čiarou vynesená krivka sa týka

AC-0137. V diagrame použité hodnoty sú stredné hodnoty ± štatistická odchýlka.

Obr. 7 znázorňuje postprandiálne hladiny glukózy ľudských klinických dobrovoľníkov, ktorým sa podalo placebo alebo ktorým sa aplikovala dvojhodinová intravenózna infúzia AC-0137 rýchlosťou 150 pq za hodinu. Na osi x diagramu je vynesený čas v minútach a na osi y množstvo glukózy v plazme v mg/dl. V čase medzi 30 a 60 minútami sa dobrovoľníkom podalo jedlo. V diagrame plnou čiarou vynesená krivka sa týka placeba, zatiaľ čo prerušovanou čiarou vynesená krivka sa týka AC-0137. V diagrame použité hodnoty sú stredné hodnoty ± štatistická odchýlka.

Obr. 8a až 8b ukazujú koncentrácie glukózy v plazme v mg/dl, triproamylínu v plazme a pM a volného inzulínu v plazme v μϋ/ml 60 minút pred zahájením intravenóznej infúzie 25 gg/hodina triproamylínu. Pokrm Sustacal^R sa podal 60 minút po zahájení infúzie triproamylínu.

V diagramoch na osi x je vynesený čas v minútach a na osi y koncentrácia glukózy v plazme v mg/dl (obr. 8a) a koncetrácia triproamylínu v plazme v pM (obr. 8b). V diagramoch použité hodnoty sú stredné hodnoty ± štatistická odchýlka.

Obr. 9a až 9c ukazujú koncentrácie glukózy v plazme v mg/dl, triproamylínu v plazme v pM a voľného inzulínu v plazme v μϋ/ml 60 minút pred zahájením intravenóznej infúzie 50 μg/hodina triproamylínu. Pokrm Sustacal^R sa podal 60 minút po zahájení infúzie triproamylínu.

V diagramoch je na osi x vynesený čas v minútach a na osi y koncentrácia glukózy v plazme v mg/dl (obr. 9a), triproamylínu v plazme v pM (obr. 9b) a voľného inzulínu v plazme v μϋ/ml (obr. 9c). V diagramoch použité hodnoty sú stredné hodnoty ± štatistická odchýlka.

Obr. 10a až 10c ukazujú koncentrácie glukózy v plazme v mg/dl, triproamylínu v plazme v pM a volného inzulínu v plazme v μϋ/ml 60 minút pred zahájením intravenóznej infúzie 50 gg/hodina triproamylínu. 60 minút pred zahájením infúzie triproamylínu sa aplikovala intravenózna dávka 300 mg/kg glukózy.

V diagramoch je na osi x vynesený čas v minútach a na osi y koncentrácia glukózy v plazme v mg/dl (obr. 10a), triproamylínu v plazme v pM (obr. 10b) a voľného inzulínu v plazme v μϋ/ml (obr. 10c). V diagramoch použité hodnoty sú stredné hodnoty ± štatistická odchýlka.

Obr. 11a až 11c ukazujú hladiny glukózy po pokrme Sustacal^R pre tolerančné testy s pokrmom Sustacal^R, uskutočnené pri štarte (deň 1), 7. deň a 14 deň na ľudských klinických dobrovoľníkoch, ktorým sa aplikovalo 30 μg triproamylínu (AC-0137) trikrát denne pred jedlom počas 14 dní.

V diagramoch je na osi x vynesený čas v minútach a na osi y koncentrácia glukózy v plazme v mg/dl (obr. 11a), triproamylínu v plazme v pM (obr. llb) a voľného inzulínu v plazme v μϋ/ml (obr. 11c). V diagramoch použité hodnoty sú stredné hodnoty ± štatistická odchýlka.

Obr. 12a až 12b ukazujú hladiny glukózy po pokrme Sustacal^R pre tolerančné testy s pokrmom Sustacal^R, uskutočnené pri štarte (deň 1), 7. deň a 14 deň na ľudských klinických dobrovoľníkoch, ktorým sa aplikovalo 100 μg triproamylínu (AC-0137) trikrát denne pred jedlom počas 14 dní.

V diagramoch je na osi x vynesený čas v minútach a na osi y koncentrácia glukózy v plazme v mg/dl (obr. 12a) a triproamylínu v plazme v pM (obr. 12b). V diagramoch použité hodnoty sú stredné hodnoty ± štatistická odchýlka.

Obr. 13a až 13b ukazujú hladiny glukózy po pokrme Sustacal^R pre tolerančné testy s pokrmom Sustacal^R, uskutočnené pri štarte (deň 1), 7. deň a 14 deň na ľudských klinických dobrovoľníkoch, ktorým sa aplikovalo 300 μg triproamylínu (AC-0137) trikrát denne počas 14 dní.

V diagramoch je na osi x vynesený čas v minútach a na osi y koncentrácia glukózy v plazme v mg/dl (obr. 13a) a triproamylínu v plazme v pM (obr. 13b). V diagramoch použité hodnoty sú stredné hodnoty ± štatistická odchýlka.

Obr. 14 znázorňuje účinky odpovede na dávku predchádzajúcej subkutánnej injekcie krysieho amylínu na zadržanie obsahu žalúdka 20 minút po podaní žalúdočnou sondou u normálnych a diabetických krýs (n = 3 až 9 pre každý bod). Symboly sú stredné hodnoty ± a krivky definujú najvhodnejšie logistické funkcie. Nula označuje tú frakciu obsahu žalúdka, ktorá bola zadržaná u normálnych a diabetických krýs neliečených amylínom (rozdiel pri P < 0,001).

V diagrame je vynesená na osi x dávka subkutánneho amylínu v gg a na osi y percentá obsahu žalúdka zostávajúceho v žalúdku po 20 minútach.

Obr. 15 znázorňuje koncentráciu amylínu v plazme zmeranú po subkutánnej injekcii buď 1 μ<3 alebo 10 μg syntetického krysieho amylínu (n = 3 na skupinu). Symboly sú stredné hodnoty ± štandardná odchýlka.

V diagrame je vynesený na osi x čas v minútach po subkutánnom podaní amylínu a na osi y koncentrácia amylínu v plazme v pM.

Obr. 16 znázorňuje trícium odvodené od glukózy v plazme (cpm/10 μΐ) po aplikácii fyziologického roztoku alebo AC-0187 žalúdočnou sondou. * označuje štatistickú významnosť. Najspodnejšia krivka (prerušovaná čiara označená pôvod”) pochádza od 4 anestetizovaných krýs, ktorým sa aplikovala žalúdočná sonda po laparatómii a podviazaní pyloru. To naznačuje, že malé množstvo trícia sa absorbuje priamo stenami žalúdka a že prírastok trícia ukazuje na prechod glukózy do obehu z tenkého čreva.

V diagrame je vynesený na osi x čas v minútach po podaní žalúdočnou sondou a na osi y obsah od glukózy odvodeného trícia v plazme v cpm/10 μΐ.

Obr. 17 znázorňuje obsah glukózy v plazme v mg/dl po podaní buď fyziologického roztoku alebo AC-0187 do žalúdka sondou. V diagrame je vynesený na osi x čas v minútach po podaní sondou do žalúdka a na osi y obsah glukózy v plazme v mg/dl.

Nomenklatúra rôznych zlúčenín analógov agonistov amylínu, užitočných podľa vynálezu, sa môže použiť na označenie ako peptidu, na ktorom je sekvencia založená, tak modifikácií akejkoľvek základnej peptidovej amylínovej sekvencie, ako ľudského amylínu. Aminokyselina, ktorou prechádza horný číselný index, znamená, že uvedená aminokyselina nahradzuje aminokyselinu normálne prítomnú s týmto horným indexom v základnej aminokyselinovej sekvencii. Napríklad ^,,18Arg^as' ^aePro-h-amylín sa týka peptidu založeného na sekvencii ”h-amylínu alebo ľudského amylínu, ktorý má nasledujúce substitúcie: Arg nahradzuje His vo zvyšku 18, Pro nahradzuje Ala vo zvyšku 25 a Pro nahradzuje Ser vo zvyšku 28. Výraz des-¹Lys-h-amylín sa týka peptidu založeného na sekvencii ľudského amylínu s prvou alebo N-terminálnou aminokyselinou vypustenou.

Analógy agonistov amylínu podľa vynálezu sú užitočné vzhladom k svojim farmakologickým vlastnostiam. Ich aktivita ako prostriedkov agonistov amylínu sa môže vyjadriť aktivitou v teste na viazanie receptora a teste s m. soleus, ktoré sú opísané nižšie. Aktivita agonistov amylínu zlúčenín sa môže tiež stanoviť schopnosťou vyvolať u cicavcov hyperkalcémiu alebo/a hyperglykémiu alebo znížiť postprandiálne hladiny glukózy v plazme, ako je tu opísané.

Výhodné zlúčeniny analógu agonistov amylínu des-^Lys-h-amylín, ^aePro-h-amylín, ^as'^ae'^asPro-h-amylín, ¹⁸Arg^a8'^a8Pro-h-amylín a des-¹Lys¹⁸Arg^as'^a8Pro-h-amylín vykazujú všetky aktivitu amylínu in vivo liečených testovaných zvierat tým, že vyvolávajú výraznú hyperlaktémiu nasledovanú hyperglykémiou. Okrem toho, že majú aktivity charakteristické pre amylín, o niektorých výhodných zlúčeninách sa zistilo, že sú rozpusť22 nejšie a stabilnejšie ako ľudský amylín. K týmto výhodným zlúčeninám patrí ^2BPro^2SVal²⁸'^2SPro-h-amylín, ²⁵'²⁸'²⁹Pro-h-amylín (uvádzaný tu tiež ako AC-0137) a ^X8Arg^2B'²⁸Pro-h-amylín.

Spôsob podľa vynálezu môže používať agonistu amylínu vrátane amylínu alebo analógu agonistu amylínu, napríklad analóg agonistu receptora amylínu ako ^xeArg^2B'^2SPro-h-amylín. des-^xLys-^X8Arg^2S'²⁸Pro-h-amylín, ^X8Arg^2B'^za·²®Pro-h-amylín, des-^xLys-^x8Arg^2B'²⁸'²⁹Pro-h-amylín, ^2Bz28'²⁹Pro-h-amylín- des-^xLys^2S'²®Pro-h-amylín a ^2BPro^2eVal^2B'²⁸Pro-h-amylín. Ako príklady iných vhodných analógov agonistov amylínu je možné uviesť:

^{2 3} Leu ^{2 s}Pro ^{2 e}Val^{2 8}'² ®Pro-h-amylín, ^{2 3}Leu^{2 s}Pro ^{2 8}Val^{2 e}Pro-h-amy1ín, des-^xLys²³Leu^2BPro^2eVal²⁸Pro-h-amylín, ^X8Arg²³Leu^2SPro^2eVal²⁸Pro-h-amylín, ^X8Arg²³Leu^2B *²⁸'²®Pro-h-amylín, ^xaArg²³Leu^{2B z 28}Pro-h-amylín, ^x7Ile²⁸Leu^2B *²⁸'^2SPro-h-amylín, ^x7Ile^2B'²⁸'²®Pro-h-amylín, des-^xLys^x7Ile²³Leu^2B'²⁸ · ²®Pro-h-amylín, ^{x 7}1le¹⁸Arg^{2 3}Leu-h-amy1ín, ^{x 7} íle¹⁸Arg^{2 3}Leu^{2 e}Val² ®Pro-h-amylín, ¹⁷Ile^{x 8}Arg^{2 3}Leu^{2 B}Pro^{2 e}Val^{2 8}'²®Pro-h-amy1ín, ^{x 3}Thr^{2 x}His^{2 3}Leu² ®Ala ^{2 a}Leu² ®Pro ^{3 x}Asp-h-amylín, ^X3Thr^2XHis²³Leu^2eAla²⁹Pro^3XAsp-h-amylín, des-^xLys^X3Thr^2XHis²³Leu^2eAla²⁸Pro^3xAsp-h-amylín, ^X3Thr^x8Arg^2xHis²³Leu^2eAla²®Pro^3XAsp-h-amylín, ^X3Thr^X8Arg^2xHis²³Leu²⁸'^2SPro^3XAsp-h-amylín a ^X3Thr^x8Arg^2xHis²³Leu^2BPro^2eAla²⁸'²®Pro^3XAsp-h-amylín.

Ešte ďalší agonisti amylínu vrátane analógov agonistov amylínu sú opísané v patentovej prihláške WPI č. 93-182488/22 s názvom Nové peptidy agonistov amylínu používané na liečbu a prevenciu hypoglykémie a diabetes mellitus.

Aktivita agonistov amylínu sa môže vyhodnotiť pri použití tu opísaných biologických testov. Test viazania na receptory môže indentifikovať ako kandidáta agonistov amylínu tak kandidáta antagonistov amylínu a môže sa použiť na vyhodnotenie viazania, zatiaľ čo test s m. soleus rozlišuje medzi agonistami a antagonistami. Účinky amylínu alebo agonistov amylínu na motilitu žalúdka sa môžu identifikovať, vyhodnocovať alebo podrobiť skríningu na použitie pri spôsoboch uvedených nižšie alebo iných z literatúry známych spôsobov alebo ekvivalentných spôsobov na určenie motility žalúdka.

Jeden takýto spôsob na použitie pri identifikácii alebo vyhodnotení schopnosti určitej zlúčeniny spomaliť motilitu žalúdka spočíva v tom, že sa (a) spojí testovaná vzorka a testovací systém, pričom uvedená testovaná vzorka je tvorená jednou alebo viacerými testovanými zlúčeninami a uvedený testovací systém je tvorený systémom na vyhodnotenie motility žalúdka, pričom tento systém sa vyznačuje tým, že sa prejavuje napríklad zvýšeným obsahom glukózy v plazme ako odozvy na zavedenie glukózy alebo potravy do uvedeného systému a (b) stanoví prítomnosť alebo veľkosť zvýšenia obsahu glukózy v plazme v uvedenom systéme. Môžu sa tiež použiť pozitívne alebo/a negatívne kontroly. Prípadne sa do testovacieho systému môže pridať vopred určené množstvo antagonistu amylínu (napríklad ^2-32lososí kalcitonín).

Zlúčeniny agonistov majú s výhodou v teste viazania na receptory účinnosť rádovo nižšiu ako asi 1 až 5 nM, s výhodou nižšiu ako asi 1 nM a výhodnejšei nižšiu ako asi 50 nM. V teste s m. soleus majú tieto zlúčeniny hodnoty EC_so rádovo nižšie ako asi 1 až 10 mikromolárne.

Test viazania na receptory je opísaný v patentovej prihláške USA č. 670 231, podanej 15. marca 1991 a zverejnenej ako medzinárodná prihláška č. PCT/US92/02125. Test viazania na receptory je konkurenčným testom, pri ktorom sa meria schopnosť zlúčenín viazať sa špecificky na receptory amylínu viazané na membráne. Výhodným zdrojom pre membránové prípravky používané v tomto teste je predný mozog, ktorý obsahuje membrány z nucleus accumbens a okolitých oblastí. Testované zlúčeniny si konkurujú pri viazaní na tieto receptorové prípravky s krysím amylínom ^iasI Bolton hunter. Konkurenčné krivky, v ktorých je naviazané množstvo (B) vynesené ako funkcia logaritmu koncentrácie ligandmi, sa analyzujú počítačom pri použití analýz nelineárnej regresie na logistickú rovnicu so 4 parametrami (Inplot program, GraphPAD Software, San Diego, Kalifornia) alebo program ALLFIT od DeLeana a kol., (ALLFIT, Version 2.7 (NIH, Bethesada, MD 20892)). Munson P. a Rodbard D., Anál. Biochem. 107, 220 - 239 (1980).

Testy biologickej účinnosti agonistov amylínu vrátane prípravkov analógov agonistov amylínu v m. soleus sa uskutočňujú pri použití prv opísaných metód (Leighton B. a Cooper G.

J. S., Náture, 335, 632 - 635 (1988), Cooper G. J. S a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 7763 - 7766 (1988)). Súhrnne uvedené, účinnosť agonistov amylínu sa stanovuje meraním inhibície inzulínom stimulovanej syntézy glykogénu v musculus soleus. Účinnosť antagonistov amylínu sa stanovuje meraním opätovného zahájenia inzulínom stimulovanej syntézy glykogénu v prítomnosti 100 nM krysieho amylínu a antagonistu amylínu. Koncentrácie peptidu rozpusteného v pufroch bez obsahu nosičov sa stanovujú kvantitatívnou analýzou aminokyselín, ako je tu opísané. Schopnosť zlúčenín pôsobiť ako agonisti v tomto teste sa stanoví zmeraním hodnôt EC_sq. Štandardné odchýlky sa stanovia zostrojením sigmoidálnych kriviek odoziev na dávky pri použití logistickej rovnice so 4 parametrami (DeLean A., Munson P.J., Guardabasso V. a Rodbad D. (1988) ALLFIT, Version 2.7, National Inštitúte of Child Health and Human Development, N. I. H. Bethesda, MD, 1 disketa). Použitím týchto biologických testov sa charakterizoval rad agonistov amylínu. Zistilo sa, že všetky zlúčeniny ^ieArg^2B'^2ePro-h-amylín, des¹Lys^ieArg^as*^2ePro—h—amylín, ^xeArg^2S,ae'^2SPro-h-amylín, des^xLys^xeArg2B,2e.2Bpr_O_h-amylín, ^as'^2e'^aBPro-h-amylín, des^x-Lys²⁵*^2e'^2BPro-h-amylín a ^a“Pro^2eVal^a=,aePro-h-amylín konkurujú amylínu v teste viazania na receptor. Tieto zlúčeniny majú zanedbatel25 nú antagonistickú účinnosť zmeranú testom m. soleus a bolo dokázané, že majú účinok agonistov amylínu. Podobné výsledky sa získali s inými vyššie uvedenými zlúčeninami agonistov.

Zlúčeniny antagonistov amylínu, ktoré sa dajú požiť pri spôsoboch liečby hypomotility žalúdka zahrňujú zlúčeniny opísané v US patentovej prihláške č. 07/794 288, podanej 19. novembra 1991.

Zlúčeniny, ako sú opísané vyššie, sa pripravujú pri použití štandardných techník syntézy peptidov v pevnej fáze a s výhodou automatizovaného alebo poloautomatizovaného syntetizéra peptidov. Typicky sa kondenzuje aminokyselina chránená alfa-N-karbamoylovou skupinou a aminokyselina pripojená k rastúcemu peptidovému reťazcu na živici pri laboratórnej teplote v inertnom rozpúšťadle, ako dimetylformamide, N-metylpyrolidóne alebo metylénchloride, v prítomnosti kondenzačných prostriedkov, ako dicyklohexylkarbodiimidu a 1-hydroxybenzotriazolu v prítomnosti zásady, ako diizopropyletylamínu. Chrániaca alfa-N-karbamoylová skupina sa odstráni z výslednej peptidovej živice použitím reagencie, ako trifluóroctová kyselina alebo piperidín, a kondenzačná reakcia sa zopakuje s ďalšou požadovanou N-chránenou aminokyselinou, ktorá sa má pridať k peptidovému reťazcu. Vhodné skupiny chrániace dusík sú v odbore dobre známe, pričom sa tu dáva prednosť terc.butyloxykarbonylovej skupine (tBos) a fluorenylmetoxykarbonylovej skupine (Fmoc).

Rozpúšťadlá, deriváty aminokyselín a 4-metylbenzhydrylové živice používané v syntetizére peptidov sa zakúpili od Applied Biosystems Inc. (Foster City, CA), ak nie je uvedené inak. Aminokyseliny s chráneným postranným reťazcom, ktoré sa použili a zakúpili od firmy Applied Biosystems Inc. (Foster City,

CA) zahrňovali nasledujúce Fmoc-Arg(Pmc), Boc-Thr(Bzl), Fmoc-Ser(t-Bu), Boc-Tyr(BrZ), Fmoc-Lys(Boe), Boc-Glu(Bzl), Fmoc-Asn(Trt) a Fmoc-Gln(Trt) zakúpila od Applied Biosystems aminokyseliny: Boc-Arg(Mts), Fmoc-Thr(t-Bu), Boc-Ser(Bzl), Fmoc-Tyr(t-Bu), Boc-Lys!Cl-Z), Fmoc-Glu(t-Bu), Fmoc-His(Trt),

Aminokyselina Boc-His(BOM sa Inc. alebo od Bachem Inc. (Tor26 ranča, USA). Anizol, metylsulfid, fenol, etánditiol a tioanizol sa získali od Aldrich Chemical Company (Milwaukee, WI). Firma Air Products and Chemicals (Allentown, PA) dodala fluorovodík. Etyléter, kyselina octová a metanol sa zakúpili od firmy Fisher Scientific (Pittsburgh, PA).

Syntéza peptidov v pevnej fáze sa uskutočnila automatickým syntetizérom peptidov (Model 430A, Applied Biosystems Inc., Foster City, CA) pri použití systému NMP/HOBt (opcia 1 a chémia tBoc alebo Fmoc (pozri Applied Biosystems User*s Manual for the ABI 430A Peptide Synthesizer, Version 1.38, 1. júl 1988, oddiel 6, str. 49 až 70, Applied Biosystems Inc., Foster City, CA). Boc-peptidové živice sa rozštiepili pomocou fluorovodíka počas 1 hodiny pri teplote -5 ’C až 0 ’C. Peptid sa extrahoval zo živice striedavo vodou a kyselinou octovou a filtráty sa lyofilizovali. Pmoc-peptidové živice sa rozštiepili štandardnými metódami (Introduction to Cleavage Techniques, Applied Biosystems, Inc. 1990, st. 6 až 12). Niektoré peptidy sa tiež zostavili použitím Advanced Chem Tech Syntetizére (Model MPS 350, Lousville, Kentucky). Peptidy sa vyčistili vysokoúčinnou kvapalinovou chromatografiou s reverznými fázami (preparatívnou a analytickou) pri použití systému Waters Delta Prep 3000. Na izoláciu peptidov sa použila preparatívna kolóna C4, C8 alebo C18 (10 μ, 2,2 x 25 cm, Vydac, Hesperia, CA) a čistota sa stanovila analytickou kolónou C4, C8 alebo C18 (5 μ, 0,46 x 25 cm, Vydac). Rozpúšťadlá (A=0,l % TFA (kyselina trifluóroctová)/voda a B=0,l % TFA/CH₃CN) sa privádzali do analytickej kolóny prietokovou rýchlosťou 1 ml/minúta a do preparatívnej kolóny prietokovou rýchlosťou 15 ml/minúta. Analýzy aminokyselín sa uskutočňovali na systéme Waters Pico Tag a aminokyseliny sa spracovali použitím programu Maxima. Peptidy sa hydrolyzovali kyslou hydrolýzou v parnej fáze (115 ’C, 20 až 24 hodín). Hydrolyzáty sa derivatizovali a analyzovali štandardnými metódami (Cohen S. A., Meys M. a Tarrin T. L. (1989), The Pico Tag Method: A Manual of Advanced Techniques for Amino Acid Analysis, str. 11 až 52, Millipore Corporation, Milford, MA). Analýza bombardovaním rýchlymi atómami sa uskutočnila pomocou M-Scan, Incorporated (West Chester, PA). Kalibrácia hmotnosti sa ušku27 točnila použitím jodidu cézia alebo zmesi cézia s glycerínom. Desorpčná ionizačná analýza plazmy využívajúca detekciu času preletu sa uskutočnila hmotnostným spektrometrom Applied Biosystems Bio-Ion 20.

Peptidové zlúčeniny použiteľné podľa vynálezu sa môžu tiež pripraviť použitím techník rekombinantnej DNA, čo sú metódy v súčasnej dobe známe v odbore. Pozri napríklad Sambrock a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vydanie, Cold Spring Harbor (1989).

Vyššie uvedené zlúčeniny tvoria soli s rôznymi anorganickými a organickými kyselinami a zásadami. Tieto soli zahrňujú soli pripravené s organickými a anorganickými kyselinami, napríklad s kyselinou soľnou, kyselinou bromovodíkovou, kyselinou sírovou, kyselinou fosforečnou, kyselinou toluénsulfónovou, kyselinou metánsulfónovou, kyselinou trifluóroctovou, kyselinou octovou, kyselinou mravčou, kyselinou maleínovou, kyselinou fumárovou a kyselinou gáforsulfónovou. Soli pripravené so zásadami zahrňujú amóniové soli, soli alkalických kovov, napríklad sodné a draselné soli, soli alkalických zemín, napríklad vápenaté a horečnaté soli. Výhodné sú acetáty, hydrochloridy a trifluóracetáty. Soli sa môžu vytvoriť zvyčajnými spôsobmi, ako reakciou produktu vo forme voľnej kyseliny alebo zásady s jedným alebo viacerými ekvivalentami vhodnej zásady alebo kyseliny v rozpúšťadle alebo v prostredí, v ktorom je soľ nerozpustná alebo v rozpúšťadle ako je voda, ktorá sa potom odstráni vo vákuu alebo lyofilizáciou alebo výmenou iónov jestvujúcej soli za iný ión na vhodnej iónomeničovej živici.

Vyššie opísané zlúčeniny sú užitočné vzhľadom na svoje farmakologické vlastnosti. Zlúčeniny podľa vynálezu sú účinné predovšetkým ako prostriedky, ktoré spomaľujú vyprázdňovanie žalúdka, ako sa dokázalo ich schopnosťou znížiť postprandiálnu hladinu glukózy u cicavcov.

Ako je opísané v príklade 1, vyhodnotili sa účinky amylínu v tolerančných testoch na orálne podanie glukózy u psov.

S prekvapením sa zistilo, že amylín, ktorý bol prv opísaný ako hyperglykemický (t.j. ako taký, ktorý spôsobuje zvýšený obsah glukózy) namiesto toho znižuje postprandiálne hladiny glukózy v plazme u týchto testovaných zvierat. Amylín znižoval pri všetkých veľkostiach dávok ako veľkosť zvýšenia obsahu glukózy v plazme tak maximálny obsah glukózy v plazme v tolerančnom teste na orálne podávanie glukózy.

Príklad 2 opisuje účinky agonistu amylínu AC-0137 na postprandiálne hladiny glukózy v plazme pri klinických testoch na ľuďoch. U pacientov s juvenilným diabetes mellitus sa pozorovalo na dávke závislé zníženie postprandiálnej hyperglykémie ako pri jednorázovej aplikácii tak pri kontinuálnej intravenóznej infúzii.

Príklad 3 opisuje účinok kontinuálnej infúzie AC-0137 (triproamylínu) na hladinu glukózy v plazme po pokrme Sustacal^R a po intravenóznom podaní glukózy. Pri intravenóznom podaní glukózy neboli hladiny glukózy v plazme pri pacientoch liečených 50 μg/hodina AC-0137 významne rozdielne od hladín glukózy pacientov, ktorým sa aplikovalo placebo. Avšak u pacientov, ktorí dostali pokrm Sustacal^R a ktorí sa liečili 25 jLig/hodina alebo 50 Mg/hodina intravenóznou infúziou AC-0137, boli hladiny glukózy v plazme znížené u pacientov liečených AC-0137 v porovnaní s placebom. AC-0137 znížil postprandiálnu koncentráciu glukózy v plazme u diabetických pacientov závislých na inzulíne po orálnej výžive, nemal však žiaden pozorovateľný účinok na koncentrácie glukózy v plazme po aplikácii intravenóznej dávky glukózy.

Ako je opísané v príklade 4, mali pacienti s juvenilným diabetom, ktorí pokračovali vo svojej zvyčajnej inzulínovej terapii a sami si pichali trikrát denne triproamylín (AC-0137), v 14-dennej dvojnásobne slepej, placebom kontrolovanej klinickej štúdii nižšie priemerné hladiny glukózy v krvi po jedle v teste ako mali pacienti, ktorí dostali inzulín a placebo. Po 14 dňoch sa pozoroval štatisticky významný (O = 0,02) účinok znižujúci glukózu (zmeraný ako plocha pod glukózovou krivkou) pri 30 mikrogramoch, maximálne koncentrá29 cie triproamylínu v plazme boli v rozmedzí amylínu detegovateľného v krvi nediabetických jedincov. Triproamylínom vyvolané zníženie AUC sprevádzalo priemerné zníženie o 45 mg/dl až 60 mg/dl pri maximálnych koncentráciách glukózy v krvi pacientov.

Ako je opísané v príklade 5, vyprázdňovanie žalúdka sa meralo u normálnych a inzulínom liečených spontánne diabetických krýs BB pomocou retencie kalorického metylcelulózového gélu obsahujúceho fenylovú červeň, ktorý sa aplikoval žalúdočnou sondou. Obsah farbiva v žalúdkoch, odstránených z krýs, ktoré sa zahubili po 20 minútach, sa stanovil spektroskopicky a porovnal sa s obsahom farbiva v žalúdkoch krýs zahubených bezprostredne po aplikácii gélu žalúdočnou sondou na stanovenie vyprázdňovania. U diabetických krýs sa zistilo výrazne väčšie vyprázdňovanie žalúdka (prešlo 90,3 ± 1,7 %) v porovnaní s normálnymi krysami Harlan Sprague Dawley (49,1 + 4,7 % prešlo, P < 0,001) a nediabetickými krysami BB (61,1 ± 9,2 % prešlo, P < 0,001). Peptid pankreatických beta-buniek amylín, ktorý chýba v IDDM, zabraňoval v závislosti od dávky vyprázdňovaniu žalúdka ako u normálnych tak u diabetických krýs. ED_=o odozvy ako u normálnych tak u diabetických krýs bolo -1 μς, dávka, ktorá mala za následok maximálnu koncentráciu 76 pM 20 minút po injekcii. Tieto koncentrácie sú v rozmedzí pozorovanom in vivo. Tieto výsledky podporujú záver, že amylín sa podieľa na fyziologickej regulácii vstupu výživy do duodena.

Ako je opísané v príklade 6, meral sa u hladujúcich, korpulentných krýs LA/N, ktoré boli pri vedomí, príjem dávky prehltnutej označenej glukózy. Predchádzajúcou injekciou antagonistu receptora amylínu AC-0137 sa urýchlilo v plazme objavenie sa trícia odvodeného od glukózy. Okrem toho viedla predbežná injekcia antagonistu amylínu v väčšiemu zvýšeniu koncentrácie glukózy v plazme 15 minút po žalúdočnej sonde. Tieto údaje súhlasia s tým, že antagonista amylínu AC-0137 pôsobí proti účinku endogénne secernovaného amylínu, čím sa urýchľuje vyprázdňovanie žalúdka.

V dodatočných štúdiách s anestézovanými krysami sa zistilo, že amylín neovplyvňuje absorpciu glukózy do krvi z tenkého čreva. V týchto pokusoch sa anestézovaným krysám aplikovala kontinuálna infúzia krysieho amylínu (0,35 nm/kg/min) alebo fyziologického roztoku (v prípade kontrolných zvierat) počas 3 hodín. Po uplynutí jednej hodiny po infúzii amylínu sa podala jednorázová dávka glukózy (1 g/kg) buď do žalúdka alebo do duodena trubičkou vsunutou ezofágom. Pretože štúdie zahrňovali skôr anestézované krysy ako krysy pri vedomí, nie sú tieto brané do úvahy pri analýze motility žalúdka, napríklad rýchlosti vyprázdňovania obsahu žalúdka do duodena. Štúdie však naznačujú, že absorpcia glukózy z duodena do krvi nebola spomalená amylínom. Na presnejšie určenie, či amylín ovplyvnil prechod glukózy z lumenu tenkého čreva do krvi, sa použil iný preparát. Anestézovaným krysám sa odobral segment tenkého čreva, stále ešte spojený so zvieraťom cestou zásobenia krvou a boli do neho zasunuté kanyly tak, aby sa tenké črevo mohlo premývať glukózovými roztokmi s regulovaným zložením. Do zvierat sa zaviedli kanyly tiež prostredníctvom tepny z dôvodu odberu vzoriek krvi a prostredníctvom žily z dôvodu infúzie amylínu, inzulínu a glukózy. Lumen sa premýval roztokom glukózy značenej tričiom. Postup glukózy z lumena čreva do krysy sa meral výskytom tritiovaného značenia v plazme. Predpoklad, že takýto výskyt trícia v plazme je skutočne meradlom absorpcie glukózy z čreva, sa testoval aplikáciou blokátora transportu glukózy floridzinu. Floridzin zabránil značnou mierou tranzitu značenia z lumenu čreva do plazmy. Na zabezpečenie, aby gradient glukózy medzi lumenom čreva a plazmou zostal konštantný, sa počas infúzie glukózy obsah glukózy v plazme upravoval infúziou glukózy, ktorá sa regulovala ako odozva na zmeny v koncentrácii glukózy v plazme. V tomto preparáte nemali intravenózne infúzie amylínu žiadny účinok na rýchlosť, ktorou značená glukóza odovzdaná tenkému črevu vstúpila do plazmy. Tieto výsledky ukazujú, že znížený obsah glukózy v krvi pozorovaný pri amylínom liečených jedincoch vo vyššie opísaných štúdiách nie je pravdepodobne dôsledkom zníženej absorpcie z tenkého čreva, ale skôr dôsledkom zníženej rýchlosti transferu obsahu žalúdka do duodena, t.j. v dôsledku spomaleného vyprázdňovania žalúdka.

Prostriedky použiteľné podľa vynálezu sa môžu účelne upraviť do formy prípravkov vhodných na parenterálnu (vrátane intravenóznej, intramuskulárnej a subkutánnej) alebo nasálnu alebo orálnu aplikáciu. V niektorých prípadoch bude účelné zostaviť agonistu amylínu a iné činidlo pôsobiace proti vyprázdňovaniu, ako glukagón, do jediného prostriedku alebo roztoku na spoločnú aplikáciu. Inokedy môže byť výhodnejšie aplikovať iné činidlo pôsobiace proti vyprázdňovaniu oddelene alebo analógu agonistu amylínu. Vhodnú najlepšie stanoviť ošetrujúci lekár pre každého pacienta individuálne. Vhodné farmaceutický prijateľné nosiče a ich liekové formy sú opísané v štandardných pojednaniach o liekových formách, napr. Remington’s Pharmaceutical Sciences od E. W. Martina. Pozri tiež Wang Y. J. a Hanson M. A. Parenteral Formulation of Proteins and Peptides: Stabilty and Stabilizers”, Journal of Parenteral Science and Technology, Technical Report č. 10, dodatok 42, 2S (1988). Vhodné liekové formy obsahujúce hypoglykemické činidlá, ako sulfonylmočoviny, sú v odbore známe.

od uvedeného amylínu aplikačnú formu môže

Zlúčeniny použiteľné podľa vynálezu sa môžu upraviť ako parenterálne prostriedky pre injekcie alebo infúzie. Môžu sa napríklad suspendovať v inertnom oleji, s výhodou v rastlinnom oleji, ako sézamovom, arašidovom, olivovom oleji alebo inom vyhovujúcom nosiči. S výhodou sa suspendujú vo vodnom nosiči, napríklad v izotonickom roztoku pufru pri pH okolo 5,6 až 7,4. Tieto prostriedky sa môžu sterilizovať zvyčajnými sterilizačnými technikami alebo sa môžu sterilné filtrovať. Tieto prostriedky môžu obsahovať farmaceutický prijateľné pomocné látky potrebné na dosiahnutie fyziologických podmienok, napríklad pufry. Užitočným pufrom je napríklad zmes octanu sodného a kyseliny octovej. Môže sa použiť forma s protrahovaným účinkom alebo depotný prípravok s pomalým uvoľňovaním účinnej látky, aby sa terapeuticky účinné množstvá prípravku dostávali do krvného riečišťa počas mnohých hodín alebo dní nasledujúcich po transdermálnej injekcii alebo podaní.

Požadovaná izotonicita sa môže dosiahnuť použitím chloridu sodného alebo iných farmaceutický prijateľných činidiel, ako dextrózy, kyseliny boritej, tartrátu sodného, propylénglykolu, polyolov (ako manitolu a sorbitolu) alebo iných anorganických alebo organických roztokov. Chlorid sodný sa uprednostňuje predovšetkým pokial ide o pufry obsahujúce sodíkové ióny.

Roztoky vyššie uvedených prostriedkov sa môžu prípadne zahustiť zahusťovadlom ako je metylcelulóza. Môžu sa pripraviť v emulgovanej forme, buď voda v oleji alebo olej vo vode. Môže sa použiť široké spektrum farmaceutický prijateľných emulgačných činidiel vrátane napríklad akáciového prášku, neionogénneho tenzidu, napríklad Tweenu, alebo iónového tenzidu, napríklad sulfátov alebo sulfonátov alkalických kovov polyetylénglykolov, napríklad Tritonu.

Prostriedky použiteľné podľa vynálezu sa pripravujú zmiešaním jednotlivých zložiek všeobecne prijatými postupmi. Zvolené zložky sa môžu napríklad jednoducho zmiešať v miešači alebo inom štandardnom zariadení na prípravu koncentrovanej zmesi, ktorá sa potom môže upraviť na konečnú koncentráciu a viskozitu prídavkom vody alebo zahusťovadla a prípadne pufru na reguláciu pH alebo dodatočného roztoku na reguláciu tonicity.

Pre lekárske použitie sa prostriedku adjustujú do formy dávkovacích jednotiek obsahujúcich množstvo amylínu alebo agonistu amylínu, napríklad zlúčeniny analógu agonistu amylínu s alebo bez iného činidla pôsobiaceho proti vyprázdňovaniu, ktoré bude schopné účinne regulovať v jednej dávke alebo vo viacnásobných dávkach cukor v krvi na zvolenej hladine. Terapeuticky účinné množstvá amylínu alebo agonistu amylínu, napríklad analógu agonistu amylínu, pre použitie pri regulácii vyprázdňovania žalúdka pri podmienkach, pri ktorých je vyprázdňovanie žalúdka priaznivo spomaľované alebo regulované, sú také, ktoré znižujú postprandiálne hladiny glukózy v krvi, s výhodou nie viac ako asi na 8 alebo 9 mM, alebo také, že sa hladiny glukózy v krvi znížia podľa potreby. U diabetických pacientov alebo u pacientov, ktorí neznášajú glukózu, sú hladiny glukózy v plazme vyššie ako u normálnych jedincov.

U týchto pacientov je možné dosiahnuť priaznivé zníženie alebo vyrovnanie postprandiálnych hladín glukózy v krvi. Ako je zrejmé odborníkom v odbore, bude účinné množstvo terapeutického prostriedku ovplyvnené mnohými faktormi, ako vekom a hmotnosťou pacienta, pacientovou fyzickou kondíciou, hladinou cukru v krvi alebo tým, aké zníženie amylínu má byť dosiahnuté, a inými faktormi.

Tieto farmaceutické prostriedky sú užitočné, aby sa u pacienta dosiahla hypomotilita žalúdka, a môžu sa použiť i pri iných poruchách, kde sa motilita žalúdka priaznivo zníži.

Účinná denná dávka zlúčenín zahrňujúcich ^ieArg^2S'^2aPro-h-amylín, des¹Lys^X8Arg²⁵ ·²⁸'^2S*Pro-h-amylín, ^X8Arg^2S'²⁸'²®Pro-h-amylín, des^xLys^xeArg^2S'²⁸Pro-h-amylín, ²⁼'^2e'^2SPro-h-amylín, des¹Lys^2S'^2e'²®Pro-h-amylín a ^2SPro^2eVal^2B'^2sPro-h-amylín bude zvyčajne v rozmedzí 0,01 alebo 0,03 až asi 5 mg/deň, s výhodou asi 0,01 alebo 0,5 až 2 mg/deň, a najvýhodnejšie asi 0,01 alebo 0,1 až 1 mg/deň, pre pacienta s hmotnosťou 70 kg, aplikovaná v jedinej dávke alebo v rozdelených dávkach. Presnú dávku, ktorá sa má aplikovať, stanoví ošetrujúci lekár a závisí od toho, kde príslušná zlúčenina leží vo vyššie uvedenom rozmedzí, ako i na veku, hmotnosti a kondícii pacienta. S aplikáciou by sa malo začať pri prvej známke symptómov alebo krátko po stanovení diagnózy diabetes mellitus. Aplikácia môže byť injekčná, s výhodou subkutánna alebo intramuskulárna. Orálne účinné zlúčeniny by sa mali podávať orálne, avšak dávkovanie by sa malo zvýšiť 5 až 10 násobne.

Zvyčajne sa môžu pri liečbe alebo prevencii zvýšených, nevyhovujúcich alebo nežiadúcich postprandiálnych hladín glukózy v krvi podávať zlúčeniny podľa vynálezu pacientom, ktorí potrebujú takúto liečbu, v rozmedzí dávok podobných vyššie uvedeným, zlúčeniny sa však aplikujú častejšie, napríklad jedenkrát, dvakrát alebo trikrát denne.

Antagonisti amylínu použiteľní pri liečbe žalúdočnej hypomotility sa môžu aplikovať v dávkach od 0,1 do 30 mg/deň, s výhodou od 0,3 do 10 mg/deň a ešte výhodnejšie od 0,1 do mg/deň. Aplikácia môže byť subkutánnou alebo intramuskulárnou injekciou. Orálne účinné zlúčeniny sa môžu podávať orálne, avšak dávkovanie by sa malo zvýšiť 8 až 10-krát.

Nasledujúce príklady, ktoré opisujú výsledky série pokusov, sú pripojené pre lepšie pochopenie vynálezu. Pokusy týkajúce sa vynálezu nemajú však obmedzovať vynález, a má sa za to, že všetky obmeny vynálezu, v súčasnom čase známe alebo neskoršie vyvinuté v medziach znalostí odborníkov v odbore, budú spadať do rozsahu vynálezu, ako je tu opísaný a neskoršie nárokovaný.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Predchádzajúce štúdie ukázali, že intravenózne injekcie amylínu hladným a kŕmeným krysiam pri podmienkach tolerančného testu na glukózu môžu zmenšiť pokles glukózy v plazme a zvýšiť laktát v plazme spôsobom závislým od dávky. Infúziami amylínu sa u hladných zvierat významne zníži odozva na inzulín.

Nasledujúce štúdie a pokusy však ukázali, že infúzia amylínu znížila hladiny glukózy v plazme u psov ako odozvu na hladinu orálnej glukózy. Účelom týchto štúdií bolo: (1) vyhodnotiť zmeny obsahu glukózy, laktátu a inzulínu v plazme ako odozvu na dávku orálnej glukózy, (2) zhodnotiť účinky intravenózne aplikovaného amylínu na tieto premenné a (3) vyhodnotiť účinnosť antagonistu amylínu AC-0253 (acetyl-¹¹’^1β-Arg,³°Arg,^3aTyr*“^3akalcitonín (lososí)) pri zrušení akýchkoľvek amylínom vyvolaných zmien glukózy v krvnej plazme.

Pre túto štúdiu sa použili psi zmiešanej rasy (9 samcov, rozmedzie hmotnosti 12 až 17 kg). Všetky zvieratá sa nechali pred každou situáciou hladovať cez noc. Každé zviera slúžilo pre všetky pokusy ako vlastná kontrola. Zvieratá sa ekvilibrovali počas 30 až 60 minút pred zahájením každého protokolu.

Pri t = - 30 sa začalo s nosičom alebo amylínom ± AC-0253. Rýchlosti aplikácie dávok amylínu boli 50, 100 a 300 pmol/kg/min. Rýchlosti aplikácie dávok AC-0253 boli 500 a 1500 pmol/kg/min. 25 % glukóza sa aplikovala orálne pri t = 0 minút. Aplikácia amylínu ± AC-0253 sa prerušila pri t = 120 minút. Vzorky inzulínu, glukózy a laktátu sa získali v 15 minútových intervaloch od t = -45 do t = 180 minút. Vzorky krysieho amylínu a AC-0253 sa odobrali v t = 60 a 120 minút.

U normálnych psov sa maximum glukózy v plazme dostavuje medzí 30 a 45 minútami po dávke orálnej glukózy u psov, ktorí sú pri vedomí. I keď medzi psami existovala značnú rôznorodosť, boli vzorky odozvy reprodukovateľné pre každého jednotlivého psa. Amylín znižoval pri všetkých veľkostiach dávok ako rýchlosť zvyšovania koncentrácie glukózy v plazme, tak tiež maximálny obsah glukózy v plazme. Počas infúzie amylínu sa ukázalo, že glukózy v plazme dosiahla stabilnú hladinu pri obsahu glukózy v plazme výrazne nižšom ako u kontrolných pokusov, pri 30 až 45 minútach začala sa zvyšovať znova po ukončení infúzie amylínu. Nejestvovali žiadne rozdiely v zmene obsahu glukózy v plazme medzi rýchlosťami dávok amylínu 50, 100 a 300 pmol/kg/min.

Pre pokusy uskutočnené na vyhodnotenie účinnosti AC-0253 zvrátiť amylínom vyvolané zmeny v obsahu glukózy sa zvolila rýchlosť aplikácie dávok 50 pmol/kg/min. AC-0253 nezruší až do 1500 pmol/kg/min úplne účinky amylínu (50 pmol/kg/min). AC-0253 samotný nemá žiadny účinok na zmeny v koncentrácii glukózy v plazme. Účinky amylínu a AC-0253 na laktát v plazme boli nepozorovateľné.

Príklad 2

Dvadsaťštyri mužských pacientov s diabetes mellitus závislom na inzulíne sa zúčastnilo klinickej štúdie agonistu amylínu AC-0137. Každý pacient sa náhodne priradil do jednej zo štyroch skupín, ktoré dostávali placebo, 30, 100 alebo 300 Mg AC-0137. Pacienti v každej skupine sa podrobili dvojdo36 bému krížovému pokusu na preskúmanie jednorázovej intravenóznej aplikácie proti intravenóznej infúzii lieku. Každé obdobie pozostávalo z trojdenného pobytu v študijnej jednotke. Pri každej príležitosti sa počiatočný deň venoval aklimatizácii na študijnú jednotku. Druhý a tretí deň sa vytvoril vložený krížový pokus placeba proti aktívnej medikácii. Napríklad pacienti, ktorí boli náhodne vybraní, aby dostali najskôr intravenóznu jednorázovú dávku, boli ďalej určení, že dostanú intravenózne jednorázovú dávku AC-0137 jeden deň a intravenózne jednorázovú dávku placeba druhý deň (alebo naopak, po jednorázovej dávke placeba nasledovala jednorazová dávka AC-0137). Po dvoch týždňoch boli pacienti znova prijatí, aby dostali rovnakú dávku AC-0137 opačným spôsobom aplikácie, t.j. intravenóznou infúziou. 2. a 3. deň po tomto príjme sa použil projekt vloženého krížového pokusu pre aplikáciu lieku a placeba podobným spôsobom, ako sa použil počas prvého príjmu. Šesť pacientov určených do skupiny s placebom dostali placebo každý deň počas štúdie.

Každý deň počas štúdie sa pacientom zaviedli najmenej 30 minút pred zahájením štúdie katétre. 15 minút pred spánkom si pacienti aplikovali zvyčajnú dávku inzulínu subkutánnou injekciou stanovenej dávky AC-0137 alebo placeba počas dvoch minút alebo sa zahájila kontinuálna infúzia AC-0137 alebo placeba, v ktorej sa pokračovalo počas dvoch hodín. Rýchlosť infúzie sa stanovila tak, aby sa určené množstvo lieku aplikovalo počas týchto dvoch hodín. Po tridsiatich minútach zjedli pacienti svoje zvyčajné raňajky. Vzorky krvi sa odoberali medzi -30 a 300 minútami na zmeranie hladín AC-0137 v plazme a hladín glukózy v plazme.

Hladiny lieku v plazme sledovali očakávaný priebeh, pričom dosiahli maximum čoskoro po injekcii jednorázovej dávky a potom zmizli z plazmy. Na rozdiel od toho viedli kontinuálne infúzie k hladinám, ktoré sa priblížili rovnovážnemu stavu počas 30 minút a zostali na tejto hladine počas zvyšku infúzie. Po ukončení infúzie hladiny poklesli podobným spôsobom, aký sa pozoroval pri aplikácii jednorázovej infúznej dávky.

Hladiny glukózy v plazme poukázali na niektoré neočakávané a zaujímavé javy. Ako sa môže vyhodnotiť na základe pacientov, ktorí dostali placebo pri každej príležitosti, hladiny glukózy v plazme sa zvýšili voči východiskovému stavu po 60 až 90 minútach a zostali zvýšené najmenej počas 240 minút. Jednorázová intravenózna aplikácie AC-0137 neviedla k žiadnej zjavnej zmene v hladinách glukózy po dávke 30 Mg. Pri jednorázovej dávke 100 gg bolo postprandiálne zvýšenie glukózy zreteľne oneskorené a menej výrazné. Po jednorázovej dávke 300 gg bol postprandiálny rast hladín glukózy v podstate eliminovaný.

Pri kontinuálnej intravenóznej infúzii sa pozorovalo zníženie postprandiálnej hyperglykémie závislej od dávky. Hodnoty z infúzie 15 pg/hodina sú vysoko presvedčivé pokiaľ sa týka účinku, a ako sa rýchlosť infúzie zvyšovala na 50 a 150 Mg/hodina, je zníženie postprandiálneho rastu hladín glukózy frapantné. Podobné trendy sú zrejmé zo štúdií používajúcich jednorázovú aplikáciu lieku.

Príklad 3

Aby sa demonštroval účinok triproamylínu (AC-0137) na zníženie postprandiálnej hyperglykémie a aby sa potvrdilo, že zníženie postprandiálnej hyperglykémie je v prvom rade gastrointestinálnym účinkom, uskutočnila sa jednostranne slepá, placebom kontrolovaná, dvojdobá skrížená štúdia minimálne s 15 hodinovou prestávkou medzi liečebnými postupmi. Dvadsaťsedem pacientov s diabetes mellitus sa určilo do kombinácie skupín dvoch hladín dávky a dvoch typov tolerančných testov. Pacienti dostali liečbu AC-0137 a placebo pomocou kontinuálnej mikroinfúznej pumpy v súlade so skríženou metódou. Pacienti sa rozdelili do troch skupín po deviatich pacientoch nasledovne: Skupina A dostala jedlá Sustacal* a dávku 25 Mg/h°dina AC-0137. Skupina B dostala jedlá Sustacaľ* a dávku ⁵⁰ M9/hodina AC-0137.

Pacienti zostali na klinike tri dni. Prvý deň pobytu na klinike sa pacienti aklimatizovali. Druhý a tretí deň sa pa38 cienti podrobili dvojdobému skríženému pokusu s AC-0137 oproti placebu. Okrem toho dostali pacienti alebo jedlo Sustacal^R alebo sa podrobili tolerančnému testu s intravenóznou glukózou, ako sa vopred stanovilo pre danú skupinu.

Počas prvého dňa sa pacientov inzulínový a kalorický príjem stabilizoval a každý pacient potom dodržiaval tento inzulínový a dietetický režim počas celého pobytu na klinike. Približne o 7. hodine (T = 0) sa začalo s kontinuálnou infúziou v súlade s medikáciou podľa štúdie. Pri T = 30 minút si pacienti aplikovali svoju zvyčajnú rannú dávku inzulínu. Pri T = 60 minút dostali pacienti štandardizované jedlo Sustacal^R obsahujúce 355 kalórií na vypitie alebo intravenóznu dávku 300 mg/kg glukózy, aplikovanú ako intravenóznu infúziu D_sqW počas piatich minút pri použití infúznej pumpy. Typ tolerančného testu sa stanovil podľa náhodného rozvrhu. V pravidelných intervaloch sa odoberali vzorky krvi na meranie glukózy, laktátu a inzulínu a na stanovenie koncentrácií AC-0137 v plazme. Aplikácia liekov pri štúdii sa prerušila pri T = 300 minút.

Na tretí deň ráno sa zaviedli katétre podobným spôsobom ako druhý deň. Pacienti si aplikovali svoje ranné dávky inzulínu ako druhý deň. Pacienti dostali placebo alebo medikáciu podľa štúdie skríženým spôsobom pri použití tej istej intravenóznej cesty a toho istého režimu ako v predchádzajúci deň (t.j. pacienti, ktorí dostali infúziu AC-0137 druhý deň, tretí deň dostali infúziu placeba). Pacienti sa podrobili rovnakému tolerančnému testu so štandardizovaným jedlom Sustacal* alebo dostali rovnakú intravenóznu dávku glukózy, ako dostali druhý deň. Po odobraní vzoriek sa intravenózne katétre odstránili.

Ako je zrejmé z obr. 10, neboli pri pacientoch liečených ⁵⁰ gg/hodina AC-0137 s dávkou intravenóznej glukózy hladiny glukózy v plazme výrazne odlišné od pacientov liečených placebom. Tieto rozdiely v koncentráciách glukózy po injekcii boli štatisticky významné, keď sa porovnali plochy pod krivkami glukózy skorigovanými o východiskové hodnoty (P = 0,0015). Teda pozorovanie zníženia postprandiálnej hyperglykémie počas aplikácie AC-0137 sa potvrdilo použitím štandardizovaného jedla v prítomnosti významne nižších stredných koncentrácií AC-0137, než aké sa použili predtým.

Avšak, ako je znázornené na obr. 8 a 9, u pacientov, ktorí dostali jedlo Sustacal^R a liečili sa 25 gg/hodina alebo 50 Mg/hodina intravenóznou infúziou AC-0137, boli znížené hladiny glukózy v plazme v prípade pacientov liečených AC-0137 oproti pacientom liečeným placebom.

AC-0137 znižoval v prijateľných farmakologických dávkach postprandiálne koncentrácie glukózy v plazme po orálne prijatých živinách u diabetických pacientov odkázaných na inzulín, nemal však merateľný účinok na koncentrácie glukózy v plazme po aplikácii intravenóznej dávky glukózy. Tieto výsledky sú v súlade s myšlienkou, že AC-0137 modifikuje príjem orálne podaných živín z čreva a naznačujú, že na tomto účinku sa aspoň sčasti podieľa zmena rýchlosti vyprázdňovania žalúdka.

Príklad 4

Náhodne vybraná, dvojnásobne slepá, placebom kontrolovaná paralelná skupina bola určená na stanovenie účinku triproamylínu (AC-0137) na hladiny glukózy v plazme po požití štandardizovaného jedla Sustacal^R (Mead-Johnson). Na 14-dennom klinickom pokuse sa zúčastnilo 72 pacientov s diabetes mellitus závislom na inzulíne. Každý pacient sa náhodne pridelil do jednej zo štyroch liečených skupín, ktoré dostávali počas 14 dní trikrát denne subkutánnou injekciou placebo, 30, 100 alebo 300 Mg triproamylínu. Pacienti zostávali počas štúdie tiež pri svojom zvyčajnom inzulínovom režime. V deň 1 (východiskový stav), 7 a 14 sa uskutočnili tolerančné testy na štandardizované jedlo.

Pri tolerančných testoch na štandardizované jedlo dostali pacienti tekuté jedlo Sustacal* (360 ml obsahujúcich 360 kalórií) o 8. hodine. Od 22. hodín minulého večera nedostali jesť ani piť okrem vody. Pacienti si neaplikovali svoju zvyčajnú rannú dávku inzulínu až do 30 minút pred jedlom Sustacal^R. Z dôvodu testovania východiskového stavu aplikoval sa 1. deň triproamylín (alebo placebo) až po dokončení testovania. 7. a 14. deň sa triproamylín (alebo placebo) aplikovali samostatnou injekciou v rovnakom čase ako zvyčajná ranná dávka inzulínu. Vzorky na stanovenie hladín glukózy v sére sa odobrali v čase -30, 0, 30, 60, 120 a 180 minút vzhľadom na začiatok testu. Za čas nula sa pokladal čas, kedy pacient začal piť jedlo Sustacal®.

Ako je znázornené v nižšie uvedenej tabuľke 1 a na obr. 11 až 13, po 14 dňoch sa pozoroval pri hladinách dávok 30 pq a 100 gg štatisticky významný (p « 0,02) glukózu znižujúci účinok, zmeraný ako plocha pod glukózovou krivkou. Triproamylínom (AC-0137) vyvolané zníženie v ploche pod krivkou (AUC) sprevádzalo priemerné zníženie od 45 mg/dl do 60 mg/dl maximálnych koncentrácií glukózy v krvi pacientov.

Tabulka 1

Zmena v glukóze po jedle (AUC) po 14 dňoch triproamylínu

Dávka triproamylínu podaná 3-krát denne placebo 30 μς 100 μg 300 μg

<	Počet pacientov testovaných 14 dní	21	15	22	12
	Glukóza po jedle: Priemer zmien v AUC (mg/dl* min)(a)	+229	-6645	-6412	-7316
	Hodnoty P oproti placebu (b)	—	0,02	0,02	0,11
	Maximá triproamylínu v plazme (pikomóly/1iter)		22±4	44±4	173±40

(a) AUC je plocha pod krivkou koncentrácie glukózy, ktorá sa týka hodnoty glukózy pred jedlom, medzi začiatkom testovacieho jedla a 3 hodiny neskôr. Zmena v AUC je hodnota pri predávkovaní mínus hodnota 14. deň pre každého pacienta testovaného počas obidvoch dní.

(b) P hodnoty získané z neparametrického Wilcoxonovho testu.

Príklad 5

Nasledujúci deň sa uskutočnila štúdia na preskúmanie účinkov agonistov amylínu na vyprázdňovanie žalúdka na modele hlodavca so spontánnym autoimunitným diabetom, inzulínom liečenej krysy BB.

Použili sa samci krýs Harlan Spraque Dawley (HSD) s hmotnosťou 161 až 244 g a Biobreeding (BB)) s hmotnosťou 181 až 405 g, ktorí sa odchovali vo vlastnom laboratóriu z kolónie, ktorá sa pôvodne získala v roku 1989 z Hollegard Breeding najmenej počas 2 dní glykozúriou boli diabetické, liečili sa denne ľudského rekombinantného inzulínu Indianapolis). Inzulínová ale minimalizovať ketóny

Center, Dánsko. Keď sa potvrdilo, že krysy BB subkutánnymi injekciami ultralente (Humulin-U, Eli Lilly, liečba mala za cieľ udržať glukózu, v moči, aby sa zabránilo hypoglykemickým úmrtiam. V skutočnosti bola prítomná glykozúria pri 88 % meraní a ketonúria pri 52 %. Priemerné trvanie diabetu bolo 53 ± 5 dní a denná spotreba inzulínu predstavovala 4,7 ± 0,3 jednotky. Všetky zvieratá boli ustajnené pri 22,7 ± 0,8 4 ’C pri cykle 12 hodín svetlo, 12 hodín tma, pričom sa pokusy uskutočňovali pri svetelnom cykle, a kŕmili sa a napájali vodou ad libitum (Diét LM-485, Tekland, Madison, WI).

Stanovenie vyprázdňovania žalúdka nižšie opísanou metódou sa zvyčajne uskutočňovalo po hladovaní až 20 hodín na zabezpečenie, aby žalúdok neobsahoval žiadny chýmus, ktorý by rušil spektrofotometrické merania absorbancie. Diabetické krysy liečené inzulínom ultralentne sa však nemohli nechať hladovať 20 hodín. Hladovanie počas obdobia dlhšieho ako 6 hodín malo za následok vznik hypoglykémie. Takéto zvieratá sa preto nechali hladovať iba 6 hodín pred meraním vyprázdňovania žalúdka. Nediabetické krysy sa nechali hladovať 6 alebo 20 hodín pred uskutočnením pokusu. Zistili sme, že i nediabetické krysy BB majú zvýšené koncentrácie glykovaného hemoglobínu. Na porovnanie s diabetickými krysami sa použili ako nediabetické krysy Harlan Spraque Dawley tak i nediabetické krysy BB. Bolo teda 5 liečebných skupín:

(1) nediabetické krysy Harlan Spraque Dawley, ktoré sa nechali hladovať 6 hodín, n = 8, (2) nediabetické krysy BB, ktoré sa nechali hladovať 6 hodín, n = 6, (3) diabetické krysy BB, ktoré sa nechali hladovať 6 hodín, n = 10, (4) nediabetické krysy Harlan Spraque Dawley, ktoré sa nechali hladovať 20 hodín, n = 20, (2) nediabetické krysy BB, ktoré sa nechali hladovať 20 hodín, n = 7.

Krysám sa pri vedomí aplikovalo žalúdočnou sondou 1,5 ml nekalorického gélu obsahujúceho 1,5 % metylcelulózy (M-0262, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) a 0,05 % fenolovej červene ako indikátora. Dvadsať minút po aplikácii žalúdočnou sondou sa krysy anestetizovali pri použití halotánu, žalúdok sa odkryl a zovrel pri pylorickom a ezofágovom sfikteri tepnovými kliešťami, vybral sa a vyprázdnil do alkalického roztoku, ktorý sa zostavil do určeného objemu. Obsah žalúdka sa odvodil podľa intenzity fenolovej červene v alkalickom roztoku, zmeranej absorbanciou pri vlnovej dĺžke 560 nm. Vo väčšine pokusov bol žalúdok číry. Pri iných pokusoch sa jednotlivé žalúdočné obsahy odstredili, aby sa vyčeril roztok na meranie absorbancie. Tam, kde zriedené žalúdočné obsahy zostali kalné, sa spektroskopická absorbancia v dôsledku fenolovej červene odvodila od rozdielu absorbancie v alkalickom a okyslenom rozpúšťadle. Pri separátnych pokusoch na 7 krysách sa žalúdok a tenké črevo excidovalo a vyprázdnilo do alkalického roztoku. Množstvo fenolovej červene, ktoré sa mohlo regenerovať z horného gastrointestinálneho traktu počas 20 minút aplikácie žalúdočnou sondou, predstavovalo 89 ± 4 %. Aby sa vysvetlila maximálna regenerácia farbiva menšia ako 100 %, vyjadrili sa žalúdočné obsahy zostávajúce po 20 minútach ako podiel žalúdočných obsahov získaných z kontrolných krýs utratených ihneď po aplikácii žalúdočnou sondou v rovnakom pokuse.

Pri štúdiách východiskového stavu (kde sa neinjektoval amylín), sa stanovilo vyprázdňovanie žalúdka počas 20 min v 5 liečebných skupinách opísaných vyššie. V štúdiách odozvy na dávku sa krysí amylín (Bachem, Torrance, CA) rozpustil v 0,15 M fyziologického roztoku a aplikoval vo forme 0,1 ml subkutánnej jednorázovej injekcie v dávkach 0, 0,01, 0,1, 1, 10 alebo 100 gg 5 minút pred aplikáciou žalúdočnou sondou 46 nediabetickým krysám Harlan Spraque Dawley, ktoré sa nechali hladovať 20 hodín (n = 17, 2, 8, 8, 6, 5) a 29 diabetickým krysám BB, ktoré sa nechali hladovať 6 hodín (n = 10, -, 3, 3, 3, 10).

V samostatnom pokuse, uskutočnenom s cieľom vyhodnotenia zmeny v koncentráciách amylínu v plazme, ku ktorej došlo v dôsledku účinnej subkutánnej dávky amylínu, sa odobrali vzorky krvi z chvostíkov krýs anestézovaných halotánom po subkutánne j jednorázovej injekcii buď 1 pg (n = 3) alebo 10 μ<3 (n =3) krysieho amylínu. Pri inom pokuse sa koncentrácie amylínu v plazme porovnali pri krysách Harlan Spraque Dawley, ktoré sa nechali hladovať (n = 8) a u diabetických krýs BB, ktoré sa nechali hladovať (n =5). Plazma z 250 pml vzoriek odobraná v 10 minútových intervaloch sa odstredila a zmrazila pri teplote -20 ’C pre analýzu dvojmiestnym imunoenzymometrickým testom vyvinutým vo vlastnom laboratóriu.

Na uskutočnenie imunologického testu sa pokryli čierne mikrotiračné doštičky (Dynatech, Chantilly, VA) protilátkou F020-4.4 (Phelps JL, Blase E, Koda JE, nepublikované) inkubáciou cez noc pri teplote 4 ’C 20 pg protilátky na ml v 50 mM uhličitanu pri pH 9,6. Doštičky sa omyli zmesou 0,05 M Tris/0,15 M chloridu sodného/0,02 % azidu sodného/0,1 % Tween 20 (TBS/Tween) a zasýtili sa 1 % nemastným práškovým sušeným mliekom v rovnakom uhličitanovom pufre počas jednej hodiny pri laboratórnej teplote. Zamrazené vzorky sa nechali rozmraziť a zriedili sa v zmesi 4 % BSA a 200 mg/dl supertráru hovädzieho cholesterolu (Milex Pentax reagents, Miles Laboratories, Kankakee, IL), podľa potreby. Vzorky alebo štandardy sa pridali k pokrytým a zasýteným doštičkám a inkubovali sa pri laboratórnej teplote počas jednej hodiny. Po omytí sa pridala detekčná protilátka F025-27 konjugovaná na alkalickú fosfatázu. Kondenzácia protilátka-enzým sa uskutočnila pomocou konjugačného setu maleínimidovou alkalickou fosfatázou (Pierce Immunochemical Co (Rockfors IL)). Kongugát sa inkuboval počas troch hodín pri laboratórnej teplote, potom sa doštičky dôkladne premyli fyziologickým roztokom pufrovaným Tris. Viazaný enzým sa stanovil inkubáciou doštičiek fluorescentným 4-metylumbeliferylfosfátovým substrátom s 50 pg/ml v 1 M dietylamín/0,5 mM MgCl, pH 9,8 počas 40 minút pri laboratórnej teplote. Fluorescentný signál sa zmeral pomocou prístroja Dynatech Microfluor plate reader a hodnoty sa analyzovali na Multicalc Software (Wallac, Gaithersburg MD). Koncentrácie amylínu vo vzorkách plazmy sa stanovili porovnaním s krivkou štandardov uskutočnenou pri tom istom pokuse. Pri uskutočnení týmto spôsobom má pokus minimálne zistiteľnú koncentráciu 2 pM.

Krivky odozvy na dávku pre vyprázdňovanie žalúdka sa prispôsobili 4-parametrovému logistickému modelu pri použití interačnej rutiny najmenších štvorcov (ALLFIT, v2.7, NIH, MD), aby sa odvodila ED_so. Pretože ED_so je log-normálne rozložené, je vyjadrená ± štandardná odchýlka logaritmu. Porovnanie v pároch sa uskutočnilo pri použití jednocestnej analýzy variácie a Student-Newman-Keulsovho viacnásobného porovnávacieho testu (Instat v2.0, GraphPad Software, San Diego) použitím P < 0,05 ako hladiny významnosti.

Pri 8 krysách Harlan Sprague Dawley, ktoré sa nechali hladovať, predstavovali koncentrácie cirkulujúceho amylínu

11,7 ± 1,4 pM (95 % CI 8,4 až 14,9 pM). Pre porovnanie, koncentrácie amylínu pri 5 spontánne diabetických krysách, ktoré sa nechali hladovať, sa nedali stanoviť.

V nasledujúcej tabuľke 2 sú zaznamenané frakcie farbiva, pretrvávajúceho 20 minút po aplikácii fenolovej červene žalúdočnou sondou, spolu s príslušnými štatistickými porovnaniami. Ako pri krysách Harlan Sprague Dawley tak aj pri diabetických krysách BB bolo vyprázdňovanie farbiva po 20 minútach rovnaké, či sa zvieratá nechali hladovať počas 6 hodín alebo počas 20 hodin. To znamená, že čas hladovania (v rozmedzí 6 až 20 hodín) neovplyvnil, ako sa zdá, významným spôsobom vyprázdňovanie žalúdka, merané touto technikou.

Tabuľka 2

Obsahy žalúdka zostávajúce 20 minút po aplikácii sondou do žalúdka

Nediabetické

HSD

Nediabetické

BB

Diabetické

BB

Hladovanie 20 h

Hladovanie 6 h

54.9 ± 3 % 27 ± n = 20 n =

50.9 ± 4,7 % 38,9 n = 8“ n

3,8 % neuskutočnené 7 ± 9,2 % 9,7 ± 1,7 % = 6“ n = 10^to'^c

Obsahy žalúdkov sú vyjadrené ako podiely tých, ktoré sa dali získať ihneď po zavedení sondy do žalúdka u 2 až 3 separátnych krýs pri tom istom pokuse.

a = nie je odlišné od krýs, ktoré sa nechali hladovať 20 hodín b = odlišné od krýs HSD, ktoré sa nechali hladovať 6 hodín (P < 0,001) c = odlišné od nediabetických krýs BB, ktoré sa nechali hladovať 6 hodín (P < 0,001)

Stojí za zmienku, že vyprázdňovanie žalúdka bolo u diabetických krýs BB významne rýchlejšie (P < 0,01 a6 0,001) ako u ktorejkoľvek z ostatných 4 liečených skupín (t.j. nediabetických zvierat). Z pozorovaní, že diabetické krysy BB majú väčšiu rýchlosť vyprázdňovania žalúdka ako nediabetické krysy BB možno usudzovať, že toto pozorovanie súvisí s prítomnosťou diabetu a nie je spojené len s kmeňom BB.

Vzhľadom k vyššie uvedeným metodologickým rozpakom sa účinky amylínu skúmali na nediabetických krysách Harlan Sprague Dowley, ktoré sa nechali hladovať počas 20 hodín. Keď sa amylínové subkutánne injekcie aplikovali 5 minút pred zavedením fenolovej červene ako indikátora sondou do žalúdka, došlo k potlačeniu vyprázdňovania obsahu žalúdka, ktoré záviselo od dávky. Potlačenie vyprázdňovania žalúdka bolo také, že farbivo, ktoré sa mohlo získať od normálnych krýs HSD, ktorým sa podal 1 μ<3 amylínu, a od diabetických krýs, ktorým sa podalo 10 μς bolo rovnaké, aké bolo možné získať hneď po aplikácii žalúdočnou sondou (0 = 0,22, 0,14). Dávka, pri ktorej sa pozorovalo 50 % maximálnej zmeny vo vyprázdňovaní žalúdka (ED_so) u normálnych krýs, bola 0,43 μ% (0,6 nmol amylínu na kg telesnej hmotnosti) ± 0,19 log jednotiek. U diabetických krýs bolo ED_bq na potláčanie vyprázdňovania žalúdka

2,2 μ% (2,3 nmol/kg) ± 0,18 log jednotiek. Z vynesených kriviek, znázornených na obr. 14, sa dá usúdiť, že dávka amylínu -2 gg podaná diabetickej kryse by upravila vyprázdňovanie žalúdka na rýchlosť pozorovanú pre normálne krysy, ktorým sa nepodal amylín.

Ako je znázornené na obr. 15, keď sa 3 krysám aplikovalo subkutánne injekčné 1 μg krysieho amylínu, bola koncentrácie plazmy zmeraná po 10 minútach 66 ± 10 pH a maximálna koncentrácia v 20. minúte bola 74 ± 26 pM. U troch krýs, ktorým sa injekčné aplikovala jednorázová dávka 10 μg subkutánne, boli zodpovedajúce 10. a 20. minútové koncentrácie 347 ± 43 pH a 301 ±57 pH. Subkutánna dávka amylínu 1 μg, ktorá potláča vyprázdňovanie žalúdka o -50 % počas 20 minút (ED_bo), musí začať pôsobiť čoskoro po injekcii, aby mala účinok po 20 minútach. Napríklad účinok, ktorý začal okolo 20. minúty po injekcii, by nebol v tomto systéme zabezpečený. Z toho vyplýva, že 50 % koncentrácie v plazme, účinné pri potlačení vyprázdňovania žalúdka (ED ), sa vyskytovali oveľa skôr, ako sa dosiahli maximálne koncentrácie v plazme, 74 pH, a preto boli oveľa nižšie ako 74 pH.

Výsledky týchto pokusov ukazujú, že amylín potláča vyprázdňovanie žalúdka vo veľkej miere a nezávisle od dávky.

Príklad 6

Pokusy opísané v tomto príklade sa uskutočnili, aby sa preskúmali účinky antagonistu receptora amylínu na toleranciu na orálnu glukózu a absorpciu trícia odvodeného od orálneho podania značenej glukózy.

Príjem dávky značenej glukózy sa zmeral u 11 korpulentných krýs (500 až 600 g) LA/N, ktoré sa nechali hladovať 24 hodín, pri dvoch príležitostiach so 14 hodinovou prestávkou. Pri jednej príležitosti sa krysám aplikovali injekčné subkutánne 3 μ<3 selektívneho antagonistu amylínu AC-0187 (ac^loN^32YS_32 lososí kalcitonín).3 minúty pred aplikáciou sondou do žalúdka. Pri druhej príležitosti sa krysám vopred aplikovala injekcia samotného fyziologického roztoku ako nosiča. Krysám sa aplikovalo sondou do žalúdka 5 μϋί (3³H) glukózy v 1 ml 50 % glukózy. Vzorky krvi sa odobrali z chvostíkov anestézovaných krýs 0, 15, 30, 40, 90 a 120 minút potom, ako sa uskutočnila aplikácia 33H glukózy a zisťoval sa v nich obsah trícia odvdeného od glukózy a glukózy.

Predbežná injekcia antagonistu amylínu, AC-0187, urýchlila objavenie sa od glukózy odvodeného trícia v plazme o 48 % 15 minút po aplikácii žalúdočnou sondou (P < 0,02) a o 45 % (P < 0,001) 30 minút po aplikácii sondou (zdvojený t-test). Predbežná injekcia AC-0187 viedla tiež k väčšiemu zvýšeniu glukózy v plazme 15 minút po aplikácii 0,5 g glukózy sondou do žalúdka (5,89 ± 0,17 až 8,33 ± 0,28 mM oproti 5,83 ± 0,22 až 6,83 ± 0,28 mM, P < 0,001, zdvojený t-test). Okrem toho u zvierat liečených AC-0187 poklesla glukóza v plazme skôr (6,89 ± 0,28 oproti 8,17 + 0,39 mM 60 minút po aplikácii glukózy žalúdočnou sondou, P < 0,001, zdvojený t-test).

Teda u korpulentných krýs LA/N zvýšil selektívny antagonista amylínu rýchlosť objavenia sa značenej glukózy v plazme po orálnej dávke glukózy a tiež zvýšil rýchlosť rastu a poklesu koncentrácie neznačenej glukózy v plazme. Tieto údaje súhlasia s tým, že antagonista amylínu pôsobí proti účinku endogénne vylučovaného amylínu a tým urýchľuje vyprázdňovanie žalúdka.

Claims (21)

1. Použitie amylínu alebo agonistu amylínu na prípravu liečiva na priaznivú reguláciu gastrointestinálnej motility jedinca .

2. Použitie amylínu alebo agonistu amylínu podľa nároku 1, pričom priaznivá regulácia gastrointestinálnej motility spočíva v znížení žalúdočnej motility tohto jedinca.

3. Použitie amylínu alebo agonistu amylínu podľa nároku 1, pričom priaznivá regulácia gastrointestinálnej motility spočíva v oddialení vyprázdňovania žalúdka tohto jedinca.

4. Použitie amylínu alebo agonistu amylínu podľa niektorého z nárokov 1, 2 alebo 3, pričom sa tento jedinec podrobuje gastrointestinálnemu diagnostickému vyšetreniu.

5. Použitie amylínu alebo agonistu amylínu podľa nároku 4, pričom týmto gastrointestinálnym diagnostickým vyšetrením je rôntgenové vyšetrenie alebo vyšetrenie zobrazením magnetickou rezonanciou.

6. Použitie amylínu amylínu alebo agonistu amylínu podľa niektorého z nárokov 1, 2 alebo 3, pričom žalúdočná motilita je sprevádzaná gastrointestinálnou poruchou.

7. Použitie amylínu alebo agonistu amylínu podľa nároku 6, pričom gastrointestinálnou poruchou je spazmus.

8. Použitie amylínu alebo agonistu amylínu podľa nároku 7, pričom tento spazmus je spojený s poruchou zo skupiny zahŕňajúcej akútnu divertikulitídu alebo poruchu žlčových ciest alebo poruchu Oddiho sfinktera.

9. Použitie agonistu amylínu alebo na prípravu liečiva na liečenie postprandiálneho dumping syndrómu jedinca.

10. Použitie agonistu amylínu 1 na prípravu liečiva na liečenie postprandiálnej hyperglykémie.

11. Použitie podľa nároku 10, pričom agonistom amylínu je amylin.

12. Použitie podľa nároku 11, pričom agonistom amylínu je krysí amylín.

13. Použitie agonistu amylínu na prípravu liečiva na liečenie postprandiálnej hyperglykémie, ktorá je dôsledkom diabetes mellitus typu 2.

14. Použitie antagonistu amylínu na prípravu liečiva na liečenie žalúdočnej hypomotility jedinca.

15. Použitie antagonistu amylínu na prípravu liečiva na urýchlenie vyprázdňovania žalúdka jedinca.

16. Použitie antagonistu amylínu podľa nároku 14 alebo 15, pričom táto hypomotilita je dôsledkom diabetickej neuropatie alebo anorexie nervosa.

17. Použitie agonistu amylínu podľa nárokov 1 až 3, 9, 10 alebo 13, pričom týmto agonistom amylínu je ^25,28'²⁹Pro-h-amylín .

18. Použitie antagonistu amylínu podľa niektorého z nárokov 14 až 16, pričom týmto antagonistom amylínu je antagonista receptora amylínu.

19. Použitie antagonistu amylínu podľa nároku 18, pričom týmto antagonistom pričom týmto antagonistom amylínu je acetyl^11,18Arg, ³⁰Asn, ³²Tyr-^9-32kalcitonín (lososí).

20. Použitie amylínu alebo agonistu amylínu na prípravu lieči51 va na elimináciu dôsledkov perorálnej intoxikácie, pričom tento amylín alebo agonista amylínu sú podávané v množstve dostatočnom na prevenciu alebo redukciu prechodu obsahu žalúdka do čriev a obsah žalúdka sa odsaje.

21. Použitie amylínu alebo agonistu amylínu podľa nárokov 1, 9, 10 alebo 13, pričom agonistom amylínu nie je CGRP alebo kalcitonín.