HUT73490A - Methods for regulating gastrointestinal mobility - Google Patents

Description

Eljárás a gyomor-bél rendszer mozgásának szabályozására

A találmány az 1993. szeptember 7-én benyújtott 08/118,381 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés folytatása, amely bejelentést referenciaként adunk meg.

A találmány tárgya

A találmány tárgya eljárás gyomor-bél rendszer mozgásának szabályozására. Részletesebben a találmány tárgya eljárás amylin és amylin agonisták alkalmazására olyan betegségek kezelésében, amelyek esetében a gyomor kiürülést késleltető és/vagy lassító hatóanyagok adagolása előnyös. A találmány tárgya továbbá amylin antagonisták alkalmazása a gyomor kiürülés gyorsítására, például a lassú gyomorműködés kezelésében, illetve ezzel kapcsolatos betegségek kezelésében.

A találmány háttere

Amylin

Az amylin egy 37 aminosavból álló protein hormon. Az amylint a humán 2 típusú diabetikus hasnyálmirigy szigetek amyloid leválásából mint fő komponenst izolálták és tisztították, valamint kémiailag jellemezték [Cooper és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84:8628-8632 (1987)]. Az amylin molekula két jelentős módosítással rendelkezik: C-terminális helyzet amidéit, továbbá a 2 és 7 helyzetben található cisztein-egységek keresztkötéssel rendelkeznek és egy N-terminális láncot képeznek. A humán amylin gén nyitott leolvasási • · · · ····

- 2 váz szekvenciája egy Lys-Arg dibázisos aminosav fehérjebontó hasítási jelet mutat az N-terminális kodon előtt, amely a Lys kondonja, továbbá Gly-t találhatunk a Lys-Arg fehérjebontó jel előtt a CLAIMS-terminális helyzetben. Ez jellemző szekvencia a PAM fehérje amidáló enzimmel történő amidáláshoz [Cooper és munkatársai, Biochem. Biophys. Acta, 1014:247-258 (1989)]. Az amylint leírák az 1987. április 27-én benyújtott 8709871 számú nagy-britanniai szabadalmi bejelentésben, valamint az ehhez kapcsolódó 1988. április 27-én benyújtott é, 1988. november 23-án benyújtott, továbbá 1989. május 2-án benyújtott amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésekben.

Az 1 típusú diabetes esetében kimutatták, hogy az amylin ugyancsak csökkentett és hiányos koncentrációjú és javasolták, hogy az inzulinnal együtt kombinált helyettesítési terápiát alkalmazza, amely például az alacsony vércukorszint epizódok csökkentésében előnyösebb mint az egyedül inzulinnal történő kezelés. A diabetes mellitus amylinnel történő kezelését írták le G.J.S. Cooper az 1987. augusztus 26-án benyújtott 8720115 számú nagy-britanniai szabadalmi bejelentésben, továbbá az 1988. augusztus 26-án benyújtott 236,985 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben. Amylint, illetve amylint és inzulint tartalmazó gyógyszerkészítményeket írtak le az 1992. június 23-án benyújtott 5,124,314 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben.

A felesleg amylin hatása a 2 típusú diabetest modellezi és az amylin gátlást javasolják, mint terápiás stratégiát. G.J.S. Cooper és munkatársai az 1988. november 23-án benyújtott kapcsolódó 275,475 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben leírták (amelyet referenciaként adunk meg), hogy az amylin a vázizom glükogénjében az alap illetve az inzulin stimulált jelzett glükóz beépülést egyaránt csökkenti. Leírták továbbá, hogy ezt

62.166/SM • · · · ···· a hatást a CGRP is mutatja [lásd Leighton, B. and Coopor, G.J.S., Natúré, 335:632-635 (1988)]. Az amylin és a CGRP körülbelül azonos hatásosságú és

1-10 nm koncentrációban jelentős aktivitást mutat. Az amylinről továbbá leírták, hogy csökkenti a vázizomba történő inzulin stimulált glikóz felvételt, továbbá csökkenti a glükogén tartalmat [Young és munkatársai, Amer· J, Physiol. 259:457-46-1 (1990)]. A 2 típusú diabetes továbbá az inzulin rezisztencia amylin antagonistákkal történt kezelését is leírták.

Az amylin kémiai szerkezete, illetve a gén szekvencája alátámasztja azt a megállapítást, hogy a vegyület biológiailag aktív vagy más néven „messenger” molekula. Az amylin kémiai szerkezete kb. 50%-ban megegyezik a calcitonin-génnel kapcsolatos peptidekével (CGRP), ez is egy 37 aminosavból álló fehérje, amely széles körű neurotranszmitter és számos más hatásos biológiai aktivitással, beleértve az értágítást is, rendelkezik. Az amylin és a CGRP egyaránt tartalmaz ²Cys-⁷Cys diszulfid hidat és C-terminális amid-csoportot, amelyek egyaránt jelentős szerepet játszanak a biológiai aktivitásban [Cooper és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci., 85-7763-7766 (1988)].

Az amylin valószínűleg egy rokon peptidcsalád tagja, amelybe beletartoznak a CGRP, az inzulin, az inzulinszerű növekedési faktorok és a relaxinok. Ezek mindannyian azonos genetikai kód körbe tartoznak [Cooper, G.J.S. és munkatársai Proc. Growth Factor Research 1:99-105 (1989)]. A calcitonin és a CGRP-1 a calcitonin génen azonos forrásból származik, ahol az elsődleges mRNS transzkripciójának váltakozó feldolgozása a két elkülönülő pepid képződéséhez vezet, amely peptidek csak limitált szekvenciában homológok (kb. 30% mértékben) [Amara, S.G. és munkatársai, Science, 229:1094-1097 (1985)]. Az amylin gén szekvencia jellemző a kiválasztott messenger fehérjék gén szekvenciájára, amelyben megtalálhatók a prepropeptidet kódoló MRNS,

62.166/SM

- 4 továbbá a kiválasztott fehérje termelésének feldolgozó helyzetei, amely feldolgozás a Golgi-ban vagy kiválasztó szemcsékben történik. Az amylin az inzulinnal együtt helyezkedik el a béta sejt szemcsékben és valószínűleg megosztott fehérjebontó feldolgozó enzimekkel rendelkezik, amelyek egyben a proinzulinból az inzulint előállítják.

Az amylin elsősorban a hasnyálmirigy béta sejtekben keletkezik és általában kiválasztása táplálék ingerre, mint például glükóz és arginin ingerre következik be. A klónozott béta sejt tumor vonalak tanulmányai [Moore és munkatársai, Biochem. Biophys. Rés. Commun., 179(19) (1991)], az izolált szigetek vizsgálata [Kanatsuka és munkatársai, FEBS Lett., 259(1), 199-201 (1989)], valamint a perfúzióval kezelt patkány hasnyálmirigy vizsgálata [Ogawa és munkatársai. J. Clin. Invest., 85:973-976 (1990)] kimutatták, hogy 10-20 perces rövid pulzusként adagolt tápanyag kiválasztási inger anyagok adagolása, amely lehet glükóz és arginin stimulálja az amylin, továbbá az inzulin kibocsátást. A kiválasztott fehérjék amylin:inzulin molaránya a különféle preparátumok függvényében körülbelül 0,01-0,4 között változik, azonban nem nagymértékben változik a különféle inger anyagok alkalmazása függvényében, bármely készítmény esetében. Azonban amennyiben magas koncentrációjú glükózzal hosszabb idejű stimulálást végeznek, az amylin:inzulin arány fokozatosan növekszik [Gedulin és munkatársai, Biochem. Biophys. Rés. Commun., 180(1): 782-789 (1991)]. Valószínűleg mivel a gén expresszálás és a transzláció sebessége egymástól függetlenül szabályozott, az amylin és inzulin nem minden esetben konstans arányban választódik ki.

Az amylin típusú immuno-reaktivitást rágcsálókban és emberekben keringési vérben mérték különféle radioimmun tesztvizsgálatokkal, amelyek mindegyikében patkány anti-amylin antiszérumot alkalmaztak. A legtöbb kísér62.166/SM ···· ····

- 5 letben extrakciót és bepárlási eljárást vagy koncentrálási eljárást is alkalmaztak abból a célból, hogy a tesztvizsgálat érzékenységét növeljék. Normál ember esetében az éhezés során az amylin koncentráció 1-10 pm és az étkezés utáni vagy glükóz kezelés utáni amylin koncentráció 5-20 pm volt [pl. Hartter és munkatársai, Diabetoloqia, 34:52-54 (1991); Sanke és munkatársai, Diabetoloqia, 34:129-132 (1991); Koda és munkatársai, The Láncét, 339:11791180 (1992)]. Az elhízott inzulin-rezisztens egyedek esetében a táplálkozás utáni amylin koncentráció magasabb is lehet és akár kb. 50 pm értéket is elérhet. Összehasonlítás céljából az éhezési, illetve a táplálkozás utáni inzulin érték sorrendben 20-50 pm közötti, illetve 100-300 pm közötti. Ez egészséges emberek esetében áll fenn. Amennyiben inzulin-rezisztens emberekben ezt a vizsgálatot elvégezték, körülbelül 3-4-szeresen magasabb koncentrációt mértek. Az 1 típusú diabetes esetében, amelynek során a béta sejtek lebomlottak, az amylin koncentráció a detektálás érzékenységének határértéke vagy ez alatti és glülóz kezelés hatására nem növekszik [Koda és munkatársai, The Láncét, 339, 1179-1180 (1992)]. Normál egerekben és patkányokban az alap amylin koncentráció 30-100 pm volt és bizonyos inzulin-rezisztens diabetesben szenvedő rágcsáló törzsek esetében egészen 600 pm magasságú koncentráció értéket is mértek [pl. Huang és munkatársai, Hypertension, 19:1-101-1-109 (1992); Gill és munkatársai, Life Sciences, 48:703-710 (1991)].

Kimutatták, hogy az amylin bizonyos hatásai hasonlóak a CGRP, illetve a calcitonin esetében mért ismert nem-metabolitikus hatásokhoz. Azonban az újonnan azonosított protein vizsgálata során az amylin metabolitikus hatásai valószínűleg elsődleges biológiai szerepét mutatják. Legalábbis néhány metabolitikus hatást a CGRP mimézisével lehetett kifejteni, azonban ilyen esetekben olyan dózist kellett alkalmazni, amelyek jelentős értágító hatást is okoznak

62.166/SM ···· ·

- 6 [lásd pl. Leighton és munkatársai, Natúré, 335:632-635 (1988); Molina és munkatársai, Diabetes, 39:260-265 (1990)].

Az amylin elsőként kimutatott hatása, hogy patkányok váz izomzatában csökkenti a glükóz glükogénbe történő inzulin stimulált beépülését [Leighton és munkatársai, Natúré, 335:632-635 (1988)]; az izom „inzulin-rezisztenssé” vált. Patkány talpemelő izommal végzett további kísérletekben ex-vivo és in vitro esetben is kimutatták, hogy az amylin csökkenti a glükogén-szintetáz aktivitást, elősegíti a glükogén-foszforiláz konverzióját az inaktív b formából az aktív a formává, elősegíti a glükogén nettó veszteséget (inzulin jelenlétében vagy anélkül), növeli a glükóz-6-foszfát koncentrációt és növelheti a laktát termelést [lásd pl. Deems és munkatársai, Biochem. Biophys. Rés. Commun., 181(1): 116-120 (1991); Young és munkatársai, FEBS Letts, 281 (1,2):149-151 (1991)]. Az, hogy az amylin közrejátszik a glükóz transzportban, még nem bizonyított [lásd pl. Young és munkatársai, Am. J. Physiol, 259:E457-E461 (1990); Zierath és munkatársai, Diabetoloqia, 35:26-31 (1992)]. Az amylin és az inzulin dózis-válaszfüggvény vizsgálatai kimutatták, hogy az amylin nem kompetitív vagy funkcionális antagonistaként hat az inzulinnal szemben a váz izomzatban [Young és munkatársai, Am. J. Physiol,, Am. J. Physiol., 263(2): E274-E281 (1992)]. Nincs bizonyíték arra, hogy az amylin valamilyen módon befolyásolja az inzulin kötődést ezeken a receptorokon vagy az inzulin receptor tirozin-kináz ezt követő aktivitásával kapcsolatosn hatást fejtene ki [Follett és munkatársai, Clinical Research 39(1):39A (1991); Koopmans és munkatársai, Diabetoloqia, 34, 218-224 (1991)]. Az amylin hatása a vázizomzatra hasonlít az adrenalin (epinefrin) hatására. Azonban, míg az adrenalin hatása valószínűleg nagyban cAMP által médiáit, néhány kísérletben kimutatták, hogy az amylin hatása nem cAMP által médiáit [lásd Deems és munkatársai, Biochem.

62.166/SM

- 7 Biophys. Rés. Commun., 181(1):116-120 (1991)]. Más kutatók leírták, hogy az amylin aktiválja az adenil-ciklázt és megnöveli a cAMP koncentrációt a vázizomban [Moore és Rink, Diabetes 42:5,821 Június (1993)]. Ez a hatás konzisztens azzal, hogy valóban az amylin a cAMP-függő proteinkináz foszforilezésén keresztül hat a szintáz és a foszforiláz enzimekkel kapcsolatos a glükogén metabolizmusra.

Feltételezik, hogy az amylin a plazma membránokban jelenlevő receptorokon keresztül fejti ki hatását. Leírták, hogy az amylin a vázizomban egy receptor-mediált mechanizmus segítségével fejti ki hatását, amely a sebesség limitáló enzim aktiválásával, azaz a glükogén lebomlást befolyásoló foszforiláz a enzim aktiválásával megnöveli a glükogenolízist [Young A. és munkatársai, FEBS Letts., 281:149-151 (1991)]. Az amylinnel, a CGRP-vel és a ⁸'³⁷CGRP antagonista hatásával kapcsolatos vizsgálatok azt mutatják, hogy az amylin saját receptorán keresztül fejti ki hatását [Wang és munkatársai, FEBS Letts., 219:195-198 (1991 b)]. Ez ellentmond annak, a más kutatók által levont következtetésnek, miszerint az amylin lehetséges, hogy elsősorban a CGRP receptorokra fejti ki hatását [pl. Chantry és munkatársai, Biochem. J., 277:139-143 (1991); Galeazza és munkatársai, Peptides, 12:585-591 (1991); Zhu és munkatársai, Biochem. Biophys. Rés. Commun., 177(2):771776 (1991)]. Újabb vizsgálatokban megvizsgálták, hogy az amylin receptorokat és ezek alkalmazását különféle screenelési és tesztvizsgálati eljárásokban, amelyekben amylin agonista és antagonista vegyületeket vizsgáltak, (az 1992. október 1-jén közzétett PCT/US92/02125 számú nemzetköz szabadami bejelentés, amelynek címe „Receptor-alapú screenelési eljárások amylin agonista és antagonista anyagok esetében”).

62.166/SM ·· ···· ····

Az amylin igen jelentős hatást fejt ki a máj tápanyag metabolizmusára in vivő körülmények között, azonban nincs általános bizonyíték és egyetértés abban, hogy az amylin milyen hatást fejt ki izolált hepatocitákra vagy perfúzióval kezelt májra. A rendelkezésre álló adatok nem bizonyítják azt az elméletet, hogy az amylin elősegíti a májban történő glükogenolízist, azaz mint glükagon fejti ki hatását [pl. Stephens és munkatársai, Diabetes, 40:395-400 (1991); Gomez-Foix és munkatársai, Biochem J., 276:607-610 (1991)]. Feltételezik, hogy az amylin valószínűleg úgy hat a májra, hogy elősegíti a laktát glükogénné történő konverzióját és megnöveli a glükagon segítségével felszabadítható glükóz mennyiségét [lásd Roden és munkatársai, Diabetoloqia, 35:116-120 (1992)]. Ebből eredően az amylin az inzulinnal szemben a májban valószínűleg anabolitikus partnerként viselkedik, ezzel szemben katabolitikus hatást fejt ki az izomban.

Újabb kísérletekben leírták éber patkányokban az amylin hatását a regionális hemodinamikus folyamatokra, beleértve a vese véráramot is [Gardiner és munkatársai Diabetes, 40:948-951 (1991)]. A szerzők leírták, hogy a patkány amylin infúziója nagyobb mértékű vese értágítást és kisebb mértékű bélfodor érszűkületet okozott, mint a humán α-CGRP infúziójánál tapasztalt értékek. Azt a következtetést vonták le, hogy az amylin a vese vérbőséget nagyobb mértékben növeli, mint az α-CGRP és így a patkány amylin kevéssé jelentős stimulálást okoz a renin-angiotenzin rendszerben. Ebből eredően kisebb másodlagos angiotenzim Il-mediált érszűkületet eredményez. Ugyancsak kimutatták, hogy a humán a-⁸’ ³⁷CGRP és a patkány amylin együttes infúziója során a renális és a bélfodor érszűkület nem maszkírozott, feltehetően amiatt, mert a II angiotenzin előre nem látható érszűkítő hatást fejt ki. Ez a kísérleti eredmény

62.166/SM

- 9 hasonló ahhoz, amit akkor tapasztaltak, amikor humán A-CGRP és humán cc-⁸'³⁷CGRP együttes infúziót végeztek (mint fent 951. oldal).

A zsírsejtekben az izomban kifejtett adrenalin-szerű hatásával ellentétben, az amylin nem hat mérhető módon az inzulin stimulált glükóz felvételre, a glükóz trigliceridbe történő beépülésére, illetve a széndioxid termelésre [Cooper és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci., 85:7763-7766 (1988)], továbbá az epinefrin-stimulált lipolízisre vagy a lipolízis inzulin-inhibiálásra [Lupien J.R. és Young, A.A., „Diabetes nutrition and metabolism - Clinical and Experimental”, Vol. 6(1), 13-18. old. (1993. február)]. A kísérleti eredmények alapján az amylin valószínűleg szövet specifikus hatásokat fejt ki, amelyek: közvetlen hatás a váz izomzatra, jelentős indirekt (a szubsztrát szolgáltatáson keresztül történő) és valószínűleg direkt hatás a májra, ugyanakkor az adipociták láthatóan nem érzékelik az amylin jelenlétét vagy ennek hiányát. Az amylin direkt hatása a vese szövetekre nem mutatható ki.

A kísérletek során kimutatták, hogy az amylin jelentős hatást fejt ki az inzulin szekrécióra. Izolált szigetekben [Ohsawa és munkatársai, Biochem. Biophys, Rés. Commun., 160(2):961-967 (1989)] perfúzióval kezelt hasnyálmirigyben [Silvestre és munkatársai, Reg. Pept., 31-23-31 (1990)] és intakt patkányban [Young és munkatársai, Mól, Cell. Endocrinol., 84:R1-R5 (1992)] végzett bizonyos kísérletek azt jelzik, hogy az amylin alul szabályozza az inzulin szekréciót. A perfúziós hasnyálmirigy kísérletekben azt tapasztalták, hogy szelektív alulszabályozás történik a glükóz hatására létejövő szekrécióra, ugyanakkor az arginin hatására létrejövő válaszfüggvény semmilyen befolyásolása nem történik. Egyéb kísérletekben azonban a kutatók nem tudtak kimutatni amylin hatást izolált β-sejteken, izolált szigeteken vagy a teljes állatban

62.166/SM • ·· · ··«·

- 10[lásd Broderick és munkatársai, Biochem. Biophys, Rés. Comm., Vol. 177:932938 (1991) és az ott idézett referenciák],

A legmeglepőbb hatás, amelyet az amylin in vivő kísérletekben kifejt, a plazma laktát tartalmának éles megnövelése, illetve stimulálása, amelyet ezután a palzma glükóz tartalmának növekedése is követ [Young és munkatársai, FEBS Letts., 281(1,2):149-151 (1991)]. Kimutatták, hogy a megnövelt laktát koncentráció szubsztrátot szolgáltat a glükóz termeléshez és az amylin hatása független lehet az inzulin vagy glükagon változástól. A „glükóz elzárás” kísérletekben az amylin infúzió „inzulin rezisztenciát” okoz, mivel csökkenti a perifériás glükóz rendelkezése álló mennyiségét, továbbá a máj glükóz kimenet inzulin-médiáit szupresszióját is limitálja [pl. Frontoni és munkatársai, Diabetes, 40:568-573 (1991); Koopmans és munkatársai, Diabetoloqia, 34, 218-224 (1991)].

Enyhén érzéstelenített patkányokban, amelyeket 18 órán át éheztettek abból a célból, hogy a máj glükogén tartalékukat lecsökkentsék, az amylin injekció a plazma laktát koncentrációt, stimulálással kb. 0,6 mmol értékről 1,5 mmol értékre növelte, amelyet ezután a plazma glükóz koncentráció hosszú időn történő növekedése követett (kb. 6 mmol értékről 11 mmol értékre). Ezt a hatást intravénás és szubkután injekció alkalmazásával is kimutatták [Young és munkatársai, FEBS Letts., 281(1,2):149-151 (1991)]. A táplált állatokon kifejtett amylin hatás mennyiségileg eltér az éheztetett állatokon kifejtett hatástól. Táplált patkányokban, amelyek feltehetően normális más glükogén tartalékkal rendelkeznek, az amylin egy jelentősebb és határozottabb, valamint hosszabb ideig tartó plazma laktát növekedést okozott; azonban csak igen kis mértékű növekedést tapasztaltak a plazma glükóz tartalmában. Feltételezték, hogy az amylin elősegíti a Cori ciklus „visszatérő ágát”, azaz a laktát lebomlása révén

62.166/SM

az izom glükogén szubsztrátot szolgáltat a máj glükogenézisében és glükogén termelésben, valamint valószínűleg a triglicerid szintézisben. Az inzulin a ciklus első részét, azaz a glükóz izomba történő felvételét, valamint az izom glükogén termelését szabályozza. Ebből eredően az inzulin és az amylin mint közös hatóanyagok tekinthetők, amelyek együttesen az „indirekt” étkezés utáni máj glükogén telítettség utat szabályozzák. Az izomban és a májban az „inzulin rezisztencia” valószínűleg normál alatti lehet és fiziológiai szabályozással az amylin függvénye.

Az amylin nem metabolitikus hatásai közé tartozik az értágító hatás is, amelyet valószínűleg a CGRP érrendszeri receptorokkal történő kölcsönhatása médiái. In vivő tesztvizsgálatokban leírták, hogy az amylin legalább körülbelül 100-1000-szer kisebb hatású értágító szer, mint a CGRP [Brain és munkatársai, Eur. J. Pharmacol., 183:221 (1990); Wang és munkatársai, FEBS Letts., 291:195-198 (1991)]. Amenyiben agyban injekció formájában alkalmazzák, az amylinről kimutatták, hogy ez csökkenti .a tápanyag felvételt [pl. Chance és munkatársai, Brain Rés., 539, 352-354 (1991)]. Ezt a hatást mutatja egyébként a CGRP és a calcitonin is. Az a hatásos koncentráció, amely a sejtekben ezt a hatást mediálja, nem ismeretes. Az amylinről továbbá kimutatták, hogy izolált osteoclast sejtekre sejtnyugalmat előidéző hatást fejt ki, továbbá in vivő a plazma kálcium tartalmát patkányokban, nyulakban, illetve Paget kórban szenvedő emberekben egészen 20%-kal csökkenti [lásd pl. Gilbey és munkatársai, J. Boné Mineral Rés., S293 (1991)]. A közölt adatok szerint az ilyen hatásokban az amylin kb. 10-30-szorosan kevésbbé aktív, mint a humán calcitonin. A kísérletek során továbbá kimutatták, hogy az amylin megnöveli az osteoclast CAMP termelést, azonban nem növeli meg a cytosoliás Ca²⁺ koncentrációt, ugyanakkor a calcitonin mindkettő növekedését előidézi [Álam és munkatársai,

62.166/SM ··♦· ····

- 12Biochem. Biophys. Rés. Commun, 179(1):134-139 (1991)]. Nem bizonyított, azonban feltételezett ennek alapján, hogy a calcitonin valószínűleg két receptor típuson keresztül fejti ki hatását, míg az amylin valószínűleg csak egy ilyen receptorhoz kötődik.

A glüko-szabályozás megváltoztatására alkalmas amylin receptor antagonisták alkalmazása. Kimutatták, hogy a ⁸'³⁷CGRP amylin blokkoló hatású in vitro és in vivő körülmények között [Wang és munkatársai, Biochem. Biophys, Rés. Commun, 181(3):1288-1293 (1991)], továbbá azt találták, hogy táplált patkányokban arginin infúzió után megváltoztatja a glüko-szabályozást [Young és munkatársai, Mól. Cell. Endocrinol., 84:R1-R5 (1992)]. A kezdeti glükóz koncentráció növekedést azzal magyarázták, hogy a sziget alfa-sejtekben arginin-stimulált glükagon szekréció történik; ezt követően az alap glükóz koncentráció visszaállását azzal magyarázták, hogy az inzulin hatást fejt ki, továbbá egyéb glüko-szabályozó hormonokban is változás történik. Amennyiben ⁸‘³⁷hCGRP előzetes infúzió segítségével az amylin hatását blokkolták, a kezdeti glükóz koncentráció növekedése nem jelentősen változott, azonban a glükóz koncentrációban jelentős csökkenés mutatkozott az alapszint alá, amely koncentráció kb. 80 perc múlva állt vissza az alapszínre. A kísérletek alapján megállapíthatjuk, hogy a fenti kezelésből eredő glüko-szabályozás egy sziget szekréció-stimulálóval megváltozhat egy amylin receptor antagonista infúziós adagolásával. Ezen túlmenően az inzulin koncentrációkat fél órás időközökben mérték és azt találták, hogy az arginin infúziót követő 30 percen belül az inzulin koncentráció kb. kétszerese volt, mint olyan állatokban, amelyeket amylin receptor antagonistával infúzió formájában kezeltek és amelyeket normál kontrolnak tekintettek. A ⁸’³⁷CGRP ugyancsak hatásos CGRP antagonista anyag. Azonban a kísérletek során hasonló eredményeket tapasztaltak egy másik

62.166/SM

- 13amylin antagonista, az AC66 alkalmazásakor, amely az amylin receptorokra a CGRP receptorokkal összehasonlítva szelektív hatást fejt ki [Young és munkatársai, Mól. Cell. Endocrino., 84:R1-R5 (1992)]. Ezek az eredmények alátámasztják azt a feltételezést, hogy az amylin hatás blokkolása igen jelentős terápiás előnnyel járhat a 2 típusú diabetes kezelésében.

Az 1 típusú diabetesben szenvedő betegekről kimutatták, hogy az inzulin hiányon kívül jelentős amylin hiánnyal is rendelkeznek. Mint korábbi közleményeket idézve leírtuk, az amylin expresszálás és kiválasztás a hasnyálmirigy béta-sejtek által az 1 típusú diabetesben szenvedő betegek esetében nem történik meg vagy a normál érték alatti értékű. Az 1 típusú diabetes számos állati modelljében kimutatták, hogy az amylin szekréció és gén expresszálás csökkentett [Cooper és munkatársai, Diabetes, 497-500 (1991); Ogawa és munkatársai, J, Clin. Invest., 85:973-976 (1990)]. Az 1 típusú diabetesben szenvedő betegek esetében a plazma amylin koncentráció mérése azt mutatta, hogy ezekben a betegekben az amylin koncentráció csökkentett és amylin hiány mutatkozik éjszakán át történő éhezést követően, valamint a glükóz terhelés nem eredményez semmilyen amylin koncentráció növelést [Koda és munkatársai, The Láncét, 339:1179-1180 (1992)].

Ezen túlmenően kísérletekkel kimutatták, hogy a korábban leírt renális értágító hatása és egyéb hatásai mellett az amylin jelentősen megnöveli a plazma renin aktivitását intakt patkányokban, amennyiben ezt olyan szubkután módon adagoljuk, hogy ne befolyásolja a vérnyomást. Ez fontos jelentőségű tulajdonság, mivel a csökkentett vérnyomás erősen stimulálja a renin kibocsátást. Az amylin antagonisták, amelyek olyan amylin receptor antagonisták, amelyek összehasonlítva a CGRP és/vagy calcitonin receptorokkal szelektívek az amylin receptorokkal szemben alkalmazhatók az amylin által okozott plazma

62.166/SM • · · ·· · · ·:.··:··..· : ·.>

- 14renin aktivitás blokkolására. Ezek az kísérleti eredmények, amelyek némileg meglepőek, azt mutatják, hogy az amylin antagonista hatású anyagok a plazma renin aktivitást csökkentik, és ebből eredően olyan előnyös terápiás hatást fejtenek ki, amely alkalmas a magas vérnyomás, illetve a szívelégtelenség, valamint más magas nem kívánatos renin aktivitással kapcsolatos betegségek kezelésére. Ezen túlmenően az amylin angatonisták alkalmasak arra, hogy előnyösen módosítsák az inzulin-rezisz-tenciát, illetve más szokásos metabolitikus rendellenességeket, amelyek gyakran magas vérnyomással és szívbetegséggel kapcsolatosak, és így előnyös terápiás hatást fejtsenek ki.

Elégtelen qyomormozqás

Az elégtelen gyomormozgás azt okozza, hogy a folyadék és/vagy szilárd gyomortartalom lassan, késleltetett módon ürül ki a gyomorból és ez különféle gyomor-bélrendszeri betegségekhez vezethet. Ezek általános leírását lásd a Goodman and Gilman, The Pharmacoloqical Basis of Therapeutics, Chapter 38 (Pergamon Press, 8. kiadás, 1990) közleményben. Ezek a szimptómák lehetnek a fenti betegségek esetében a hányinger, a hányás, a gyomorégés, az étkezés utáni kellemetlen érzés, illetve az emésztési zavar. A gyomor bakteriofág reflux gyakran nyilvánvalóan kialakul és például nyelőcsövi fekélyt okoztat, továbbá okozhat különböző légzőszervi szimptómákat vagy igen heves szegycsont mögötti fájdalmat, amely utóbbiakat sorrendben asztmával vagy szívizom infarctussal lehet összetéveszteni. Az okokat nem ismerik, azonban a betegek többsége gyomorpangást vagy csökkentett gyomormozgást észlel, amely diabetikus neurosis-ból ered; ez a betegség igen gyakran jelentkezik olyan betegekben is, amelyek idegi étvágytalanságban vagy gyomorsavhiányban szenvednek vagy gyomor operáció utáni állapotban vannak, lásd a 928. oldal közleményét.

62.166/SM

- 15- .......

Csökkent gyomormozgásban szenvedő betegek gyógyszerészeti kezelésében általában prokinetikus hatóanyagot adagolnak. A hányingert csökkent hatóanyagok, mint például a fenotiazinok vagy bethanechol adagolása, bizonyos könnyebbséget eredményez, azonban ezek a hatóanyagok nem gyorsítják a gyomor kiürülést és nagy többségben súlyos mellékhatásokat okoznak a betegekben. A jelenleg rendelkezésre álló prokineikus hatóanyagok a metoclopramid és a cisaprid, azonban egyéb hatóanyagokat (például domperidon) is vizsgáltak.

A metoclopramid csökkenti a befogadó relaxációt a gyomor felső részében, ugyanakkor növeli az antráíis összehúzódást. A gyomorkapu és a nyombél relaxált állapotba kerül, ugyanakkor az alsó nyelőcsövi záróizom tónusa megnövekszik. Ezek a hatások egyesített módon meggyorsítják a gyomortartalom kiürülését és csökkentik a vékonybélből, illetve a gyomorból a nyelőcsőbe történő visszaáramlás mértékét. Ezen túlmenően a vékonybélből történő tápanyag kiáramlás ideje a csípővagbéli szelep irányában csökken, mivel megnövelt éhbél hosszanti bélmozgás alakul ki. A metoclopramide kis hatást gyakorol a gyomor szekrécióra, valamint a vastagbél motilitásra. Id. 928. oldal.

Általában a dopaminerg agonista anyagok ellenkező hatást fejtenek ki és ezeket a D₂ receptorok mediálják, amelyek legalább részben a gyomoremésztőrendszer traktusban helyezkednek el.

A metoclopramide hatásmechanizmusa nem teljesen értelmezett, azonban kimutatták, hogy dopaminerg antagonista hatású anyag és blokkolja a lokális vagy szisztémás dopaminerg agonista hatóanyagok adagolásának hatását a gyomor-bél rendszerben. A metoclopramide hatását nem oltja ki a vagotomia, azonban prokinetikus hatásait blokkolni helet atropin vagy egyéb muszkarin antagonisták adagolásával. Ezen túlmenően nem valamennyi

62.166/SM

- 16dopaminerg antagonista gyorsítja a gyomor kiürülést. Feltételezik, hogy a hatóanyag elősegíti az acetilkolin felszabadulást a bélizomzat neuronokból, azonban erre közvetlen bizonyítékot nem találtak. Mivel a bethanechol megnöveli a metoclopramide hatását, valószínű, hogy ebben szerepet játszik az acetilkolin megnövelt hatása. Id. 928-929. oldal.

A domperidon benzimidazol származék, amely prokinetikus és hányás ellenes jellemzőkkel is rendelkezik. A vegyület dopaminerg antagonista és jelentős hiperprolaktiméniát okoz; a gasztrointesztinális motilitásra kifejtett hatása ugyancsak közeli a metoclopramid által kifejtett hatáshoz. Ezzel szemben a metoclopramiddal összehasonlítva ezek a hatások nem antagonista jellegűek az atropin hatásával szemben, erre a különbségre azonban még nem találtak magyarázatot. A domperidon a vér-agy gátat csak igen kis mértékben tudja leküzdeni, ennek következtében ritkán okoz extrapiramidális mellékhatásokat. Ebből eredően nem befolyásolja a Parkinson betegség kezelését és alkalmazható például a levodopa és a bromocriptine által okozott gyomor-bélrendszeri rendellenességek kezelésére. Az eddigi vizsgálatok szerint úgy tűnik, hogy a hatóanyag megfelelő betegekben hasonló terápiás felhasználású, mint a metoclopramide a gyomor hipomotilitás kezelésében. Azonban ez a vegyület kisebb hányás ellenes aktivitással rendelkezik. Id. 929. oldal. A domperidon a kísérletek szerint orális adagolás után gyorsan abszorbeálok, azonban biológiai rendelkezésre állása csak kb. 15% és a hatóanyag legnagyobb része metabolitként a székletbe kerül. Az elimináció ideje a vérplazmából fél időtartam értékben kb. 7-8 óra. Id. A domperidone általában nem kapható az Amerikai Egyesült Államokban, azonban más területeken MOTILIUM néven kereskedelemben kapható. A vegyület optimális dózisát nem állapították meg, azon

62.166/SM ···· ····

- 17ban napi 40-120 mg orális dózist alkalmaztak a gyomor hipomotilitás kezelésére. Id. 929. oldal.

A cisapride egy benzamid származék és a gyomor, valamint a vékonybél motilitására kifejtett hatása nagyban hasonlít a metoclopramide és a domperidon hatására; azonban ezen hatóanyagokkal szemben ez még megnöveli a vastagbél motilitását is továbbá hasmenést is okozhat. A hatóanyag gasztrointesztinális hatásának mechanizmusa nem tisztázott. A metoclopramide-hoz hasonlóan ezeket a hatásokat az atropin blokkolja és valószínűleg a hatás bélizomzat acetilkolin felszabadulással jár együtt. A cisapride valószínűleg nem mutat dopaminerg blokkoló aktivitást és nem befolyásolja a prolaktin koncentrációt a plazmában, továbbá nem okoz extrapiramidális szimptómákat. A hatóanyag a patkány ileumban az 5- -HT₂ triptaminerg receptorokhoz kötődik és ezeket blokkolja, azonban a kötődés és a hatóanyag hatása közötti összefüggés nem tisztázott. Id. Az eddigi kísérletek alapján a hatóanyag hatásossága a gyomor hipomotilitás rendellenesség kezelésében körülbelül egyenlő a metoclopramide és a domperidon hatásával anélkül azonban, hogy ez dopaminerg blokkoló mellékhatást fejtene ki. Ezen túlmenően a cisapride alkalmazható olyan betegek kezelésében, amelyek krónikus idiopátiás székrekedésben szenvednek vagy amelyek gerincvelő sérülésből eredő vastagbél hipomotilitásban szenvednek. Id. 929. oldal.

A fentiekkel ellentétben a gyomor kiürülést csökkentő hatóanyagok gyógyszerészeiben alkalmazhatók különösen diagnosztikai segédanyagként a gasztrointesztinális radiokémiái vizsgálatokban. Például a glükagon egy polipeptid hormon, amelyet a hasnyálmirigy Langerhans szigetek a sejtjei termelnek. A hatóanyag hyperglicaemiás hatású, amely a máj glikogenolízis aktiválásával glükózt mobilizál. Ez kisebb mértékben stimulálja a hasnyálmirigy

62.166/SM

- 18inzulin szekrécióját. A glükagont mint glükagon hidrokloridot adagolják; azonban dózisát általában glükagon tartalomban fejezik ki.

A glükalont olyan esetekben alkalmazzák inzulin indukált hypoglycaemia kezelésére, amikor intravénás glükóz adagolás nem lehetséges. Az adagolást szubkután, intramuszkuláris vagy intravénás injekció formájában 0,5-1 mg (egység) dózisban végzik és amennyiben szükséges 20 perc elteltével megismétlik. Azonban a glükagon csökkenti a gransztointesztinális traktus motilitását, ezért ezt gasztrointesztinális radiológiai vizsgálatokban diagnosztikai segédanyagként alkalmazzák. Az adagolás útja a diagnosztikai eljárás függvénye. 1-2 mg (egység) dózist adagolnak intramuszkulárisan és ennek hatása 4-14 percen belül megkezdődik és 10-40 percen át tart; amennyiben 0,2-2 mg (egység) dózist adagolnak intravénás úton, a hatás 1 percen belül megkezdődik és 9-25 percen át fennmarad.

A glükagont számos vizsgálatban különféle fájdalmas görccsel együttjáró gasztrointesztinális betegség kezelésében alkalmazták. (Dániel és munkatársai, Br. Med. J., 1974, 3, 720) közelményükben leírták, hogy az akut diverticulitis esetében a szimptóma csökenése sokkal gyorsabb a glükagon kezelés esetében, mint a fájdalomcsillapítókkal vagy görcsoldókkal kezelt betegeknél tapasztalt érték. (Glauser és munkatársai, J. Am, Coll. Emerqency Physns, 1979, 8, 228) áttekintő közleményben leírták, hogy az akut osteophag tápanyag obstrukció kezelése glükagon terápia esetében megvalósítható. Más vizsgálatban leírták, hogy a glükagon kezelés 21 epe traktus betegségben szenvedő betegben jelentősen csökkentette a fájdalmat, illetve a nyomásérzékenységet, amelyek összehasonlítva 22 beteggel, amelyek placebo vegyülettel kezeltek (M.J. Stower és munkatársai, Br. J. Surq., 1982, 69, 591-2). Frankét és munkatársai, (Radioloqy, 1983, 146, 687) közleményükben azonban a

62.166/SM • «

- 18inzulin szekrécióját. A glükagont mint glükagon hidrokloridot adagolják; azonban dózisát általában glükagon tartalomban fejezik ki.

A glükalont olyan esetekben alkalmazzák inzulin indukált hypoglycaemia kezelésére, amikor intravénás glükóz adagolás nem lehetséges. Az adagolást szubkután, intramuszkuláris vagy intravénás injekció formájában 0,5-1 mg (egység) dózisban végzik és amennyiben szükséges 20 perc elteltével megismétlik. Azonban a glükagon csökkenti a gransztointesztinális traktus motilitását, ezért ezt gasztrointesztinális radiológiai vizsgálatokban diagnosztikai segédanyagként alkalmazzák. Az adagolás útja a diagnosztikai eljárás függvénye. 1-2 mg (egység) dózist adagolnak intramuszkulárisan és ennek hatása 4-14 percen belül megkezdődik és 10-40 percen át tart; amennyiben 0,2-2 mg (egység) dózist adagolnak intravénás úton, a hatás 1 percen belül megkezdődik és 9-25 percen át fennmarad.

A glükagont számos vizsgálatban különféle fájdalmas görccsel együttjáró gasztrointesztinális betegség kezelésében alkalmazták. (Dániel és munkatársai, Br. Med. J., 1974, 3, 720) közelményükben leírták, hogy az akut diverticulitis esetében a szimptóma csökenése sokkal gyorsabb a glükagon kezelés esetében, mint a fájdalomcsillapítókkal vagy görcsoldókkal kezelt betegeknél tapasztalt érték. (Glauser és munkatársai, J. Am. Coll. Emerqency Physns, 1979, 8, 228) áttekintő közleményben leírták, hogy az akut osteophag tápanyag obstrukció kezelése glükagon terápia esetében megvalósítható. Más vizsgálatban leírták, hogy a glükagon kezelés 21 epe traktus betegségben szenvedő betegben jelentősen csökkentette a fájdalmat, illetve a nyomásérzékenységet, amelyek összehasonlítva 22 beteggel, amelyek placebo vegyülettel kezeltek (M.J. Stower és munkatársai, Br, J, Surq., 1982, 69, 591-2). Frankét és munkatársai, (Radioloqy, 1983, 146, 687) közleményükben azonban a

62.166/SM • · ·· ········ • · · · · · · ······· ······ ·· · · ··· · ·· · ··

- 19glükagon semmilyen előnyét nem tudták kimutatni a placebo kezeléssel szemben hidrosztatikus ileokólia bél betüremkedés csökkentésében 30 gyermekkel végzett kíséret esetében. Végül Webb és munkatársai, (Med. J. Aust., 1986, 144, 124) közelményükben leírták, hogy a glükagon elsősegélynyújtási kezelések során hatástalan az ureter-görcs kezelésében.

A találmány részletes leírása

Kísérleteink során felfedeztük a korábban leírt hiperglycaemiás jellemzők figyelembevételével, hogy az amylin és az amylin agonista vegyületek, beleértve a leírt vegyületeket, például az amylin agonista analógot, a ^25,28,29Pro-hamylint (amelyet „AC-0137” névvel is jelölünk) csökkentik a gyomor motilitást és lassítják a gyomor kiürülését, ezt az ilyen vegyületek azon képességével mutattuk ki, hogy ezek alkalmazásával csökken az étkezés utáni plazma glükóz koncentráció.

A találmány tárgya új eljárás gyomor motilitás csökkentésére, valamint a gyomor kiürülésének lassítására, azzal jellemezve, hogy a betegnek amylint vagy amylin agonista vegyületet, például az AC-0137 amylin agonista analóg vegyületet adagoljuk. A találmány szerinti eljárások például alkalmasak az étkezés utáni hyperglycaemia kezelésére, továbbá 2 típusú diabetes mellitus (nem inzulin függő) betegségek kezelésére.

Az „amylin” elnevezésbe beleértjük azokat a vegyületeket, amelyeket Young és Cooper az 1993. augusztus 10-én benyújtott 5,234,906 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben „Hyperglycaemiás készítmény” néven leírták, amely bejelentést referenciaként adunk meg. Például ilyen anyagok közé tartoznak a humán peptid hormon és ennek különféle változatai, amelyeket amylinként írnak le és amely a hasnyálmirigy béta sejtjeiben kiválasztott vegyület. A „amylin agonista” vegyületek a szakirodalomban

62.166/SM ·«·· ····

- 20ugyancsak ismertek és ezen vegyületek körébe azokat az anyagokat értjük, amelyek biomimetikus módon amylin hatást fejtenek ki. Ennélfogva magát az amylint, illetve az amylin agonista analóg vegyületeket széles értelmezésben amylin agonista vegyületként kezelhetjük. Az „amylin agonista analóg” elnevezés alatt olyan amylin származékokat értünk, amelyek amylin agonistaként viselkednek és általában ezek a jelen ismereteink szerint kötődésük révén vagy egyébként közvetlenül vagy közvetetten amylin receptorral vagy más olyan receptorral vagy receptorokkal lépnek kölcsönhatásba, amellyel az amylin is kölcsönhatásba léphet, és így a fent leírt biológiai jellemzőket mutatják. A jelen leírásban leírt vegyületeken túlmenően egyéb alkalmas amylin agonista analóg vegyületeket írtak le a „Új amylin agonista peptidek, amelyek hypoglycaemia és diabetes mellitus kezelésére és megelőzésére alkalmazhatók” című WPI Acc. No. 93-182488/22 számú szabadalmi bejelentésben, amelyet egyben referenciaként adunk meg.

A találmány tárgya eljárás gasztrointesztinális motilitás előnyös szabályozására egy betegben, amely betegnek az amylin vagy amylin agonista, előnyösen amylin agonista analóg terápiásán hatásos mennyiségét adagoljuk. A találmány tárgya továbbá eljárás gyomor motilitás csökkentésére. A találmány tárgya továbbá eljárás gyomor kiürülés késleltetésére.

A fenti eljárások alkalmazhatók olyan beteg esetében is, amelyet gasztrointesztinális diagnosztikai eljárásnak, például radiológiás vizsgálatnak vagy mágneses magrezonancia leképezés vizsgálatnak vetünk alá. Más eljárás esetében a fenti módszerek alkalmazhatók olyan beteg esetében a gyomor motilitás csökkentésére, amelyek gasztrointesztinális betegségben, például görcsben (amely például akut diverticulitissel kapcsolatos, ami az epe traktus betegsége vagy Oddi záróizom rendellenességgel kapcsolatos).

62.166/SM • · ·· ········ • · · · · · · • · · · · · · • ···· · · · · · ······· ··

- 21 A találmány tárgya továbbá eljárás étkezés utáni hányási szindróma kezelésére, ilyen kezelést igénylő betegben, azzal jellemezve, hogy a betegnek az amylin agonista terápiásán hatásos mennyiségét adagoljuk.

A találmány tárgya továbbá eljárás étkezés utáni hyperglycaemia kezelésére, mely eljárás során az ilyen kezelést igénylő betegnek valamely amylin agonista terápiásán hatásos mennyiségét adagoljuk. Előnyös megvalósítás szerint a kezelt étkezés utáni hyperglycaemia a 2 típusú diabetes mellitus következménye.

Előnyösen alkalmazható amylin agonisták például a ^25,28,29Pro-h-amylin. Előnyös amylin agonista analógok továbbá lehetnek a ^25,28,29Pro-H-amylin.

A találmány tárgya továbbá eljárás ilyen kezelést igénylő betegben gyomor hypomotilitás kezelésére, azzal jellemezve, hogy az ilyen kezelést igénylő betegnek valamely amylin antagonista terápiásán hatásos mennyiségét adagoljuk. Előnyös megvalósítás során ezeket az eljárásokat akkor alkalmazhatjuk, amikor a hypomotilitás diabetikus neuropátia következménye vagy amennyiben a hypomotilitás anorexia nevosa következtében alakul ki. Hypomotilitás létrejöhet továbbá gyomorsav hiány vagy gyomor sebészeti operáció következtében is.

A találmány tárgya továbbá eljárás a gyomor kiürülés meggyorsítására ilyen kezelést igénylő betegben, azzal jellemezve, hogy a betegnek valamely amylin antagonista terápiásán hatásos mennyiségét adagoljuk. Az amylin antagonista elnevezés alatt olyan vegyületet értünk, amely az amylin hatásával lép kölcsönhatásba, például olyan vegyület, amely önmagában nem rendelkezik jelentős farmakológiai aktivitással, azonban egy specifikus agonista hatására inhibiáló hatást fejt ki, például úgy, hogy az agonista vegyület kötési helyeihez kompetitív módon kötődik. Előnyösen az amylin antagonista anyagok,

62.166/SM ···· ···· • · ♦ · · · · • · · · · · · · · · •·· « ·· · ··

- 22amelyeket a találmány szerinti eljárásokban alkalmazunk, amylin receptor antagonista hatású vegyületek. Előnyösen alkalmazható antagonista vegyület az acetil-^11,15Arg,³⁰Asn,³²Tyr⁹'³²calcitonin (lazac).

A találmány tárgya továbbá eljárás toxikus anyagok fogyasztása esetén a betek kezelésére oly módon, hogy valamely amylin vagy amylin agonista vegyület olyan mennyiségét adagoljuk, amely hatásosan megakadályozza vagy csökkenti a gyomortartalom áthaladását a bélrendszerbe és amely a gyomor tartalmat felszívja.

Az ábrák rövid leírása

1. ábra: Bemutatja az amylin hatását kutyákban a plazma glükóz koncentrációra orális glükóz terhelés után a kontroll csoporttal összehasonlítva.

2. ábra: Bemutatja humán klinikai önkéntes betegek esetében az étkezés utáni glükóz profilt, amelyeket placebo vegyülettel vagy IV bolus segítségével 30 μg AC-0137 vegyülettel kezeltünk.

3. ábra: Bemutatja az étkezés utáni glükóz profilt humán klinikai önkénteseken, amelyeket placebo vegyülettel vagy IV bolus 100 pig AC-0137 vegyülettel kezeltünk.

4. ábra: Bemutatja humán klinikai önkéntesek étkezés utáni glükóz profilját, amelyeket placebo vegyülettel vagy IV bolus 300 pg AC-0137 vegyülettel kezeltünk.

5. ábra: Bemutatja humán klinikai önkéntesek étkezés utáni glükóz profilját, amelyeket placebo vegyülettel vagy 2 óráig IV AC-0137 vegyület infúzióval kezeltünk 15 pg/óra koncentrációban.

62.166/SM

6. ábra: Bemutatja humán klinikai önkéntesek étkezés utáni glükóz profilját, amelyeket placebo vegyülettel vagy 2 óra időtartamon át IV AC-0137 infózióval kezeltünk 50 pg/óra sebességgel.

7. ábra: Bemutatja humán klinikai önkéntesek étkezés utáni glükóz profilját, amelyeket placebo vegyülettel vagy 2 órán át IV AC-0137 infúzióval 150 pg/óra sebességgel kezeltünk.

8a-8b ábrák: Bemutatják a plazma glükóz tartalmát (mg/dl), a plazma tripro-amylin (pm) tartalmát és a plazma szabad inzulin koncentrációját (gU/ml) 60 perccel az IV 25 pig/óra tripro-amylin IV infúzió megkezdése előtt. Sustacal® élelmet adagoltunk a tripro-amylin infúzió megkezdése után 60 perc elteltével.

9a-9c ábrák: Bemutatják a plazma glükóz tartalmát (mg/dl) a plazma tripro-amylin (pm) tartalmát és a plazma szabad inzulin koncentrációját (U/ml) 60 perccel az IV 50 pg/óra tripro-amylin infúzió megkezdése előtt. Sustacal® élelmet adagoltunk 60 perccel a tripro-amylin infúzió megkezdése után.

10a-10c ábrák: Bemutatják a plazma glükóz tartalmát (mg/dl), a plazma tripro-amylin (pm) tartalmát és a plazma szabad inzulin koncentrációt (pU/ml) az IV 50 pg/óra tripro-amylin infúzió megkezdése előtti 60 perces időtartamtól kezdődően. IV glükóz terhelés (300 mg/kg) adagoltunk 60 perccel a triproamylin infúzió megkezdése után.

a-11c ábrák: Bemutatják a post-Sustacal® élelmiszer glükóz profilt alapvonalban (1 nap) a 7. nap és a 14. nap Sustacal® élelmiszer tolerancia tesztvizsgálat eredményét humán klinikai önkéntesek esetében, amelyeknek 30 μg tripro-amylint (AC-0137) adagoltunk az élelmiszer adagolása előtt háromszor naponta 14 nap időtartamon át.

62.166/SM • · ···· ····

- 2412a-12b ábrák: Bemutatják a post-Sustacal® élelmiszer glükóz profilt az alapvonalra (1. nap) 7. és 14. nap Sustacal® élelmiszer tolerancia tesztvizsgálatban humán klinikai önkéntesek esetében, amelyeknek 100 gg tripro-amylin (AC-0137) vegyületet adagolunk napi három alkalommal az étkezés előtt 14 nap perióduson keresztül.

13a-13b ábrák: Bemutatják a post-Sustacal® élelmiszer glükóz profilt alapvonalra (1. nap), majd 7. nap és 14. nap Sustacal® élelmiszer tolerancia tesztvizsgálatra, amelyet humán klinikai önkénteseken végeztük, akiknek 300 pg tripro-amylint (AC-0137) adagoltunk napi három alkalommal az étkezés előtt 14 nap időtartamon át.

14. ábra: Bemutatja a dózis-válaszfüggvény hatást patkány amylin előzetes szubkután injekció esetében a gyomortartalom 20 percen át történő visszatartására normál, illetve BB diabetikus patkányok esetében (n = 3-9 állat minden pont esetében). A jelzések az alábbiak: átlag ± SEM, illetve a görbék a legjobban illeszkedő helyzeteket jelzik. „Zero” azt jelzi, amikor a gyomortartalom normál, illetve diabetikus patkányokban visszatartott, amelyeket amylinnel nem kezeltünk (eltérés P < 0,001).

15. ábra: Bemutatja a plazma amylin koncentrációt, amelyet vagy 1 pg vagy 10 gg szintetikus patkány amylin szubkután injektálása után mértünk (n = 3 állatcsoportonként). A jelzések átlag ± SEM.

16. ábra: Bemutatja a glükózból származó plazma trícium koncentrációt (cpm/10 μΙ) fiziológiás sóoldat vagy AC-0187 vegyület lenyelése után. A * jel a statisztikus eltérést mutatja. A legkisebb jelzés (szaggatott vonal: amelyet „háttér”) jelzéssel jeleztünk, 4 érzéstelenített patkány méréséből származik, amelyek hasfelnyitás és elkötés után végeztek nyelést. Ez azt mutatja, hogy

62.166/SM igen kis mennyiségű trícium aboszrbeálódik közvetlenül a gyomorfalon keresztül, továbbá, hogy a trícium felvétel a glükóz áthaladással kapcsolatos, amely glükóz a vékonybél keringésbe kerül.

17. ábra: Bemutatja a plazma glükóz tartalmat (mg/dl) fiziológiás sóoldat vagy AC-0187 lenyelése után.

A találmány részletes ismertetése

A találmány szerinti eljárásban alkalmazott különféle amylin agonista analóg vegyületeket a nevezéktanban úgy jellemezhetjük, hogy megadjuk a peptid nevét, továbbá ennek alapszekvenciáját, illetve azokat a módosításokat, amelyeket bármely alappeptid amylin (amely lehet például humán amylin) szekvencián végeztünk. A leírásban megadott aminosavakat a felső indexben számmal jelöljük és ez a szám jelzi, hogy az alap aminosav szekvenciában az adott aminosav helyzetben milyen helyettesítő aminosavat alkalmaztunk. Például a „¹⁸Arg^25,28Pro-h-amylin” elnevezés alatt olyan pepiidet értünk, amely a „h-amylin” szekvencián alapul vagy „humán-amylin” szekvencia alapú, ami az alábbi helyettesítéseket tartalmazza: Arg helyettesítés a 18 helyzetű His maradék helyett, Pro helyettesítés a 25 helyzetű Alá maradék helyett és Pro helyettesítés a 28 helyzetű Ser maradék helyett. A „dez-¹Lys-h-amylín” elnevezés alatt olyan humán-amylin szekvencián alapuló pepiidet értünk, amelyben az első vagy N-terminális aminosav elhagyott, azaz nincs jelentése.

A találmány szerinti amylin agonista analóg vegyületek farmakológiai jellemzőik miatt alkalmasan felhasználhatók. Az amylin agonista hatóanyagok aktivitását úgy jellemezhetjük, hogy meghatározzuk a kötési hely tesztvizsgálat receptor kötődést, illetve megvizsgáljuk a talpemelő izom tesztvizsgálatban ezeket a vegyületeket, amely vizsgálatokat az alábbiakban megadunk. Az amylin agonista hatást a vegyületek esetében ugyancsak kimutathatjuk annak

62.166/SM

- 26meghatározásával, hogy milyen mértékben képesek hypercalcemia és/vagy hyperglycemia kiváltására emlősökben, illetve milyen mértékben képesek csökkenteni az étkezés utáni plazma glükóz koncentrációt. Ezt az alábbiakban részletesen megadjuk.

Az előnyös amylin agonista analóg vegyületek a dez-¹Lys-h-amylin, ²⁸Pro-h-amylin, ^25,28'²⁹Pro-h-amylin valamennyien in vivő amylin aktivitást mutatnak a vizsgált tesztvizsgálati állatokban és határozott hyperlactemiát idéznek elő, amelyet ezután hyperglycemia követ. Azon túlmenően, hogy az amylinre jellemző aktivitással rendelkeznek, bizonyos előnyös tulajdonságú vegyületek, továbbá kívánatosabb oldhatósággal és stabilitással is rendelkeznek, mint a humán amylin. Ezek az előnyös vegyületek a ²⁵Pro²⁶Val^28,28Pro-h-amylin, 25,28,29p_ro_^__amy|j_n (_ame|y _má_S néven „AC-0137”) továbbá a ¹⁸Arg^25,28Pro-h-amylin.

A találmány szerinti eljárásban alkalmazhatunk amylin agonista anyagokat, beleértve az amylint vagy amylin agonista analóg vegyületeket, mint például az amylin receptor agonista analógokat, amelyek lehetnek például a ¹⁸Arg^25,28Pro-h-amylin, dez-¹Lys¹⁸Arg^25,28Pro-h-amylin, ¹⁸Arg^25,28'²⁹Pro-hamylin, dez-¹Lys¹⁸Arg^25,28,29Pro-h-amylin, ^25,282,29Pro-h-amylin, dez¹Lys^25,28’²⁹Pro-h-amylin, és ²⁵Pro²⁶Val²⁵’²⁸Pro-h-amylin.

További alkalmas amylin agonista analóg vegyületek az alábbiak: ²³Leu²⁵Pro²⁶Val^28,29Pro-h-amylin;

²³Leu²⁵Pro²⁶Val²⁸Pro-h-amylin; dez-¹Lys²³Leu²⁵Pro²⁶Val²⁸Pro-h-amylin; ¹⁸Arg²³Leu²⁵Pro²⁶Val²⁸Pro-h-amylin;

¹⁸Arg²³Leu²⁵’^28,29Pro-h-amylin; ¹⁸Arg²³Leu^25,28Pro-h-amylin;

62.166/SM • · · · ·

- 27¹⁷lle²³Leu^25,28,29Pro-h-amylin;

¹⁷lle²⁵'^28,29Pro-h-amylin; dez-¹Lys¹⁷lle²³Leu^25,28,29Pro-h-amylin;

¹⁷lle¹⁸Arg²³Leu-h-amylin; ¹⁷lle¹⁸Arg²³Leu²⁶Val²⁹Pro-h-amylin; ¹⁷lle¹⁸Arg²³Leu²⁵Pro²⁶Val^28,29Pro-h-amylin; ¹³Thr²¹His²³Leu²⁶Ala²⁸Leu²⁹Pro³¹Asp-h-amylin; ¹³Thr²¹His²³Leu²⁶Ala²⁹Pro³¹Asp-h-amylin; dez-¹Lys¹³Thr²¹His²³Leu²⁶Leu²⁶Ala²⁸Pro³¹Asp-h-amylin; ¹³Thr¹⁸Arg²¹His²³Leu²⁶Ala²⁹Pro³¹Asp-h-amylin; ¹³Thr¹⁸Arg²¹His²³Leu^28,29Pro³¹Asp-h-amylin és ¹³Thr¹⁸Arg²¹His²³Leu²⁵Pro²⁶Ala^28,29Pro³¹Asp-h-amylin.

További amylin agonista vegyületeket, beleértve az amylin agonista analóg vegyületeket is, írtak le az „Új amylin agonista fehérjék, amelyek hypoglycaemia és diabetes mellitus kezelésére alkalmasak” című WPI Acc. No. 93-182488/22 számú szabadalmi bejelentésben, amelyet referenciaként adunk meg. Az amylin agonisták hatásosságát különféle biológiai tesztvizsgálatokkal mutathatjuk ki, amelyeket az alábbiakban leírunk.

A receptor kötési tesztvizsgálattal meghatározhatjuk az amylin agonista és antagonista vegyületek hatását is, továbbá ezt alkalmazhatjuk a kötés meghatározására, míg a talpemelő izom tesztvizsgálat megkülönbözteti az amylin agonista és antagonista hatású vegyületeket. Az amylin vegyületek és amylin agonista vegyületek gyomor motilitásra kifejtett hatását meghatározhatjuk és értékelhetjük vagy szkrinelhetjük az alábbi példákban leírt eljárások segítségével vagy más szakirodalomban ismert vagy azokkal ekvivalens tesztvizsgálatok alkalmazásával, amelyek alkalmasak a gyomor motilitás meghatározására.

62.166/SM

- 28····· · · · • · » ·

Az egyik eljárás szerint meghatározzuk és értékeljük a vegyület hatásosságát a gyomor motilitás lassításában. Ez az eljárás az alábbiakkal jellemezhető: (a) egy tesztvizsgálati rendszert, valamint a teszvizsgálatnak alávetett vegyületet elegyítjük, amely tesztvizsgálati minta egy vagy több tesztvizsgálatnak alávetett vegyületet tartalmaz. A teszvizsgálati rendszer azzal jellemezhető, hogy ez alkalmas a gyomor motilitás értékelésére és azzal jellemezhető, hogy például megnövelt plazma glükóz válaszfüggévényt mutat, amennyiben a rendszerbe glükózt vagy valamilyen élelmiszert vezetünk be; és (b) meghatározzuk a fenti rendszerben a plazma glükóz tartalmának növekedési mértékét, illetve a glükóz jelenlétét. Ezen túlmenően a vizsgálatban pozitív és/vagy negatív kontrollt is alkalmazhatunk. Kívánt esetben meghatározott mennyiségű amylin antagonistát (például ⁸'³²lazac-calcitonint) is adagolhatunk a tesztvizsgálati rendszerhez.

Előnyösen az agonista típusú vegyületek a receptor kötési tesztvizsgálatban kisebb mint kb. 1-5 nm, előnyösen kisebb mint kb. 1 nm és legelőnyösebben kb. 50 pm koncentrációban mutatnak aktivitást. A talpemelő izom tesztvizsgálatban a vegyületek előnyösen kisebb mint kb. 1-5 pmol EC₅₀ értéket mutatnak.

A receptor kötési tesztvizsgálatot leírták az 1991. március 15-én benyújtott, 1992. október 1-jén közzétett 670,231 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben, amely egyben a PCT/US92/02125 számú nemzetközi szabadalmi bejelentés, amelyet referenciaként adunk meg. A receptor kötési tesztvizsgálat egy kompetitív tesztvizsgálat, amely méri a vegyületek kötési képességét a membránhoz kötött specifikus amylin receptorokhoz. Ez a kötődés ugyancsak specifikus. Előnyös membrán preparátum forrás a tesztvizsgálatban az alapi előagy, amely sejtmag támaszkodó és környező terüle62.166/SM

- 29tekről származó membránokat tartalmaz. A vizsgált vegyületek ezekhez a receptorokhoz a ¹²⁵l-Bolton Hunger patkány amylinnel szemben kompetitív módon kötődnek. A kompetitív kötődés görbéket a (B) kötött vegyületmennyiség ábrázolásában adjuk meg a ligandum koncentráció lóg skálán kifejezett értékével szemben és ezt a kötődést számítógéppel nem lineáris 4-paraméteres egyenlet segítségével értékeljük (Inplot program; GraphPAD Software, San Diego, California) vagy ALLFIT program, DeLean és munkatársai, (ALLFIT, Version 2,7 (NIH, Bethesda, MD 20892). Munson, P. és Rodbard, D., Anal. Bichem. 107:220-239 (1980), értékelést végzünk.

Az amylin agonista vegyületek, beleértve az amylin agonista analóg készítményeket is, biológiai aktivitását a talpemelő izomban a korábban leírt eljárásokkal vizsgáltuk [Leighton, B. és Cooper, G.J.S., Natúré, 335:632-635 (1988); Cooper, G.J.S. és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:77637766 (1988)]. Összefoglalva az amylin agonisták aktivitását úgy határoztuk meg, hogy milyen mértékben inhibiálják a talpemelő izomban az inzulin stimulált glükogén szintézist. Az amylin antagonista vegyületek aktivitását úgy határoztuk meg, hogy mértük, milyen mértékben történik meg az inzulin stimulált glükogén szintézis újraindulása 100 nm patkány amylin jelenlétében vagy valamely amylin antagonista jelenlétében. A hordozóanyag mentes pufferekben az oldott peptid koncentrációt kvantitatív aminosav analízissel az alábbiak szerint határoztuk meg. A vegyületek tesztvizsgálatban agonista hatást kifejtő mértékét az EC₅₀ értékek meghatározásával mértük. A standard hibát a sigmaid dózisfüggő görbék illesztésével 4 paraméteres egyenlet alapján végeztük [De Lean, A., Munson, P.J., Guardabasso, V. és Rodbard, D. (1988) ALLFIT, Version 2,7, National Institute of Child Health and Humán Development, N.I.H. Bethesda, MD, 1 -disket]. Számos amylin agonistát meg62.166/SM

- 30vizsgáltunk ezzel a biológiai tesztvizsgálattal. Ezek a vegyületek az alábbiak: ¹⁸Arg^25,28Pro-h-amylin, dez¹Lys¹⁸Arg^{25 28}Pro-h-amylin, ¹⁸Arg^25,28’²⁹Pro-h-amylin, dez-¹Lys¹⁸Arg²⁵'^28,29Pro-h-amyliri, ^25,28’²⁹Pro-h-amylin, dez-¹Lys¹⁵'^18,19Pro-h-amylin és ²⁵Pro²⁶Val^25,28Pro-h-amylin. Valamennyi vegyületről azt találtuk, hogy a receptor kötési tesztvizsgálattal az amylinnel kompetitív jellemzőket mutatott. A fenti vegyületek elhanyagolható antagonista aktivitással rendelkeznek a talpemelő izom tesztvizsgálatban és kimutattuk, hogy ezek amylin agonista hatásúak. Hasonló eredményeket nyertünk más fent leírt agonista vegyületek esetében is.

A gyomor hypomotilitást kezelő eljárásokban alkalmazható amylin antagonista vegyületeket írtak le például az 1991. november 19-én benyújtott 07/794,288 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben, amelyet referenciaként adunk meg.

A fent leírt vegyületeket általában standard szilárd fázisú pepiid szintézis segítségével állítjuk elő, előnyösen automata vagy félautomata peptid szintetizáló berendezés alkalmazásával. Jellemzően egy α-Ν-karbamoil-védett aminosavat és egy aminosavat kapcsoltunk a növekvő peptidlánc kialakításában egy gyanta hordozóhoz. Ezt a kapcsolást általában szobahőmérsékleten inért oldószerben, mint például dimetil-formamidban, N-metil-pirrolidinonban vagy diklórmetánban végeztük kapcsoló reagensek, mint például diciklohexil-karbodiimid és 1-hidroxi-benzotriazol jelenlétében. A reakcióban általában bázist is alkalmaztunk, amely lehet például diizopropil-etil-amin. A kapott peptid-gyanta termékről az α-Ν-karbamoil-védőcsoportot eltávolítottuk megfelelő reagens, mint például trifluor-ecetsav vagy piperidin segítségével, majd a kapcsolási reakciót megismételtük a következő kívánt N-védőcsoporttal ellátott aminosav segítségével, amelyet a peptidlánchoz kívánunk kötni. Alkalmas N-védőcsoportok a

62.166/SM • · · · ·

- 31 • * · · • · · ·« szakirodalomban jól ismertek és ezek lehetnek terc-butoxi-karbonil-csoport (tBoc) és fluorenil-metoxi-karbonil-csoport (Fmoc), amelyeket előnyösen alkalmazhatunk.

A peptid szintetizáló berendezésben alkalmazott oldószereket, illetve aminosav származékokat, valamint a 4-metil-benzhidril-amin gyantát, hacsak másképp nem jelezzük, az Applied Biosystems Inc. cégtől szerezzük be (Foster City, CA). Az oldalláncon védett aminosavakat, amelyeket a szintézisben alkalmazunk az Applied Biosystems, Inc. cégtől szerezzük be és ezek az alábbiak lehetnek: Boc-Arg(Mts), Fmoc-Arg(Pmc), Boc-Thr(Bzl), Fmoc-Thr(t-Bu), Boc-Ser(Bzl), Fmoc-Ser(t-Bu), Boc-Tyr(BrZ), Fmoc-Tyr(t-Bu), Boc-Lys(CI-Z), Fmoc-Lys(Boc), Boc-Glu(Bzl), Fmoc-Glu(t-Bu), Fmoc-His(Trt), Fmoc-Asn(Trt), és Fmoc-Gln(Trt). A Boc-His(BOM) vegyületet az Applied Biosystems, Inc. vagy Bachem Inc.-tői (Torrance, CA) szerezzük be. Az anizolt, a metil-szulfidot, a fenolt, az etán-ditiolt és a tioanizolt az Aldrich Chemical Company (Milwaukee, Wl) cégtől szerezzük be. Az Air Products and Chemicals (Allentown, PA) cég szolgáltatja a hidrogén-fluoridot (HF). Az etil-étert és az ecetsavat, továbbá a metanolt a Fisher Scientific (Pittsburgh, PA) cégtől szerezzük be.

A szilárd fázisú peptid szintézist automata peptid szintetizálóval (Model 430A, Applied Biosystems Inc., Foster City, CA) végezzük NMP/HOBt (1 változat) rendszer alkalmazásával és tBoc vagy Fmoc kémia felhasználásával (lásd Applied Biosystems User's Manual forthe ABI 430A Peptide Synthesizer, Version 1,3B 1988 július 1, Section 6, 49-70, Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). A Boc-peptid-gyanta hasítását hidrogén-fluorid (HF) segítségével végezzük (-5°C - 0°C közötti hőmérsékleten 1 óra időtartamon át). A pepiidet a gyantáról víz és ecetsav váltakozó extrakciójával extraháljuk, majd a szűrlete62.166/SM

- 32• · két liofilizáljuk. Az Fmoc-peptid gyantákat szokásos eljárással hasítjuk (Introduction to Cleavage Techniques, Applied Biosystems, Inc., 1990, 6-12 old.). Néhány pepiidet az Advanced Chem Tech Synthesizer (Model MPS 350, Louisville, Kentucky) készülékkel állítunk elő. A peptideket RP-HPLC (preparatív és analitikai kromatográfia) segítségével tisztítjuk Waters Delta Prep 3000 rendszer alkalmazásával. A peptidek izolálására C4, C8 vagy C18 preparatív oszlopot alkalmazunk (10 μ, 2,2 x 25 cm; Vydac, Hesperia, CA) és a tisztaságot C4, C8 vagy C18 analitikai oszlop alkalmazásával (5 μ, 0,46 x 25 cm; Vydac) határozzuk meg. Az alkalmazott oldószerek (A = 0,1% TFA (trifluor-ecetsav)/víz és B = 0,1% TFA/CH₃CN), amelyeket az analitikai oszlopon 1,0 ml/perc áramlási sebességgel alkalmazunk, a preparatív oszlopon pedig 15 ml/perc áramlási sebességet használunk. Az aminosav analízist Waters Pico Tag rendszerrel végezzük és az adatfeldolgozást Maxima programmal hajtjuk végre. A peptideket gőzfázisú savas hidrolízissel hidrolizáljuk (115°C, 20-24 óra). A hidrolizátumot származékká alakítjuk, majd standard eljárásokkal analizáljuk [Cohen, S.A., Meys, M., és Tarrin, T.L. (1989), The Pico Tag Method: A Manual of Advanced Technigues fór Amino Acid Analysis, 11-52. old. Millipore Corporation, Milford, MA], A gyors atomtömeg meghatározás analízist M-Scan, Incorporated (West Chester, PA) berendezéssel végezzük. A tömegkalibrálást cézium-jodid vagy cézium-jodid/glicerol elegy alkalmazásával végezzük. A plazma deszorpciós ionizálás analízist az idő függvényében fokozatos detektálással végezzük Applied Biosystems Bio-Ion 20 tömegspektroszkóp segítségével.

A találmány szerinti eljárásban alkalmazható peptideket továbbá előállíthatjuk rekombinációs DNS technológia alkalmazásával a szakirodalomban is62.166/SM

- 33mert eljárásoknak megfelelően [lásd pl. Sambrook és munkatársai, Molecular Cloninq: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor (1989)].

A fent leírt vegyületek só formát képezhetnek különféle szervetlen és szerves savakkal, valamint bázisokkal. A szerves vagy szervetlen savakkal képzett sók lehetnek például sósavas só, hidrogén-bromid, kénsavas só, foszforsavas só, trifluor-ecetsavval képzett só, ecetsavval képzett só, hangyasavval képzett só, metánszulfonsavval képzett só, toluol-szulfonsavval képzett só, maleinsavval képzett só, fumársavval képzett só és kámforszulfonsavval képzett só. A bázisokkal képzett sók lehetnek például ammónium só, alkálifém só, mint például nátrium só és kálium só, alkáliföldfémmel képzett só, mint például kálcium só és magnézium só. Előnyösen alkalmazható sók az acetát, a hidroklorid és a trifluor-acetát sók. A só formákat szokásos eljárásokkal állíthatjuk elő és például a találmány szerinti vegyület szabad sav vagy bázis formáját egy vagy több ekvivalens megfelelő bázissal vagy savval reagáltathatjuk olyan oldószerben vagy közegben, amelyben a só oldhatatlan vagy olyan oldószerben, mint például vízben, amely ezután vákuumban elpárologtatható vagy liofilizálással eltávolítható vagy ioncseréléssel a só ionját étcseréljük alkalmas ioncserélő gyanta felhasználásával.

A fent leírt vegyületek gyógyszerészeti jellemzőik következtében alkalmasak gyógyszerészeiben történő felhasználásra. Részletesebben a találmány szerinti vegyületek alkalmasak a gyomor ürülés lassítására, mivel ezek nyilvánvalóan csökkentik emlősökben az étkezés utáni glükóz koncentrációt.

Az 1. példa szerinti eljárásnak megfelelően megvizsgáltuk az amylin orális glükóz tolerancia tesztvizsgálatban kifejtett hatását kutyák esetében. Vizsgálataink szerint az amylin, amelyről korábban leírták, hogy hyperglycaemiás hatóanyag (azaz növelt glükóz koncentrációt okoz), ez azonban ezekben a teszt62.166/SM • ·· · • · · ·· · , ·:. ··.“ ·..· : ·..· -34vizsgálati állatokban csökkentette az étkezés utáni plazma glükóz koncentrációt. Valamennyi vizsgált dózis esetében az amylin a plazma glükóz növekedési sebességét csökkentette, illetve az orális glükóz tolerancia tesztvizsgálatban a plazma glükóz csúcsot is csökkentette.

A 2. példában leírjuk az amylin agonista AC-0137 hatását az étkezés utáni plazma glükóz koncentrációra humán klinikai tesztvizsgálatban. Bolus és folyamatos intravénás infúzió esetében is az AC-0137 hatóanyag dózisfüggő csökkentést mutatott az étkezés utáni hyperglycaemia esetében fiatalkorú diabetes mellitusban szenvedő betegek tesztvizsgálata során.

A 3. példában bemutatjuk az AC-0137 (tripro-amylin) folyamatos infúziós adagolásának hatását Sustacal® táplálék adagolása, illetve IV glükóz terhelés után a plazma glülóz koncentrációra. A IV glükóz terhelés esetében az 50 pg/óra AC-0137 által kezelt betegek plazma glükóz koncentrációja nem volt lényegesen eltérő a placebo által kezelt betegek plazma glükóz tartalmától.

Azonban amennyiben Sustacal® táplálékkal kezelt betegeket 25 pg/óra vagy μg/ÓΓa IV AC-0137 infúzióval kezeltünk, a plazma glükóz koncentráció az

AC-0137 által kezelt betegekben a placeboval kezelt betegek értékéhez hasonlítva csökkent. Az étkezés után a plazma glükóz koncentrációt inzulin függő diabetes betegekben orális tápanyag adagolását követően az AC-0137 adagolása csökkentette a plazma glükóz koncentrációt. Azonban nem fejtett ki jelentős hatást a plazma glükóz koncentrációra, amennyiben előzetesen intravénás glükóz terhelést adagoltunk.

A 4. példában bemutatjuk egy 14 napon át végzett kétszeres vakpróbával végzett kísérlet klinikai eredményeit. A vizsgálatot olyan betegeken hajtottuk végre, akik fiatalkori diabetesben szenvedtek és szokásos inzulin terápiát

62.166/SM ·· · • ·· · ····

- 35kaptak, illetve önmaguknak injektálták napi 3 alkalommal a tripro-amylin (AC0137) hatóanyagot. Ezek a betegek a tesztvizsgálati tápanyag felvétele után átlagosan alacsonyabb vér glükóz koncentrációt mutattak, mint azok a betegek, akik inzulint és placebo vegyületet kaptak kezelésként. 14 nap elteltével statisztikusan jelentős (P = 0,02) glükóz csökkentő hatást (a glükóz görbe alatti terület alapján mért) tapasztaltunk 30 mikrogram kezelés alkalmazása esetében. A tripro-amylin plazma koncentrációk a nem diabetes betegek esetében tapasztalható amylin vér koncentráció határértékén belül voltak. A tripro-amylin által indukált AUC koncentráció csökkentése mellett átlagos 45 mg/dl - 60 mg/dl vérglükóz koncentráció csúcs csökkentés történt a kezelt betegekben.

Az 5. példában bemutatjuk, hogy milyen mértékben változik a gyomor ürítés normális és inzulinnal kezelt spontán diabetes BB patkányokban. Erre a célra egy kalória tartalmú metil-cellulóz gélt alkalmazunk, amely fenol-vöröst tartalmaz és amelyet nyeléssel juttattunk a gyomorba. A patkányokat a táplálást követő 20 percen belül elpusztítottuk, majd a gyomrot eltávolitattuk és ennek tartalmát spektroszkópia segítségével mértük. A gyomortartalmat összehasonlítottuk azon patkányok gyomortartalmával, amelyeket közvetlenül a táplálás után pusztítottunk el, és így a kiürülés sebességét mértük. A diabetesben szenvedő patkányok jelentősen nagyobb gyomorürülést (90,3 ± 1,7%) mutattak a normál Harlan Sprague Dawley patkányokkal (49,1 ± 4,7%; P < 0,001) és a nem-diabetes BB patkányokkal (61,1 ± 9,2%; P < 0,001) összehasonlítva. A hasnyál-mirigy β-sejt pepiid az amylin, amely az IDDM mintában hiányt mutat, dózisfüggő módon inhibiálta normál és diabetes patkányokban a gyomor kiürülést. A normál és a diabetesben szenvedő patkányokban az ED₅₀ válaszfüggvény értéke kb. 1 μg volt és ez az a dózis, amely 20 perccel az injektálást kö

62.166/SM ···· ····

- 36vetöen egy 76 pm amylin koncentráció csúcsot eredményez. Ezek a koncentrációk az in vivő megfigyelt koncentráció értékeken belüli értékek. Az eredmény azt támasztja alá, hogy az amylin szerepet játszik a tápanyag nyombélbe történő bejutásának fiziológiai szabályozásában.

A 6. példa szerinti vizsgálatban leírjuk a jelzett glükóz terhelés hatását emésztett mennyiség felvételét éber éheztetett, ugyanakkor jó állapotban lévő LA/N patkányokban. Az AC-0187 amylin receptor antagonistával végzett előzetes injektálás meggyorsította a glükózból származó tricium megjelenését a plazmában. Ezen túlmenően az amylin antagonistával végzett előzetes injektálás 15 perccel a tápanyag elnyelése után a plazma glükóz tartalom nagyobb növekedését eredményezte, továbbá egy korábbi plazma glükóz koncentráció csökkenés megjelenését is magával vonta. Ezek az adatok megfelelnek annak, hogy az AC-0187 amylin angatonista hatású vegyület ellenhatást gyakorol az endogén módon szekrécióval kiválasztott amylinnel szemben, és így meggyorsítja a gyomor kiürülését.

Érzéstelenített patkányokban további vizsgálatokat végeztünk és azt mutattuk ki, hogy az amylin nem fejt ki hatást a vékonybélből a véráramba történő glükóz abszorpcióra. Ezen kísérletekben érzéstelenített patkányokat folyamatosan infúzióval kezeltünk patkány amylinnel (0,35 nm/kg/perc) vagy fiziológiás sóoldattal a kontroll állatok esetében és ezt a kezelést 3 órán át végeztük. 1 órán át végzett amylin infúzió után 1 g/kg bolus glükózt infúzióval vagy a gyomorba vagy a nyombélbe juttattunk, utóbbi esetben a nyelőcsövön át lejuttatott csövön keresztül. Mivel a kísérletekben érzéstelenített és nem éber patkányokat alkalmaztunk, ezt a vizsgálatot nem alkalmazhattuk a gyomor motilitás analizására, azaz a gyomortartalom kiürülés sebességének meghatározására, amely gyomor tartalom a kiürülés során a nyombélbe kerül. A vizsgá62.166/SM ···· ···· · · · · · • · · ·· · · ······ · · · . ··· ......

- 37latok azonban azt mutatták, hogy a nyombélböl a véráramba történő glükóz abszorbció az amylin alkalmazásával nem késleltetett. Eltérő preparátumot alkalmaztunk, hogy közvetlenebbül meghatározzuk, vajon az amylin befolyásolja-e a glükóz áthaladását a vékonybél üregből a vérbe. Érzéstelenített patkányokban a vékonybél egy szegmensét, amely még az állathoz vérellátásán keresztül kötött, kimetszettük és egy kanült helyeztünk az üregbe, hogy a vékonybelet perfúzióval glükóz oldatokkal átöblítsük, amely oldatok koncentrációja előre meghatározott volt. Az állatokat ezen túlmenően egy artérián keresztül is kanüllel láttuk el (vér mintavétel céljából), illetve egy vénán keresztül is kanült helyeztünk be (amylin, inzulin és glükóz infúzió céljából). Az üreget triciummal jelzett glükóz oldattal átöblítettük. A glükóz áthaladását a bél üregből a patkányba a tricium jelzés plazmában történő megjelenésével mértük. A feltételezés, hogy a plazmában a tricium ilyen megjelenése valóban a bélből történő glükóz felvételt méri, egy glükóz átvitel blokkoló a pholidzin adagolásával vizsgáltuk. A pholidzin nagyban megakadályozta a radioaktív jelzés bélből a plazmába történő áthaladását. Abból a célból, hogy az amylin infúzió során a glükóz gradienst a bélüreg és a plazma között konstans értéken tartsuk a plazma glükózt „elzártuk” glükóz infúzióval, amely a plazma glükóz koncentráció változásának megfelelően változott. A készítményben az intravénás amylin infúzió nem befolyásolta a jelzett glükóz sebességet, amelyet a glükóz a vékonybélből a plazmába átkerülve mutatott. Az eredmények azt mutatják, hogy az amylinnal kezelt egyedekben csökkentett vér glükóz koncentráció, amelyeket a korábbi kísérletekben kimutattunk nem valószínű, hogy abból erednek, mivel a vékonybélből történő abszorpció csökken, hanem inkább a gyomortartalom nyombélbe történő áthaladásának csökkentett sebessége okozza ezt, azaz a késleltetett gyomorkiürülés következménye.

62.166/SM

- 38• » ···· ·

A találmány szerinti eljárásokban alkalmazható készítmények alkalmasan parenterális (beleértve az intravénás, intramuszkuláris és szubkután) vagy nazális vagy orális adagolásra alkalmas készítmény formában állíthatók elő. Néhány esetben egy amylin agonista és más gyomor kiürülést gátló szert, mint például glükagont egyetlen készítményben állíthatunk elő vagy oldatban közösen készíthetünk készítményt és a két anyagot így együttesen adagolhatjuk. Más esetben előnyös lehet az egyéb gyomor kiürülést gátló hatóanyagot a fenti amylintól vagy amylin agonista analógtól külön adagolni. A megfelelő adagolási formát előnyösen a kezelőorvos az egyes betegek esetében külön-külön határozza meg. Alkalmas gyógyszerészetileg elfogadható hordozóanyagokat, illetve ezek formulálását a standard formulálási szakirodalomban leírták [pl. Remington’s Pharmaceutical Sciences by E.W. Martin, lásd továbbá Wang, Y.J. és Hanson, M.A. „Parenteral Formulations of Proteins and Peptides: Stability and Stabilizers”, Journal of Parenteral Science and Technoloqy, Technical Report No. 10, Supp. 42:2S (1988)]. Az alkalmas formuláit alakok, beleértve a hypoglycaemiás hatóanyagok, mint például szulfonil-karbamidok, a szakirodalomban ismertek.

A találmány szerinti eljárásban alkalmazható vegyületeket injekció vagy infúzió céljára alkalmas parenterális készítmény formájában állíthatjuk elő. Ezeket a vegyületeket például szuszpendálhatjuk inért olajban, alkalmasan növényi olajban, mint például szezámolaj, mogyoróolaj, olívaolaj vagy egyéb elfogadható hordozóanyagban. Előnyösen az aktív hatóanyagokat vizes hordozóanyagban, például izotóniás puffer oldatban pH = 5,6-7,4 értéken szuszpendáljuk. Ezek a készítmények szokásos sterilizálási eljárásokkal sterilizálhatok vagy steril szűrésnek vethetők alá. A készítmények tartalmazhatnak gyógyszerészetileg elfogadható segédanyagokat, amelyek a fiziológiai körülmények

62.166/SM *··· *···

- 39függvényei, mint például pH puffer anyagokat. Alkalmas pufferek lehetnek például a nátrium-acetát/ecetsav pufferek. Alkalmazhatunk behelyezett vagy úgynevezett „depót” lassú hatóanyag kibocsátású készítményeket abból a célból, hogy a terápiásán hatásos hatóanyag mennyiség a készítményből a véráramba a transzdermális injekciót vagy behelyezést követően több óra vagy több nap időtartamon átjusson be.

A kívánt izotóniás jellemzőket nátrium-klorid vagy egyéb gyógyszerészetileg elfogadható segédanyag, mint például dextróz, bórsav, nátriumtartarát, propilén-glikol, poliolok (mint például mannitol és szóróitól) vagy más szervetlen vagy szerves oldott anyagok segítségével biztosíthatjuk. Erre a célra előnyösen alkalmazható a nátrium-klorid, különösen olyan pufferek esetében, amelyek nátrium-ionokat tartalmaznak.

Amennyiben kívánatos a fenti készítmény oldat formája sűrítő segédanyaggal besűríthető, amely lehet például metil-cellulóz. Az ilyen oldatokat emulzió formában is előállíthatuk, amely vagy víz-az-olajban vagy vízben-olaj forma lehet. A gyógyszerészetileg elfogadható emulzifikáló szerek bármelyikét alkalmazhatjuk, amely lehet például akácia por, nem-ionos felületaktív anyag (mint például Tween) vagy ionos felületaktív anyag (mint például alkálifém-poliéter-alkohol-szulfát vagy -szulfonát, például Triton).

A találmány szerinti eljárásban alkalmazható készítményeket úgy állíthatjuk elő, hogy az egyes alkotóelemeket az elfogadott eljárások alkalmazásával elegyítjük. Például a választott komponenseket egyszerűen egy keverőben vagy más standard készülékben elkeverjük, és így koncentrált keveréket állítunk elő, amelyet ezt követően végső koncentrációjú eleggyé alakíthatunk és viszkozitását víz vagy sűrítő anyag adagolásával beállíthatjuk, továbbá kívánt

62.166/SM •··· «··

- 40esetben pH értékét pufferrel szabályozhatjuk vagy izotóniás jellemzőit további oldott anyaggal állíthatjuk be.

Az orvosi felhasználására a készítményeket dózisegység formában állítjuk elő, amely valamely amylin vagy amylin agonista, például amylin agonista analóg vegyület adott mennyiségét tartalmazza egyéb gyomorkiürítést gátló hatóanyagokkal együtt vagy ezek alkalmazása nélkül, amely mennyiség egy vagy több dózisformában hatásos és a vércukor tartalmat egy előre meghatározott értéken tartja. Az amylin vagy amylin agonista, mint például amylin agonista analóg vegyület hatásos mennyisége a gyomor kiürülés szabályozására és arra a célra, hogy a gyomor kiürülés előnyösen lassított vagy szabályozott legyen, olyan mennyiség, amely csökkenti az étkezés utáni vér glükóz koncentrációt és ez előnyösen nem több, mint kb. 8 vagy 9 mmol vagy olyan mennyiség, amely előre meghatározott módon csökkenti a vér glükóz koncentrációt. A diabetes vagy glükózra nem toleráns betegek esetében a plazma glükóz koncentráció magasabb mint a normál egyedeknél. Az ilyen betegek esetében előnyös csökkentést vagy úgynevezett sima koncentráció „beállást” érhetünk el az étekezés utáni vércukor koncentrációban. A szakember felismeri, hogy a terápiás hatóanyag hatásos mennyisége több tényező függvényében változhat, amely tényezők lehetnek például a beteg kora és testtömege, a beteg fizikai állapota, a vércukor koncentráció vagy ennek amylinnal elérhető csökkenése, és egyéb tényezők.

A gyomor hypomolitást okozó ilyen gyógyszerkészítmények a betegben hasznosan alkalmazhatók és alkalmazhatók egyéb betegségek kezelésére is, amely betegségekben előnyösen csökkenteni kell a gyomor motilitást.

A vegyületek hatásos napi gyomor kiürülést gátló dózisa, amelyek lehetnek például ¹⁸Arg^25,28Pro-h-amylin, dez-¹Lys¹⁸Arg^25,28Pro-h-amylin,

62.166/SM ··· ····

- 41 ¹⁸Arg^25,28'²⁹Pro-h-amylin, dez-¹Lys¹⁸Arg-^25,28,29 Pro-h-amylin, ^25,28,29Pro-h-amylin, dez-¹Lys^25,28,29Pro-h-amylin és ²⁵Pro²⁶Val^25,28Pro-h-amylin, jellemzően 0,01 vagy 0,03 - kb. 5 mg/nap, előnyösen kb. 0,10 vagy 0,5 - 2 mg/nap és legelőnyösebben kb. 0,01 vagy 0,1-1 mg/nap érték egy 70 kg testtömeg beteg esetében, amely hatóanyagot egyetlen vagy osztott dózisban adagolhatunk. A pontos adagolandó dózist a kezelőorvos határozza meg és ez függ a fenti vegyületek csoportjában az adott alkalmazott vegyület típusától, továbbá a beteg korától, testtömegétől és állapotától. Az adagolást az első szimptómák megjelenésekor kell kezdeni vagy röviddel azután, hogy megállapították a diabetes mellitus jelenlétét. Az adagolási forma lehet injekció, előnyösen szubkután vagy intramuszkuláris injekció. Orálisan aktív vegyületeket orális úton adagolhatunk, azonban ebben az esetben a dózist 5-10-szeres mértékben meg kell emelni.

Általában a magas, nem megfelelő vagy nem kívánatos étkezés utáni vér glükóz koncentráció kezelésére vagy kialakulásának megelőzésére a találmány szerinti vegyületeket az ilyen kezelést igénylő betegeknek a fentiekhez hasonló dózíshatáron belül adagolhatjuk, azonban a vegyületeket naponta többször, például 1, 2 vagy 3 alkalommal kell adagolni.

Az gyomor hypomotilitást megfelelően kezelő amylin antagonista vegyületeket dózisformában adagolhatjuk, amely dózis 0,1-30 mg/nap, előnyösen 0,3-10 mg/nap és legelőnyösebben 0,1-3 mg. Az adagolás lehet például szubkután vagy intramuszkuláris injekció forma. Az orálisan aktív vegyületeket orálisan is adagolhatjuk, azonban a dózist 5-10-szeres mértékben meg kell növelni.

A találmány szerinti eljárás részletes ismertetése céljából az eljárást az alábbi példákon részletesen bemutatjuk, illetve bemutatjuk a vizsgálatok részle

62.166/SM

- 42tes leírását is. A találmány szerinti eljárással kapcsolatos vizsgálatok, illetve eljárások természetesen nem limitáló hatásúak és bármely más ismert vagy később kidolgozható változtatást is beleértünk a találmány tárgykörébe.

1. példa

A korábbi kísérletek kimutatták, hogy intravénás amylin injekció éheztetek vagy táplált patkányokban glükóz tolerancia teszvizsgálat körülményei között csökkentheti a plazma glükóz tartalmát és növelheti a plazma laktát tartalmát és ez a változás dózisfüggő módon történik. Az inzulin válaszfüggvény ugyancsak jelentősen csökkenthető éhetetett állatokban amylin infúzió adagolásával.

Az alábbi vizsgálatok és tesztvizsgálatok kimutatták, hogy az amylin infúzió az orális glükóz koncentrációhoz képest csökkenti a plazma glókóz tartalmat kutyákban. A kísérletek célja az alábbi volt: (1) a plazma glükóz koncentráció, laktát koncentráció és inzulin koncentráció változásának értékelése orális glükóz terhelés függvényében; (2) a fenti változók esetében az intravénásán adagolt amylin hatásának értékelése; és (3) az amylin antagonista AC0253 [acetil-^11,18Arg, ³⁰Arg, ³²Arg, ³²Tyr-⁹’³² calcitonin (lazac)] hatásosságának megállapítása, hogy ez mennyiben képes a vér plazma glükóz tartalomban megfordítani amylin által indukált változásokat.

A vizsgálatokban kevert fajú kutyákat (9 hím, 12-17 kg testtömegű) alkalmaztunk. Valamennyi állatot az egyes kísérletek megkezdése előtt éjszakán át éheztettük. Valamennyi állat saját kontrolljaként is szerepelt minden protokoll esetében. Az állatokat az egyes protokoll megkezdése előtt 30-60 percen át kiegyenlítettük.

t = -30 perc időpontban hordozóanyag vagy amylin ± AC-0253 adagolás kezdődött. Az amylin dózis sebessége 50, 100 és 300 pmol/kg/perc érték volt.

62.166/SM

- 43Az AC-0253 dózis értéke 500 és 150 pmol/kg/perc volt. A t = 0 percben 25%os glükóz oldatot (1 g/kg) adagoltunk. Az amylin ± AC-0253 adagolást a t = 120 percben leállítottuk. Az inzulin, glükóz és laktat mérése céljából mintákat vettünk 15 perc időtartamokon belül a t = -45 perc -1 = 180 perc időtartamon át. A patkány amylin és AC-0,253 mintákat a t = 60 s 120 perc időpontokban vettük.

Normál kutyák esetében a plazma glükóz koncentráció csúcsa az orális glükóz adagolást követő 30-45 perc időtartam határon belül jelentkezik (éber kutyák esetében). Ugyan igen jelentős kutyák közötti eltérés tapasztalható, az egyes kutyák esetében a válasz formája mindig ismételhető volt. Valamennyi vizsgált dózis esetében az amylin csökkentette a plazma glükóz koncentráció növekedési sebességét, valamint a plazma glükóz koncentráció csúcs értékét. Az amylin infúzió során a plazma glükóz koncentráció egy platót ért el, amely érték sokkal kisebb koncentráció volt mint a kontroll kísérletekben tapasztalt érték. A plató a 30-45 perc közötti időtartamban jelentkezett és amikor az amylin infúziót megszüntettük, a koncentráció ismét növekedni kezdett. Nem volt eltérés a plazma glükóz koncentrációban az 50, 100, illetve 300 pmol/kg/perc amylin dózisok alkalmazása esetében.

Az 50 pmol/kg/perc amylin dózis sebességet választottuk abból a célból, hogy meghatározzuk az AC-0253 hatásosságát az amylin-indukált plazma glükóz koncentráció változások megfordításában. Az AC-0253 egészen 1500 pmol/kg/perc dózisig nem tudta teljesen megfordítani az amylin 50 pmol/kg/perc dózis hatását. Önmagában az AC-0253 nem fejt ki hatást a plazma glükóz tartalom változására. Az amylin és az AC-0253 hatása a plazma laktát koncentrációjára nem jelentős.

62.166/SM ···· ···· • · · · · · · • · · · · · · • ····· · · · · -44- .........

2. példa

Az amylin agonista AC-0137 klinikai vizsgálatában 24 férfi vett részt, akik inzulin függő diabetes mellitusban szenvedtek. Valamennyi beteg véletlenszerűen kiválasztott módon csoportokba került. 4 kezelési csoportot alakítottunk ki, amelyek sorrendben placebót, továbbá 30, 100 vagy 300 pg AC-0137 kezelést kaptak. Az egyes dóziscsoportokhoz tartozó betegek két periódusos kezelésben vettek részt, hogy megvizsgáljuk az intravénás (IV) bolus hatását az IV infúzió hatásával összehasonlítva. Mindként periódus 3-3 napos vizsgálatot jelentett. Minden esetben a vizsgálat megkezdése előtt a vizsgálati egységhez történő aklimatizálást az első napon biztosítottuk. A második és harmadik tesztvizsgálati napokon a placebo és az aktív kezelés váltakozó kezelést végeztünk. Például véletlenszerűen kiválasztott betegek IV bolust kaptak első alkalommal, majd a továbbiakban AC-0137 IV bolus kezelésben részesültek egy napon át és blacebo IV bolus kezelésben részesültek a másik napon (vagy ellentétes sorrendben alkalmaztuk és a bolus placebót a bolus AC-0137 kezelés követte). Két hét elteltével a betegeket ismét vizsgálatnak vetettük alá és ebben az esetben a másik adagolási módon, azaz IV infúzió segítségével ugyanolyan dózisú AC-0137 kezelést alkalmaztunk. A váltakozó kezelést a második és harmadik napon ezen a vizsgálaton ugyancsak hasonlóan alkalmaztuk mint a korábbi első tesztvizsgálatnál, azaz váltakozóan placebót és aktív hatóanyagot adagoltunk. A hat beteg, akik csak a placebo csoport tagjai voltak mindenegyes vizsgálati napon kizárólag placebót kapott.

A tesztvizsgálati napokon a vizsgálat kezdete előtt legalább 30 perccel intravénás katétert helyeztünk a betegbe. A dózis adagolása előtt 15 perccel a betegek szokásos inzulin dózisukat kapták meg szubkután injekció formájában. A 0 időpontban a betegek vagy IV bolus injekciót kaptak, amely a megfelelő

62.166/SM • · * · ··· /IC ···♦♦··<

dózisú AC-0137 hatóanyagot vagy placebot tartalmazott és ezt 2 percen át alkalmaztuk; vagy folyamatos infúzió kezelésében részesültek, amely az AC0137 előre meghatározott dózisát tartalmazta vagy placebot tartalmazott és ez a kezelés 2 órán át történt. Az infúzió sebességét úgy állítottuk be, hogy a 2 óra időtartam alatt kapja a beteg a megadott mennyiségű hatóanyagot. 30 perc elteltével a betegek elfogyasztották szokásos reggelijüket. Vérmintákat a -30 perc és 300 perc időtartam között vettünk és mértük a plazma AC-0137 koncentrációt, továbbá a plazma glükóz koncentrációt.

A plazma hatóanyagtartalom a várt módon a bolus injekció után gyorsan csúcsértéket ért el, majd ezután a plazmából látszólagos elsőrendű kinetika szerint eltűnt. Ezzel szemben amennyiben folyamatos infúziót alkalmaztunk, ez 30 percen belül körülbelül állandó koncentrációhoz vezetett és ez a koncentráció az infúzió alkalmazása során mindvégig fentmaradt. Az infúzió befejezése után a plazma koncentrációk hasonlóan csökkentek mint amit az IV bolus adagolás esetében tapasztaltunk.

A plazma glükóz koncentráció alakulása váratlan és igen érdekes módon alakult. Amint várható volt, a placeboval kezelt betegek esetében mindenegyes vizsgálat során a plazma glükóz koncentráció kb. 60-90 percen belül az alapvonal fölé emelkedett és ezen a magas koncentráció értéken maradt legalább 240 percig. Az IV bolus AC-0137 adagolás, amennyiben 30 μg dózist alkalmaztunk, nem okozott jelentős változást a glükóz koncentrációban. Amennyiben 100 μg bolus dózist alkalmaztunk az étkezés utáni glükóz koncentráció növekedés nyilvánvaló módon késleltetett és kevésbbé jelentős. Amennyiben 300 μg bolus dózist alkalmaztunk, a glükóz koncentráció étkezés utáni növekedése teljes mértékben megszüntethető.

62.166/SM

- 46A folyamatos intravénás infúzió adagolása esetében dózisfüggő étkezés utáni hyperglycaemia csökkenést figyelhettünk meg. A 15 gtg/óra infúzió adagolása esetében valamely hatást tapasztalhattunk és amennyiben az infúzió sebességet 50 gg és 150 gg/óra értékre növeltük, az étkezés utáni glükóz koncentráció növekedésének csökkentése különösen jelentős. Hasonlót eredményt tapasztalhattunk, amennyiben bolus hatóanyag adagolást alkalmaztunk.

3. példa

Egy vakvizsgálatú, placeboval kontrolált két periódusból álló tesztvizsgálatot végeztünk, amely két vizsgálat között minimálisan 15 óra kimosási időtartamot alkalmaztunk. Ezt abból a célból végeztük, hogy a tripro-amylin (AC0137) hatását kimutassuk abban, hogy csökkenti az étkezés utáni hyperglycaemiát, illetve, hogy bizonyítsuk, hogy az étkezés utáni hyper-glycaemia csökkentése elsődlegesen gasztrointesztinális hatás következménye. 27 inzulin-függő diabetes mellitusban szenvedő beteget két dózis koncentrációjú csoportba osztottunk és két típusú tolerancia teszvizsgálatot hajtottunk végre. A betegek folyamatos mikro-infúziós pumpa segítségével AC-0137, valamint placebo kezelésben részesültek. Ez egy kereszt vizsgálati eljárás segítségével történt. A betegeket három csoportra osztottuk és minden csoportba az alábbiak szerint kilenc beteg került: az A csoport Sustacal® táplálékot és AC-0137 25 μg/óra dózist kapott. A B csoport Sustacal® táplálékot és AC-0137 50 μg/óra dózist kapott, a C csoport intravénás glükóz terhelést és AC-0137 50 μg/óra dózist kapott.

A betegek három napig maradtak a klinikán. Az első kísérleti napon a betegek a klinikához aklimatizálódtak. A második és harmadik napokon a betegeket az AC-0137 és a placebo összehasonlítása céljából egy két periódusú

62.166/SM

- 47• * · · ········ • · · · · · · • ····· · · · ··· · ·· · ·· kereszt tervezésű tesztvizsgálatnak vetettük alá. Ezen túlmenően a betegek a csoportok szerint vagy Sustacal® táplálékot vagy iv. glükóz tolerancia terhelést kaptak.

Az első nap során a betegek szokásos inzulin- és kalóriafelvételét stabilizáltuk, majd a betegek a klinikán való tartózhodás során ezt az inzulin és táplálkozási módot követték.

Körülbelül 0700 óra (T = 0) időpontban a gyógyászati infúzió folyamatos vizsgálatot megkezdtük. T = 30 perc időpontban a betegeknek szokásos délelőtti inzulin dózisukat adagoltuk. T = 60 perc időpontban a betegeknek standard Sustacal® táplálékot adagoltunk, amely 355 kalória tartalmú. Ezt folyadék formájában kellett elfogyasztaniuk, vagy ugyanebben az időpontban 300 mg/kg glükóz terhelést alkalmaztunk. Ez utóbbit 5 percen át infúziós pumpa alkalmazásával, IV infúzió segítségével, D₅₀V\/ adagolásával végeztük. A tolerancia tesztvizsgálat típusát a véletlenszerű kiválasztás szerint határoztuk meg. Szabályos időpontokban vérmintákat vettünk, hogy a plazma, glükóz, laktát és inzulin tartalmát, továbbá az AC-0137 plazma koncentrációt mérjük. A hatóanyag adagolás vizsgálatot a T = 300 perc időpontban befejeztük.

A harmadik nap reggelén az iv adagolást hasonló módon végeztük, mint a második nap folyamán. A betegeknek a második napohoz hasonlóan adagoltuk a reggeli étkezés előtti inzulin dózisukat. Ezt követően keresztvizsgálati módszer szerint a betegek megkapták a placebo vagy tesztvizsgálati vegyület kezelésüket, az előző naphoz hasonló iv út és dózis alkalmazásával (azaz azok a betegek, akik a második napon AC-0137 infúziót kaptak, a harmadik napon placebo infúzióval kezeltek). A második naphoz hasonló standard

62.166/SM • · ·· ···· • · · · · · · • · « · · · « * ····· · · · · • ·· · ·· · · ·

- 48Sustacal® élelmiszer tolerancia vagy iv glükóz terhelés alkalmazását végeztük.

A mintavételi időtartam befejezése után az iv adagolást megszüntettük.

Amint ezt a 10. ábrán bemutatjuk, az IV glükóz terhelés esetében a plazma glükóz koncentráció olyan betegekben, akiket 50 pg/óra AC-0137 dózissal kezeltünk, nem jelentősen tért el a placeboval kezelt betegek vér glükóz koncentrációjától. Ezek az eltérések a glükóz koncentráció injektálás utáni értékében statisztikusan jelentősek, amennyiben a glükóz görbék alatti terület az alapvonalra korrigálva kerültek összehasonlításra (P = 0,0015). így az AC0137 adagolás során tapasztalt étkezés utáni csökkentett hyperglycaemia megfigyeléseket újra bizonyítottuk standard élelmiszer adagolása esetében sokkal alacsonyabb átlagos AC-0137 plazma koncentráció esetében (korábban alkalmazott koncentrációval összehasonlítva).

Azonban amint a 8. és 9. ábrákon bemutatjuk, az olyan betegek esetében, akik Sustacal® élelmiszert kaptak és 25 pg/óra vagy 50 pg/óra iv infúzió AC-0137 kezelésben részesültek a placeboval kezelt betegek koncentrációjával összehasonlítva a plazma glükóz koncentráció az AC-0137 által kezelt betegekben csökkent.

Az AC-0137 tolerálható farmakológiai dózisban csökkenti az étkezés utáni plazma glükóz koncentrációt inzulinfüggő diabetes betegekben orális tápanyag adagolás után, azonban nem fejt ki mérhető hatást a plazma glükóz koncentrációra, amennyiben intravénás glükóz terhelést alkalmazunk. Ezek az eredmények egybevágnak azzal a feltételezéssel, hogy az AC-0137 hatóanyag módosítja a bélrendszerbe történő orális tápanyagfelvételt és azt jelzik, hogy legalábbis részben a fenti vegyület hatására a gyomor kiürülés sebességben változás következik be.

62.166/SM • · · · · • · · · · · · • · · · · · · • ···*· · · · · ··· « ·· · ··

4, példa

Véletlenszerűen kiválasztott két vak kísérletbe osztott placebo kontroll alatt lévő párhuzamos betegcsoporton vizsgáltuk a tripro-amylin (AC-0137) hatását a plazma glükóz koncentrációra Sustacal® standard élelmiszer (Mead-Johnson) fogyasztása után. A 14 napos klinikai vizsgálatban 72 inzulinfüggő diabetes mellitus beteg vett részt. Valamennyi beteget véletlenszerűen a négy kezelési csoport egyikébe beosztottuk, ezek a csoportok 14 napon át napi három alkalommal szubkután injekció formájában placeboval, 30, 100 vagy 300 μg trípto-amylinnel kezeltek. A betegeket eközben szokásos inzulin kezelés alatt tartottuk az egész vizsgálat időtartama alatt. Az 1. napon (alapvonal), a 7. és 14. napon standard élelmiszer tolerancia tesztvizsgálatot hajtottunk végre.

A standard élelmiszer tolerancia tesztvizsgálatban a betegeknek Sustacal® folyékony tápanyagot (360 ml, amely 360 kalória tartalmú) 8,00 órakor adagoltuk. A betegektől az előző éjszaka 22,00 órájától kezdődően a táplálékot, illetve a folyadékot (a víz kivételével) megvontuk az előző éjszaka 22,00 órájától kezdődően. A betegeknek nem adagoltuk a szokásos inzulin dózisukat csak a Sustacal® élelmiszer adagolása előtt 30 perccel. Az első napon az alapvonal tesztvizsgálat esetében tripro-amylint (vagy placebot) csak akkor adagoltunk, amikor a tesztvizsgálatot már befejeztük. A 7. és 14. napon triproamylint (vagy placebot) adagoltunk külön injekció formában, ugyanabban az időpontban, amikor a szokásos reggeli inzulin dózist is adagoltuk. A szérum glükóz koncentráció meghatározására mintákat vettünk a vizsgálat kezdetéhez számítva -30., 0., 30., 60., 120. és 180. percben. A 0 időpontnak azt az időpontot tekintettük, amikor a beteg a Sustacal® élelmiszer ivását megkezdte.

62.166/SM • · ♦ ί . ······ • · · · · · · ··· « · · · · · - 50Mint az alábbi 1. táblázatban és a 11-13. ábrákon bemutatjuk, a 14. nap után statisztikailag jelentős (p = 0,02) glükóz koncentráció kiegyenlítő hatás (a glükóz görbe alatti terület mérésével) figyelhető meg a 30 μ és a 100 pg dózis koncentráció alkalmazása esetében. A tripro-amylin (AC-0137) indukált csökkenés a görbe alatti területben (AUC) a csúcs vér glükóz koncentrációban a betegek esetében 45 mg/dl - 60 mg/dl átlagos csökkenés volt.

1. táblázat

A tripro-amylin adagolás utáni 14 naptól kezdődően az étkezés utáni glükóz (AUC) koncentrációban tapasztalt változás

Tripro-amylin dózis (napi 3 alkalommal adagolt)	Placebo	30 mikrogramm	100 mikrogramm	300 mikrogramm
A 14. napon tesztvizsgálatnak alávetett betegek száma	21	15	22	12
Étekezés utáni glükóz: az AUC változásának átlaga (mg/dl*perc) (a)	+229	-6,645	-6,412	-7,316
„p” értékek a placebo függvényében (b)		0,02	0,02	0,11
Plazma tripro-amylin csúcsa (pikomol/liter)		22 + 4	44 + 14	173+40

(a) Az AUC a glükóz koncentráció görbe alatti terület az étkezés előtti glükóz értékhez viszonyítva a tesztvizsgálati tápanyag felvételének kezdeti és 3 órával ezutáni időpont között. Az AUC változása a dózis előtti érték mínusz a 14. napon mért érték mindenegyes beteg esetében, akiket mindkét napon tesztvizsgálatnak vetettünk elá.

(b) p értékeket egy nem paraméteres Wilcoxon teszttel nyertük.

62.166/SM

- 51 • · ·· ········ ·· · · · · · • · * · · t · • ····· · « · · ··· · ·· · ··

5. példa

Az alábbi tesztvizsgálatot abból a célból végeztük, hogy megvizsgáljuk az amylin agonisták hatását rágcsáló modellben a gyomorkiürülésre, ahol a modell spontán autoimmun diabetesben szenvedő inzulin kezelt BB patkány.

Hím Harlan Sprague Dawley (HSD) patkányokat (161-244 g) és biotenyésztett (BB) patkányokat (181-405 g) amelyeket házon belüli kolóniából nyertünk, amely kolónia eredete 1989-ben a Mollegárd Breeding Center-bői, Dánia származott, alkalmaztunk a tesztvizsgálatokban. Amikor a BB patkányokról bebizonyítottuk, hogy ezek legalább két napon át cukorvizelésben diabetes állapotúak, ezeket naponta s.c. különlegesen lassú rekombináns humán inzulin injekcióval kezeltük (Humunin-U,Eli Lilly, Indianapolis). Az inzulin terápiát azért alkalmaztuk, hogy a glükóz tartalmat fenntartsuk, azonban a vizeletben a keton tartalmat minimálisra csökkentsük, hogy elkerüljük a hypoglycaemia miatt bekövetkező elhullást. A vizsgálatok szerint az esetek 88%-ában cukorvizelés volt jelen és 52%-ban keton vizelési tapasztaltunk. A diabetes átlagos időtartama 53 ± 5 nap volt és a napi inzulin kezelés igény 4,7 ± 0,3 egység volt. Valamennyi állatot 22,7 ± 0,8°C hőmérsékleten 12 óra megvilágítás -12 óra sötétség ciklusban (a kísérleteket a megvilágítás cilusban hajtottuk végre) tartottuk és ad Hbitum tápláltuk, illetve vízzel itattuk (Diet LM-485, Teklád, Madison, Wl).

A gyomorkiürítést az eljárás során az alábbiaknak megfelelően úgy végeztük, hogy kb. 20 órán át éheztetést alkalmaztunk abból a célból, hogy biztosítsuk, hogy a gyomor további ételpépet ne tartalmazzon, ami zavarhatná a spektrofotometriás abszorpció méréseket. Azonban az Ultralente inzulinnal kezelt diabetikus patkányok éheztetése nem történhetett 20 órán át. A 6 óránál nagyobb éheztetési periódus hypoglycaemiát eredményezett. Ennélfogva az

62.166/SM • · · ·

- 52ilyen állatokat a mérés előtt csak 6 órán át éheztettük, amikor a gyomorkiürülést meghatároztuk. A nem diabetesben szenvedő patkányokat a kísérlet megkedzése előtt 6 vagy 24 órán át éheztettük. Megjegyzendő, hogy a BB nem diabetesben szenvedő patkányok is magas glicerinezett-hemoglobin koncentrációval rendelkeznek, ez valószínűleg azt jelzi, hogy ezek az állatok nem klinikai jellegű insulitisban szenvednek. A nem diabetikus Harlan Sprague Dawley patkányok és a nem diabetikus BB patkányok ennélfogva a diabetikus patkányok összehasonlítási alapjául szolgáltak. A vizsgálatban ebből eredően 5 kezelési csoportot különböztettünk meg:

1) Nem diabetikus Harlan Sprague Dawley patkányok, amelyeket 6 órán át éheztettünk, n = 8.

2) Nem diabetikus BB patkányok, amelyeket 6 órán át éheztettünk, n = 6.

3) Diabetikus BB patkányok, amelyeket 6 órán át éheztettünk, n = 10.

4) Nem diabetikus Harlan Sprague Dawley patkányok, amelyeket 20 órán át éheztettünk, n = 20.

5) Nem diabetikus BB patkányok, amelyeket 20 órán át éheztettünk, n = 7.

Éber patkányoknak nyeléssel 1,5 ml acaloric gélt adagoltunk, amely 1,5% metil-cellulóz (M-0262, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) és 0,05% fenolvörös indikátor tartalmú. A nyelés után 20 perccel a patkányokat 5% halothane segítségével érzéstelenítettük, majd a gyomrot kiemeltük és a gyomorkapu, valamint az alsó nyelőcsövi záróizmokat artéria csipesz segítségével elzártuk. Ezt követően a gyomor tartalmát kiürítettük és alkálikus oldatba vittük, amelyet állandó térfogatra egészítettünk ki. A gyomor tartalmat úgy határoztuk meg, hogy 560 nm hullámhossznál mért abszorpció segítségével megmértük a fenolvörös intenzitását az alkálikus oldatban. A legtöbb kísérletben a gyomor üres volt. Egyéb kísérletekben a darabos gyomor tartalmat centrifugáltuk, hogy

62.166/SM

az abszorpció méréshez tiszta oldatot nyerjünk. Amennyiben a hígított gyomor tartalom zavaros maradt, fenolvörösböl eredő spektroszkópiai abszorpció az a különbség, ami az alkálikus oldatban jelen van, illetve amelyet a savas hígítóanyag tartalmaz. Külön kísérletben 7 patkány esetében a gyomor, illetve a vékonybél tartalmát ugyancsak kimetszettük és alkálikus oldatba vittük. A felső gasztrointesztinális traktusból az evés után 20 perccel kinyerhető fenolvörös mennyisége az összes mennyiség 89 ± 4%-a volt. A maximális festék visszanyerés kebesebb mint 100%, emiatt a 20 perc időtartam után maradó gyomor tartalmat a kontroll patkányok gyomor tartalmából kinyert festék százalékában adjuk meg, amely patkányokat ugyanabban a kísérletben közvetlenül a nyelés után pusztítottunk el és távolítottuk el a gyomor tartalmát.

Az alapvonal vizsgálatokban (amelyekben amylint nem adagoltunk injekció útján) a 20 perc időtartam utáni gyomor ürítést a fent megadott 5 kezelési állatcsoportban határoztuk meg. A dózis-válaszfüggvény tesztvizsgálatban 0,15m fiziológiás sóoldatban oldott patkány amylint (Bachem, Torrance, CA) adagoltunk 0,1 ml-es szubkután bolusban 0, 0,01, 01, 1 10 vagy 100 μg dózis alkalmazásával 5 perccel a táplálkozás előtt 46 Harlan Sprague Dawley (nem diabetikus) patkánynak, amelyeket 20 órán át éheztettünk (n = 17, 2, 8, 8,6,5 sorrendben) továbbá 29 diabetikus BB patkánynak, amelyeket 6 órán át éheztettünk (n = 10, -, 3, 3, 3, 10 sorrendben).

Külön kísérletben megvizsgáltuk a plazma amylin koncentráció változását, amelyet effektív dózis szubkután amylin adagolással nyertünk. A vérmintákat 6 halothane-érzéstelenített patkány farkából nyertük, miután s.c. bolus injekciót adagoltunk, amely injekció 1 pg (n = 3) vagy 10 μg (n = 3) patkány amylint tartalmazott. Egy másik kísérletben a plazma amylin koncentrációt ösz62.166/SM

- 54szehasonlítottuk nem éheztetett Harlan Sprague Dawley patkányok (n =8) és nem éheztetett diabetikus BB patkányok (n = 5) esetében. 250 qg plazma mintát vettünk 10 perc intervallumokban, ezt elválasztottuk, majd -20°C hőmérsékleten analízis céljából (2-helyzetű immuno-enziometrikus tesztvizsgálat, amelyet saját kutatásainkkal fejlesztettünk ki) fagyasztottuk.

Az immuno-tesztvizsgálat céljából fekete mikrotiter lemezeket (Dynatech, Chantilly, VA) vontunk be F024-4.4 antitesttel (Phelps JL, Blase E, Koda JE, nem közzétett). A bevonás után éjszakán át 4°C hőmérsékleten inkubálást hajtottunk végre, és a bevonáshoz 50 μιτιοΙ karbonát oldatban 9,6 pH érték mellett 20 ug antitest/ml anyagot alkalmaztunk. Ezt követően a lemezeket 0,05m Tris/0,15m nátrium-klorid/0,02% nátrium-azid/0,1% Teween 20 (TBS/Tween) eleggyel mostuk és a reakció előrehaladást 1% nem zsíros száraz tejpor ugyanabban a karbonát pufferben készült elegyével leállítottuk 1 órán át szobahőmérsékleten végzett inkubálást alkalmaztunk. A mintákat ezután jégen fölolvasztottuk, majd amennyiben ez szükségesnek látszott 4% BSA/200 mg/dl marha koleszterin - supertrate (Miles Pentex reagens, Miles Laboratories, Kankakee, IL) segítségével hígítottuk. A bevont és blokkolt lemezekhez mintákat vagy standard anyagokat adagoltunk, majd az elegyet 1 órán át szobahőmérsékleten inkubáltuk. Ezt követően az elegyet mostuk, majd F025-27 detektáló antitestet (amely az alálikus foszfatázhoz konjugált) adagoltunk a keverékhez. Az antitest-enzim kapcsolást maleimid alkálikus foszfatáz konjugáló készlettel végeztük, amely a Pierce Immunochemical Co (Rockford, IL) terméke. A konjugátot 3 órán át szobahőmérsékleten inkubáltuk, majd Tris puffereit fiziológiás sóoldattal alaposan átmostuk. A kötött enzim mennyiségét úgy határoztuk meg, hogy a lemezeket 4-metil-umbelli-feril-foszfát fluoreszcen62.166/SM ···· ···· • ····« · · · · ··· · ·· · ··

- 55ciás szubsztráttal 50 ug/ml koncentrációban 1m dietanol-amin/0,5 mmol MgCI₂, pH 9,8 keverékben szobahőmérsékleten 40 percen át inkubáltuk. A fluoreszcens jelet Dynatech Microfluor lemezleolvasó segítségével mértük, majd az adatokat Multicalc software (Wallac, Gaithersburg, MD) segítségével analizáltuk. Az amylin plazma koncentrációt a plazma mintákban az ugyanezen tesztvizsgálatban nyert standard görbével összehasonlítva meghatároztuk. Amenynyiben a kísérletet ilyen módon végeztük, a minimálisan detektálható koncentráció 2 pm érték volt.

A gyomor kiürülési dózis válaszfüggvényeket 4 paraméteres modellhez illesztettük legkisebb négyzet iteraktív módszer alkalmazásával (ALLFIT, v2.7, NIH, MD) és így meghatároztuk az ED₅₀ értékeket. Mivel az ED₅₀ értékek lognormál eloszlásúak, ezeket ± standard hibával a logaritmus értékekben fejeztük ki. Párosított összehasonlítást végeztünk egyutas variancia analízissel, illetve Student-Newmann-Keuls többszörös összehasonlítási teszttel (Instat v2.0, GraphPad Software,San Diego), amelyben P < 0,05 jellemző eltérés értéket használtunk.

nem éheztetett Harlan Sprague Dawley patkányban a keringési rendszerben az amylin koncentráció 11,7 ± 1,4 pm érték volt (95% Cl 8,4-14,9 pm).

nem éheztetett spontán diabetesben szenvedő BB patkányban összehasonlításként megadjuk, hogy az amylin koncentráció ugyanebben a rendszerben nem detektálható.

Az étkezés után 20 perccel maradó festék frakció (fenolvörös) a statisztikai összehasonlítások alapján a 2. táblázatban található. A Harlan Sprague Dawley patkányokban, illetve a nem diabetes BB patkányokban 20 perc után mutatott gyomorkiürülés ugyanolyan volt, mint amikor ezeket az állatokat 6

62.166/SM τ

- 56»··· ····

órán át vagy 20 órán át éheztettük. Ez az éheztetési periódus (6-20 óra közötti) nem jelentősen befolyásolja az ezzel az eljárással mért gyomorkiürülést.

2. táblázat

Az étkezés után 20 perccel fennmaradó gyomortartalom

	Nem-diabetikus HSD	Nem-diabetikus BB	Diabetikus BB
20 óra éheztetés	54,9 ± 3,0% n = 20	27,0 ± 3,8% n = 7	nem elvégzett kísérlet
6 óra éheztetés	50,9 ± 4,7% n = 8a	38,9 ± 9,2% n = 6a	b c 9,7 + 1,7% n = 10

A gyomortartalmat közvetlen az étkezés után visszanyert gyomortaralom százalékában fejezzük ki, amelyet 2-3 külön patkányban végzünk, ugyanazon kísérleten belül.

^a = nem eltérő a 20 órán át éheztetett patkányok eredményeitől.

^b = eltérő a 6 órán át éheztetett HSD patkányok értékeitől (P < 0,001) ^c - eltérő a nem-diabetes BB 6 órán át éheztetett patkányok értékeitől (P < 0,001)

Megjegyzendő, hogy a diabetes BB patkányok gyomorkiürülése jelentősen gyorsabb volt (P < 0,01-0,001) mint az egyéb 4 kezelt csoport kiürülése (azaz a nem-diabetesben szenvedő állatok értékei). Az a megfigyelés, hogy a BB diabetes patkányok magasabb gyomorkiürülési sebességgel rendelkeztek mint a nem-diabetikus BB patkányok, azt jelzi, hogy ennek oka a diabetes jelenléte, nem pedig a BB törzsből eredő ok áll fenn.

A fent leírt kutatási feltételek miatt, az amylin hatását mértük nem-diabetesben szenvedő, 20 órán át éheztetett Harlan Sprague Dawley patkányok, és diabetesben szenvedő 6 órán át éheztetett BB patkányok, amelyeket 6 órán át éheztettünk, összehasonlításában. Amennyiben a fenol-vörös indikátor lenyelése előtt 5 perccel szubkután amylin injekciót adagoltunk, dózisfüggő gyomorkiürülés csökkenést tapasztaltunk. A gyomorkiürülés csökkentés olyan volt, hogy az kb. azonosnak mutatkozott a normál HSD patkányok esetében, ame62.166/SM

lyeket 1 μς amylinnal kezeltünk, illetve a diabetikus patkányok esetében, amelyeket 10 μς amylinnel kezeltünk és ez a kiürülés kb. azonos volt mint közvetlenül a nyelés után visszanyerhető gyomortartalom (P = 0,22, 0,14). A gyomorkiürülésben 50% maximális változást elérő (ED₅₀) dózis normál patkányok esetében 0,43 μg (0,60 nmol amylin/kg testtömeg) ±0,19 lóg egység volt. A diabetikus patkányok esetében a ED₅₀ érték a gyomorkiürülés csökkentésére

2,2 pg (2,3 nmol/kg) ±0,18 lóg egység volt. A 14. ábrán bemutatott illesztett görbék alapján becsülhető, hogy körülbelül 2 μg diabetikus patkánynak adagolt amylin dózis visszaállttá a gyomorürülés sebességét arra az értékre, amelyet normál patkányok esetében tapasztaltunk, amely utóbbi állatokat amylinnel nem kezeltünk.

Amint a 15. ábrá bemutatjuk, amennyiben 3 patkányt szubkután úton 1 μg patkány amylinnel kezeltünk, a plazma koncentráció 10 perccel ezután 66 ± 10 pm érték volt, illetve a csúcs koncentráció 20 perc elteltével 74 ± 26 pm érték volt. 3 patkány esetében, amelyeket 10 pg szubkután bolus alkalmazásával kezeltünk, a 10, illetve 20 perc időtartamban mért koncentrációk sorrendben 347 ± 43 pm és 301 ± 57 pm értékek voltak. Az 1 μg szubkután amylin dózis, amely a gyomor kiürülést körülbelül 50%-kal inhibiálja 20 perc időtartamon belül (ED₅₀ érték) valószínűleg az injektálás után hamarosan kifejti hatását ahhoz, hogy a 20 perc időtartamon belül ez az eredmény létrejöjjön. Amennyiben az injektálás után körülbelül 20 percen belül hatás jelentkezik, ezt ezzel a fenti rendszerrel nem detektálhatjuk. Ebből az következik, hogy az olyan plazma koncentráció, amely 50%-ban inhibiálja a gyomorkiürülést (azaz az (EC₅₀ érték), sokkal korábban bekövetkezik, mielőtt a 74 pm plazma koncentráció csúcsot elérjük és ennélfogva ez sokkal kisebb koncentráció, mint a 74 pm érték.

62.166/SM

- 58A kísérletek eredményei azt mutatják, hogy az amylin hatásosan és dózisfüggő módon ínhibiálja a gyomorkiürülést.

6. példa

A példában leírt tesztvizsgálatokat abból a célból végeztük, hogy meghatározzuk, hogy egy amylin receptor antagonista milyen hatást fejt ki az orális glükóz toleranciára, illetve a jelzett orális glükóz terhelésből származó trícium abszorpcióra.

Jelzett glükóz terhelés bevitt mennyiségének felvételét vizsgáltuk 11 éber 24 órán át éheztetett életképes (500-600 g testtömegű) LA/N patkányon két alkalommal, amely vizsgálatok időpontjai közötti eltérés 14 nap volt. Az egyik vizsgálat során a patkányokat szubkután úton 3 pg szelektív amylin antagonistával, az AC-0187 anyaggal (AC-¹⁰N^32Y8‘³²lazac-calcitonin) kezeltük és az adagolást 3 perccel a nyelés előtt végeztük. A másik alkalommal a patkányokat csak fiziológiás sóoldat hordozóanyaggal előzetesen injektáltuk. A patkányoknak nyeléssel 1 ml 50%-os glükóz oldatban 5 llCí [3³H]glükózt adagoltunk. A vérmintákat érzéstelenített patkányok farkából a lenyelés után 0, 15, 30, 60, 90 és 120 perccel vettük és meghatároztuk, hogy milyen ezek glükózból származó trícium koncentrációja, illetve glükóz koncentrációja.

Az AC-0187 amylin antagonistával végzett előzetes injekció a glükózból származó trícium plamza koncentrációját, illetve feltűnését a lenyelés után 15 perccel 48%-kal (P < 0,02) és a lenyelés után 30 perccel 45%-kal növelte (P < 0,001) (páros t-tesztvizsgálat). Az AC-0187 anyaggal végzett előzetes injektálás a plazma glükóz koncentráció 15 percen belül az étkezés után magasabb növekedését okozta, amely növekedés 0,5 g glükóz érték volt (5,89 ± 0,17 - 8,33 ± 0,28 mmol összehasonlítva az 5,83 ± 0,22 - 6,83 ± 0,28 mmol értékek

62.166/SM ···· ···* kel P < 0,001, páros t-tesztvizsgálat). Ezen túlmenően az AC-0187 által kezelt állatokban a plazma glükóz koncentrációja korábban csökken (6,89 ± 0,28 mmol összehasonlítva 8,17 ± 0,39 mmol értékkel 60 perccel a glükóz lenyelése után, P < 0,001, páros t-tesztvizsgálat).

A fenti eredmények alapján megállapíthatjuk, hogy LA/N életképes patkányokban egy szelektív amylin antagonista a plazmában a jelzett glükóz megjelenését az orális glükóz terhelés után sebességében megnövelte, valamint ennek mennyiségét is növelte, ezen túlmenően növelte a plazmában a koncentráció növekedésének, illetve csökkenésének sebességét a nem jelzett glükóz vonatkozásában is. Ezek az adatok megegyeznek azzal, hogy az amylin antagonista vegyületek az endogén kiválasztású amylinre ellenhatást gyakorolnak, ennek következtében meggyorsítják a gyomor kiürülést.

Claims (26)

1. Eljárás adott betegben a gasztrointesztinális motilitás előnyös szabályozására, azzal jellemezve, hogy a betegnek valamely amylin vagy amylin agonista terápiásán hatásos mennyiségét adagoljuk.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a gasztrointesztinális motilitás előnyös szabályozása során a gyomor motilitást csökkentjük.

3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a gasztrointensztinális motilitás előnyős szabályozása során a gyomor kiürülést késleltetjük.

4. Az 1., 2. vagy 3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a betegen ezt gasztrointesztinális diagnosztikai eljárás során alkalmazzuk.

5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a betegen egy radiológiai gasztrointesztinális diagnosztikai eljárást alkalmazunk.

6. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a betegen mágneses rezonancia leképzés gasztrointesztinális diagnosztikai eljárást alkalmazunk.

7. Az 1., 2. vagy 3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy gasztrointesztinális betegséggel kapcsolatos gyomor motilitást kezelünk.

8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gasztrointesztinális görcsöt kezelünk.

62.166/SM ·· J ···· ···*

- 61 - í · · ·· · »* — · : \.·

9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy akut diverticuliltissel vagy a vese traktussal kapcsolatos betegséget vagy Oddi záróizommal kapcsolatos betegségből eredő görcsöt kezelünk.

10. Eljárás étkezés utáni kiürülés szindróma kezelésére egy ilyen kezelést igénylő betegben, azzal jellemezve, hogy a betegnek valamely amylin agonista vegyület terápiásán hatásos mennyiségét adagoljuk.

11. Eljárás étkezés utáni hyperglycaemia kezelésére, azzal jellemezve, hogy a betegnek valamely amylin agonista terápiásán hatásos mennyiségét adagoljuk.

12. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy amylin agonista vegyületként valamely amylint adagolunk.

13. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy amylinként patkány amylint adagolunk.

14. Eljárás étkezés utáni hyperglycaemia kezelésére, amely a 2 típusú diabetes mellitus következménye, azzal jellemezve, hogy a betegnek valamely amylin agonista terápiásán hatásos mennyiségét adagoljuk.

15. Eljárás ilyen kezelést igénylő betegben a gyomor hypomotilitás kezelésére, azzal jellemezve, hogy a betegnek valamely amylin antagonista terápiásán hatásos mennyiségét adagoljuk.

16. Eljárás ilyen kezelést igénylő betegben a gyomor kiürülés gyorsításá- ra, azzal jellemezve, hogy a betegnek valamely amylin antagonista vegyület terápiásán hatásos mennyiségét adagoljuk.

17. A 15. vagy 16. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy diabetikus neuropátia következtében beállt hypomotilitást kezelünk.

62.166/SM

18. A 15. vagy 16. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy anorexia nervosa következtében beállt hypomotilitást kezelünk.

19. Az 1-3., a 10., a 11. vagy a 14. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy amylin agonista analóg vegyületként ^25,28,29Pro-h-amylint alkalmazunk.

20. A 15-18. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy amylin antagonista vegyületként egy amylin receptor antagonista vegyületet alkalmazunk.

21. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy amylin antagonista vegyületként az acetil-^11J8Arg, ³⁰Asn, ³²Tyr-⁹'³²-calcitonint (lazac) alkalmazzuk.

22. Eljárás toxin fogyasztás kezelésére, azzal jellemezve, hogy: (a) valamely amylin vagy amylin agonista olyan menyiségét adagoljuk, amely alkalmas a gyomortartalom bélbe történő átáramlásának megakadályozására vagy csökkentésére; és (b) a gyomortartalmat kiszívjuk.

23. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan amylin agonista vegyületet alkalmazunk, amely nem CGRP vagy calcitonin.

24. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan amylin agonista vegyületet alkalmazunk, amely nem CGRP vagy calcitonin.

25. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan amylin agonista vegyületet alkalmazunk, amely nem CGRP vagy calcitonin.

26. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan amylin agonista vegyületet alkalmazunk, amely nem CGRP vagy calcitonin.