HU222249B1

HU222249B1 - Eljárás amilin agonista peptidszármazékok és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására

Info

Publication number: HU222249B1
Application number: HU9302061A
Authority: HU
Inventors: Elisabeth Albrecht; Laura S. L. Gaeta; Howard Jones
Original assignee: Amylin Pharmaceuticals Inc.
Priority date: 1991-03-08
Filing date: 1992-11-19
Publication date: 2003-05-28
Also published as: US5998367A; US20040038900A1; US7271238B2; US20020187923A1; US6610824B2; US5686411A; HUT64975A; HU9302061D0

Abstract

A találmány tárgya eljárás új, (I) általános képletű amilinagonistaanalógok 1A1-X-Asn-Thr-5Ala-Thr-Y-Ala-Thr-10Gln-Arg-Leu- Ala-Asn-15Phe-Leu-Val-D1-Ser-20Ser-Asn-Asn-Phe- Gly-25I1-J1-Leu-K1-L1-30Thr-Asn-Val-Gly-Ser-35Asn-Thr-Tyr-Z (I) valamint gyógyászatilagelfogadható sóik előállítására – ahol A1 jelentése Lys, Ala, Ser vagyhidrogénatom; D1 jelentése His vagy Arg; I1 jelentése Ala vagy Pro; J1jelentése Ile vagy Val; K1 jelentése Ser vagy Pro; L1 jelentése Servagy Pro; X és Y jelentése Cys, vagy egyikük Lys és a másik Asp,amelyek kémiai kötéssel kapcsolódnak egymáshoz egy intramolekulárisdiszulfid-, illetve amidkötést alkotva; Z jelentése aminocsoport,kivéve az olyan (I) általános képletű amilinagonista analógokat,melyekben A1 jelentése Lys, D1 jelentése His, I1 jelentése Ala, J1jelentése Ile, K1 jelentése Ser, L1 jelentése Ser, X, Y és Z jelentésea fenti, oly módon, hogy szilárd fázisú peptidszintézis során a védettaminosavakat sorrendben egymáshoz kapcsolják, 2,7-- helyzetűciklizációt végeznek, majd a hordozógyantát és a védőcsoportokatlehasítják, és kívánt esetben a kapott vegyületet gyógyászatilagelfogadható sóvá alakítják. ŕ

Description

A találmány tárgya új, 3. ábra szerinti amilin peptidhormon analógok előállítási eljárása.

A találmány tárgya közelebbről eljárás (I) általános képletű, az alábbi aminosavszekvenciájú amilinagonista analógok előállítására ¹A1-X-Asn-Thr-⁵Ala-Thr-Y-Ala-Thr-¹⁰Gln-Arg-LeuAla-Asn-¹⁵Phe-Leu-Val-D]-Ser-²⁽⁾Ser-Asn-Asn-PheGly-²⁵-I1-J₁-Leu-K₁-L₁-^3O'ITu:-Asn-Val-Gly-Ser-³⁵AsnThr-Tyr-Z (I) (3. ábra) oly módon, hogy szilárd fázisú peptidszintézis során a védett aminosavakat sorrendben egymáshoz kapcsoljuk, 2,7-helyzetű ciklizációt végzünk, majd a védőcsoportokat lehasítjuk.

A találmány szerinti eljárással előállított új vegyületek amilinagonista hatásúak és hipoglikémiás esetekben, valamint egyéb, amilinhatáshoz kapcsolódó betegségeknél, mint a diabetes mellitus, gyógyszerként alkalmazhatók.

A diabetes mellitus komoly anyagcsere-betegség, amelyet a krónikusan megemelkedett vérglükózszint (hiperglikémia) jellemez. Ez a hiperglikémiás állapot az inzulin nevű peptidhormon hatásának abszolút vagy relatív hiánya esetén következik be. Az inzulint a hasnyálmirigy β-sejtjei termelik és választják ki. Az inzulin meggyorsítja a glükózfelhasználást, a proteinszintézist és a neutrális lipidek képződését és tárolását. A glükózt, amely a szénhidrát-energia fő forrása, a szervezet glikogénként tárolja. A glikogén egy polimerizált glükóz, amely az anyagcsere-kívánalmaknak megfelelően visszaalakítható glükózzá. Normál körülmények között a glükózstimuláció függvényében az inzulin alapszinten vagy megemelkedett szinten választódik ki, a glükóz-»glikogén metabolikus homeosztázis fennmaradásának szükséglete szerint.

A diabetes mellitus különféle hiperglikémiás állapotokban nyilvánulhat meg. Ezek az állapotok: az 1-es típusú (inzulinfüggő diabetes mellitus vagy IDDM) és 2es típusú (nem inzulinfüggő diabetes mellitus, vagy NIDDM) diabetes. Az 1-es típusú diabetes esetében a hiperglikémia elégtelen, csökkent vagy hiányzó inzulinszinteket jelent, amelyek nem elegendőek a fiziológiás tartományon belüli vérglükózszintek fenntartásához. Az 1-es típusú diabetes kezelése ismételt inzulindózisok általában parenterális úton való beadását jelenti. A 2-es típusú diabetesben szenvedő egyének esetében a hiperglikémia normál vagy emelkedett inzulinszintekben nyilvánul meg; mégis, ezek a betegek képtelenek a metabolikus homeosztázis fenntartására a perifériás szövetekben és a májban meglévő inzulinrezisztancia, valamint a betegség előrehaladásával az inzulint kiválasztó hasnyálmirigy β-sejtek progresszív károsodása következtében. így a 2-es típusú diabetes terápiája diétán, valamint orálisan beadható hipoglikémiás szerek, így szulfonil-karbamidok szedésén alapul. Az inzulinterápiánál főként a betegség későbbi fázisaiban mégis gyakran szükség van a hiperglikémiai szabályozását elősegítő intézkedésekre a betegség komplikációinak minimálisra csökkentése miatt. így, sok 2-es típusú diabetesben szenvedő betegnek végül a túléléshez szüksége van inzulinra.

Az amiloid az extracelluláris lapos β-protein rostlerakódások neve. Bizonyos vizsgálatok szerint az amiloidlerakódások a 2-es típusú diabetes mellhúsban szenvedő betegek hasnyálmirigyében találhatók. Más vizsgálatok szerint az amiloidlerakódások mértéke emberek esetében a hiperglikémiai mértékével és a 2-es típusú diabetes mellitus betegség komolyságával emelkedik. A hasnyálmirigyben található amiloid kémiai analízise vezetett az amilin peptidhormon meglepő és váratlan felfedezéséhez [Clark, A. és társai, Láncét ii: 231-234 (1987)]. Az amilin 37 aminosavból álló peptid, ahol az aminosavak egyike sem savas maradékú, a 2-es és 7-es helyeken egy diszulfidkötés található a ciszteinmaradékok között, és C-terminálisan amidált. Az amilin az amiloid fő protein-alkotórésze; az amiloid pedig a 2-es típusú diabetes mellhúsban szenvedő betegek hasnyálmirigyeiben az úgynevezett Langerhansszigetekben található egyes kutatások szerint.

Az irodalomban ismertetettek szerint [például Cooper, G. J. S., és társai, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 84/8628-8632 (1987); Cooper G. J. S., és társai, Diabetes 1988. Kiadva Larkins, R., Zimmet, P. & Chisholm, D. (Elsevier, Amsterdam) által, 493-496 (1989)] a szintetikus molekula peptidstruktúrájában az intramolekuláris cisztinhíd és a karboxi-terminális amidcsoport jelenléte eredményezi a legnagyobb biológiai aktivitást a glikogénszintézis gátlása terén a vázizomban. Az amilin aminosavszekvenciája (1. ábra) 46%-ban homológ a humán kalcitoningén-rokon peptid-2-vel (CGRP-2-vel).

Glenner és társai szerint [Biochem. Biophys. Rés. Commun. 755:608-614 (1988)] az amilinmolekula egy meghatározott szegmense, a 20-29 maradékok, tekinthetők potenciális közreműködőnek a 2-es típusú diabetes mellhúsban szenvedő betegek hasnyálmirigyében képződő amiloidrost létrejöttében. Más kutatók szerint [Westermak és társai, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 57:5036-5040 (1990)] bizonyos emlősfajok esetében az amilinek különböznek az aminosavszekvencia tekintetében és további kutatások szükségesek az amiloidképződményekhez kötött maradékok azonosításához. Westermark és társai szintetizálták különböző fajokból származó amilinszekvenciák különböző 20-29 aminosavszegmenseit, majd összehasonlították azok amiloidrostképzési hajlamát. Eredményeik szerint a humán amilin 25-29 maradékok bizonyultak a legerőteljesebb amiloidképzőknek és a 28-as helyen a prolin->szerin szubsztitúció, amint az bizonyos rágcsálófajokban van, erőteljesen gátolta a rostképződést a vizsgált dekapeptidekben.

Az amilin egy komplex peptid, és a bioaktív amilinkészítmények szintézise igen fáradságos művelet. Emellett az amilin korlátozott oldékonyságú, és oldatbeli stabilitása is korlátozott.

A humán amilin tisztítási eljárását Cooper et al., a Proc. Natl. Acad Sci. USA 84:8628-8632 (1987) cikkben írták le. A Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:7763-7766 (1988) közleményekben Cooper és munkatársai további vizsgálataikról számolnak be a humán amilinnal kapcsolatosan.

Kísérleteink alapján azt tapasztaltuk, hogy a patkányamilin nagyobb oldékonyságú és stabilitású, mint

HU 222 249 Bl a humán amilin. Ennek oka lehet bizonyos mértékig a különféle fajokból származó amilinek különböző aggregációs tulajdonsága is. Csak a humán, nem humán főemlős és macskaamilin aggregálódik amiloidszigetecskékké in vivő. Az említett amilinszekvenciák a 2. ábra szerinti fajokból izolált amilinek.

Az 1. típusú diabetes esetén a normál kontrollal összehasonlítva az amilinszintek csökkentek, vagy nincsenek is jelen. Az 1-es típusú diabetes mellitus betegségnél az inzulint és amilint előállító β-sejteket egy autoimmun folyamat szétrombolja. Az amilin jól alkalmazható a diabetes mellitus és hipoglikémia, így az inzulinindukált hipoglikémia kezelésében. Az inzulin és amilin együttes beadása még jobb terápiát biztosít, mint az inzulin önmagában való beadása, és hasonlóképpen, az amilin glukagonnal való együttes beadása a hipoglikémia gyógyítására jobb terápiát biztosít, mint a glukagon egyedül történő beadása. A fenti és egyéb célokra történő beadás esetén célszerű lenne a natív humán amilin hatásával rendelkező, de kevésbé komplikált, viszont jobb oldékonyságú és jobb stabilitású vegyület alkalmazása. Ilyen vegyületeket ismertet a találmány szerinti leírás.

A találmány tárgya eljárás új amilin peptidhormon analógok előállítására, mely vegyületek szimulálják az amilin hatását, és amilinagonista vagy agonista analóg vegyületeknek tekinthetők.

A találmány oltalmi köre kiteljed a találmány szerinti eljárással előállított agonista analógokat tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására is. Ezek a készítmények hipoglikémiás állapotok esetén megelőzés vagy kezelés céljából, továbbá olyan, amilinhatáshoz kötött állapotok kezelésére alkalmazhatók, amelyeknél inzulinra van szükség, mint például a diabetes mellitus esetén. A kezelés során valamely találmány szerinti amilinagonista analógot adunk be egyedül vagy inzulinnal, illetőleg glukagonnal együtt.

A leíráshoz mellékelt rajzok magyarázata:

1. ábra: humán amilin aminosavszekvenciája

2. ábra: különböző emlősökből származó amilinek aminosavszekvenciájának összehasonlítása

3. ábra: az (I) általános képletű, új amilinagonista peptidek aminosavszekvenciája.

A találmányt az alábbiakban ismertetjük részletesen.

A találmány tárgya eljárás (I) általános képletű új amilinagonista analógok és gyógyászatilag elfogadható sóik előállítására, ahol

A! jelentése Lys, Alá, Ser vagy hidrogénatom;

Di jelentése His vagy Arg;

Ii jelentése Alá vagy Pro;

J! jelentése Ile vagy Val;

K-! jelentése Ser vagy Pro;

L_t jelentése Ser vagy Pro;

X és Y jelentése Cys, vagy egyikük Lys és a másik

Asp, amelyek kémiai kötéssel kapcsolódnak egymáshoz egy intramolekuláris diszulfid-, illetve amidkötést alkotva; Z jelentése aminocsoport;

kivéve az olyan (I) általános képletű amilinagonista analógokat, melyekben A! jelentése Lys, Dj jelentése His, i! jelentése Alá, J, jelentése Ile, Kj jelentése Ser, Lj jelentése Ser, valamint X, Y és Z jelentése a fenti, oly módon, hogy szilárd fázisú peptidszintézis során a védett aminosavakat sorrendben egymáshoz kapcsoljuk, majd 2,7-helyzetű ciklizációt végezünk, majd a hordozógyantát és a védőcsoportokat lehasítjuk, és kívánt esetben a kapott vegyületet gyógyászatilag elfogadható sóvá alakítjuk.

A találmány szerinti vegyületek különböző szervetlen és szerves savakkal, valamint bázisokkal sókat képeznek. Megfelelő savak például a sósav, hidrogén-bromid, kénsav, foszforsav, trifluor-ecetsav, ecetsav, hangyasav, metánszulfonsav, toluolszulfonsav, maleinsav, íumársav és kámforszulfonsav. Bázisokkal képzett sók például az ammóniumsók, alkálifémsók, így nátriumés káliumsók, alkáliföldfémsók, így kalcium- és magnéziumsók. Előnyösek az acetát-, hidroklorid- és trifluoracetát-sók.

A sókat ismert módon, a találmány szerinti vegyületek szabad sav vagy bázis formáját egy vagy több ekvivalens megfelelő bázissal vagy savval, valamilyen megfelelő oldószerben való reagáltatásával állíthatjuk elő. Oldószerként vagy közegként olyan oldószer megfelelő, amelyben a képződő só oldhatatlan, vagy olyan oldószerben, például vízben, amelyet azután vákuummal, vagy szolubilizálással vagy ioncseréléssel eltávolítunk.

A találmány szerinti vegyületek különböző sztereoizomer formában léteznek. Az előnyös vegyületek királis centrumai az epitidláncon mind (S)-konfigurációjúak.

A találmány szerinti vegyületeket a peptidkémiában használt jól ismert kapcsolási reakciókkal állíthatjuk elő. A találmány szerinti analógokat úgy állítjuk elő, hogy a növekvő peptidlánchoz egymás után adjuk a kívánt aminosavakat. Általában ez úgy történik, hogy valamilyen α-Ν-karbamoil-védett aminosavat, és egy gyantahordozón lévő növekvő peptidlánchoz kapcsolt aminosavat reagáltatunk szobahőmérsékleten, inért oldószerben, így N-metil-pirrolidonban, dimetil-formamidban vagy metilén-kloridban, valamilyen kapcsolószer, így diciklohexil-karbodiimid-l-hidroxi-benzotriazol, és valamilyen bázis, így diizopropil-etil-amin jelenlétében. A kapott pepiidről az α-Ν-karbamoil-védőcsoportot valamilyen reagenssel, így trifluor-ecetsavval vagy piperidinnel eltávolítjuk, és tovább folytatjuk a kapcsolási reakciót az utolsó kívánt N-védett aminosav felkapcsolásáig. A megfelelő N-védőcsoportok az irodalomban jól ismertek, a találmány szerinti vegyületek esetében előnyös a t-butil-oxi-karbonil-védőcsoport alkalmazása.

Bizonyos előnyös szintetizálási módszereket ismertet a 667,040 bejelentési számú szabadalmi leírás (Amilin és amininanalógok szintetikus előállítása, bejelentve: 1991. 03. 08.). Ezek a módszerek amilin és megnövelt biológiai aktivitású amilinanalógok szintetizálására szolgáló szilárd fázisú peptidszintézisek.

A kapott peptidek gyakorlatilag mindenféle szennyező peptidtől mentesek. Az eljárásban egymást követő ciklusokban szintetizáljuk a peptidet, amikor is minden ciklusban a kiválasztott aminosavat hozzáadjuk az oldhatatlan gyantahordozóhoz kapcsolt növekvő peptid3

HU 222 249 Bl lánchoz. A művelet alatt a hordozóhoz kapcsolt növekvő peptidlánc α-aminocsoportja és a kiválasztott hozzáadott aminosav α-karboxilcsoportja között egy peptidkötés jön létre. A szintézisciklusok a következő lépésekből állnak: (a) a növekvő peptidlánc kezelése a-amino-védőcsoport eltávolítására szolgáló körülmények között egy α-aminocsoport eltávolítása céljából; (b) a kiválasztott α-aminovédett aminosav a-karboxilcsoportjának aktiválása; (c) a növekvő peptidlánc és a kiválasztott aminosav összehozása kapcsolási körülmények között, a peptidlánc szabad α-aminocsoportja és a kiválasztott aminosav aktivált α-karboxilcsoportja között egy peptidkötés létrehozása céljából; és (d) ha a (c) lépés kapcsolási hatásfoka körülbelül 97%-nál kisebb, megismételjük a (b) és (c) lépéseket. Ha a kapcsolás hatásfoka 99%-nál kisebb, előnyös a (b) és (c) lépések megismétlése. Egy előnyös megvalósítási forma szerint minden szintézisciklusban megismételjük a (b) és (c) lépéseket. A kapcsolás hatásosságát minden kapcsolási lépés után célszerű megmérni.

Megfelelő kapcsolási körülményeket biztosít valamely olyan oldószerrendszer alkalmazása, amely a szilárd hordozó maximális megduzzadását eredményezi, és minimálisra csökkenti a szintézisciklusok alatt a peptidlánc másodlagos szerkezeti elemeinek számát, valamint minimálisra csökkenti az intrapeptid és interpeptid hidrogénkötések előfordulását.

A szintézisciklusban a kapcsolási lépés(ek) után előnyösen egy lefedő lépést is végzünk, amikor is a peptidlánc elreagálatlan α-aminocsoportjait dezaktiváljuk. A szintézisciklusokat egymást követően addig ismételjük, a kiválasztott megfelelő védett α-aminosavak hozzáadásával, míg megkapjuk az amilint vagy a kívánt szekvenciájú amilinanalógot. Az egymást követő szintézisciklusok befejezése után az amilint vagy amilinanalógot leszedjük a szilárd hordozóról. Előnyösen úgy járunk el, hogy a peptidlánc ciszteinmaradékairól szelektíve eltávolítjuk a védőcsoportokat, és mielőtt a peptidkötést lehasítjuk a szilárd hordozóról, kialakítunk egy intramolekuláris diszulfidkötést.

Megfelelő α-amino-védőcsoportok a t-butoxi-karbonil- és 9-fluorenil-metoxi-karbonil-csoport. Előnyösen, ha α-amino-védőcsoportként t-butoxi-karbonil-csoportot alkalmazunk, az α-karbonilcsoportokat diciklohexil-karbodiimiddel és 1-hidroxi-benzotriazollal aktiváljuk, 1-hidroxi-benzotriazol-észterek keletkezése közben. Különösen előnyös oldószerrendszerként az N-metil-pirrolidon alkalmazása.

A találmány oltalmi körébe eső amilinagonista analógok egy részének előállítását ismertetik az 1-17. példák.

Más vegyületeket, amelyeket szintén a találmány szerinti eljárásokkal állíthatunk elő, a II. táblázatban ismertetünk.

A találmány oltalmi körébe eső vegyületeket az irodalomban jól ismert rekombináns DNA-technikákkal is előállíthatjuk, például Sambrock és társai [Molecular Cloning: A laboratory Manual, Ed. 2., Cold Spring Harbok (1989)] módszere szerint.

A találmány szerinti vegyületek itt használt nevezéktana olyan, hogy jelzi azt a peptidet, amin a szekvencia alapul, és jelzi az alappeptid-amilinszekvencián végrehajtott módosításokat is. Egy felső indexszámmal megjelölt aminosav azt jelzi, hogy a nevezett aminosav helyettesíti a normálisan jelen lévő aminosavat, mégpedig az alap-aminosavszekvenciának azon a helyén helyettesíti, amit a felső indexszám jelez. Például a „¹⁸Arg²⁵’²⁸Pro-h-amilin” jelölés olyan peptidet jelent, amely a „h-amilin” vagy „humán amilin” szekvencián alapul, és a következő helyettesítések fordulnak elő benne: Arg helyettesíti a His-t a 18-as helyen, Pro helyettesíti az Ala-t a 25-ös helyen és Pro helyettesíti a Ser-t a 28-as helyen. A „des-'Lys-h-amilin” jelölés humán amilinszekvencián alapuló peptidet jelent, ahol az első, azaz N-terminális aminosav le van hasítva.

A találmány szerinti amilinagonista analógok farmakológiai tulajdonságaik alapján alkalmazhatók. A vegyületek főként mint amilinagonista szerek hatásosak, amint azt a 18. és 19. példákban ismertetett receptorkötési és muscle soleus vizsgálatok eredményei bizonyítják. A vegyületek amilinagonista aktivitását azon képességük is bizonyítja, hogy emlősökben hiperlaktémiát és/vagy hiperglikémiát képesek indukálni. Az (I) általános képletű vegyületek körébe tartozó, bizonyos előnyös vegyületeket az I. táblázat tartalmaz. Az előnyös vegyületek - így a des-'Lys-h-amilin, ²⁸Pro-h-amilin, ²⁵>²⁸>²⁹Pro-h-amilin, ¹⁸Arg²⁵-²⁸Proh-amilin és des^lLys¹⁸Arg²⁵>²⁸Pro-h-amilin - mindegyike mutatott in vivő amilinaktivitást, a kezelt állatok mindegyikében hiperlaktémiát majd hiperglikémiát provokálva. Az amilinra jellemző aktivitás mellett bizonyos előnyös vegyületek még jobb oldhatósági és stabilitási tulajdonságokkal rendelkeznek, mint a humán amilin. Ezek az előnyös vegyületek a ²⁵Pro2⁶Val²⁸’²⁹Pro-h-amilm, 25,28,29p_ro.}₁amilin, és ¹⁸Arg²⁵>²⁸Pro-h-amilin.

Különösen előnyös vegyületek a következők: ¹⁸Arg²⁵>²⁸Pro-h-amilin, des-¹Lys¹⁸Arg²⁵>²⁸Pro-h-amilin, ¹⁸Arg²⁵.²⁸>²⁹Pro-h-amilin, des-¹Lys¹⁸Arg²⁵»²⁸>²⁹Pro-hamilin, ²⁵>²⁸>²⁹Pro-h-amilin, des-'Lys²⁵’²⁸’²⁹Pro-h-amilin, és ²⁵Pro²⁶Val²⁸-²⁹Pro-h-amilin.

A találmány szerinti vegyületeket a gyógyszeriparban szokásos hordozóanyagokkal összekeverve parenterális beadásra alkalmas gyógyszerkészítményekké alakíthatjuk. A kísérletek eredményei alátámasztják a vegyületeknek a diabetes mellitus és más inzulint igénylő állapotok kezelésében, valamint hipoglikémiás rohamok megelőzésében, illetőleg kezelésében való alkalmazhatóságát. Ezen állapotok kezelésekor a találmány szerinti vegyületeket inzulinnal is kombinálhatjuk. Az „inzulin” kifejezés egy polipeptidet, vagy ennek a vér glükózszintje szabályozására használt ekvivalensét jelenti. Az inzulinok egy általános ismertetése a következő irodalomban található: Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therepeutics, 8th Ed., Pergamon Press (1990). Az inzulinok lehetnek gyorsan, közepesen vagy hosszasan hatók. Különféle inzulinszáimazékok ismeretesek (például US 5,049,547, 5,028,787 és 5,016,643), amelyek alkalmazhatók a találmány szerinti készítményekben. Az inzulinpeptidek (például 5,008,241), valamint analógjaik (például USP 4,992,417 és 4,992,4818) szintén használhatók. A találmány szerinti vegyületeket tartal4

HU 222 249 Β1 mázó készítmények bármilyen szokásos úton - beleértve az orron át való beadást is - beadhatók [US 4,988,512 és 4,985,242 számú szabadalmi leírások, valamint 2 BioWorld Today, No. 125 (1991)]. A hipoglikémia megelőzésében és kezelésében a találmány szerinti vegyületek, glukagonnal keverve is alkalmazhatók (Young és társai, 5,234,906 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás, „Hyperglycemic Compositions”).

A találmány szerinti készítmények parenterális beadás - így intravénás, intramuszkuláris és szubkután céljára szolgáló, valamint orális, illetőleg orron át történő beadás céljára szolgáló készítmények is lehetnek. Sok esetben az amilinagonista analógot célszerű az inzulinnal vagy glukagonnal együtt egy készítményben beadni. Más esetekben célszerűbb lehet az inzulint vagy glukagont az agonista analógtól elkülönítve beadni. A legmegfelelőbb beadási formát minden beteg esetében az orvos szakember határozza meg. Megfelelő gyógyászatilag alkalmazható hordozóanyagokat és feldolgozásukat ismertetik a következő irodalmak: Remington’s Pharmaceutical Sciences, E. W. Martin; Wang, Y. J. és Hanson, Μ. X. „Parenteral Formulations of Proteins and Peptides: Stability and Stabilizers”, Journal of Parenteral Science and Technology, Technical Report No. 10, Supp. 42:25 (1988). Az inzulinra vagy glukagonra vonatkozó megfelelő készítményformák szintén ismertek az irodalomban.

A találmány szerinti agonista készítményeket semleges pH-η stabilizálhatjuk. Mivel a találmány szerinti készítmények amfoter természetűek, szabad bázisok, savaddíciós sók vagy fémsók formájában egyaránt alkalmazhatók. Ezek a sók természetesen kizárólag gyógyászatilag alkalmazható sók lehetnek, közéjük tartoznak a fémsók, főként az alkálifémek vagy alkáliföldfémek sói, így a kálium- vagy nátriumsók is. A gyógyászatilag alkalmazható savaddíciós sók sok fajtája ismeretes, ezeket szerves és szervetlen savakkal egyaránt előállíthatjuk. Alkalmas savak lehetnek a citromsav, borkősav, tejsav, hidrogén-klorid és hidrogén-bromid stb. A sókat a szakember számára ismert módon, egyszerűen állíthatjuk elő a megfelelő savak alkalmazásával.

A találmány szerinti készítményeket általában parenterális beadás céljára, injekciós vagy infúziós készítmények formájában állíthatjuk eló. Ezeket például valamilyen inért olajban, célszerűen egy növényi olajban, így szezám-, földimogyoró- vagy olívaolajban szuszpendálhatjuk. A vegyületeket szuszpendálhatjuk körülbelül 5,6-7,4 pH-értékre beállított vizes izotóniás pufferoldatban is. Megfelelő pufferek a nátrium-citrát/citromsav, nátrium-foszfát/foszforsav rendszerek. Késleltetett hatóanyag-leadású készítményformák is előállíthatok és alkalmazhatók, amelyeknél a készítmény terápiásán hatásos mennyisége a transzdermális injekció beadása után több órával vagy nappal kerül be a véráramba.

A kívánt izotonicitás nátrium-klorid vagy más gyógyászatilag alkalmazható szer, így dextróz, bórsav, nátrium-tartarát, propilénglikol, poliolok (így mannit és szorbit), vagy más szervetlen vagy szerves oldatok alkalmazásával érhető el. A nátrium-klorid főként nátriumionokat tartalmazó pufferek esetében előnyös.

Kívánt esetben a fenti készítményoldatokat valamilyen sűrítőszerrel, így metil-cellulózzal sűríthetjük. Előállíthatjuk őket emulgeált formában, „víz az olajban” vagy „olaj a vízben” emulzió formájában egyaránt. Sokféle gyógyászatilag alkalmazható emulgeálószer használható, ilyen például az akácmézgapor, valamilyen nemionos felületaktív szer (Tween) vagy ionos felületaktív szer (úgy alkáli-poliéter-alkohol-szulfátok vagy -szulfonátok, például a Triton).

A találmány szerinti terápiás készítmények ismert, általánosan elfogadott módszerekkel, az alkotórészek összekeverésével állíthatók elő. Például a kiválasztott komponenseket egyszerűen összekeverhetjük egy keverőben, és a kapott koncentrált keverékhez hozzáadva a megfelelő mennyiségű vizet és/vagy sűrítószert és/vagy puffért stb., beállíthatjuk a végső koncentrációt, pH-értéket, tonicitást stb.

Az orvosi felhasználás céljára a készítményeket dózisegység formában készíthetjük el, amely dózisegység az agonista vegyület olyan mennyiségét tartalmazza adott esetben inzulin vagy glukagon mellett, amely egy vagy több dózisban beadva hatásos a vércukorszint kívánt értéken tartása szempontjából. A hipoglikémia kezelésében terápiásán hatásos mennyiségnek az agonista amilinanalógok olyan mennyiségét tekintjük, amely a vércukorszintet előnyösen 80 mg/dl fölé emeli. A diabetes mellitus és más inzulint kívánó állapotok kezelésében terápiásán hatásos mennyiségnek ezen agonista analógok olyan mennyiségét tekintjük, amely elegendő az inzulin-túladagolás vagy a nemkívánatos hipoglikémia kivédésére. A terápiás mennyiség sok faktortól, így a páciens életkorától és testsúlyától, a páciens fizikai állapotától, az elérni kívánt vércukorszint értékétől stb. fiigg. Diabetes mellitus esetén a kezelésben használt általános dózisegységek körülbelül 0,1-5 mg amilinagonista vegyületet és kívánt esetben körülbelül 0,5-körülbelül 10 mg inzulint tartalmaznak. A hipoglikémia kezelése esetén az általános dózisegységek körülbelül 0,5-1,0 mg amilinagonista vegyületet tartalmaznak kívánt esetben az irodalomban ajánlott, vagy annál kisebb mennyiségű glukagon mellett.

A találmány szerinti vegyületek szükséges dózisértékeinek meghatározása az orvos szakember feladata.

A találmányt az alábbi példákkal illusztráljuk anélkül, hogy igényünket ezekre a példákra korlátoznánk.

1. példa ²⁸Pro-h-amilin

Standard peptidszintézis-módszerekkel, szilárd fázisú szintézisben állítjuk elő ezt a humán („h”) amilinanalógot, metil-benzhidril-amin-kötést tartalmazó gyanta és N^a-Boc/benzil-oldallánc védelem alkalmazásával. A ²’⁷-[diszulfid]-amilin-MBHA-gyantát Acm-védett ciszteinek tallium(III)-trifluor-acetátos, trifluor-ecetsavban végzett kezelésével állítjuk elő. Miután a ciklizáció végbement, a gyanta-peptid kötést és az oldallánc-védőcsoportokat hasítjuk folyékony hidrogén-fluoriddal („HF”), dimetil-szulfid és anizol jelenlétében. A ²⁸Proh-amilint preparatív HPLC-vel tisztijük. Analitikai HPLC-vel és kapilláriselektroforézissel a peptidet ho5

HU 222 249 Β1 mogénnek találtuk, a szerkezetét pedig aminosavanalízis és szekvenciaanalízis bizonyítja.

FAB tömeg: (M+l)/e=3914.

2. példa ²⁵Pro²⁶Val²⁸’²⁹Pro-h-amilin

A kívánt cím szerinti amilinanalógot metil-benzhidril-amin-kötést tartalmazó gyanta és N^a-Boc/benziloldallánc védelem alkalmazásával, szilárd fázisú szintézissel állítjuk elő, standard peptidszintézis-módszerek szerint. A ².^{4 * * 7}-[diszulfid]-amilin-MBHA-gyantát tallium(III)-trifluor-acetáttal, trifluor-ecetsavban való kezeléssel kapjuk meg. A ciklizáció végbemenetele után a gyanta-peptid kötést és az oldallánc-védőcsoportokat folyékony hidrogén-fluoriddal hasítjuk dimetil-szulfid és anizol jelenlétében. A ²⁵Pro²⁶Val²⁸-²⁹Pro-h-amilint preparatív HPLC-vel, és kapilláriselektroforézissel homogénnek találtuk, szerkezetét aminosavanalízis és szekvenciaanalízis igazolja.

FAB tömeg: (M+l)/e=3936.

3. példa ²-⁷Ciklo-[²Asp,⁷Lys]-h-amilin

A kívánt cím szerinti amilinanalógot metil-benzhidril-amin-kötést tartalmazó gyanta és N^a-Boc/benziloldallánc védelem alkalmazásával, szilárd fázisú szintézissel állítjuk elő, standard peptidszintézis-módszerek szerint. A ²Asp és ⁷Lys csoportot Boc-²Asp(Fmoc)-OH és Boc-⁷Lys(Fmoc)-OH segítségével visszük be. Piperidinnel végrehajtott oldalláncvédőcsoport-eltávolítás után végrehajtjuk az oldallánc-oldallánc (²Asp-⁷Lys) ciklizációt benzotriazol-1 -il-oxi-trisz(dimetil-amino)foszfónium-hexafluor-foszfát (BOP reagens) felhasználásával. A ciklizációt Di Maio, J. és társai [J. Med. Chem. 33:661-667 (1990)], valamint Félix, A. M. és társai [Int. J. Pent. Prot. Rés. 32:441 (1988)] módszere szerint hajtjuk végre. A ciklizáció után kapott 2,7ciklo[²Asp,⁷Lys]-amilin-MBHA-gyantáról a pepiidet folyékony hidrogén-fluoriddal lehasítjuk dimetil-szulfid és anizol segítségével. A kapott cím szerinti amilinszármazékot preparatív HPLC-vel, és kapilláriselektroforézissel homogénnek találtuk, szerkezetét aminosavanalízis és szekvenciaanalízis igazolja.

FAB tömeg: (M+l)/e=3925.

4. példa dez-^lLys-h-amilin

A kívánt cím szerinti amilinanalógot metil-benzhidril-amin-kötést tartalmazó gyanta és N^a-Boc/benziloldallánc védelem alkalmazásával, szilárd fázisú szintézissel állítjuk elő, standard peptidszintézis-módszerek szerint. A ²>⁷-[diszulfid]-amilin-MBHA-gyantát Acmvédett ciszteinek tallium(III)-trifIuor-acetátos kezelésével kapjuk meg, amelyet trifluor-ecetsavban hajtunk végre. A ciklizáció végbemenetele után a gyanta-peptid kötést és az oldallánc-védőcsoportokat folyékony hidrogén-fluoriddal hasítjuk dimetil-szulfid és anizol jelenlétében. A kapott cím szerinti pepiidet preparatív fordított fázisú HPLC-vel tisztítjuk. A pepiidet analitikai PHLC-vel és kapilláriselektroforézissel homogénnek találtuk, szerkezetét aminosavanalízis és szekvenciaanalízis igazolja.

FAB tömeg: (M+H)+=3,775.

5. példa ’Ala-h-amilin

A kívánt cím szerinti amilinanalógot metil-benzhidrilamin-kötést tartalmazó gyanta és N^a-Boc/benzil-oldallánc védelem alkalmazásával, szilárd fázisú szintézissel állítjuk elő, standard peptidszintézis-módszerek szerint. A ²>⁷[diszulfid]-amilin-MBHA-gyantát Acm-védett ciszteinek tallium(III)-trifluor-acetáttal, trifluor-ecetsavban való kezelésével kapjuk meg. A ciklizáció végbemenetele után a gyanta-peptid kötést és az oldallánc-védőcsoportokat folyékony hidrogén-fluoriddal hasítjuk dimetil-szulfid és anizol jelenlétében. A cím szerinti vegyületet preparatív HPLC-vel tisztítjuk. A pepiidet analitikai HPLC-vel, és kapilláriselektroforézissel homogénnek találtuk, szerkezetét aminosavanalízis és szekvenciaanalízis igazolja.

FAB tömeg: (M+H)+=3,847.

6. példa 'Ser-h-amilin

A kívánt cím szerinti amilinanalógot metil-benzhidril-amin-kötést tartalmazó gyanta és N^Boc/benzil-oldallánc védelem alkalmazásával, szilárd fázisú szintézissel állítjuk elő, standard peptidszintézis-módszerek szerint. A ²>⁷-[diszulfid]-amilin-MBHA-gyantát Acmvédett ciszteinek tallium(III)-trifluor-acetáttal, trifluorecetsavban való kezelésével kapjuk meg. A ciklizáció végbemenetele után a gyanta-peptid kötést és az oldallánc-védőcsoportokat folyékony hidrogén-fluoriddal hasítjuk dimetil-szulfid és anizol jelenlétében. A kapott pepiidet preparatív HPLC-vel tisztítjuk. A peptidet analitikai HPLC-vel, és kapilláriselektroforézissel homogénnek találtuk, szerkezetét aminosavanalízis és szekvenciaanalízis igazolja.

FAB tömeg: (M+H)+=3,863.

7. példa ²⁹Pro-h-amilin

A kívánt humán amilinanalógot metil-benzhidrilamin-kötést tartalmazó gyanta és Na-Boc/benzil-oldallánc védelem alkalmazásával, szilárd fázisú szintézissel állítjuk elő, standard peptidszintézis-módszerek szerint. A V[diszulfid]-amilin-MBHA-gyantát Acm-védett ciszteinek tallium(III)-trifluor-acetáttal, trifluor-ecetsavban való kezelésével kapjuk meg. A ciklizáció végbemenetele után a gyanta-peptid kötést és az oldallánc-védőcsoportokat folyékony hidrogén-fluoriddal hasítjuk dimetil-szulfid és anizol jelenlétében. A kapott cím szerinti peptidet preparatív HPLC-vel tisztítjuk. A peptidet analitikai HPLC-vel, és kapilláriselektroforézissel homogénnek találtuk, szerkezetét aminosavanalízis és szekvenciaanalízis igazolja. FAB tömeg: (M+H)+=3,916.

8. példa ²5,28p_ro-h-amilin

A kívánt cím szerinti amilinanalógot metil-benzhidril-amin-kötést tartalmazó gyanta és N^a-Boc/benzil6

HU 222 249 Bl oldallánc védelem alkalmazásával, szilárd fázisú szintézissel állítjuk elő, standard peptidszintézis-módszerek szerint. A ²’⁷-[diszulfid]-amilin-MBHA-gyantát Acmvédett ciszteinek tallium(III)-trifluor-acetáttal, trifluorecetsavban való kezelésével kapjuk meg. A ciklizáció végbemenetele után a gyanta-peptid kötést és az oldallánc-védőcsoportokat folyékony hidrogén-fluoriddal hasítjuk dimetil-szulfid és anizol jelenlétében. A kapott cím szerinti vegyületet preparatív fordított fázisú HPLC-vel tisztítjuk. A peptidet analitikai HPLC-vel, és kapilláriselektroforézissel homogénnek találtuk, szerkezetét aminosavanalízis és szekvenciaanalízis igazolja. FAB tömeg: (M+H)⁺=3,939.

9. példa dez-¹Lys²⁵-²⁸Pro-h-amilin

A kívánt cím szerinti amilinanalógot metil-benzhidril-amin-kötést tartalmazó gyanta és N^a-Boc/benzil-oldallánc védelem alkalmazásával, szilárd fázisú szintézissel állítjuk elő, standard peptidszintézis-módszerek szerint. A ²-⁷-[diszulfid]-amilin-MBHA-gyantát Acmvédett ciszteinek tallium(III)-trifluor-acetáttal, trifluorecetsavban való kezelésével kapjuk meg. A ciklizáció végbemenetele után a gyanta-peptid kötést és az oldallánc-védőcsoportokat folyékony hidrogén-fluoriddal hasítjuk dimetil-szulfid és anizol jelenlétében. A kapott cím szerinti peptidet preparatív fordított fázisú HPLCvel tisztítjuk. A peptidet analitikai HPLC-vel, és kapilláriselektroforézissel homogénnek találtuk, szerkezetét aminosavanalízis és szekvenciaanalízis igazolja.

FAB tömeg: (M+H)⁺=3,811.

10. példa ¹⁸ Arg²⁵.²⁸Pro-h-amilin

A kívánt cím szerinti amilinanalógot metil-benzhidril-amin-kötést tartalmazó gyanta és N^Boc/benzil-oldallánc védelem alkalmazásával, szilárd fázisú szintézissel állítjuk elő, standard peptidszintézis-módszerek szerint. A ²’⁷-[diszulfid]-amilin-MBHA-gyantát tallium(Ifl)-trifluor-acetáttal, trifluor-ecetsavban való kezeléssel kapjuk meg. A ciklizáció végbemenetele után a gyantapeptid kötést és az oldallánc-védőcsoportokat folyékony hidrogén-fluoriddal hasítjuk dimetil-szulfid és anizol jelenlétében. A ²⁵Pro²⁶Val²⁸>²⁹Pro-h-amilint preparatív HPLC-vel, tisztítjuk. A peptidet analitikai HPLC-vel, és kapilláriselektroforézissel homogénnek találtuk, szerkezetét aminosavanalízis és szekvenciaanalízis igazolja. FAB tömeg: (M+l)/e=3936.

11. példa dez-¹Lys¹⁸Arg²⁵>²⁸Pro-h-amilin

A kívánt cím szerinti amilinanalógot metil-benzhidril-amin-kötést tartalmazó gyanta és N^a-Boc/benziloldallánc védelem alkalmazásával, szilárd fázisú szintézissel állítjuk elő, standard peptidszintézis-módszerek szerint. A ²>⁷-[diszulfid]-amilin-MBHA-gyantát Acmvédett ciszteinek tallium(III)-trifluor-acetáttal, trifluorecetsavban való kezelésével kapjuk meg. A ciklizáció végbemenetele után a gyanta-peptid kötést és az oldallánc-védőcsoportokat folyékony hidrogén-fluoriddal hasítjuk dimetil-szulfid és anizol jelenlétében. A cím szerinti peptidet preparatív fordított fázisú HPLC-vel tisztítjuk. A peptidet analitikai HPLC-vel, és kapilláriselektroforézissel homogénnek találtuk, szerkezetét aminosavanalízis és szekvenciaanalízis igazolja.

FAB tömeg: (M+H)⁺=3,832.

12. példa ¹⁸ Arg²⁵>²⁸>²⁹Pro-h-amilin

A kívánt cím szerinti amilinanalógot metil-benzhidril-amin-kötést tartalmazó gyanta és N^a-Boc/benzil-oldallánc védelem alkalmazásával, szilárd fázisú szintézissel állítjuk elő, standard peptidszintézis-módszerek szerint. A ²>⁷-[diszulfid]-amilin-MBHA-gyantát Acmvédett ciszteinek tallium(III)-trifluor-acetáttal, trifluorecetsavban való kezelésével kapjuk meg. A ciklizáció végbemenetele után a gyanta-peptid kötést és az oldallánc-védőcsoportokat folyékony hidrogén-fluoriddal hasítjuk dimetil-szulfid és anizol jelenlétében. A cím szerinti peptidet preparatív fordított fázisú HPLC-vel tisztítjuk. A peptidet analitikai HPLC-vel, és kapilláriselektroforézissel homogénnek találtuk, szerkezetét aminosavanalízis és szekvenciaanalizis igazolja.

FAB tömeg: (M+H)+=3,971.

13. példa dez-¹Lys¹⁸Arg²⁵>²⁸>²⁹Pro-h-amilin

A kívánt cím szerinti amilinanalógot metil-benzhidril-amin-kötést tartalmazó gyanta és N^Boc/benzil-oldallánc védelem alkalmazásával, szilárd fázisú szintézissel állítjuk elő, standard peptidszintézis-módszerek szerint. A ²>⁷-[diszulfid]-amilin-MBHA-gyantát Acmvédett ciszteinek tallium(III)-trifluor-acetáttal, trifluorecetsavban való kezelésével kapjuk meg. A ciklizáció végbemenetele után a gyanta-peptid kötést és az oldallánc-védőcsoportokat folyékony hidrogén-fluoriddal hasítjuk dimetil-szulfid és anizol jelenlétében. A cím szerinti peptidet preparatív fordított fázisú HPLC-vel tisztítjuk. A peptidet analitikai HPLC-vel, és kapilláriselektroforézissel homogénnek találtuk, szerkezetét aminosavanalízis és szekvenciaanalízis igazolja.

FAB tömeg: (M+H)+=3,843.

14. példa ²⁵-²⁸-²⁹Pro-h-amilin

A kívánt cím szerinti amilinanalógot metil-benzhidril-amin-kötést tartalmazó gyanta és N^a-Boc/benzil-oldallánc védelem alkalmazásával, szilárd fázisú szintézissel állítjuk elő, standard peptidszintézis-módszerek szerint. A ²>⁷-[diszulfid]-amilin-MBHA-gyantát Acmvédett ciszteinek tallium(in)-trifluor-acetáttal, trifluorecetsavban való kezelésével kapjuk meg. A ciklizáció végbemenetele után a gyanta-peptid kötést és az oldallánc-védőcsoportokat folyékony hidrogén-fluoriddal hasítjuk dimetil-szulfid és anizol jelenlétében. A cím szerinti peptidet preparatív fordított fázisú HPLC-vel tisztítjuk. A peptidet analitikai HPLC-vel, és kapilláriselektroforézissel homogénnek találtuk, szerkezetét aminosavanalízis és szekvenciaanalízis igazolja.

FAB tömeg: (M+H)+=3,949.

HU 222 249 Bl

75. példa dez-¹ Lys^{18 * * * * * * 25 * *}-²⁸'²⁹Pro-h-amilin

A kívánt cím szerinti amilinanalógot metil-benzhidril-amin-kötést tartalmazó gyanta és N^a-Boc/benzil-oldallánc védelem alkalmazásával, szilárd fázisú szintézissel állítjuk elő, standard peptidszintézis-módszerek szerint. A ²>⁷-[diszulfid]-amilin-MBHA-gyantát Acmvédett ciszteinek tallium(III)-trifluor-acetáttal, trifluorecetsavban való kezelésével kapjuk meg. A ciklizáció végbemenetele után a gyanta-peptid kötést és az oldallánc-védőcsoportokat folyékony hidrogén-fluoriddal hasítjuk dimetil-szulfid és anizol jelenlétében. A cím szerinti peptidet preparatív fordított fázisú HPLC-vel tisztítjuk. A peptidet analitikai HPLC-vel, és kapilláriselektroforézissel homogénnek találtuk, szerkezetét aminosavanalízis és szekvenciaanalízis igazolja.

FAB tömeg: (M+H)⁺=3,823.

16. példa dez-¹Lys²⁵Pro²⁶Val²⁸>²⁹Pro-h-amilin

A kívánt cím szerinti amilinanalógot metil-benzhidril-amin-kötést tartalmazó gyanta és N^a-Boc/benziloldallánc védelem alkalmazásával, szilárd fázisú szintézissel állítjuk elő, standard peptidszintézis-módszerek szerint. A ²>⁷-[diszulfíd]-amilin-MBHA-gyantát tallium(III)-trifluor-acetáttal, trifluor-ecetsavban való kezelésével kapjuk meg. A ciklizáció végbemenetele után a gyanta-peptid kötést és az oldallánc-védőcsoportokat folyékony hidrogén-fluoriddal hasítjuk dimetil-szulfid és anizol jelenlétében. A cím szerinti peptidet preparatív HPLC-vel tisztítjuk.

17. példa [(D)-¹¹ Arg]-h-amilin

A kívánt cím szerinti amilinanalógot metil-benzhidril-amin-kötést tartalmazó gyanta és N^a-Boc/benzil-oldallánc védelem alkalmazásával, szilárd fázisú szintézissel állítjuk elő, standard peptidszintézis-módszerek szerint. A (£>)-^uArg csoportot Boc-/D)-¹¹Arg(Mtr)-OH segítségével visszük be. A ²>⁷-[diszulfíd]-amilinMBHA-gyantát tallium(III)-trifluor-acetáttal, trifluorecetsavban való kezelésével kapjuk meg. A ciklizáció végbemenetele után a gyanta-peptid kötést és az oldallánc-védőcsoportokat folyékony hidrogén-fluoriddal hasítjuk dimetil-szulfid és anizol jelenlétében. A kapott cím szerinti peptidet - amely nem tartozik az oltalmi körbe - preparatív HPLC-vel tisztítjuk.

18. példa

Receptorkötési vizsgálat

A találmány szerinti vegyületek amilinreceptorokhoz való kötését a következők szerint vizsgáltuk. A vizsgálatban ¹²⁶I-patkányamilint használtunk (Bolton-Hunter-jelölés az N-terminális lizinen), amelyet az Amersham Corporationtól (Arlingon Heights, II) szereztünk be. Specifikus aktivitástartomány: 1950-2000 Ci/mmol. A jelöletlen peptideket a BACHEM Inc.-től (Torrance, CA) és a

Peninsula Laboratories-től (Belmont, CA) szereztük be.

Hím Sprague-Dawley-patkányokat (200-250 gr) dekapitálással leöltünk. Az agyakat eltávolítottuk és hideg foszfátpufferes sóoldatba (PB5) helyeztük. A ventrális felületből kiindulva rostrális vágásokat ejtettünk a hypothalamusnak laterálisán a szaglószervi területekkel összekötött részébe: a vágások 45°-os szögben nyúltak ki mediálisan ezekből a területekből. Ezt, a nucleus accumbenst és a körülötte lévő területeket tartalmazó basalis előagyi szövetet megmértük és jéghideg 20 mmol-os HEPES-pufferben (20 mmol HEPESsav, a pH nátrium-hidroxiddal 7,3 értékre állítva 23 °Con) homogenizáltuk. A membránokat háromszor mostuk friss pufferben 15 percig, 48 000 g-vel történő centrifugálással. A mosott membránpelletet felszuszpendáltuk 20 mmol-os HEPES-pufferben, amely 0,2 mmol fenil-metil-szulfonil-fluoridot (PMSF) tartalmazott.

A ¹²⁵I-amilin-kötés méréséhez 4 mg eredeti nedves szövetsúlyú membránokat inkubáltunk ¹²⁵I-amilinnel 12-16 pM-nél, 20 mmol-os HEPES-pufferben, amely 0,5 mg/ml bacitracint, 0,5 mg/ml borjúszérum-albumint és 0,2 mmol PMSF-et tartalmazott. Az oldatokat 60 percig 23 °C-on inkubáltuk. Az inkubálást GF/B üvegszálas szűrőkön (Whatman Inc., Clifton, NJ) való átszűréssel fejeztük be; a szűrőket előzőleg 4 órán keresztül 0,3%-os polietilén-imin-oldatban előáztattuk, a radiojelzett peptidek nemspecifikus kötődésének lecsökkentése céljából. A szűrőket közvetlenül a szűrés előtt 5 ml hideg PBS-sel, közvetlenül a szűrés után pedig 15 ml hideg PBS-sel mostuk. A szűrés után a szűrőket eltávolítottuk, és a radioaktivitást egy gammaszámlálóban mértük, 77%-os számlálási hatékonysággal. Összehasonlító görbéket vettünk fel olyan módon, hogy mértük a kötést 10^_12-10~⁶ M jelöletlen vizsgálandó vegyület jelenlétében és az eredményeket nemlineáris regresszióval értékeltük, egy 4 paraméteres logisztikus egyenlet (Inplot program. GraphPAD software, San Diego) segítségével.

A vizsgálatban a tisztított humán amilin körülbelül 50 pM IC₅₀-értéknél kötődött a receptorához. Az eredmények az I. táblázatban láthatók, és bizonyítják, hogy minden vizsgált vegyület szignifikáns receptorkötési aktivitással rendelkezik.

19. példa

Talpemelőizom- (Muscle soleus) vizsgálat

A találmány szerinti vegyületek amilinagonista hatásának értékelésére a következők szerint végrehajtott m. soleus vizsgálatot használtuk. Körülbelül 200 g-os hím Harlan Sprague-Dawley-patkányokat használtunk, ezekből hasítottuk ki a 40 mg-nál kisebb m. soleus-darabokat. Az állatokat a dekapitálással történő leölés előtt 4 órán keresztül éheztettük. A mellső végtagról lehúztuk a bőrt és parafatáblához tűztük. Megfelelő ollók és sebészeti fogók segítségével kimetszettük a 15-20 mm hosszú, 0,5 mm vastag lapos muscle soleust. A m. soleust ezután egy penge segítségével egyenlő részekre szabdaltuk, így minden állatból 4 izomcsíkot nyertünk. Miután kimetszettük az izmot az állatból, rövid ideig fiziológiás sóoldatban tartottuk.

Az izmokat 50 ml-es Erlenmeyer-lombikokba tettük, amelyek 10 ml Krebs-Ringer hidrogén-karbonát-puffert tartalmaztak, amely puffer literenként a következőket tar8

HU 222 249 Bl talmazta: 118,5 mmol (6,93 g) NaCl, 5,94 mmol (443 mg) K.C1, 2,54 mmol (282 mg) CaCl₂, 1,19 mmol (143 mg) MgSO₄, 1,19 mmol (162 mg) KH₂PO₄, mmol (2,1 g) (NaHCO₃, 5,5 mmol (1 g) glükóz és rekombináns humán inzulin (HUmulin-R, Eli Lilly, IN), 5 valamint a vizsgálandó vegyületet.

A pH 37 °C-on 7,1 és 7,4 között volt. Az izomdarabokat úgy osztottuk szét a különböző lombikokba, hogy az egy állatból származó 4 izomdarab egyenletesen osztódjék szét a különböző vizsgálati körülmények között. Az inkubáló közeget egyenletesen karbogénnel (95% O₂, 5% CO₂) áramoltattuk át a felületen, miközben folyamatosan kevertük 37 °C-on egy oszcilláló vízfürdőben. Félórás „előinkubálási” periódus után minden lombikba 0,5 pCi U-¹⁴C-glükózt adtunk és a lombikokat még további 60 percig inkubáltuk. Ezután minden izomdarabot gyorsan eltávolítottunk, leitattuk a nedvességet, és az izomdarabokat folyékony N₂-ban lefagyasztottuk, megmértük, és az ezután következő ¹⁴Cglikogén-meghatározásig tároltuk.

A ¹⁴C-glikogén-meghatározást 7 ml-es szcintillációs fiolában hajtottuk végre. Minden fagyott izomdarabot elhelyeztünk egy fiolában, és 1 ml 60%-os káliumhidroxidban emésztettük 70 °C-on, 45 percig, folyamatos keverés mellett. A feloldott glikogént 3 ml absz. eta- 25 nol hozzáadásával, egy éjszakán át -20 °C-on való hűtéssel csaptuk ki. A felülúszót óvatosan lecsapoltuk, a glikogént újra mostuk etanollal, lecsapoltuk, és a csapadékot vákuumban szárítottuk. Minden etanolt elpárologtattunk, hogy elkerüljük a szcintillációs számolás alatti zavarást. A visszamaradó glikogént újra feloldottuk 1 ml vízben és 4 ml szcintillációs folyadékkal, majd számoltuk a ¹⁴C-t.

A glükóz glikogénbe való beépülésének mértékét pmol/g/órában kifejezve az inkubációs közeg 5,5 mM glükózában lévő ¹⁴C-glükóz specifikus aktivitásából és az izomból kiextrahált glikogénben maradt összes ¹⁴C 10 számából kaptuk meg. Dózis-válasz görbéket vettünk fel egy 4 paraméteres logisztikus modellhez, az ED₅₀értékek meghatározásához.

Dózis-válasz görbéket vettünk fel minden izomdarab esetében, ezeket beletettük a vizsgálóközegekbe, 15 amelyek 7,1 nM (1000 pU/ml) inzulint és a vizsgálandó vegyületeket 0, 1, 3, 10, 30, 100, 300 és 100 nM vég- (nominális) koncentrációban tartalmazták. Minden mérőfolyadék belső pozitív kontrollokat is tartalmazott, amely liofilizált és -70 °C-on tárolt archivált 20 patkányamilin egy adagja.

A humán amilin ismert hiperglikémiás peptid, és a muscle soleus mérés EC₅₀-értékei körülbelül 1-10 uM közötti tartományban vannak. Bizonyos kereskedelmi készítmények a bennük lévő szennyeződések miatt, amelyek alacsonyabb mért aktivitást eredményeznek, magasabb EC₅₀-értékeket adnak. A vizsgált vegyületek eredményei az I. táblázatban láthatók, bizonyítva, hogy a vegyületek rendelkeznek amilinaktivitással.

I. táblázat

	Receptorkötési vizsgálat IC₅₀ (pM)	Muscle soleus vizsgálat EC₅₀ (nM)
1. ²⁸Pro-h-amilin	15,0	2,64
2.²⁵Pro²⁶Val²⁸’²⁹Pro-h-amilin	18,0	4,68
3.²-⁷Ciklo-[²Asp,⁷Lys]-h-amilin	310,0	6,62
4.²~³⁷h-amilin	236,0	1,63
5. ’Ala-h-amilin	148,0	12,78
6. ’Ser-h-amilin	33,0	8,70
7.²⁹Pro-h-amilin	64,0	3,75
8. ²⁵-²⁸Pro-h-amilin	26,0	13,20
9. dez-¹Lys²⁵>²⁸Pro-h-amilin	85,0	7,70
10.¹⁸Arg²⁵’²⁸Pro-h-amilin	32,0	2,83
11. dez-¹Lys¹⁸Arg²⁵'²⁸Pro-h-amilin	82,0	3,77
12.¹⁸Arg²⁵’²⁸’²⁹Pro-h-amilin	21,0	1,25
13. dez-¹Lys^l8Arg²⁵'²⁸’²⁹Pro-h-amilin	21,0	1,86
14. 25J8í9p_ro._h._amj_lin	10,0	3,71
15. dez-¹Lys²⁵-²⁸'²⁹Pro-h-amilin	14,0	4,15

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás (I) általános képletű amilinagonista analógok 'Aj-X-Asn-Thr-SAla-Thr-Y-Ala-Thr-'OGln-Arg-LeuAla-Asn-¹⁵Phe-Leu-Val-DrSer-²⁰Ser-Asn-Asn-PheGly-²⁵Ij-J1-Leu-K₁-L₁-³⁰Thr-Asn-Val-Gly-Ser-³⁵AsnThr-Tyr-Z (I) valamint gyógyászatilag elfogadható sóik előállítására, ahol

Aj jelentése Lys, Alá, Ser vagy hidrogénatom;

Dj jelentése His vagy Arg;

Ij jelentése Alá vagy Pro;

Jj jelentése Ile vagy Val;

Kj jelentése Ser vagy Pro;

Lj jelentése Ser vagy Pro;

X és Y jelentése Cys, vagy egyikük Lys és a másik Asp, amelyek kémiai kötéssel kapcsolódnak egymáshoz egy intramolekuláris diszulfid-, illetve amidkötést alkotva;

Z jelentése aminocsoport;

kivéve az olyan (I) általános képletű amilinagonista analógokat, melyekben Aj jelentése Lys, Dj jelentése His, Ij jelentése Alá, Jj jelentése Ile, Kj jelentése Ser, L_t jelentése Ser, X, Y és Z jelentése a fenti, azzal jellemezve, hogy szilárd fázisú peptidszintézis során a védett aminosavakat sorrendben egymáshoz kapcsoljuk, 2,7-helyzetű ciklizációt végzünk, majd a hordozógyantát és a védőcsoportokat lehasítjuk, és kívánt esetben a kapott vegyületet gyógyászatilag elfogadható sóvá alakítjuk.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás olyan amilinagonista analógok előállítására, ahol X és Y jelentése diszulfidkötéssel kapcsolódó Cys-maradék, a többi szubsztituens jelentése az 1. igénypontban megadott, azzaljellemezve, hogy a megfelelően helyettesített kiindulási vegyületeket alkalmazzuk.
3. A 2. igénypont szerinti eljárás amilinagonista analógok előállítására, ahol I_b K_t és Lj közül kettő jelentése Pro, a többi szubsztituens jelentése a 2. igénypontban megadott, azzal jellemezve, hogy a megfelelően helyettesített kiindulási vegyületeket alkalmazzuk.
4. A 2. igénypont szerinti eljárás amilinagonista analógok előállítására, ahol I_b Kj és Lj jelentése Pro, a többi szubsztituens jelentése a 2. igénypontban megadott, azzal jellemezve, hogy a megfelelően helyettesített kiindulási vegyületeket alkalmazzuk.
5. A 2. vagy 3. igénypont szerinti eljárás amilinagonista analógok előállítására, ahol Dj jelentése Arg, a többi szubsztituens jelentése a 2. vagy 3. igénypontban megadott, azzal jellemezve, hogy a megfelelően helyettesített kiindulási vegyületeket alkalmazzuk.
6. A 2. vagy 3. igénypont szerinti eljárás amilinagonista analógok előállítására, ahol Jj jelentése Val, a többi szubsztituens jelentése a 2. vagy 3. igénypontban megadott, azzal jellemezve, hogy a megfelelően helyettesített kiindulási vegyületeket alkalmazzuk.
7. A 2. vagy 3. igénypont szerinti eljárás amilinagonista analógok előállítására, ahol A! jelentése Lys, a többi szubsztituens jelentése a 2. vagy 3. igénypontban megadott, azzal jellemezve, hogy a megfelelően helyettesített kiindulási vegyületeket alkalmazzuk.
8. A 2. vagy 3. igénypont szerinti eljárás amilinagonista analógok előállítására, ahol A! jelentése hidrogénatom, a többi szubsztituens jelentése a 2. vagy 3. igénypontban megadott, azzal jellemezve, hogy a megfelelően helyettesített kiindulási vegyületeket alkalmazzuk.
9. Az 1. igénypont szerinti eljárás ²⁵>²⁸>²⁹Pro-h-amilin előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelően helyettesített kiindulási vegyületeket alkalmazzuk.
10. Az 1. igénypont szerinti eljárás az (I) általános képletű vegyületek szűkebb körét képező 'Aj-X-Asn-Thr-⁵Ala-Thr-Y-Ala-Thr-¹⁽⁾Gln-Arg-LeuAla-Asn-¹⁵Phe-Leu-Val-Dj-Ser-²⁰Ser-Asn-Asn-PheGly-²⁵Pro-J₁-Leu-Pro-Pro-³⁰Thr-Asn-Val-GlySer-³⁵Asn-Thr-Tyr-Z (II) (II) általános képletű amilinagonista analógok és gyógyászatilag elfogadható sóik előállítására, ahol A, jelentése Lys, Alá, Ser vagy hidrogénatom;

Dj jelentése His vagy Arg;

Jj jelentése Ile vagy Val;

X és Y jelentése Cys, vagy az egyik Lys és a másik

Asp, amelyek kémiai kötéssel kapcsolódnak egymáshoz egy intramolekuláris diszulfid-, illetve amidkötést alkotva;

Z jelentése aminocsoport;

kivéve az olyan (II) általános képletű amilinagonista analógokat, melyekben Aj jelentése Lys, Dj jelentése His, Jj jelentése Ile, X, Y és Z jelentése a fenti, azzal jellemezve, hogy szilárd fázisú peptidszintézis során a védett aminosavakat sorrendben egymáshoz kapcsoljuk, 2,7-helyzetű ciklizációt végezünk, majd a hordozógyantát és a védőcsoportokat lehasítjuk, és kívánt esetben a kapott vegyületet gyógyászatilag elfogadható sóvá alakítjuk.
11. Az 1. igénypont szerinti eljárás des-¹Lys²⁵«²⁸>²⁹Pro-h-amilin, ¹⁸Arg²⁵>²⁸Pro-h-amilin, des-¹Lys¹⁸Arg²⁵>²⁸Pro-h-amilin, ¹⁸Arg²⁵>²⁸>²⁹Pro-h-amilin, des-¹Lys¹⁸Arg²⁵-²⁸-²⁹Pro-h-amilin vagy ²⁵Pro²⁶ V al²⁸-²⁹Pro-h-amilin előállítására, azzal jellemezve, hogy szilárd fázisú peptidszintézis során a megfelelően védett aminosavakat sorrendben egymáshoz kapcsoljuk, 2,7-helyzetű ciklizációt végzünk, majd a hordozógyantát és a védőcsoportokat lehasítjuk.
12. Eljárás gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti eljárással előállított (I) általános képletű amilinagonista analógot - melynél az Aj-Lj, X, Y és Z jelentése az 1. igénypontban megadott - a gyógyászatilag elfogadható hordozóanyaggal és adott esetben egyéb adalék anyagokkal összekeverve gyógyszerkészítménnyé alakítjuk.