KR20010101079A - Ｉｇｆ-ⅰ 및 -ⅱ를 억제하는 ｇｈ-ｒｈ의 길항 유사체 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 hGH-RH(1-29)NH2의 신규한 일련의 합성 유사체를 제공한다. 이러한 유사체는 내생적인 hGH-RH이 활성을 억제하고, 그에 따라 성장 호르몬의 방출을막는다. 종래 설명된 것에 대한 신규 유사체이 더 강한 억제 효능은 다양한 아미노산의 대체에 기인한다.
Description
성장호르몬("GH")은 매우 많은 다른 성장인자, 예를 들어, 인슐린같은 성장인자 I(IGF-I)를 촉진하고, 수많은 조직(골격, 결합조직, 근육 및 내장) 및 생리학적 활성(핵산 및 단백질 합성 및 지방분해를 높이는 반면, 요소 분비를 낮춤)을 증진시키는 191 아미노산을 갖는 펩티드이다.
GH의 배출은 시상하부에 의해서 분비된 배출 및 억제 인자의 조절하에서 이루어진다. 제 1 배출 인자는 성장 호르몬 배출 호르몬("GH-RH")이고; 인간 성장 호르몬-배출 호르몬("hGH-RH")은 44 아미노산을 갖는 펩티드이다. 본 발명의 신규한 펩티드는 단지 잔기 1 내지 29("hGH-RH(1-29)NH2")를 갖는 hGH-RH의 유사체, 하기 아미노산 서열:
Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile5-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr10-Arg-Lys-Val-Leu-Gly15-Gln-
Leu-Ser-Ala-Arg20-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp25-Ile-Met-Ser-Arg29-NH2
을 갖는 펩티드의 유사체와 관련된다.
GH는 여러가지의 질병에 연루되어 왔다. GH가 연루된 하나의 질병은 선단비대증으로, 이는 GH의 과도한 수준이 존재하는 것이다. 이러한 질병의 비정상적인 확장된 얼굴 및 사지 뼈는 GH-RH 길항제를 투여함으로써 치료될 수 있다.
또한, GH와 관련된 질병은 당뇨병에 기인하는 망막장애 및 당뇨병에 기인하는 신장장애이다. 이러한 질병에서 망막 및 신장 각각의 손상은 GH에 기인하는 것으로 생각되며, 실명 또는 신장 기능의 저하를 낳는다. 이러한 손상은 효과적인 GH-RH 길항제의 투여에 의해서 억제되거나 완화시킬 수 있다.
그러나, GH-RH 길항제의 주요한 적용은 암분야(에이. 브이. 샬리 등, 임상 시행에서의 성장 호르몬 세크리태고구스, 버쿠, 비.비 & 월커, 알.에프., 텍커, 뉴욕, pp.145-162, 1998)에서 이루어졌다. IGF-I 및 -Ⅱ는 다양한 암에 대한 강력한 미토겐이다. GH 분비를 억제함으로써, GH-RH 길항제는 간 및 다른 조직에서 IGF-I이 합성되는 것을 줄인다. GH-RH 길항제는 또한 다양한 종양에 의한 IGF-I 및/또는 IGF-Ⅱ의 오토크린 및 파라크린 생성을 줄인다. 여러가지 실험적 암에서, GH-RH의 길항제에 의한 치료는 IGF-I 및 -Ⅱ의 감소와 동시에, 종양 성장의 억제를 낳는다.
이러한 질병 및 다른 상태를 조정하기 위해서, 몇몇 조사원들은 GH 배출 억제제의 하나로, 소마토스타틴을 사용해서 GH 수준을 조절하려고 시도하였다. 그러나, 소마토스타틴은 단독으로 투여될 경우, GH 또는 IGF-I 수준을 원하는 정도로 억제하지 못한다. GH-RH 길항제와 조합해서 투여될 경우, 소마토스타틴은 IGF-I 수준 억제를 보다 낫게 향상시킨다.
과학자들은 향상된 촉진적 또는 길항적 성질을 갖는 합성 협동근을 제공하기 위해서 GH-RH 활성과 GH-RH 구조간의 관계를 해명하기 위해서 다양한 GH-RH 변형을 조사하여왔다. 따라서, 잔기 1 내지 29, 또는 GH-RH(1-29)를 포함한 GH-RH 단편은 생물학적 활성을 위해 필요한 최소한의 서열임이 일찍부터 확립되어 왔다. 이러한 단편은 원래의 GH-RH의 효능의 50% 이상을 보유한다.
먼저 설명된 GH-RH 길항제, [Ac-Tyr1, D-Arg2]hGH-RH(1-29)NH2는 문헌에서 일반적으로 "표준 길항제"로 불리는 것으로, hGH-RH(1-29)NH2에 의해서 래트 앞면 뇌하수체 아데닐리트 사이클라제의 활성을 방해하는 것으로 알려져 왔다. 동일한 펩티드가 뇌하수체 및 시상하부내의 그의 수용체상에서 GH-RH의 작용을 막고, 맥박치는 성장 호르몬 분리를 억제한다.
공지된 문헌상의 상당히 많은 특허 및 논문이 GH-RH의 촉진제(즉, GH의 방출을 촉진하도록 작용)로 또는 GH-RH의 길항제(즉, GH의 방출을 억제하도록 작용)로 작용하는 GH-RH 유사체를 공개하고 있다. 이러한 펩티드의 대부분은 강화된 촉진적 또는 길항적 성질의 이유를 설명하는 특정한 구조적 변형을 갖고 GH-RH(1-29) 펩티드 서열에서 유도된다.
따라서, 미국 특허 제4,659,693호는 GH-RH(1-29) 서열의 위치 2내의 특정N,N'-디알킬-오메가-구아니디노 알파-아미노 아실 잔기를 포함하하는 GH-RH 길항적 유사체를 개시하고 있다.
공고된 출원 WO 91/16923은 아미노산 서열을 변경함으로써 hGH-RH의 2차 구조를 바꾸는 더 이전의 시도들을 재고하고 있다. 이러한 보다 더 이른 시도들은 Tyr1, Ala2, Asp3또는 Asn8을 그들의 D-이성질체로 바꾸고; Asn8을 L- 또는 D-Arg, Asn, Thr, Gln 또는 D-Lys로 바꾸고; 부위의 양성친화성을 강화하기 위해서 Ser9을 Ala로 바꾸고; 및 Gly15를 Ala 또는 Aib로 바꾸는 것을 포함한다. 유사체내의 R2가 D-Arg이고, R8, R9, 및 R15이 상기 지적한 바와 같이 치환될 때, 길항적 활성은 결과와 같다. 이러한 길항적 펩티드는 GH의 과도한 수준과 관련된 상태, 예를 들어, 선단비대증을 치료하는 약학적 조성물로 투여되기에 적합한 것으로 언급된다.
미국 특허 제5,084,555호의 hGH-RH 유사체 "[Ser9-Ψ[CH2-NH]-Tyr10]hGH-RH(1-29)"의 길항적 활성은 R 및 R 잔기간의 유사펩티드 결합(즉, [CH2-NH]연결로 감소된 펩티드 결합에 기인하는 것으로 설명되어 있다. 그러나, [Ser9-Ψ[CH2-NH]-Tyr10]hGH-RH의 길항적 성질은 표준 길항제, [N-Ac-Tyr1, D-Arg2]GH-RH(1-29)-NH2보다 낮은 것으로 언급되어 있다.
본 출원과 같은 양수인에게 할당된 미국 특허 제5,550,212호 및 미국 특허출원 제08/642,472호는 길항적 성질을 강화시키고 작용기간을 연장시킨 것으로 언급된 hGH-RH(1-29)NH2의 유사체를 개시하고 있다. 이러한 성질은 GH-RH(1-29)NH2의 N-말단에서의 다양한 아미노산의 대체 및 방향족 또는 비극성 산으로의 아실화에서 기인하는 것으로 생각된다. 상기 미국 특허 및 특허출원에서, R9은 언제나 Ser이고, R10은 Gln 또는 락탐 다리를 형성하는 아미노산(즉, Glu)이고, R28은 Ser, Asn, Asp, Ala 또는 Abu이고, 및 R29은 Agm, Arg-NH2, Arg-OH, Cit-NH2, Cit-OH, Har-OH2, 또는 락탐 다리를 형성하는 아미노산(즉, Lys 또는 Orn)인 것을 주목하여야 한다.
본 발명은 제대군인 사무국의 의학 연구 서비스에서 후원된 정부에서 일부 만들어졌다. 정부는 본 출원에 대해서 일정한 권리를 갖는다.
본 발명은 포유동물의 뇌하수체에서 나오는 성장 호르몬의 방출을 억제하는 신규한 합성 펩티드, 및 이러한 신규 펩티드를 포함하는 치료효과가 있는 조성물과 관련된다.
도 Ⅰ은 특정한 GH-RH 길항제로 치료하는 동안 MXT 마우스의 유방암의 부피 변화를 치료일수에 대해서 나타낸 도표이고,
도 Ⅱ는 특정한 GH-RH 길항제로 치료하는 동안 누드 마우스내의 MDA-MB-468 인간 유방암의 부피 변화를 치료일수에 대해서 나타낸 도표이고,
도 Ⅲ은 특정한 GH-RH 길항제로 치료하는 동안 누드 마우스내의 HT-29 인간 결장 암의 부피 변화를 치료일수에 대해서 나타낸 도표이고,
도 Ⅳ는 GH-RH 길항제로 치료하는 동안 누드 마우스내의 U87MG 인간 교모세포증의 부피변화를 치료일수에 대해서 나타낸 도효이고,
도 Ⅴ는 특정한 GH-RH 길항제로 치료하는 동안 누드 마우스내의 PC-3 인간 전립선 암의 부피변화를 치료일수에 대해서 나타는 도표이다.
hGH-RH(1-29)NH2의 신규한 일련의 합성 유사체가 제공된다. 이러한 유사체는 내생의 hGH-RH의 활성을 억제하고, 그에 따라 성장 호르몬의 방출을 막는다. 이미 설명된 것에 비해서, 신규한 유사체의 보다 강한 억제 효능은 다양한 아미노산의 대체로부터 기인한다.
특히, 본 발명은 다음 식:
X-R1-R2-Asp-Ala-R5-R6-Thr-R8-R9-R10-Arg-R12-R13-R14-R15-R16-Leu-R18-R19-Arg-R21-R22-Leu-Gln-Asp-Iie-R27-R28-R29-NH2
(상기 식에서, X는 PhAc, IndAc, Ibu, Nac, 1- 또는 2-Npr, 또는 Fpr이고,
R1은 Tyr 또는 His이고,
R2는 D-Arg 또는 D-Cit이고,
R5는 Iie 또는 Val이고,
R6은 Phe. Nal 또는 Phe(Y), 여기서, Y=F, Cl, Br이고,
R8은 Asn, Gln, Ser, Thr, Ala, D-Asn, D-Gln, D-Ser, D-Thr, Abu, D-Abu, 또는 Aib이고,
R9는 Arg, Har, Lys, Orn, D-Arg, D-Har, D-Lys, D-Orn, Cit, Nle, Tyr(Me), Ser, Ala 또는 Aib이고,
R10은 Tyr 또는 Phe(Y), 여기서, Y=H, F, Cl, Br, 또는 OCH3이고,
R12는 Lys, D-Lys, 또는 Orn이고,
R13은 Val 또는 Nle이고,
R14는 Leu 또는 Nle이고,
R15는 Gly, Ala, Abu, Nle 또는 Gln이고,
R16은 Gln 또는 Arg이고,
R18은 Ser 또는 Nle이고,
R19는 Ala 또는 Abu이고,
R21은 Lys 또는 Orn이고,
R22는 Leu, Ala 또는 Aib이고,
R27은 Met, Leu, Nle, Abu, 또는 D-Arg이고,
R28은 Arg, D-Arg, Ser, Asn, Asp, Ala 또는 Abu이고,
R29는 Arg, D-Arg, Har 또는 D-Har이다)
을 포함하는 펩티드 및 그의 약학적으로 허용가능한 염과 관련된다.
바람직한 실시예 중에서 X는 PhAc, IndAc 또는 Nac이고, R1은 Tyr 또는 His이고, R2는 D-Arg이고, R5는 Iie이고, R6은 Phe(pCl)이고, R8은 Asn 또는 Abu이고, R9는 Arg 또는 Har, Lys, Orn, D-Arg, D-Har, D-Lys, D-Orn, Cit, Nle, 또는 Tyr(Me)이고, R10은 Tyr 또는 Tyr(Me)이고, R12는 Lys이고, R13은 Val 또는 Nle이고, R14는 Leu 또는 Nle이고, R15는 Abu, Ala, 또는 Nle이고, R16은 Gln 또는 Arg이고, R18은 Ser 또는 Nle이고, R19는 Ala 또는 Abu이고, R21은 Lys이고, R27은 Nle 또는 D-Arg이고, R28은 D-Arg, Arg, 또는 Ser이고, R29는 D-Arg, Har 또는 D-Har인 펩티드이다.
원래의 GH-RH 분자의 30 내지 44의 아미노산 잔기는 활성에 본질적인 것으로 나타나지 않을 뿐만 아니라, 그들의 항등식도 중요한 것으로 나타나지 않았다. 따라서, 본 발명의 hGH-RH(1-29)-NH2유사체의 C-말단의 이러한 부가 아미노산 잔기의 일부 또는 모두의 첨가는 GH-RH 길항제로서 이러한 유사체의 효능에 영향을 주지 않는 것으로 나타난다. hGH-RH(1-29)NH2유사체의 C-말단에 이러한 아미노산의 일부 또는 전부가 첨가된다면, 첨가된 아미노산 잔기는 원래의 hGH-RH 서열내의 잔기 30 내지 44와 같거나 또는 정당한 등량일 수 있다.
합성 방법
합성 펩티드는 전부의 고체상 기술, 부분적 고체-상 기술, 단편 압축 또는 분류적 용액 상 합성에 의한 것과 같은 적합한 방법에 의해서 합성된다.
본 발명의 유사체가 고체-상 방법에 의해서 합성될 때, C-말단 잔기(여기서, R29)는 불활성 고체 토대(레진)에 적합하게 연결(단단하게 고정)되고, 그동안 그것의 알파 아미노 그룹(및, 부쇄 작용기에 적합한 곳)용 보호기를 갖고 있다. 이러한 단계가 완성된 후, 알파 아미노 보호기는 고정된 아미노산 잔기에서 제거되고, 다음 아미노산 잔기, R28가 적합하게 보호된 그것의 알파 아미노기(모든 적합한 부쇄 작용기뿐만 아니라)를 갖도록 부가되는 등의 단계를 거친다. N-말단 보호기는 각잔기가 부가된 후에 제거되나, 부쇄 보호기는 아직 제거되지 않는다. 모든 원하는 아미노산이 적당한 서열로 결합된 후에, 펩티드는 서열내의 잔기에 대해서 최소로 파괴적인 조건하에서 토대에서 쪼개지고, 모든 부쇄보호기(들)로부터 자유롭게 된다. 다음으로 합성 생성물의 조심스런 정화 및 신중한 특성화가 이어지고, 그에 따라 원하는 구조는 실제로 획득된 것임을 확실하게 한다.
산 또는 염기에 민감한 보호기로 결합하는 단계동안 아미노산의 알파 아미노 작용을 보호하는 것이 특히 바람직하다. 그러한 보호기는 펩티드 결합 형성의 상태에서 안정하게 되는 성질을 갖으며, 그 동안 성장하는 펩티드 체인의 파괴됨 없이 및 그 안에 포함된 모든 키랄 센터의 라세미화없이 쉽게 제거가능하다. 적합한 알파 아미노 보호기는 Boc 및 Fmoc이다.
의학적 적용
hGH-RH 길항제 펩티드, 또는 이러한 펩티드의 염은 그것의 효과적인 양을 포함하는 약학적 복용량 형태로 제제되고, 치료용 또는 진단용 목적으로 인간 또는 동물에게 투여될 수 있다. 이러한 펩티드는 GH 수준을 억제하고, GH의 과도한 수준과 관련된 상태, 예를 들어, 당뇨병에 기인하는 망막장애 및 신장장애, 및 선단비대증을 치료하는데 사용될 수 있다. 또한, 그러한 치료가 필요한 개체에 본 발명의 조성물을 투여함으로써 이러한 질병을 치료하는 방법이 제공된다. 그러나, GH-RH 길항제의 주요 용도는 암분야, 예를 들어, IGF-I 또는 IGF-Π에 대한 수용체가 존재하는 유방, 폐, 결장, 뇌, 췌장 및 전립선의 인간의 암에 있다.
A. 약자
펩티드를 정의하는데 사용된 용어는 N-말단의 아미노기는 왼쪽에 표시되고, C-말단의 카르복실기는 오른쪽에 표시되는 통상적인 표현에 따라서, 생화학 명명법에 대한 IUPAC-IUB 위원에 의해서 지정되었다. 여기서 사용된 용어 "자연의 아미노산"은 보통의, 자연적으로 생기는 단백질내에서 발견되는 자연적으로 생기는 L-아미노산: Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Thr, Lys, Arg, Asp, Asn, Glu, Gln, Cys, Met Phe, Tyr, Pro, Trp 및 His를 의미한다. 자연의 아미노산 잔기가 이성질체 형태를 갖을 경우, 그것은 다르게 명화하게 지적되지 않는 한 여기서 표현되는 아미노산의 L-형이다.
비-코드된 아미노산, 또는 아미노산 유사체는 또한 GH-RH 길항체내에 결합된다. ("비-코드된"아미노산은 자연적으로 생기는 펩티드내에서 발견되는 대략 20개의 자연적 아미노산 중에 없는 아미노산이다). hGH-RH 길항제 펩티드내에 사용될 수 있는 비-코드된 아미노산 또는 아미노산 유사체 중에는 다음과 같은 것이 있다: Abu는 알파 아미노 부티르산을 의미하고, Aib는 알파 아미노 이소부티르산을 의미하고, Har은 호모아르기닌을 의미하고, Nal은 2-나프틸-알라닌을 의미하고, Nle는 노르류신이고, 및 Orn은 오르니틴을 의미한다. 이러한 비-코드된 아미노산, 또는 아미노산 유사체가 이성질체 형태를 가질 경우, 그것은 명확하게 지적되지 않는 한 표현된 아미노산의 L-형이다.
본원에서 사용되는 약자는 다음과 같다:
Abu α-아미노부티르산
Ac 아세틸
AcOH 아세트산
Ac2O 아세트산 무수물
Aib α-아미노이소부티르산
Boc 테트.부틸옥시카보닐
Bom 벤질옥시메틸
2BrZ 2-브로모-벤질옥시카보닐
cHx 사이클로헥실
Cit 시트룰린(2-아미노-5-유레이도발레릭산)
2CIZ 2-클로로-벤질옥시카보닐
DCM 디클로로메탄
DIC N,N'-디이소프로필카보디이미드
DIEA 디이소프로필에틸아민
DMF 디메틸포름아미드
Fmoc 플루오레닐메틸옥시카보닐
Fpr 3-페닐프로피오닐
GH 성장호르몬
GH-RH GH 방출 호르몬
Har 호모아르기닌
HBTU 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸유로니움
헥사플루오로인산염
hGH-RH 인간 GH-RH
HOBt 1-하이드록시벤조트라이졸
HPLC 고성능 액체 크로마토그래피
Ibu 이소부틸
IndAc 인돌-3-아세틸
MBHA 파라-메틸벤질드릴아민
MeOH 메탄올
MeCN 아세토니트릴
Nac 1-나프틸아세틸
Nal 2-나프틸알라닌
NMM N-메틸모르폴린
Npr 나프틸프로피오닐
PAM 페닐아세트아미도메틸
Phe(pCl) 파라-클로로-페닐알라닌
PhAc 페닐아세틸
rGH-RH 래트 GH-RH
RP-HPLC 역상 HPLC
TFA 트리플루오로아세트산
Tos 파라-톨루엔설포닐
Tyr(Me) 티로신 메틸에테르
Z 벤질옥시카보닐
B. GH-RH 유사체
본 발명의 hGH-RH 유사체는 수용체에 대한 펩티드의 친화력을 증가시키고, 대사 안정성을 향상시키고 및 분자의 양성 친화성 2차 구조를 최대화하도록 고안되었다. 많은 이러한 유사체는 생체밖 및 생체내의 hGH-RH(1-29)NH2에 의해서 촉진된 GH 방출의 매우 효과적이고 긴 억제를 일으킨다.
다음의 실시예는 현저한 생체활성을 갖는 것으로 특히 바람직하다:
[PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-RH(1-29)NH2펩티드 1
[IndAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-RH(1-29)NH2펩티드 2
[PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Har9, Tyr(Me)10, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-RH(1-29)NH2펩티드 3
[PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Har9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-RH(1-29)NH2펩티드 4
[Nac0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-RH(1-29)NH2펩티드 5
[PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Arg9, Tyr(Me)10, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-RH(1-29)NH2펩티드 6
[PhAc0, His1, D-Arg2, Phe(pCl)6, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-RH(1-29)NH2펩티드 7
[Nac0, His1, D-Arg2, Phe(pCl)6, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-
RH(1-29)NH2펩티드 8
[PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28]hGH-RH(1-29)NH2펩티드 9
[PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Abu15, Arg16, Nle27, D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2펩티드 10
[PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-RH(1-29)NH2펩티드 11
[PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Nle9, Abu15, Nle27, D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2
펩티드 12
[PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Nle13, Nle14, Abu15, Nle27, D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2펩티드 13
[PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Nle15, Nle27, D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2펩티드 14
[PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Abu15, Nle18, Nle27, D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2펩티드 15
[PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Tyr(Me)10, Abu15, Nle27, D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2펩티드 16
[PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Abu8, Tyr(Me)10, Abu15, Nle27, D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2펩티드 17
[PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, D-Abu8, Tyr(Me)10, Abu15, Nle27, D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2펩티드 18
[PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Tyr(Me)10, Abu15, D-Arg27, Arg28, D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2펩티드 19
[PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Tyr(Me)9, Abu15, D-Arg27, Arg28, D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2펩티드 20
[PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Abu15, D-Arg27, Arg28, D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2펩티드 21
[PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Abu8, Tyr(Me)10, Abu15, D-Arg27, Arg28, D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2펩티드 22
[PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, D-Abu8, Tyr(Me)10, Abu15, D-Arg27, Arg28, D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2펩티드 23
[PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Lys9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-RH(1-29)NH2펩티드 24
[PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Orn9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-RH(1-29)NH2펩티드 25
[PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, D-Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-RH(1-29)NH2펩티드 26
[PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, D-Har9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-RH(1-29)NH2펩티드 27
[PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, D-Lys9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-RH(1-29)NH2펩티드 28
[PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, D-Orn9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-RH(1-29)NH2펩티드 29
[PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Cit9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-RH(1-29)NH2펩티드 30
여섯개의 매우 바람직한 실시예는 하기 식을 갖는다:
PhAc0-Tyr1-D-Arg2-Asp3-Ala4-Ile5-Phe(pCl)6-Thr7-Asn8-Arg9-Tyr10-Arg11-Lys12-Val13-Leu14-Abu15-Gln16-Leu17-Ser18-Ala19-Arg20-Lys21-Leu22-Leu23-Gln24-Asp25-Ile26-Nle27-D-Arg28-Har29-NH2펩티드 1
IndAc0-Tyr1-D-Arg2-Asp3-Ala4-Ile5-Phe(pCl)6-Thr7-Asn8-Arg9-Tyr10-Arg11-Lys12-Val13-Leu14-Abu15-Gln16-Leu17-Ser18-Ala19-Arg20-Lys21-Leu22-Leu23-Gln24-Asp25-Ile26-Nle27-D-Arg28-Har29-NH2펩티드 2
PhAc0-Tyr1-D-Arg2-Asp3-Ala4-Ile5-Phe(pCl)6-Thr7-Asn8-Har9-Tyr(Me)10-Arg11-Lys12-Val13-Leu14-Abu15-Gln16-Leu17-Ser18-Ala19-Arg20-Lys21-Leu22-Leu23-Gln24-Asp25-Ile26-Nle27-D-Arg28-Har29-NH2펩티드 3
PhAc0-Tyr1-D-Arg2-Asp3-Ala4-Ile5-Phe(pCl)6-Thr7-Asn8-Arg9-Tyr(Me)10-Arg11-Lys12-Val13-Leu14-Abu15-Gln16-Leu17-Ser18-Ala19-Arg20-Lys21-Leu22-Leu23-Gln24-Asp25-Ile26-Nle27-D-Arg28-Har29-NH2펩티드 6
PhAc0-His1-D-Arg2-Asp3-Ala4-Ile5-Phe(pCl)6-Thr7-Asn8-Arg9-Tyr10-Arg11-Lys12-Val13-Leu14-Abu15-Gln16-Leu17-Ser18-Ala19-Arg20-Lys21-Leu22-Leu23-Gln24-Asp25-Ile26-Nle27-D-Arg28-Har29-NH2펩티드 7
Nac0-His1-D-Arg2-Asp3-Ala4-Ile5-Phe(pCl)6-Thr7-Asn8-Arg9-Tyr10-Arg11-Lys12-Val13-Leu14-Abu15-Gln16-Leu17-Ser18-Ala19-Arg20-Lys21-Leu22-Leu23-Gln24-Asp25-Ile26-Nle27-D-Arg28-Har29-NH2펩티드 8
잘 실시된 협정에서, 상기한 것들은 다음과 같이 약자로 될 수 있다:
[PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-RH(1-29)NH2펩티드 1
[IndAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-RH(1-29)NH2펩티드 2
[PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Har9, Tyr(Me)10, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-RH(1-29)NH2펩티드 3
[PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Arg9, Tyr(Me)10, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-RH(1-29)NH2펩티드 6
[PhAc0, His1, D-Arg2, Phe(pCl)6, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-RH(1-29)NH2펩티드 7
[Nac0, His1, D-Arg2, Phe(pCl)6, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-RH(1-29)NH2펩티드 8
C. 제조방법
1. 합성의 개요
펩티드는 전부의 고체 상 기술, 부분적인 고체-상 기술, 단편 응축 또는 분류적인 용액 상 합성에 의해서 합성된다. 예를 들어, 전부 고체-상 합성 기술은 교과서 "고체상 펩티드 합성"(제이.엠. 스트워트 및 제.디. 영, 피어스 화학 컴퍼니, 락포드, 111, 1984(2판)) 및 엠, 보단스키의 "펩티드 합성의 원리"(스피링거 베르락, 1984)에 설명되어 있다. hGH-RH 길항제 펩티드는 고체 상 합성을 이용해서 바람직하게 제조되며, 이는 당업계에서 공지된 다른 동등한 화학적 합성이 상기한 바와 같이 사용될 수 있을 지라도, 페리필드, 제이.앰.화학 협회. 85 p2149(1963)에 의해서 일반적으로 설명된다.
합성은 그의 알파 아미노기에서 보호되는 아미노산으로 실시된다. 우레탄 타입 보호기(Boc 또는 Fmoc)는 알파 아미노기의 보호를 위해서 사용되기에 바람직하다. 바람직한 보호기는 Boc이다.
고체상 합성에서, C-말단에 최종 펩티드의 아미노아실기를 형성한 N-알파-보호된 아미노산 부분은 화학결합을 통해서 중합체적 수지 토대에 부착된다. 결합반응이 완성된 후에, 알파 아미노 보호기는 연속되는 결합 반응이 아미노-말단에서,바람직하게는 N-알파-보호기가 Boc일 때 DCM내 50% TFA로 일어나도록 하기 위해서 선택적으로 제거된다. 단순히 Boc-보호된 알파 아미노기와 함께 남아있는 아미노산은 원하는 펩티드 서열을 얻기 위해서 수지상에 진행되는 아미노산의 자유 아미노기에 단계적으로 결합된다. 아미노산 잔기가 C-말단 잔기의 알파 아미노기와 결합되기 때문에, 합성적 hGH-RH 유사체 펩티드의 성장은 C-말단에서 시작해서 N-말단을 향해서 진행된다. 원하는 서열을 얻었을 때, 펩티드는 N-말단에서 아실화되고, 그것은 토대 중합체에서 제거된다.
각각의 보호된 아미노산은 초과량(2.5 또는 3등량)으로 사용되고, 결합 반응은 보통 DCM, DMF, 또는 그의 혼합물에서 실시된다. 결합 반응의 완성 정도는 닌하이드린 반응에 의해서 각 단계에서 모니터된다. 불완전한 결합으로 결정된 경우, 다음 아미노산의 결합전에 알파 아미노 보호기가 제거되기 전에, 결합 과정은 반복되고, 또는 미반응 아미노기의 아실화가 시행되어 마무리된다.
대표적인 합성 사이클은 하기 표 1에 나타내었다.
| 단계 | 시약 | 혼합시간(분) |
| 1.비보호 | DCM의 50% DCMDCM 세척2-프로판올 세척 | 5+2511 |
| 2.중화 | DCM의 5% DIEADCM 세척MeOH 세척DCM의 5% DIEAMeOH 세척DCM 세척(3회) | 111311-1 |
| 3.결합 | DCM 내 3가 Boc-아미노산 또는 DMF+3가 DIC 또는 Boc-아미노산의 실시된 HOBt 에스테르MeOH 세척DCM 세척 | 6022 |
| 4. 아실화(적합하다면) | DCM(30%)의 Ac2OMeOH 세척(3회)DCM 세척(3회) | 10+2022 |
합성이 완성된 후에, 수지로부터 펩티드의 분열은 펩티드 화학에서 공지되어 있는 과정을 이용해서 이루어질 수 있다.
펩티드의 아미노산 잔기 중 일부는 결합 또는 비보호에서 사용된 시약과 반응하는 부쇄 작용기를 갖는다. 그러한 부쇄기가 존재할 경우, 펩티드 형성에 사용되는 반응중에 발생하는 원하지 않는 화학반응을 막기 위해서 적합한 보호기가 이러한 작용기에 부착하게 된다. 하기의 일반적인 규칙이 특정 부쇄보호기를 선택하는데 따르게 된다: (a) 보호기는 그의 보호 성질을 바람직하게 유지하고 결합조건하에서 분열되지 않는다, (b) 보호기는 합성의 각 단계에서 알파 아미노 보호기를 제거하기 위한 조건하에서 안정하여야 한다, (c) 부쇄 보호기는 펩티드 체인을 바람직하지 않게 변경시키지 않을 반응 조건하에서, 원하는 아미노산 서열의 합성의 완성시에 제거될 수 있어야 한다.
반응 부쇄 작용기는 다음에 의해서 보호되는 것이 바람직하다: Thr 및 Ser용 벤질; Tyr용 2-브로모-벤질옥시카보닐; Arg 및 Har 용 p-톨루엔-설포닐 또는 니트로; Lys, Orn용 2클로로벤질옥시카보닐 또는 플루오에닐메틸옥시카보닐; His용 벤질옥시메틸; 및 Asp 및 Glu용 사이클로헥실 또는 플루오레닐메틸. Asn 및 Gln의 부쇄는 보호되지 않는다.
3. 아미노산 잔기와 토대 중합체의 단계적 결합
hGH-RH 길항제 펩티드는 다양한 토대 중합체, 즉, MBHA, 메리필드, 팜 또는 황 수지상에 합성될 수 있다. N-알파-Boc 보호된 아미노산이 합성에 사용될 때, 바람직한 수지는 MBHA이다. 이 경우, 아미데이트된 C-말단은 토대 상에서 분열될 때 얻어진다.
먼저, C-말단 아미노산은 중화된 MBHA 수지에 부착된 다음, 연속되는 아미노산 결합이 이루어진다. 각각의 보호된 아미노산은 수지-결합된 자유 아미노 잔기에 대해서, 약 3배 몰농도 초과량으로 결합되고, 결합은 DMF : CH2Cl2(1:1)와 같은 매개에서 또는 DMF 또는 CH2Cl2단독에서 실시된다. 적합한 결합 시약은 공지기술에 의해서 선택된다. 특히 적합한 결합제는 N,N'-디이소프로필카르보디이미드(DIC), 또는 HOBt와 결합된 HBTU이다. 합성의 각 단계에서의 결합반응의 성공은 닌히드린 반응에 의해서 바람직하게 모니터된다. 불완전한 결합이 일어날 경우, 알파 아미노 보호기의 제거전에, 결합과정이 반복되거나, 수지-결합 비반응된 아미노 잔기가 Ac2O/DCM을 이용해서 아실화된다.
펩티드의 N-말단의 최종 아실화는 적합한 카르복실산이 아미노산 대신에 사용되는 차이점외에는 이전의 결합과 동일하게 이루어진다.
4. 토대 중합체에서 펩티드 제거
합성이 완성되면, 펩티드는 토대 상에서 절단된다. 수지로부터 펩티드의 제거는 또한 모든 남아있는 부쇄 보호기를 절단하는 액체 플루오르화수소와 같은 시약으로 처리함으로써 이루어진다.
알맞게 건조되고 보호된 펩티드-수지는 펩티드를 레진으로부터 절단할 뿐만 아니라 모든 부쇄 보호기를 제거하기 위해서 펩티드-수지의 그램당 1.0mL의 m-크레졸 및 10mL의 무수 플루오르화수소로 구성된 혼합물로 0℃에서 60분동안 처리한다. 질소흐름 및 진공하에서 플루오르화수소를 제거한 후에, 자유 펩티드를 에테르로 침전시키고, 여과시키고, 에테르 및 에틸아세테이트로 세척하고, 50% 아세트산으로 용출하고, 동결건조시킨다.
5. 정화
크루드(crude) 펩티드의 정화는 펩티드 화학에 공지되어 있는 방법을 이용해서 실시될 수 있다. 예를 들어, 정화는 나우어 UV 광도계 및 킵프 및 조넨 BD40 기록기가 있는 맥래빗 HPLC 시스템(레이닌 기구 컴퍼니 인코오퍼레이션, 우번, 엠에이)상에서 비닥크 218TP5010 역상 컬럼(10×250mm, C18 실리카겔로 채워지고, 300Å 세공크기, 5㎛ 입자크기인 것)(분리 그룹 인코오퍼레인션, 헤스페리아, 시에이)분리 그룹 을 이용해서 실시된다. 컬럼은 (A) 0.1% 수용성 TFA 및 (B) 직선 기울기 양식의 70% 수용성 MeCN의 0.1% TFA(예를 들어, 120내에 30-55% B)로 구성된 용매 시스템으로 용출된다. 용리액은 220nm에서 모니터되고, 분율은 헤레트-팩카드 모델 HP-1090 액체 크로마토그래프를 이용해서 분석적인 HPLC에 의해서 조사되고 최대의순도를 내기 위해서 풀(pool)된다. 분석 HPLC는 비닥 218TP52 역상 컬럼(2×250mm, C18, 300Å, 5㎛)에서 상기 정의된 (A) 및 (B)로 구성된 용매 시스템의 등용매 용리를 이용해서 실시된다. 피크는 220 및 280nm에서 모니터된다. 펩티드는 분석 HPLC에 의해서 실질적으로 순수한(>95%) 것으로 판단된다. 또한, 예상한 아미노산 조성물은 아미노산 분석에 의해서 확인된다.
D. 약학적 조성물
본 발명의 펩티드는 약학적으로 허용가능한, 산 첨가 염과 같은 비독성 염의 형태로 투여될 수 있다. 그러한 산 첨가 염의 예는 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 황산염, 인산염, 퓨마레이트, 클루코네이트, 탄네이트, 말레이트, 아세테이트, 시트레이트, 벤조에이트, 석시네이트, 알지네이트, 파모에이트, 말레이트, 아스코베이트, 타르타르에이트 등이 있다. 특히 바람직한 길항제는 낮은 용해도의 염으로, 예를 들어, 파모에이트 염 등이 있다. 이러한 것들은 장기간의 활성을 나타낸다.
본 발명의 화합물은 인간 환자 또는 동물 s.c., i.m., 또는 i.v에; 코내부로 또는 폐 흡입에 의해서; 또는 생물분해성이 있는 적합한 중합체(예를 들어, D,L-락타이드-코글리코라이드)에서 제제된 디폿 형태(예를 들어, 마이크로캡슐, 마이크로과립, 또는 임플란트와 같은 원기둥형 로드), 바람직한 앞서 언급한 두 개으 ㅣ디폿 양식으로 적합하게 투여된다. 투여의 다른 동등한 양식, 즉, 계속적인 드립, 디폿 주사, 주입펌프 및 마이크로캡슐과 같은 시간 방출 양식은 또한 본 발명의 범위내에 있다. 당업계에서 공지되어 있는 다른 담체가 사용될 수 있을 지라도, 모든생리학적으로 허용가능한 주사가능한 담체, 허용가능한 생리학적 함염물로 투여된다.
펩티드는 등조의 함염물과 같은 약학적으로 허용가능한 담체로 주사로, 근육내로, 피아로 또는 정맥내로 투여되는 것이 바람직하다. 또는, 펩티드는 적합한 담체로 코내 스프레이 또는 폐 흡입으로 투여될 수 있다. 하나의 적합한 투여 루트는 생물분해성이 있는 적합한 중합체에서 제제된 디폿 형태, 예를 들어, 마이크로캡슐, 마이크로과립 또는 분산된 길항적 화합물을 함유하는 원기둥형 임플란트로서의 폴리-D,L-락타이드-코글리코라이드이다.
필요한 펩티드의 양은 투여 양식 및 의도하는 결과에 좌우된다. 일반적으로, 복용량 범위는 하루에 숙주의 체중당 1-100㎍/㎏ 사이이다.
E. GH-RH 길항제의 치료적 사용
hGH-RH 길항제는 과도한 성장 호르몬에 기인한 상태, 예를 들어, 얼굴 및 사지의 뼈의 비정상적인 확대로 나타나는 선단비대증에 사용될 수 있다. GH-RH 길항제는 또한 당뇨병에 기인한 신장장애(당뇨병에 기인한 실명의 주요 원인) 및 당뇨병에 기인한 망막장애(여기서, 눈 및 신장 각각에 대한 손상은 GH에 기인하는 것으로 판단된다)를 치료하는데 사용될 수 있다.
hGH-RH 길항제는 결합을 막고 그에 따라 GH-RH의 작용을 막도록 고안된 것으로, GH-RH는 GH의 분비를 촉진하고, 차례로 IGF-I의 생산을 촉진한다. GH-RH 길항제는 그것만으로 투여될 수 있으며, 또는 소마토스타틴 유사체와 함께, IGF-I 수준을 보다 완전히 억제하는 결합으로 투여될 수 있다. GH-RH 길항제가 목표 장소가소마토스타틴 수용체를 갖고 있지 않는 상태에서 이용될 수 있다는 사실 때문에 소마토스타틴 보다 GH-RH 길항제를 투여하는 것이 유익하다.
그러나, GH-RH 길항제이 주요 적용은 암분야에 있다. 이는 하기 고려사항에 기인한다: GH-RH 길항제는 결합을 막고 그에 따라 GH의 분비를 촉진하고, 차례로 소위 소마토메딘-C로 불리는 인슐린같은 성장 인자 I(IGF-I)의 생성을 촉진하는 GH-RH의 작용을 막도록 고안된다. 유방암, 전립선 암, 결장암, 뼈 종양 및 다른 악성 종양내에서 IGF-I(소마토메딘-C)의 관야는 잘 이루어지고, 소마토스타틴 유사체 자체는 GH 및 IGF-I 수준을 적합하게 억제하지 못한다. IGF-I 또는 분비의 완전한 억제는 종양 성장의 보다 나은 억제를 위해서 필요하다. 다양한 종양에 의한 IGF-I 의 오토크린 생성은 또한 GH-RH의 조절하에 있을 수 있으며, 그에 따라 GH-RH 길항제에 의해서 억제될 수 있다. GH-RH 길항제는 또한 IGF-I의 생성을 억제할 수 있다. 종양학(암)분야에서 GH-RH의 적용에 대한 보다 상세한 이론적 배경은 다음과 같다: IGF-I에 대한 수용체는 일차적인 인간 유방암, 전립선암, 폐암, 결장암, 뇌종양, 췌장암, 및 신장세포 암에 존재한다.
이러한 종양에서 IGF-I 수용체의 존재는 이러한 암의 악성 전환 및 확산과 관련되어 나타난다. IGF-I는 다양한 인간 암을 위해서 내분비물, 파라크린 또는 오토크린 성장 인자로 작용할 수 있으며, 이러한 종양의 성장은 IGF-I에 의존한다. GH 분비 억제에 의한 GH-RH 길항제는 IGF-I의 생성을 낮춘다. IGF-I는 이러한 다양한 종양(암)의 성장을 촉진하기 때문에, 순환하는 IGF-I 수준을 저하시키면 종양 성장 억제를 이끌게 된다. GH-RH 길항제는 종양에 의한 IGF-I의 파라크린 또는 오토크린 생성을 저하시키고, 또한 암 확산 억제를 유도하는 것을 가능하게 한다. 이러한 관점은 임상적 종양학의 현대적 개념에 따른 것이다. GH-RH 길항제는 그 자체만으로 또는 소마토스타틴 유사체와 함께 제공되며, 결합은 예를 들어, 유방암, 결장암, 전립선 암, 및 비-소세포 폐 암(비-SCLC) 뿐만 아니라, 인간 골육종에서 IGF-I 수준의 보다 완전한 억제, 조직 IGF-I 수준의 제거를 달성한다.
소마토스타틴 유사체에 대한 GH-RH 길항제의 잇점은 GH-RH 길항제가 소마토스타틴 수용체를 갖지 않는 종양, 예를 들어, 인간 골원의 육종의 억제에 유용할 수 있다는 사실에 기초한다.
GH-RH의 길항적 유사체는 생체내의 다양한 종양의 성장을 억제하는 것으로 알려져 왔다. 이러한 효과는 GHRH-GH-IGF-I 축의 억제를 통해서 부분적으로 발휘된다. 그럼에도 불구하고, IGF-Ⅱ에 의한 정화의 오토크린/파라크린 조절은 또한 많은 종양에서 주요한 인자이다. 이러한 오토크린 성장-촉진 경로의 방해는 종양 조절에의 접근을 제공한다. GH-RH의 길항적 유사체, MZ-4-71{[Ibu0, Tyr1, D-Arg2, Abu15, Nle27]hGH-RH(1-28)Agm} 및 MZ-5-156{[PhAc0, D-Arg2, Abu15, Nle27]hGH-RH(1-28)Agm}는 측색계 및 [3H]-티미딘 결합 테스트에 의해 나타나는 바와 같이, 시험관내의 유방의(MDA-MB-468, ZR-75-1), 전립선의(PC-3 및 DU-145), 및 췌장의(MiaPaC-2, SW-1990 및 Capan-2) 암 세포 라인을 현저하게 억제하고, 세포내의 IGF-Ⅱ mRNA 의 표현 및 배양 매개체내로 분비된 IGF-Ⅱ 농도를 감소시켰다. 동일한 GH-RH 길항제는 전립선 종양(PC-3, DU-145), 신장 암(Caki-I) 및 비-소세포 폐 암(H157)에 대해서 생체내에서 유사한 결과(확산의 억제 및 IGF-Ⅱ 생성의 감소)를 낳는다. 이러한 발견은 GH-RH의 길항적 유사체가 특정 종양 세포내에서, 단지 GHRH-GH-IGF-I 축을 억제하는 것에 의해서 뿐만 아니라, IGF-Ⅱ 생성을 줄이는 것에 의해서 종양 성장을 억제시키고, 그에 따라 그것의 오토크린 조정 경로를 차단시킬 수 있다는 것을 제안한다.
본 발명은 단지 예시의 목적으로 설명되는 하기의 실시예와 관련지어 설명될 것이다. 실시예에서, L-형상내의 광학상의 활성 보호된 아미노산은 특별히 지적된 곳외에서 사용된다.
다음의 실시예는 고체-상 기술에 의한 신규한 GH-RH 길항제의 합성 방법을 설명한다.
실시예 Ⅰ
PhAc0-Tyr1-D-Arg2-Asp3-Ala4-Ile5-Phe(pCl)6-Thr7-Asn8-Arg9-Tyr10-Arg11-Lys12-Val13-Leu14-Abu15-Gln16-Leu17-Ser18-Ala19-Arg20-Lys21-Leu22-Leu23-Gln24-Asp25-Ile26-Nle27-D-Arg28-Har29-NH2(펩티드 1)
{[PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-RH(1-29)NH2}
합성은 수동식 고체 상 펩티드 합성 장치를 이용해서 단계적인 방식으로 실시되었다. 요약하면, 파라-메틸벤즈하이드릴아민(MBHA)수지(Bachem, 캘리포니아)(720㎎, 0.50mmole)를 CH2Cl2의 5% DIEA로 중화시키고, 표 1에 설명된 프로토콜에 따라서 세척하였다. DMF-CH2Cl2(1:1)의 Boc-Har(NO2)-OH(500㎎, 1.5mmole) 용액을 중화된 수지 및 수동식 고체 상 펩티드 합성 장치내의 DIC(235㎕, 1.5mmole)로 1시간 동안 흔들었다. 결합반응의 완성이 음성 닌히드린 테스트, CH2Cl2의 50% TFA로 비보호, 및 CH2Cl2의 5% DIEA로 중화에 의해서 입증된 후에, 펩티드 체인은 원하는 펩티드 서열을 얻기 위해서 수지상에 지적된 명령내에 하기의 보호된 아미노산을 결합시킴으로써 단계적으로 만들어졌다: Boc-D-Arg(Tos)-OH, Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Asp(OcHx)-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Lys(2CIZ)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser(Bzl)-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Lys(2CIZ)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Tyr(2BrZ)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Asn-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Phe(pCl)-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp(OcHx)-OH, Boc-D-Arg(Tos)-OH, Boc-Tyr(2BrZ)-OH.
이러한 보호된 아미노산 잔기(또한 Bachem 컴퍼니로부터 통상적으로 입수가능)는 수락된 협정에 따라서 상기와 같이 표현된다. 특정 아미노산의 부쇄 작용기에 대해서 적합한 보호기는 괄호로 표시된다. 상기 식에서 OH기는 각 잔기의 카르복실 말단이 자유로움을 지적한다.
보호된 아미노산(각각 1.5mmole)은 실시된 HOBt 에스테르와 결합된 Boc-Asn-OH, 및 Boc-Gln-OH의 예외로 DIC(235㎕, 1.5mmole)와 결합한다. Tyr1에서 N"-Boc 보호기가 제거된 후에, 펩티드는 DIC(313㎕, 2mmole)를 이용해서 페닐아세트산(PhAc) (272㎎, 2mmole)으로 아실화된다.
수지로부터 펩티드를 절단하고 그것을 비보호하기 위해서, 건조된 펩티드 수지(2.18g)을 2mL m-크레졸 및 20mL 플루오르화수소(HF)로 0℃에서 1시간동안 교반하였다. 진공에서 HF의 증발후에, 나머지는 건조 디에틸에테르 및 에틸아세테이트로 세척되었다. 절단되고 비보호된 펩티드는 50% 아세트산에 용해되고 여과에 의해서 수지로부터 분리되었다. 물로 희석되고 동결건조된 후, 1.51g의 크루드 생산물을 획득하였다.
크루드 펩티드는 비닥 218TP52 역상 컬럼(2×250mm, C18 실리카 겔로 채워지고, 300Å 세공사이즈, 5㎛ 입자사이즈 임)(분리 그룹 인코포레이션, 헤스페리아, CA)이 구비된 헤렛트-팩카드 모델 HP-1090 액체 크로마토그래프를 이용한 분석적 HPLC에 의해서 체크되고, 크루드 펩티드의 70% 수용성 MeCN. 500㎎의 (A) 0.1% 수용성 TFA 및 (B) 0.1% TFA로 구성된 용매 시스템으로 선형 기울기 용출,(예를 들어, 40-80% B)은 AcOH/H2O에 용해되고, 교반되고, 여과되고, 베크만 울트라프렙 ODS 컬럼(21.2×150mm, C18 실리카 겔로 채워지고, 300Å 세공사이즈, 10㎛ 입자사이즈 임)상에 적용되었다. 컬럼은 상기 설명한 용매 시스템으로 선형 양식(예를 들어, 120분내에 30-55% B); 흐름율 6mL/분으로 용출되었다. 용리액은 220nm로 모니터되고, 분율은 분석용 HPLC에 의해서 조사되었다. 95% 이상의 순도의 분율은 풀(pool)되고 동결건조되어 98mg의 순수 생산물을 산출하였다. 분석용 HPLC는 흐름율 0.2mL/분으로 상기한 용매 시스템으로 등용매용리를 이용해서 상기한 비닥 C18 역상 컬럼상에 실시되었다. 피크는 220 및 280nm에서 모니터되었다. 생성물은 분석용 HPLC에 의해서 실질적으로(>95%) 순수한 것으로 판단되었다. 분자량은 전자스프레이 질량 분광계에 의해서 체크되고, 예상한 아미노산 조성물은 아미노산 분석에 의해서 확인되었다.
실시예 Ⅱ
PhAc0-Tyr1-D-Arg2-Asp3-Ala4-Ile5-Phe(pCl)6-Thr7-Asn8-Har9-Tyr(Me)10-Arg11-Lys12-Val13-Leu14-Abu15-Gln16-Leu17-Ser18-Ala19-Arg20-Lys21-Leu22-Leu23-Gln24-Asp25-Ile26-Nle27-D-Arg28-Har29-NH2(펩티드 3)
{PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Har9, Tyr(Me)10, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-RH(1-29)NH2}
합성은 수동식 고체 상 펩티드 합성 장치를 이용해서 단계적인 방식으로 실시되었다. 요약하면, 파라-메틸벤즈하이드릴아민(MBHA)수지(Bachem, 캘리포니아) (100㎎, 0.070mmole)를 CH2Cl2의 5% DIEA로 중화시키고, 표 1에 설명된 프로토콜에 따라서 세척하였다. DMF-CH2Cl2(1:1)의 Boc-Har(NO2)-OH(83㎎, 0.25mmole) 용액을 중화된 수지 및 수동식 고체 상 펩티드 합성 장치내의 DIC(44㎕, 0.275mmole)로 1시간 동안 흔들었다. 결합반응의 완성이 음성 닌히드린 테스트, CH2Cl2의 50% TFA로 비보호, 및 CH2Cl2의 5% DIEA로 중화에 의해서 입증된 후에, 펩티드 체인은 원하는펩티드 서열을 얻기 위해서 수지상에 지적된 명령내에 하기의 보호된 아미노산을 결합시킴으로써 단계적으로 만들어진다: Boc-D-Arg(Tos)-OH, Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Asp(OcHx)-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Lys(2CIZ)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser(Bzl)-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Lys(2CIZ)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Tyr(Me)-OH, Boc-Har(NO2)-OH, Boc-Asn-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Phe(pCl)-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp(OcHx)-OH, Boc-D-Arg(Tos)-OH, Boc-Tyr(2BrZ)-OH.
이러한 보호된 아미노산 잔기(또한 Bachem 컴퍼니로부터 통상적으로 입수가능)는 수락된 협정에 따라서 상기와 같이 표현된다. 특정 아미노산의 부쇄 작용기에 대해서 적합한 보호기는 괄호로 표시된다. 상기 식에서 OH기는 각 잔기의 카르복실 말단이 자유로움을 지적한다.
보호된 아미노산(각각 0.25mmole)은 실시된 HOBt 에스테르와 결합된 Boc-Asn-OH, 및 Boc-Gln-OH의 예외로 DIC(44㎕, 0.275mmole)와 결합된다. Tyr1에서 N"-Boc 보호기가 제거된 후에, 펩티드는 DIC(70㎕, 0.44mmole)을 이용해서 페닐아세트산(PhAc)(54㎎, 0.4mmole)으로 아실화된다.
수지로부터 펩티드를 절단하고 그것을 비보호하기 위해서, 건조된 펩티드 수지(206㎎)을 0.5mL m-크레졸 및 5mL 플루오르화수소(HF)로 0℃에서 1시간동안 교반하였다. 진공에서 HF의 증발후에, 나머지는 건조 디에틸에테르 및 에틸아세테이트로 세척하였다. 절단되고 비보호된 펩티드는 50% 아세트산에 용해되고 여과에 의해서 수지로부터 분리되었다. 물로 희석하고 동결건조한 후, 112㎎의 크루드 생산물을 획득하였다.
크루드 펩티드는 비닥 218TP52 역상 컬럼(2×250mm, C18 실리카 겔로 채워지고, 300Å 세공사이즈, 5㎛ 입자사이즈임)(분리 그룹 인코포레이션, 헤스페리아, CA)이 구비된 헤렛트-팩카드 모델 HP-1090 액체 크로마토그래프를 이용한 분석적 HPLC에 의해서 체크되고, 크루드 펩티드의 70% 수용성 MeCN. 80㎎의 (A) 0.1% 수용성 TFA 및 (B) 0.1% TFA로 구성된 용매 시스템으로 선형 기울기 용출,(예를 들어, 40-80% B)이 AcOH/H2O에 용해되고, 교반되고, 여과되고, 비닥 218TP5010 컬럼(10 ×250mm, C18 실리카 겔로 채워짐)상에 적용되었다. 컬럼은 상기 설명한 용매 시스템으로 선형 기울기 양식(예를 들어, 120분내에 30-55% B); 흐름율 2mL/분으로 용출되었다. 용리액은 220nm로 모니터되고, 분율은 분석용 HPLC에 의해서 조사되었다. 95% 이상의 순도의 분율은 풀(pool)되고 동결건조되어 9.6mg의 순수 생산물을 산출하였다. 분석용 HPLC는 흐름율 0.2mL/분으로 상기한 용매 시스템으로 상기 등용매용리를 이용해서 상기한 비닥 C18 역상 컬럼상에 실시되었다. 피크는 220 및 280nm에서 모니터되었다. 생성물은 분석용 HPLC에 의해서 실질적으로(>95%) 순수한 것으로 판단되었다. 분자량은 전자스프레이 질량 분광계에 의해서 체크되고, 예상한 아미노산 조성물은 아미노산 분석에 의해서 확인되었다.
펩티드 2, 및 펩티드 4 내지 30은 다른 치환을 포함하여 산출하는 것을 제외하고, 펩티드 1 및 펩티드 3과 동일한 방식으로 합성되었다:
[IndAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-RH(1-29)NH2펩티드 2
[PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Har9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-RH(1-29)NH2펩티드 4
[Nac0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-RH(1-29)NH2펩티드 5
[PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Arg9, Tyr(Me)10, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-RH(1-29)NH2펩티드 6
[PhAc0, His1, D-Arg2, Phe(pCl)6, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-RH(1-29)NH2펩티드 7
[Nac0, His1, D-Arg2, Phe(pCl)6, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-RH(1-29)NH2펩티드 8
[PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28]hGH-RH(1-29)NH2펩티드 9
[PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Abu15, Arg16, Nle27, D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2펩티드 10
[PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-RH(1-29)NH2펩티드 11
[PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Nle9, Abu15, Nle27, D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2펩티드 12
[PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Nle13, Nle14, Abu15, Nle27, D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2펩티드 13
[PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Nle15, Nle27, D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2펩티드 14
[PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Abu15, Nle18, Nle27, D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2펩티드 15
[PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Tyr(Me)10, Abu15, Nle27, D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2펩티드 16
[PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Abu8, Tyr(Me)10, Abu15, Nle27, D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2펩티드 17
[PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, D-Abu8, Tyr(Me)10, Abu15, Nle27, D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2펩티드 18
[PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Tyr(Me)10, Abu15, D-Arg27, Arg28, D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2펩티드 19
[PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Tyr(Me)9, Abu15, D-Arg27, Arg28, D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2펩티드 20
[PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Abu15, D-Arg27, Arg28, D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2
펩티드 21
[PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Abu8, Tyr(Me)10, Abu15, D-Arg27, Arg28, D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2펩티드 22
[PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, D-Abu8, Tyr(Me)10, Abu15, D-Arg27, Arg28, D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2펩티드 23
[PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Lys9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-RH(1-29)NH2펩티드 24
[PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Orn9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-RH(1-29)NH2펩티드 25
[PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, D-Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-RH(1-29)NH2펩티드 26
[PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, D-Har9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-RH(1-29)NH2펩티드 27
[PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, D-Lys9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-RH(1-29)NH2펩티드 28
[PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, D-Orn9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-RH(1-29)NH2펩티드 29
[PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Cit9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-RH(1-29)NH2펩티드 30
실시예 Ⅲ
생물학적 활성
본 발명의 펩티드를 GH 방출을 유도하는 hGH-RH(1-29)NH2를 억제하는 능력에 대한 생체외 및 생체내 평가를 시험하였다.
과융 래트 뇌하수체 시스템
유사체에 대해서는 변형(제트. 레카시 및 에이.브이.샬리, 피.엔.에이.에스. 90:2146-2149, 1993)을 가한 앞서 설명한 테스트(에스. 비그 및 에이.브이.샬리, 펩티드 5:241-347, 1984)를 생체밖에서 실시하였다.
요약하면, 세포는 다양한 농도에서 9분동안(3mL)펩티드로 미리 배양된다. 배양 직후, 1nM hGH-RH(1-29)NH2가 3분동안(1mL)[0분 반응] 투여된다. 유사체의 길항적 효과 경과를 체크하기 위해서, 1nM hGH-RH(1-29)NH2가 3분이 지난후에 30, 60, 90 및 120분에 적용된다[30, 60, 90, 120분 반응]. GH 반응의 정수값이 얻어진다. GH 반응은 1nM hGH-RH(1-29)NH2에 의해 유도된 원래의 GH 반응과 비교되고 펴센트로 표현된다. 신규 길항제의 효과는 "표준길항제"인 [Ac-Tyr1, D-Arg2]hGH-RH(1-29)NH2의 효과와 비교된다.
성장 호르몬 방사선면역측정법
비희석된 및 희석된 과융 샘플의 일정부분내의 래트 GH 수준은 매릴랜드, 발티모어, 내셔널 호르몬 및 뇌하수체 프로그램에 의해서 공급된 물질을 이용한 이중-항체 방사선면역측정법에 의해서 측정되었다. RIA의 결과는 우리 학회(브이. 세르너스 및 에이.브이.샬리, 신경내분비계 연구방법, 하우드 아카데믹(그린스타인, 비.디., 런던, pp.71-109, 1991)에서 개발된 컴퓨터 프로그램으로 분석되었으며, 그 결과로 참고로 결합되었다. 인터-평가 변수는 15%이하며, 인트라-평가 변수는 10%이하였다.
GH-RH 결합 평가민감한 방사선수용체 결합 평가가 GH-RH 길항제의 결합 특성을 결정하도록 개발되었으며(지. 할모스, 에이.브이.샬리 등, 수용체 3, 87-97, 1993), 그 결과 참고로 결합되었다. 평가는 래트 앞면 뇌하수체 막 동종에[His1, Nle27]hGH-RH(1-32)NH2로 라벨된 결합에 근거한다. [His1, Nle27]hGH-RH(1-32)NH2의 요오드화된 유도체가 클로라민-T 방법(에프.시.그린우드 등, 생화학 89:114-123, 1963)에 의해서 제조되고, 그 결과 참고로 결합되었다. 수컷 스프락-도레이 래트(250-300g)의 뇌하수체가 크루드 막을 제조하는데 이용되었다. 포화 결합 분석을 위해서, 막 동종은 초과 비라벨 펩티드의 존재 또는 비존재내에 0.005 내지 0.35nM의 범위에 있는, [His1,125]-Tyr10, Nle27]hGH-RH(1-32)NH2의 적어도 6 농도로 배양되었다.
환약은 y-카운터내 방사능에 대해서 계산되었다. 래트 뇌하수체 GH-RH 수용체에 대해 테스트된 길항제 펩티드의 친화력은 경쟁적인 결합 실험에서 결정되었다. 최종 결합 친화력은 K1(억제제-수용체 복합체의 분해상수)에 의해서 추정되고, 리간드 PC 및 문손과 로드바드의 맥퍼슨 컴퓨터 프로그램(피.제이. 문손 및 디.로드바드, 분석화학 107, 220-239, 1980)에 의해서 결정된다. 표준 길항제, [Ac-Tyr1, D-Arg2]hGH-RH(1-29)NH2에 대한 상대 친화력은 표준 길항제의 K1에 대한 테스트된 GH-RH 길항제의 K1의 비로 계산된다.
생체내 시험
유사체의 GH-RH 길항적 효과는 어린 수컷 스프락-도레이 래트(200-250g)으로 시험하였다. 7 동물 각각의 5 그룹이 사용되었다. 화합물(80㎍/㎏) 및 GH-RH(1-29)NH2(3㎍/㎏)을 5.5% 만티톨에 용해시키고, 멤부탈 마취상태에 있는 래트의 경부 정맥에 정맥주사에 의해서 넣었다. GH-RH와 길항제의 투여사이에 경과된 시간은 하기의 스케줄에 따라서, 그룹간에 다양하다. 동물의 제 1 그룹은 길항제 투여후 5분이 됐을 때 GH-RH 주사를 맞고, 제 2, 제 3 및 제4 그룹은 길항제 및 GH-RH의 주사사이에 경과된 시간 간격이 각각 15, 30, 및 60분이었다. 대조 그룹에는 길항제 대신에 용매만 먼저 주사한 후, 5분 후에 GH-RH를 주사하였따.
0.4mL의 혈액 샘플이 길항제 투여전("혈액0", 및 GH-RH주사 후 5분("혈액 1")에 GH RIA를 위해서 취해졌다. 각 그룹의 GH 반응은 각각의 차이점의 rGH=(GHblood1/GHblood0), 평균±S.E.M.으로 계산되었다. 처리된 각 그룹내 GH 반응의 상대 억제(%)는 100×(rGHtreated-1)/(rGHcontrol-1)에 의해서 계산되었다.
시험관내 결과
과융 래트 뇌하수체 시스템 및 결합 평가에서 시험된 시험관내 길항적 활성의 결과를 표 2 및 표 3에 요약하였다. 이러한 데이타에서 확인할 수 있는 바와 같이, 분자내 존재하는 치환은 표준 길항제에 비해서 시험관내 수용체 결합 뿐만 아니라 GH 방출의 억제에 상당한 증가를 가져온다. 시험관내에서 매우 강력한 길항제, 펩티드 1은 표준 테스트 조건하에서 90분동안 유도된 GH 방출의 완전한 억제를 일으킨다. GH-RH 반응 회복의 제 1 표시는 이러한 유사체의 노출후 120분에 탐지되었다.
| 길항제 | 용량(nM62.1)2.5 | GH 방출억제(%)0분 30분 60분 90분 120분 | ||||
| 표준 길항제 | 100 | 62.1 | 2.5 | 19 | ||
| 펩티드 1 | 30 | 100 | 100 | 100 | 100 | 94 |
| 펩티드 2 | 30 | 100 | 100 | 100 | 100 | 91 |
| 펩티드 3 | 30 | 85 | 98 | 91 | 92 | 87 |
| 펩티드 4 | 30 | 83 | 86 | 80 | 79 | 68 |
| 펩티드 5 | 30 | 79 | 77 | 59 | 58 | 50 |
| 펩티드 6 | 30 | 93 | 93 | 97 | 95 | 90 |
| 펩티드 7 | 30 | 97 | 92 | 82 | 77 | 65 |
| 펩티드 8 | 30 | 100 | 100 | 98 | 97 | 90 |
| 펩티드 9 | 30 | 91 | 87 | 79 | 72 | 59 |
| 펩티드 10 | 30 | 75 | 69 | 46 | 24 | 22 |
| 펩티드 11 | 30 | 96 | 89 | 80 | 56 | 42 |
| 펩티드 12 | 30 | 68 | 75 | 48 | 52 | 52 |
| 펩티드 16 | 30 | 65 | 87 | 83 | 56 | 65 |
| 펩티드 19 | 30 | 58 | 47 | 59 | 23 | 39 |
| 펩티드 | K1(nM) | R.A. |
| 료준 | 2.94 | 1 |
| 펩티드 1 | 0.044 | 67 |
| 펩티드 2 | 0.046 | 64 |
| 펩티드 3 | 0.068 | 43 |
| 펩티드 4 | 0.087 | 34 |
| 펩티드 5 | 0.036 | 82 |
| 펩티드 9 | 0.058 | 51 |
| 펩티드 10 | 0.107 | 27 |
| 펩티드 11 | 0.071 | 41 |
| 펩티드 12 | 0.070 | 42 |
| 펩티드 16 | 0.070 | 42 |
생체내 결과
표 4는 GH-RH 길항제로 미리 처리된 래트내의 혈청 GH 반응과 그들의 상대적 억제를 나타낸다. 테스트된 유사체 모두(펩티드 1, 펩티드 2, 펩티드 3, 펩티드 4,펩티드 8, 펩티드 9, 펩티드 11, 및 펩티드 16)는 hGH-RH(1-32)NH2에 의해서 촉진된 GH 방출의 강하고 장기간의 억제를 생산한다. 펩티드 1 및 펩티드 2는 단기간에 매우 강력하여, hGH-RH(1-32)NH2전 주어진 5분에 95% 및 91%에 의해 GH 반응을 억제한다. 두 펩티드의 이러한 효가는 적어도 30분동안 지속된다. 한편, 펩티드 11 및 펩티드 3는 단기간에 약간 효력이 덜한 것으로 매우 장기간 작용하여 효과가 적어도 60분동안 지속된다.
| 길항제 | 시간간격(분) | GH 반응평균±S.E.M. | 상대억제% |
| 펩티드 1 | 5 | 1.13±0.13 | 95 |
| 15 | 1.87±0.13 | 68 | |
| 30 | 1.97±0.16 | 64 | |
| 60 | 3.89±0.65 | -8 | |
| 대조 | 3.68±0.78 | 0 | |
| 펩티드 2 | 5 | 1.40±0.29 | 91 |
| 15 | 3.45±0.13 | 45 | |
| 30 | 3.64±0.71 | 41 | |
| 60 | 5.41±1.35 | 2 | |
| 대조 | 5.47±0.97 | 0 | |
| 펩티드 3 | 5 | 3.01±0.41 | 68 |
| 15 | 3.63±0.80 | 61 | |
| 30 | 4.89±0.95 | 41 | |
| 60 | 5.36±0.63 | 34 | |
| 대조 | 7.65±0.66 | 0 | |
| 펩티드 4 | 5 | 3.08±0.58 | 82 |
| 15 | 7.73±1.12 | 43 | |
| 30 | 12.00±2.54 | 7 | |
| 60 | 11.88±0.90 | 8 | |
| 대조 | 12.82±1.38 | 0 | |
| 펩티드 8 | 5 | 2.3±0.3 | 74 |
| 15 | 3.6±0.4 | 46 | |
| 30 | 5.5±0.6 | 8 | |
| 60 | 5.8±0.7 | 1 | |
| 대조 | 5.8±0.5 | 0 | |
| 펩티드 9 | 5 | 2.75±0.75 | 75 |
| 15 | 3.85±0.50 | 59 | |
| 30 | 3.34±0.30 | 67 | |
| 60 | 7.32±1.16 | 10 | |
| 펩티드 11 | 5 | 5.15±1.11 | 84 |
| 15 | 13.64±1.41 | 50 | |
| 30 | 16.04±4.36 | 40 | |
| 60 | 16.61±6.02 | 38 | |
| 대조 | 26.17±3.92 | 0 | |
| 펩티드 16 | 5 | 2.89±0.65 | 77 |
| 15 | 3.44±0.62 | 70 | |
| 30 | 5.24±1.36 | 48 | |
| 60 | 9.19±1.89 | 0 | |
| 대조 | 9.13±1.69 | 0 |
실시예 4
종양학적 테스트
본 발명에 의한 펩티드의 제암성 활성은 다양한 암 모델에서 시험되었다. 이러한 신규 펩티드의 제암적 효과는 미국특허 제5,550,212호 및 미국 특허출원 제08/642,472호에 종속하는 이전의 유사체(MZ-4-71 및 MZ-5-156의 효과와 비교된다.
MXT 마우스 유방종양에 대한 GH-RH 길항제 효과
에스트로겐의 영향을 받지 않는 MXT 종양을 암컷 BDF 마우스에 sc. 이식하였다. 이식후 하루지나서, 마우스를 각각 10동물의 그룹으로 나누고 처리를 시작하였다. 그룹 1, 2, 3, 및 4의 마우스에게 18일동안 하루에 20㎍ 용량으로 다양한 GH-RH 길항제 sc.의 단일 주사를 주었다. 그룹 5 및 6에는, 펩티드가 20㎍ 펩티드의 일일량을 방출하는 알제트 삼투 펌프에 의해서 투여되었다. 종양을 정규적으로 측정하고, 종양 부피를 계산하였다. 마우스가 하루 18로 희생되고 종양 무게가 측정되었다.
결과
펩티드 1 및 펩티드 3은 MXT 마우스 유방암에 유사한 강한 억제 효과를 갖는다. MZ-5-156으로 처리하면 또한 종양 성장의 중대한 억제를 낳고, 그것의 효과는 펩티드 1 내지 펩티드 3의 효과보다 약하다(표 5 및 도 1 참조).
| 그룹 | 종양부피(㎣)일 14 일 18 | 종양무게 | 생존마우스의 수 | |
| 1.대조 | 4051±1007 | 7040±646 | 7269±292 | 5 |
| 2.MZ-5-156 | 2717±773 | 5368±408* | 4885±480* | 4 |
| 3.펩티드 1 일일 주사 | 2924±654 | 4373±381** | 6964±676 | 6 |
| 4.펩티드 3 일일 주사 | 1902±349** | 3465±607** | 5266±906 | 8 |
| 5.펩티드 1 펌프 | 1329±327** | 3403±584** | 4810±645* | 7 |
| 6.펩티드 3 펌프 | 1688±220** | 4272±295* | 5939±453 | 8 |
*p<0.05 **p<0.01
누드 마우스내 MDA-MB-468 인간 유방암 이종이식편에 대한 GH-RH 길항제의 효과
MDA-MB-468 호르몬-독립 인간 유방암 이종이식편을 갖는 누드 마우스를 각각 10 동물의 그룹으로 나누었다. 처리된 그룹은 GH-RH 길항제 20㎍의 단일 일일 s.c. 주사를 맞았다. 한 그룹은 펩티드 1으로 처리하고, 제 2 그룹은 비교를 위해 MZ-5-156으로 처리하였다. 대조 그룹은 매체 용매로 주사하였다. 처리는 5주간동안 계속되었다. 종양을 일주일에 한번씩 측정하고, 종양 부피를 계산하였다. 마우스들은 실험 종기에 희생되고, 종양 무게가 측정되었다.
결과
두 개의 펩티드 모두 되고 MDA-MB-468 이종이식편에 중요한 종양-억제 효과를 발휘하였다. 펩티드 1, 4로 주사된 그룹에서는 실험동안 종양이 일정하게 경감하는 것을 보여주었다. 유사하게, MZ-5-1560은 3 종양의 경감을 일으켰다. 처리 5주 후, 이러한 암은 작은 상처같은 조직 자취로 경감하였다. 이러한 조직의 조직학적 조사에 의하면 막대한 괴사로 식별되지 않는 상피세포 종양과 살아있는 종양 조직의 단지 좁은 경계선만이 드러났다. 반대로, 대조 동물내의 모든 종양은 점진적으로 발전하였다. 처리된 그룹의 최종 종양 부피 및 무게는 상당히 감소되었으며(표 6 및 도 2 참조), 펩티드 1은 더 강한 효과를 갖었다.
| 그룹 | 최종 종양 부피(㎣) | 종양 무게(mg) | 경감된 종양 수 |
| 대조 | 477.5±41.2 | 440.7±37.7 | 0 |
| 펩티드 1 | 82.4±29.1** | 64.0±28.7** | 4 |
| mz-5-156 | 104.4±32.2** | 77.7±31.7** | 3 |
*p<0.05 **p<0.01
누드 마우스내 HT-29 인간 결장암 이종이식편에 대한 GH-RH 길항제의 효과
H-29 인간 결장암을 암컷 누드 마우스내에 sc. 이식하였다. 이식 후 19일에, 마우스를 각각 10 동물의 그룹으로 나누고, 처리를 시작하였다. 마우에게 6주동안 일일 20㎍ 용랭으로 다양한 GH-RH 길항제 sc.를 단일로 매일 주사하였다. 조양을 정규적으로 측정하고, 종양 부피를 계산하였다. 마우스는 실험 종기에 희생되고, 종양 부피가 측정되었다.
결과
펩티드 1 및 MZ-5-156은 HT-29 인간 결장암에 동등하게 강한 억제 효과를 갖었다. 펩티드 9로 처리한 것은 더 작으나 종양 성장의 매우 상당한 억제를 낳았다. 펩티드 11 및 MZ-4-71은 단지 중요치않은 효과를 가졌다. (그 결과를 표 7 및 도 3에 요약하였다)
| 그룹 | 최종 종양 부피(㎣) | 종양 무게(mg) |
| 대조 | 2117±751 | 2364±835 |
| MZ-4-71 | 1953±400 | 2189±458 |
| MZ-5-156 | 908±195* | 1012±174* |
| 펩티드 11 | 1663±610 | 1849±681 |
| 펩티드 9 | 1194±506* | 1383±576* |
| 펩티드 1 | 890±322* | 1354±480* |
*P<0.05
누드 마우스내 U87MG 인간 교모세포증 이종이식편에 대한 GH-RH 길항제 펩티드 1의 효과
마우스를 U87MG 교모세포증으로 s.c. 이식하고, 종양의 부피가 약 70㎣에 달할 때 마우스를 무작위로 2 실험 그룹으로 분리하였다. 한 그룹은 28일동안 20㎍의 단일 매일 s.c. 주사로 펩티드 1으로 처리하고, 다른 그룹은 대조구로 이용하였다.
결과
펩티드 1으로 처리한 것은 처리 4주후에 대조구에 대해 77%로 종양 성장을 억제하였다(표 8 및 도 4 참고).
| 그룹 | 최종 종양부피(㎣) | 종양 무게(g) |
| 대조 | 3425±723 | 4.7±1.3 |
| 펩티드 1 | 817±323** | 1.4±0.7** |
**p<0.01
누드 마우스내 PC-3 인간 전립선 암 이종이식편에 대한 GH-RH 길항제 효과
PC-3 인간 호르몬-독립 전립선 암 조직의 3㎣ 피스를 암컷 누드 마우스의 양 옆구리에 s.c. 이식하였다. 종양의 부피가 약 40-50㎣에 이르렀을 때, 마우스를 3 실험 그룹으로 나누었다. 제 1 및 제 2 그룹을 각각 21일동안 20㎍의 단일 일일 s.c. 주사로 처리하고, 반면에, 제 3 그룹은 대조구로 사용하였다. 종양 부피를 주간격으로 측정하고, 종양무게를 실험말기에 측정하였다.
결과
두 GH-RH 길항제는 PC-3 종양의 성장을 억제하였다(표 9 및 도 5 참조). 펩티드 3은 MZ-5-156(각각 52% 및 46%)보다 더 강한 성장 억제(종양부피에 있어서 65% 및 종양 무게에 있어서 62%)를 발휘하였다.
| 그룹 | 최종 종양부피(㎣) | 종양무게(mg) |
| 대조 | 307.9±64.5 | 191.8±42.6 |
| 펩티드 3 | 107.9±12.5* | 73.7±11.9* |
| MZ-5-156 | 148.9±41 | 104.3±27.2 |
*p<0.05
Claims (11)
- 하기 식:X-R1-R2-Asp-Ala-R5-R6-Thr-R8-R9-R10-Arg-R12-R13-R14-R15-R16-Leu-R18-R19-Arg-R21-R22-Leu-Gln-Asp-Ile-R27-R28-R29-NH2을 갖고, 상기 식에서,X는 PhAc, IndAc, Ibu, Nac, 1- 또는 2-Npr, 또는 Fpr이고,R1은 Tyr 또는 His이고,R2는 D-Arg 또는 D-Cit이고,R5는 Ile 또는 Val이고,R6은 Phe, Nal 또는 Phe(Y), 여기서, Y=F, Cl, Br이고,R8은 Asn, Gln, Ser, Thr, Ala, D-Asn, D-Gln, D-Ser, D-Thr, Abu, D-Abu, 또는 Aib이고,R9는 Arg, Har, Lys, Orn, D-Arg, D-Har, D-Lys, D-Orn, Cit, Nle, Tyr(Me), Ser, Ala 또는 Aib이고,R10은 Tyr 또는 Phe(Y), 여기서, Y=H, F, Cl, Br, 또는 OCH3이고,R12는 Lys, D-Lys, 또는 Orn이고,R13은 Val 또는 Nle이고,R14는 Leu 또는 Nle이고,R15는 Gly, Ala, Abu, Nle 또는 Gln이고,R16은 Gln 또는 Arg이고,R18은 Ser 또는 Nle이고,R19는 Ala 또는 Abu이고,R21은 Lys 또는 Orn이고,R22는 Leu, Ala 또는 Aib이고,R27은 Met, Leu, Nle, Abu, 또는 D-Arg이고,R28은 Arg, D-Arg, Ser, Asn, Ala 또는 Abu이고,R29는 Arg, D-Arg, Har 또는 D-Har인그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 펩티드 및 약학적으로 허용가능한 그의 염.
- 제 1 항에 있어서, 하기[PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-RH(1-29)NH2펩티드 1[IndAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-RH(1-29)NH2펩티드 2[PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Har9, Tyr(Me)10, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-RH(1-29)NH2펩티드 3[PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Arg9, Tyr(Me)10, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-RH(1-29)NH2펩티드 6[PhAc0, His1, D-Arg2, Phe(pCl)6, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-RH(1-29)NH2펩티드 7[Nac0, His1, D-Arg2, Phe(pCl)6, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-RH(1-29)NH2펩티드 8로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 1 항에 있어서, 식 [PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-RH(1-29)NH2펩티드 1을 갖는 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 1 항에 있어서, 식 [IndAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-RH(1-29)NH2펩티드 2를 갖는 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 1 항에 있어서, 식 [PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Har9, Tyr(Me)10, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-RH(1-29)NH2펩티드 3을 갖는 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 1 항에 있어서, 식 [PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Arg9, Tyr(Me)10, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-RH(1-29)NH2펩티드 6을 갖는 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 1 항에 있어서, 식 [PhAc0, His1, D-Arg2, Phe(pCl)6, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-RH(1-29)NH2펩티드 7을 갖는 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 1 항에 있어서, 식 [Nac0, His1, D-Arg2, Phe(pCl)6, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-RH(1-29)NH2펩티드 8을 갖는 것을 특징으로 하는 화합물.
- 동일한 것을 요구하는 환자의 과도한 GH 수준을 억제하는 방법에 있어서, 제 1 항의 화합물의 효과적인 양을 상기 환자에게 투여하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- IGF-Ⅰ 또는 -Ⅱ에 대한 수용체를 갖는 암이 있는 환자를 치료하는 방법에 있어서, 제 1 항의 화합물의 효과적인 양을 상기 환자에게 투여하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 종양(암)내 IGF-I 수준 및 동일한 종양내 IGF-Ⅱ용 mRNA의 표현을 억제하는 방법에 있어서, 제 1 항의 화합물의 효과적인 양을 상기 환자에게 투여하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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