PT1133522E - Análogos antagonistas da gh-rh que inibem os igf-i e -ii - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "ANÁLOGOS ANTAGONISTAS DA GH-RH QUE INIBEM OS IGF-I e II"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção realizou-se em parte com apoio governamental proveniente do Medicai Research Service of the Veterans Affairs Department. Neste Pedido de Patente de invenção o Governo detém direitos formais. A presente invenção diz respeito a novos péptidos de síntese que, nos mamíferos, inibem a libertação da hormona do crescimento pela pituitária, e a composições terapêuticas que contêm esses novos péptidos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A Hormona do Crescimento ("GH") é um péptido com 191 aminoácidos que estimula a produção de numerosos e diferentes factores de crescimento, por exemplo o factor de crescimento I do tipo da insulina (IGF-I) e assim promove o crescimento de numerosos tecidos (esqueleto, tecido conjuntivo, músculos e vísceras) e actividades fisiológicas (aumento de ácidos nucleicos e da síntese proteica e da lipólise, mas diminuição da secreção de ureia). A libertação da GH é controlada por factores de libertação e de inibição segregados pelo hipotálamo. O principal factor de libertação é a hormona libertadora de hormona do crescimento ("GH-RH"); a hormona libertadora de hormona do crescimento humana (hGH-RH) é um péptido com 44 aminoácidos. Os novos péptidos da presente invenção dizem respeito a análogos da hGH-RH com apenas 1 a 29 restos ("hGH- 2 -RH (1-29)NH2") , isto é, a análogos de um péptido que apresenta a sequência de aminoácidos:

Tyr-AIa-Asp-Ala-Iles-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr10-Arg-Lys-Val-

Leu-Gly15-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg20-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp25-Ile-

Met-Ser-Arg29-NH2 A GH tem sido implicada em algumas doenças. Uma doença em que a GH está envolvida é a acromegalia, na qual estão presentes níveis excessivos de GH. Os ossos faciais e das extremidades anormalmente aumentados nesta doença podem tratar-se mediante administração de um antagonista da GH-RH.

Outras doenças que envolvem a GH são a retinopatia diabética e a nefropatia diabética. Nessas doenças as lesões na retina e nos rins respectivamente, que se pensa serem devidas à GH, resultam em cegueira ou redução da função renal. Essas lesões podem evitar-se ou reduzir-se mediante administração de um antagonista eficaz da GH-RH.

No entanto, as principais aplicações dos antagonistas da GH-RH tiveram lugar na área do cancro (A. V. Schally et al, em Growth Hormone Secretagogues in Clinicai Practice, ed. Bercu, B.B. & Walker, R.F., Dekker, New York, pág. 145-162, 1998) . Em diversos cancros os IGF-I e -II são potentes mitógenos. Por supressão da secreção da GH, os antagonistas da GH-RH reduzem a síntese do IGF-I no figado e em outros tecidos. Os antagonistas da GH-RH reduzem também a produção autócrina e parácrina dos IGF-I e/ou IGF-II por diversos tumores. Em alguns cancros experimentais, o tratamento com antagonistas da GH-RH origina uma redução dos IGF-I e -II, concomitante com a inibição do crescimento tumoral. 3

Num esforço para intervir nessas doenças e em outras situações, alguns investigadores tentaram controlar os níveis da GH utilizando somatostatina, um inibidor da libertação da GH. Contudo, a somatostatina quando administrada individualmente, não suprime a GH ou os níveis do IGF-I até ao grau pretendido. Quando administrada em associação com um antagonista da GH-RH, a somatostatina poderá melhorar muito mais a supressão dos níveis do IGF-I.

Num esforço para preparar congéneres de síntese com melhores propriedades agonistas ou antagonistas os cientistas têm investigado diversas modificações da GH-RH para esclarecerem a relação entre a sua estrutura e a sua actividade. Assim, constatou-se inicialmente que o fragmento da GH-RH que contem os restos 1 a 29, ou GH-RH (1-2 9) , é a sequência mínima necessária para actividade biológica. Este fragmento retém 50% ou mais da potência da GH-RH nativa. O primeiro antagonista descrito da GH-RH, o [Ac-Tyr1, D--Arg2] hGH-RH (1-29) NH2, que na literatura se designa, na generalidade, por "antagonista padrão", verificou-se ser capaz de evitar a activação da adenilato ciclase na pituitária anterior de camundongos como os hGH-RH(1-29)NH2. 0 mesmo péptido bloqueou a acção da GH-RH sobre os seus receptores na pituitária e no hipotálamo, e inibiu a secreção pulsátil da hormona do crescimento.

Um número considerável de patentes e de artigos na literatura disponível divulga análogos da GH-RH que ou actuam como agonistas da GH-RH (isto é actuam para inibir a libertação da GH) ou como antagonistas da GH-RH (isto é actuam para inibir a libertação da GH) . Grande parte desses péptidos deriva da sequência peptídica GH-RH(1-29), com 4 modificações estruturais específicas que contribuem para as suas propriedades agonistas ou antagonistas intensas.

Dessa forma, a Patente de invenção norte-americana N° 4 659 693 divulga análogos antagonistas da GH-RH que contêm, determinados restos N,N'-dialquil-omega-guanidino alfa-amino acilo em posição 2 da sequência GH-RH(1-29). 0 Pedido publicado da Patente de invenção internacional WO 91/16923 revê tentativas anteriores para alterar a estrutura secundária da hGH-RH mediante modificação da sua sequência de aminoácidos. Essas tentativas anteriores incluem: substituição de Tyr1, Ala2, Asp3 ou Asn8 pelos seus isómeros D; substituição de Asn8 por L- ou D-Ser, D-Arg, Asn, Thr, Gin ou D-Lys; substituição de Ser9 por Ala para reforçar a anfifilicidade da região; e substituição da Gly15 por Ala ou Aib. Quando nos análogos R2 representa D-Argf e R8, R9, e RiS são substituídos como indicado antes, diz-se que a actividade antagonista resulta. Esses péptidos antagonistas consideram-se apropriados para administração como composições farmacêuticas para tratar situações associadas a niveis excessivos de GH, por exemplo a acromegalia. A actividade antagonista do análogo da hGH-RH "[Ser9--ψ [CIÍ2-NH] -Tyr10] hGH-RH (1-29) " da Patente de invenção norte--americana N° 5 084 555 considerou-se resultante de uma ligação pseudopeptídica (isto é, de uma ligação peptidica reduzida à associação [CH2-NH] } entre os restos R9 e Ri0. Contudo, as propriedades antagonistas de " [Ser9-i|f [CHo-NH] --Tyr10]hGH-RH(1-29) consideraram-se inferiores às do antagonista padrão, [N-Ac-Tyr1, D-Arg2]GH-RH(1-29)-NH2 . 5 A Patente de invenção norte-americana N° 5 550 212, e o Pedido de Patente de invenção norte-americano 08/642 472, cedidos ao mesmo cessionário como o presente Pedido de Patente de invenção, referem análogos de hGH-RH(1-29)NH2 citados por possuírem propriedades antagonistas reforçadas e prolongada duração de acção. Acredita-se que essas propriedades têm origem na substituição de diversos aminoácidos e na acilação com ácidos aromáticos ou não polares no N-terminal dos GH-RH(1-29)NH2. Na Patente de invenção norte-americana e no Pedido de Patente de invenção norte-americano anteriores menciona-se que R9 representa sempre Ser, R16 representa Gin ou um aminoácido capaz de formar uma ponte lactâmica (isto é Glu), R28 representa Ser, Asn, Asp, Ala ou Abu, e R29 representa Agm, Arg-NH2, Arg-OH, Cit-NH2, Cit-OH, Har-NH2, Har-OH, ou um aminoácido capaz de formar uma ponte lactâmica (isto é Lys ou Orn).

SOMÁRIO DA INVENÇÃO

Fornece-se uma nova série de análogos sintéticos dos hGH-RH(1-29)NH2. Estes análogos inibem a actividade da hGH-RH endógena, e evitam portanto a libertação da hormona do crescimento. Os poderes ínibidores mais fortes dos novos análogos, quando comparados com os descritos anteriormente, têm origem na substituição de diversos aminoácidos.

Especificamente, a presente invenção diz respeito a péptidos que apresentam a fórmula: X-R1-R2-Asp-Ala-R5-R6-Thr-R8-R9-R10-Arg-R12-R13-R14-R15-R16-Leu- -R18-R19-Arg-R21-R22-Leu-Gln-Asp-Ile-R27-R28-R29-NH2 na qual X representa PhAc, IndAc, Ibu, Nac, 1- ou 2-Npr ou

Fpr, R1 representa Tyr ou His, R2 representa D-Arg ou D-Cit, 6 R3 representa Ile ou Vai, R6 representa Phe, Nal ou Phe(Y), em que Y representa um átomo de F, Cl ou Br, R8 representa Asn, Gin, Ser, Thr, Ala, D-Asn, D-Gln, D-Ser, D-Thr, Abu, D-Abu ou Aib, R9 representa Arg, Har, Lys, Orn, D-Arg, D-Har, D-Lys, D-Orn ou Cit, R“u representa Tyr ou Phe(Y), em que Y representa um átomo de H, F, Cl, ou Br ou um grupo OCH3,

Rl2 representa Lys, D-Lys, ou Orn,

Rx3 representa Vai ou Nle,

Rx4 representa Leu ou Nle,

Rx5 representa Gly, Ala, Abu, Nle ou Gin,

Rl6 representa Gin ou Arg, 1 fi

Rx representa Ser ou Nle, >13 representa Ala ou Abu, R21 representa Lys ou Orn, R22 representa Leu, Ala ou Aib, R27 representa Met, Leu, Nle, Abu, ou D-Arg, p o R representa Arg ou D-Arg,

p Q R representa Arg, D-Arg, Har ou D-Har, e aos seus sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico.

Entre uma forma de realização preferida encontram-se os péptidos em que X representa PhAc, IndAc ou Nac, R1 representa Tyr ou His, R‘ representa D-Arg, R5 representa Ile, R6 representa Phe (pCl) , R8 representa Asn ou Abu, R9 representa Arg ou Har, Lys, Orn, D-Arg, D-Har, D-Lys, D-Orn ou Cit, R10 representa Tyr ou Tyr (Me), R12 representa Lys, R representa Vai ou Nle, R14 representa Leu ou Nle, R representa Abu, Ala, ou Nle, Ri6 representa Gin ou Arg, R representa Ser ou Nle, R19 representa Ala ou Abu, R: 7 representa Lys, R27 representa Nle, ou D-Arg, R28 representa D-ftrg ou Arg, R29 representa D-Arg, Har ou D-Har.

Salienta-se que os restos de aminoácidos de 30 a 44 da molécula GH-RH natural não parecem ser essenciais para a actividade; nem a sua identidade parece ser fundamentai. Consequentemente, parece que a adição de alguns ou de todos esses outros restos de aminoácidos aos C-terminais dos análogos hGH-RH(1-29)-NH2 da presente invenção não afectará a eficácia desses análogos como antagonistas da GH-RH. Se se adicionassem alguns ou todos esses aminoácidos ao C-terminal dos análogos hGH-RH(1-29)-NH2, os restos dos aminoácidos adicionados poderiam ser os mesmos como os restos 30 a 44 da sequência da hGH-RH natural ou equivalentes admissíveis. Métodos de Síntese

Os péptidos sintéticos sintetizam-se por um método apropriado como por técnicas em fase exclusivamente sólida, por técnicas em fase parcialmente sólida, por condensação de fragmentos ou por síntese clássica em fase de solução.

Quando se sintetizam análogos de acordo com a presente invenção por um método em fase sólida, o resto do C-termínal (aqui designado R29) liga-se de um modo apropriado (ancorado) a um suporte sólido inerte (resina) transportando ao mesmo tempo grupos protectores do seu grupo alfa-amino (e, se adequado, do seu grupo funcional da cadeia lateral). Concluída esta fase, remove-se o grupo protector do radical alfa-amino do resto de aminoácidos ancorado e adiciona-se o resto de aminoácidos seguinte, R28, que possui o seu grupo alfa-amino (bem como qualquer grupo funcional apropriado da cadeia lateral) protegido de um modo apropriado, e assim por diante. Depois da adição de cada resíduo removem-se os grupos 8 protectores do N-terminal, mas não se removem ainda os grupos protectores da cadeia lateral. Depois de se terem ligado todos os aminoácidos pretendidos na sequência correcta, separa-se o péptido do suporte e liberta-se de todos os grupos protectores da cadeia lateral sob condições que são minimamente destrutivas no que respeita aos restos da sequência. A isto segue-se a purificação cuidadosa e a caracterização escrupulosa do produto sintético, para assim assegurar que a estrutura pretendida é na verdade a que se obtém.

Durante a fase de acoplamento com um grupo protector sensível a ácidos ou bases, prefere-se principalmente proteger a função alfa-amino dos aminoácidos. Esses grupos protectores devem possuir a característica de serem estáveis nas condições de formação da ligação peptídica, sendo ao mesmo tempo facilmente removíveis sem destruição da cadeia peptídica em crescimento e sem racemização de qualquer dos centros quirálicos nela contidos. Grupos protectores apropriados do radical alfa-amino são os grupos Boc e Fmoc.

Aplicações Médicas

Os péptidos antagonistas da hGH-RH, ou os sais desses péptidos, podem formular-se em formas de dosagem farmacêuticas contendo quantidades eficazes desses péptidos e administrar-se ao homem ou a animais com propósitos terapêuticos ou de diagnóstico. Estes péptidos podem utilizar-se para suprimir os níveis da GH e para tratar situações associadas aos níveis excessivos dessa hormona, por exemplo, retinopatia diabética e nefropatia, e acromegalia. Fornecem-se também métodos para o tratamento dessas doenças mediante a administração de uma composição de acordo com a 9 presente invenção a um indivíduo necessitado de um tal tratamento. As utilizações principais de antagonistas da GH--RH ocorrem contudo, na área do cancro, por exemplo cancros humanos da mama, dos pulmões, do cólon, do cérebro, do pâncreas, e da próstata onde estão presentes receptores do IGF-I ou do IGF-II.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura I é uma representação gráfica das alterações do volume de cancros mamários MXT de camundongos durante o tratamento com alguns antagonistas da GH-RH face aos dias de tratamento. A Figura II é uma representação gráfica das alterações do volume de cancros mamários humanos MDA-MB-4 68 em camundongos nus durante o tratamento com alguns antagonistas da GH-RH face aos dias de tratamento. A Figura III é uma representação gráfica das alterações do volume de cancros do cólon humanos HT-29 em camundongos nus durante o tratamento com alguns antagonistas da GH-RH face aos dias de tratamento. A Figura IV é uma representação gráfica das alterações do volume de glioblastornas humanos U87MG em camundongos nus durante o tratamento com um antagonista da GH-RH face aos dias de tratamento. A Figura V é uma representação gráfica das alterações do volume de cancros da próstata humanos PC-3 em camundongos nus durante o tratamento com alguns antagonistas da GH-RH face aos dias de tratamento. 10

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS FORMAS DE REALIZAÇÃO PREFERIDAS DA

PRESENTE INVENÇÃO A. Abreviaturas A nomenclatura utilizada para definir os péptidos é a especificada por IUPAC-IUB Comirtí ssion on Biochemical Nomenclature em que, de acordo com a representação convencional, o grupo amino em um N-terminal aparece à esquerda e o grupo carboxilo em um C-terminal aparece à direita. A expressão "aminoácido natural" quando utilizada na presente memória descritiva significa um dos L-aminoácidos comuns que ocorrem naturalmente encontrados em proteínas que ocorrem naturalmente: Gly, Ala, Vai, Leu, Ile, Ser, Thr, Lys, Arg, Asp, Asn, Glu, Gin, Cys, Met, Phe, Tyr, Pro, Trp e His. Quando o resto de aminoácidos naturais apresenta formas isoméricas, é a forma L do aminoácido que se representa na presente memória descritiva a menos que expressamente indicado de outro modo.

Aminoácidos não codificados, ou análogos de aminoácidos, íncluem-se também nos antagonistas da GH-RH. (Aminoácidos "não codificados" são os aminoácidos que não se encontram entre os aproximadamente 20 aminoácidos naturais encontrados em péptidos que ocorrem naturalmente) . Entre os aminoácidos não-codificados ou análogos de aminoácidos que se podem utilizar nos péptidos antagonistas da hGH-RH encontram-se os seguintes: Abu significa ácido alfa-aminobutírico, Aib significa ácido alfa-aminoisobutírico, Har significa homoarginina, Nal significa 2-naftil-alanina, Nle significa norleucina, e Orn significa ornitina. Quando estes aminoácidos não codificados, ou análogos de aminoácidos, exibem formas isoméricas, representa-se a forma L do aminoácido a menos que expressamente indicado de outro modo.

Abreviaturas utilizadas na presente memória descritiva

Abu ácido α-aminobutírico Ac acetilo AcOH ácido acético Ac20 anidrido acético Aib ácido α-aminoisobutírico Boc ter-butiloxicarbonilo Bom benziloximetilo 2BrZ 2-bromo-benziloxicarbonilo cHx ciclo-hexilo Cit citrulina(ácido 2-amino-5-ureídovalérico) 2CIZ 2-cloro-benziloxicarbonilo DCM diclorometano DIC N, N'-diisopropilcarbodiimida Dl EA diisopropiletilamina DMF dimetilformamida Fmoc fluorenilmetiloxicarbonilo Fpr 3-fenilpropionilo GH hormona do crescimento GH-RH hormona libertadora de hormona do crescimento Har homoarginina HBTU hexafluorofosfato de 2-(IH-benzotriazol--1-il)-1,1,3,3-tetrametilurónio hGH-RH GH-RH humana HOBt 1-hidroxibenzotriazole HPLC cromatografia liquida de alta resolução Ibu isobutirilo IndAc indole-3-acetilo MBHA para-metilbenzidrilamina MeOH metanol MeCN acetonitrilo Nac 1-naftilacetil 12

Nal 2-naftílalanina NMM N-metilmorfolina Npr naftilpropionilo PAM fenilacetamidometilo Phe (pci) para-cloro-fenilalanina PhAc fenilacetilo rGH-RH GH-RH de camundongo RP-HPLC HPLC de fase reversa TFA ácido trifluoroacético Tos para-toluenossulfonilo Tyr(Me) tirosina éter metilico Z benziloxicarbonilo B. Os Análogos da GH-RH

Os análogos da hGH-RH da presente invenção foram desenhados para aumentar as afinidades dos péptidos com o receptor, para melhorar a estabilidade metabólica e para aumentar ao máximo a estrutura anfifiiica secundária das moléculas. Muitos desses análogos induzem in vitro e in vivo a inibição, muito eficaz e de duração prolongada, da libertação da GH estimulada pelos hGH-RH(1-29)NH2.

As seguintes formas de realização da presente invenção são especialmente preferidas por exibirem uma impressionante bioactividade: ’ PhAc0, D-Arg2, Phe(pC1)6,

Arg9,

Abu 15

Nle 27 D-Arg 28 Péptido 1

Har29] hGH-RH (1-2 9) NH2 [ IndAc, D-Arg2, Phe(pCl)

ArgJ

Abu 15

Nle27, D-Arg28, Péptido 2

Har29] hGH-RH (1-2 9) NH2 [PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Har9, Tyr(Me) 10

Abu 15

Nle 27 D- -Arg28, Har29] hGH-RH (1-29) NH2 Péptido 3 [PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Har9, Abu15,

Nle 27 D-Arg28, Péptido 4

Har29] hGH-RH (1-2 9) NH2 13 [Nac°, D-Arg2, Phe(pCl)6, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg23, Har29] hGH-RH (1-2 9) NH2 Péptido 5 [PhAc°, D-Arg2, Phe(pCl)6, Arg9, Tyr ( (Me)10, Abu15, Nle27, D- -Arg28, Har29] hGH-RH (1- 29)NH2 Péptido 6 [PhAc°, His1, D-Arg2, Phe(pCl)6, Arg9 , Abu1 5, Nle27, D-Arg28, Har29] hGH-RH (1-29) NH2 Péptido 7 [Nac°, His1, D-Arg2, Phe(pCl)6, Arg9, , Abul£ ’, Nle27, D-Arg"3, Har29] hGH-RH (1-2 9) NH2 Péptido 8 [PhAc°, D-Arg2, Phe(pCl)6, Lys9, Abu15, Nle2', 2R D-Arg “, Har29] hGH-RH (1-29) NH2 Péptido 24 [PhAc°, D-Arg2, Phe (pCl)6, Orn9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29] hGH-RH (1-29) NH2 Péptido 25 [PhAc°, D-Arg2, Phe(pCl)6, D-Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29] hGH-RH (1-29) NH2 Péptido 26 [PhAc°, D-Arg2, Phe(pCl)6, D-Har9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29] hGH-RH (1-29) NH2 Péptido 27 [PhAc°, D-Arg2, Phe(pCl)6, D-Lys9, Abu15, Nle2', D-Arg28, Har29] hGH-RH (1-29) NH2 Péptido 28 [PhAc°, D-Arg2, Phe(pCl)6, D-Orn9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29] hGH-RH (1-29) NH2 Péptido 29 [PhAc°, D-Arg2, Phe(pCl)6, Cit9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29] hGH-RH (1-29) NH2 Péptido 30

Seis formas de realização da presente invenção muito preferidas exibem as fórmulas:

PhAc°-Tyr1-D-Arg2-Asp3-Ala4-Ile5-Phe (pCl) °-Thr7-Asn8-Arg9-Tyr10--Argil-Lys12-Val13-Leu14-Abulb-Gln16-Leu17-Ser18-Ala19-Arg20-Lys21--Leu22-Leu23-Gln24-Asp25-Ile26-Nle27-D-Arg28,Har29-NH2 Péptido 1

IndAc°-Tyr1-D-Arg2-Asp3-Ala4-Ile5-Phe(pCl}6-Thr7-Asn8-Arg9-Tyr10--A1rg11-Lys12-Val13-Leu14-Abu15-Gln16-Leu17-Ser18-Ala19-Arg20-Lys21--Leu22-Leu23-Gln24-Asp25-Ile26-Nle27-D-Arg28, Har29-NH2 Péptido 2 14

PhAc^Tyr^-D-Arg^Asp^Ãla^Ile^Phe (pCl) 6-Thr7-Asn8-Har9--Tyr (Me) lc*-Arg11-Lys12-Val13-Leu14-Abu15-Gln16“Leui7-Ser:L8-Ala19--Arg20-Lys21-Leu22-Leu23-Gln24-Asp25-Ile26-Nle27-D-Arg28,Har29-NH2 Péptido 3

PhAc°-Tyr1-D-Arg2-Asp3-Ala4-Ile5-Phe (pCl) 6-Thr7-Asn8-Arg9-Tyr (Me)10-Argu-Lys12-Val13-Leu14-Abu15-Gln16-Leu17-Ser18-Ala19-Ar g20-Lys21-Leu22-Leu23-Gln24-Asp25-I le2o-N le27-D-Arg28, Har29-NH2 Péptido 6

PhAc°-His1-D-Arg2-Asp3-Ala4-Ile5-Phe (pCl) 6-Thr7-Asn8-Arg9-Tyr10--Arg11-Lys12-Val13-Leu14-Abu15-Gln16-Leu17-Ser18-Ala19-Arg20-Lys21--Leu22-Leu23-Gln24-Asp25-Ile26-Nle27-D-Arg28, Har29-NH2 Péptido 7

Nac°-His1-D-Arg2-Asp3-Ala4-Ile5-Phe (pCl) 6-Thr7-Asn8-Arg9-Tyr10--Arg11-Lys12-Val13-Leu14-Abu15-Gln16-Leu11-Ser18-Ala19-Arg20-Lys21--Leu22-Leu23-Gln24-Asp25-Ile26-Nle27-D-Ãrg28,Har29-NH2 Péptido 8

De acordo com uma convenção perfeitamente estabelecida, estas podem abreviar-se como se segue: [ PhAc°, D-Arg2, Phe(pCl)6, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28,

Har29] hGH-RH (1-29) NH2 Péptido 1 [ IndAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28,

Har29] hGH-RH (1-2 9) NH2 Péptido 2 [PhAc°, D-Arg2, Phe(pCl)6, Har9, Tyr(Me)10, Abu15, Nle27, D--Arg28, Har29] hGH-RH (1-29) NH2 Péptido 3 [PhAc°, D-Arg2, Phe(pCl)6, Arg9, Tyr(Me)10, Abu15, Nle27, D--Arg28, Har29] hGH-RH (1-23) NH2 Péptido 6 15 [PhAc0, His1, D-Arg2, Phe(pCl)6, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29] hGH-RH (1-29) NH2 Péptido 7 [Nac°, His1, D-Arg2, Phe(pCl)6, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29] hGH-RH (1-2 9) NH2 Péptido 8 C. Método de Preparação 1. Resumo da Síntese

Os péptidos sintetizam-se por métodos apropriados como por técnicas em fase exclusivamente sólida, por técnicas era fase parcialmente sólida, por condensação de fragmentos ou por uma síntese clássica em fase de solução. Por exemplo, as técnicas de síntese em fase exclusivamente sólida estão publicadas no manual "Solid Phase Peptide Synthesis", J.M. Stewart e J.D. Young, Pierce Chem. Company, Rockford, 111, 1984 (2a ed.) , e M. Bodanszky, "Principies of Peptide Synthesis", Springer Verlag, 1984. Os péptidos antagonistas da hGH-RH preparam-se preferivelmente realizando uma síntese em fase sólida, como a descrita na generalidade por Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85 p. 2149 (1963), embora se possam utilizar também outras sínteses químicas equivalentes conhecidas na arte como previamente mencionado. A síntese realiza-se com aminoácidos que estão protegidos no seu grupo alfa-amino. Para a protecçâo do grupo alfa-amino utilizam-se preferencialmente os grupos protectores do tipo uretano (Boc ou Fmoc). O grupo protector preferido é o Boc.

Na síntese em fase sólida, o radical N-alfa-protegido dos aminoácidos que forma o grupo aminoacilo do péptido final 16 no C-terminal liga-se ao suporte de resina polimérica via uma ligação química. Concluída a reacção de acoplamento, remove--se selectivamente o grupo protector alfa-amino para permitir que as subsequentes reacções de acoplamento se realizem no amino-terminal, preferivelmente com TFA a 50% em DMC quando o grupo protector do N-alfa é o Boc. Os aminoácidos remanescentes com grupos alfa-amino similarmente protegidos por Boc são acoplados, passo a passo, sobre a resina ao grupo amino livre do aminoácido precedente para se obter a sequência peptídica desejada. Porque os restos dos aminoácidos são acoplados ao grupo alfa-amino do resto do C--terminal, o desenvolvimento dos péptidos análogos sintéticos da hGH-RH tem inicio no C-terminal e progridem em direcção ao N-terminal. Depois de se ter obtido a sequência pretendida, acila-se o péptido no N-termínal, e remove-se do polímero de suporte.

Cada aminoácido protegido utiliza-se em excesso (2,5 ou 3 equivalentes) e as reacções de acoplamento executam-se habitualmente em DCM, DMF ou suas misturas. O grau do rendimento da reacção de acoplamento é monitorizado em cada fase pela reacção da ninidrina. Nos casos em que se verifica acoplamento incompleto, repete-se a técnica de acoplamento, ou executa-se a adição ("capping") de uma estrutura "capuz" (cap) por acetilação de grupos amino que ainda não reagiram, diante da remoção do grupo protector do radical alfa-amino antes do acoplamento do aminoácido seguinte.

No Quadro I apresenta-se um ciclo de síntese característico. 17

QUADRO I

Protocolo para um Ciclo de Síntese Característico Utilizando uma estratégia com o Boc

Fase Reagente Tempo de mistura (min.} 1. Desprotecçâo TFA a 50% em DCM 5+25

Lavagem com DCM 1

Lavagem com 2-propanol 1 2. Neutralização DIEA a 5% em DCM 1

Lavagem com DCM 1

Lavagem com MeOH 1 DIEA a 5% em DCM 3

Lavagem com MeOH 1

Lavagem com DCM (3 vezes) 1-1 3. Acoplamento 3 equiv. de Boc-aminoácido em DCM ou DMF + 3 equiv. de DIC ou o éster HOBt do Boc--aminoácido 60

Lavagem com MeOH 2

Lavagem com DCM 2 4. Acetilação Ac20 em DCM (30%) 10 + 20 (se necessária) Lavagem com MeOH (3 vezes) 2

Lavagem com DCM (3 vezes) 2

Após a conclusão da síntese, a acção de separar o péptido da resina pode realizar-se utilizando técnicas bem conhecidas na química dos péptídos.

Alguns dos restos de aminoácidos dos péptídos possuem grupos funcionais que reagem com os reagentes utilizados em reacções de acoplamento ou de desprotecçâo. Quando tais 18 grupos da cadeia lateral estão presentes, unem-se grupos protectores apropriados a esses grupos funcionais para impedir a ocorrência de reacções químicas indesejáveis durante as reacções utilizadas para formar péptidos. Na selecção de um grupo protector específico das cadeias laterais seguem-se as seguintes regras gerais: (a) preferivelmente o grupo protector conserva as suas propriedades protectoras e não é eliminado nas condições de acoplamento, (b) em cada fase da síntese o grupo protector deve ser estável nas condições de remoção do grupo protector do radical alfa-amino, (c) o grupo protector da cadeia lateral deve ser removível a partir da conclusão da síntese da pretendida sequência de aminoácidos, nas condições reaccionais que não alterarão de um modo indesejável a cadeia peptídica.

Os grupos funcionais reactivos da cadeia lateral protegem-se preferivelmente como se segue: benzilo para Thr e Ser; 2-bromo-benziloxicarbonilo para Tyr; p-tolueno-sulfonilo ou nitro para Arg e Har; 2-clorobenziloxicarbonilo ou fluorenilmetiloxicarbonilo para Lys e Orn; benziloximetilo para His; e ciclo-hexilo ou fluorenilmetilo para Asp e Glu. As cadeias laterais de Asn e de Gin não são protegidas. 3. Acoplamento Fase a Fase dos Restos de Aminoácidos ao Polímero de Suporte

Os péptidos antagonistas da hGH-RH podem sintetizar-se sobre diversos polímeros de suporte, isto é resinas MBHA, Merrifield, PAM ou Wang. Quando na síntese se utilizam aminoácidos protegidos com Boc em N-alfa, a resina preferida é MBHA. Neste caso, a partir da separação da fase de suporte, obtêm-se péptidos com o C-terminal amidado. 19

Primeiro, liga-se o aminoácido pelo C-terminal à resina MBHA neutralizada, e realizam-se depois os subsequentes acoplamentos de aminoácidos. Cada aminoácido protegido é acoplado em um excesso molar aproximadamente triplo, relativamente aos restos amino livres ligados à resina, e o acoplamento pode realizar-se em um meio tal como DMF: CH2CI2 (1:1) ou em DMF ou CH2C12 individualmente. A selecção de um reagente de acoplamento apropriado compete aos entendidos na arte. Especificamente apropriados como reagentes de acoplamento são a N,N'-diisopropilcarbodiimida (DIC), ou o HBTU associado ao HOBt. Em cada fase da síntese, o êxito da reacção de acoplamento é preferivelmente monitorizada pela reacção da ninidrina. Nos casos em que ocorre acoplamento incompleto, ou se repete a técnica de acoplamento ou se acetilam os restos amino ligados à resina que não reagiram utilizando Ac20/DCM, antes da remoção do grupo protector do radical alfa-amino. A acílação final do N-terminal do péptido realiza-se de modo igual às dos acoplamentos precedentes, com a diferença de se utilizar um ácido carboxílico apropriado em vez de um aminoácido. 4. Remoção do Péptido do Polímero de Supor-te

Quando a síntese está concluída, separa-se o péptido da fase de suporte. A remoção do péptido da resina realiza-se mediante tratamento com um reagente tal como o ácido fluorídrico líquido que também separa todos os grupos protectores remanescentes das cadeias laterais.

Apropriadamente, trata-se o complexo péptido-resina seco e protegido com uma mistura constituída por 1,0 ml de m-cre- 20 sol e 10 ml de ácido fluorídrico anidro por grama do complexo péptido-resina durante 60 minutos à temperatura de 0 °C para separar o péptido da resina bem como para separar todos os grupos protectores das cadeias laterais. Concluída a remoção do ácido fluoridrico sob uma corrente de azoto e vazio, precipitam-se os péptidos livres com éter, filtram-se, lavam--se com éter e acetato de etilo, extraem-se com ácido acético a 50%, e liofilizam-se. 5. Purificação A purificação dos péptidos brutos pode realizar-se utilizando técnicas bem conhecidas na química dos péptidos. Por exemplo, a purificação pode realizar-se em um sistema MacRabbit de HPLC (Rainin Instrument Co. Inc., Woburn, MA) com um Fotómetro Knauer de UV e um Registador Kipp e Zonen BD40 utilizando uma coluna Vydac 218TP5010 de fase reversa (10x250 mm, contendo gele de sílica C18, dimensão do poro 300 Ã, dimensão da partícula 5 pm) (The Separations Group Inc., Hesperia, CA) . A coluna é eluída com um sistema de solventes constituídos por (A) solução aquosa a 0,1% de TFA e (B) TFA a 0,1% em solução aquosa a 70% de MeCN sob a forma de uma aplicação de um gradiente linear (por exemplo, 30-55% de B em 120 minutos). O eluente é monitorizado a 220 nm, e observam--se as fracções por HPLC analítica utilizando um cromatógrafo Hewlett-Packard Modelo HP-1090 para líquidos, e reunido para se obter a pureza máxima. Ά HPLC analítica realiza-se em uma coluna Vydac 218TP52 de fase reversa (2x250 mm, C18, 300 Á, 5 pm) utilizando uma eluição isocrática com um sistema de solventes constituído por (A) e (B) definidos antes. Os picos são monitorizados a 220 e 280 nm. Por HPLC analítica avaliam--se os péptidos quanto ao seu verdadeiro grau de pureza (>95%). A composição aguardada em aminoácidos é também confirmada pela análise dos mesmos. 21 D. Composição Farmacêutica

Os péptidos da presente invenção podem administrar-se sob a forma de sais não tóxicos aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico, como sais de adição de ácido. Exemplos desses sais de adição de ácido são os sais cloridrato, bromidrato, sulfato, fosfato, fumarato, gluconato, tanato, maleato, acetato, citrato, benzoato, succinato, alginato, pamoato, malato, ascorbato, tartarato, e similares. Antagonistas especialmente preferidos são os sais de baixa solubilidade, por exemplo, pamoatos e similares. Estes exibem duração prolongada da actívidade.

Os compostos da presente invenção administram-se apropriadamente a humanos ou a animais pelas vias subcutânea, intramuscular, ou endovenosa; por inalação intranasal ou pulmonar; ou sob formas depósito ("depot") [por exemplo, microcápsulas, microgrânulos, ou implantes semelhantes a "barras" (rod) cilíndricas] formuladas a partir de um polímero biodegradável apropriado (tal como o D,L-lactido--coglicolido), preferindo-se os dois primeiros modos de depósito. Outros modos equivalentes de administração são também abrangidos pelo âmbito da presente invenção, isto é, administração contínua gota a gota, injecções "depot" (depósito), bomba de perfusão e métodos de libertação em um determinado período como microcápsulas e outros iguais. A administração ocorre em um qualquer veículo inj ectável aceitável sob o ponto de vista fisiológico, considerando-se adequado o soro fisiológico, embora se possam utilizar também outros veículos conhecidos na arte.

Os péptidos administram-se preferivelmente pelas vias parentérica, intramuscular, subcutânea ou endovenosa com um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico como uma 22 solução isotóníca de cloreto de sódio. Alternativamente, os péptídos podem. admínistrar-se sob a forma de "spray" (vaporização) intranasal com um veiculo apropriado ou por inalação pulmonar. Uma via de administração apropriada é a forma depósito ("depot") formulada a partir de um polímero biodegradável apropriado, por exemplo o poli-D,L-lactido-co-glicolido) como microcápsulas, microgrânulos ou implantes cilíndricos contendo compostos antagonistas dispersos. A quantidade de péptido necessária depende da forma de administração e do resultado pretendido. Em geral, a dose varia entre 1 e 100 pg/Kg de peso corporal do hospedeiro por dia.

E. Aplicações Terapêuticas dos Antagonistas da GH-RH

Os antagonistas da hGH-RH podem utilizar-se no tratamento de situações causadas por excesso de hormona do crescimento, por exemplo acromegalia, que se manifesta pelo aumento anormal dos ossos da face e das extremidades. Os antagonistas da GH-RH podem utilizar-se também para tratar a nefropatia diabética (a causa principal da cegueira nos diabéticos) e a retinopatia diabética, situações em que se pensa que a lesão dos olhos e dos rins respectivamente é devida à GH.

Os antagonistas da hGH-RH são desenhados para bloquear a ligação e consequentemente a acção da GH-RH, que estimula a secreção da GH, que por sua vez estimula a produção do IGF-I. Os antagonistas da GH-RH podem administrar-se individualmente ou em associação com análogos da somatostatina, a associação que mais eficientemente suprime os níveis do IGF-I. É vantajoso administrar antagonistas da GH-RH em vez da somatostatina devido ao facto dos antagonistas da GH-RH se 23 poderem utilizar em situações em que os sitios-alvo não possuem receptores da somatostatina.

Contudo, as principais aplicações dos antagonistas da GH-RH ocorrem na área do cancro. Esse facto baseia-se nas considerações seguintes: os antagonistas da GH-RH são desenhados para bloquear a ligação e consequentemente a acçâo da GH-RH, o que estimula a secreção da GH, que por sua vez estimula a produção do factor de crescimento I do tipo da insulina (IGF-I) também designado somatomedina-C. 0 envolvimento do IGF-I (somatomedina-C) no cancro da mama, cancro da próstata, cancro do cólon, tumores ósseos e outras malignidades está bem estabelecido, e os análogos da somatostatina individualmente não suprimem adequadamente a GH e os niveis do IGF-I. Para uma maior inibição do crescimento tumoral impõe-se a supressão total dos níveis ou da secreção do IGF-I. A produção autócrina do IGF-I pelos diversos tumores poderá também estar sob o controlo da GH-RH e consequentemente poderá ser inibida pelos antagonistas da GH--RH. Os antagonistas da GH-RH podem também inibir a produção do IGF-I. O acontecimento teórico mais detalhado das aplicações da GH-RH no campo da oncologia (cancro) é o seguinte: Os receptores do IGF-I estão presentes em cancros da mama, cancros da próstata, cancros dos pulmões, cancros do cólon, tumores do cérebro, cancros do pâncreas primários humanos e em carcinomas da célula renal. A presença de receptores do IGF-I nesses tumores parece estar relacionada com a transformação maligna e as proliferações desses cancros. 0 IGF-I pode actuar como factor de crescimento endócrino, parácrino ou autócrino de diversos cancros humanos, ou seja o crescimento desses neoplasmas depende do IGF-I. Os antagonistas da GH-RH por supressão da 24 secreção da GH poderão baixar a produção do IGF-I. Como o IGF-I estimula o crescimento desses diversos neoplasmas (cancros), a diminuição dos níveis circulantes do IGF-I deve conduzir à inibição do crescimento tumoral. É possível que os antagonistas possam também diminuir a produção parácrina ou autócrina do IGF-I pelos tumores, o que poderá também conduzir à inibição da proliferação cancerígena. Esses pontos de vista estão de acordo com os conceitos modernos de oncologia clínica. Os antagonistas da GH-RH devem administrar-se individualmente ou em associação com análogos da somatostatina, conseguindo essa associação uma supressão mais eficiente do IGF-I, a eliminação dos níveis do IGF-I nos tecidos, por exemplo, em osteosarcomas humanos, bem como no cancro da mama, cancro do cólon, cancro da próstata, e cancro do pulmão de células não-pequenas (non-SCLC). A vantagem dos antagonistas da GH-RH sobre análogos da somatostatina baseia-se no facto dos antagonistas da GH-RH se poderem utilizar na supressão de tumores que não possuem receptores de somatostatina, por exemplo sarcomas osteogénicos humanos.

Tem-se demonstrado que análogos antagonistas da GH-RH suprimem o crescimento de diversos tumores in vivo. Este efeito manifesta-se em parte pela inibição do eixo GHRH-GH--IGF-I. Contudo, em muitos tumores o controlo autócrino/parácrino da proliferação pelo IGF-II constitui também um factor principal. A interferência com essa via autócrina estimuladora do crescimento oferece uma técnica para controlar o tumor. Os análogos antagonistas da GH-RH, o MZ-4-71 { [Ibu°, Tyr1, D-Arg2, Abu15, Nle27] hGH-RH (1-28) Agm} e o MZ-5-156 { [ PhAc0, D-Arg2, Abu15, Nle27] hGH-RH (1-28 ) Agm}, inibiram significativamente a taxa de proliferação de linhas 25 de células de cancros mamários (MDA-MB-468, ZR-75-1), prostáticos (PC-3 e DU-145), e pancreáticos (MiaPaCa-2, SW--1990 e Capan-2) in vitro como demonstrado por ensaios colorimétricos e de incorporação de [3H]-timidina e reduziram a expressão de mARN dos IGF-II nas células e a concentração do IGF-II segregado no meio de cultura. Os mesmos antagonistas da GH-RH produziram resultados similares in vivo (inibição da proliferação e redução da produção do IGF-II) em tumores da próstata (PC-3, DU-145), adenocarcinoma renal (Caki-1) e carcinoma do pulmão de células não pequenas (H157). Estes achados sugerem que os análogos antagonistas da GH-RH podem inibir o crescimento tumoral não apenas mediante inibição do eixo GHR-GH-IGF, mas também mediante redução da produção do IGF-II em determinadas células tumorais, interrompendo assim a sua via autócrina reguladora. A presente invenção está descrita em conexão com os exemplos seguintes que se apresentam apenas com o obj ectivo de esclarecimento. Nesses exemplos, utilizam-se aminoácidos activos sob o ponto de vista óptico e protegidos na configuração L excepto nos casos mencionados especificamente.

Os exemplos seguintes apresentam métodos de síntese apropriados de novos antagonistas da GH-RH utilizando uma técnica em fase sólida. 26

EXEMPLO I

PhAc°-Tyr1-D-Arg2”Asp3-Ala4-IIe5-Phe (pCl) 6-Thr7-Asn8-Arg9-Tyr10--Arg11-Lys12-Val13-Leu14-Abu15-Gln16-Leu17-Ser18-Ala19-Arg20-Lys21--Leu22-Leu23-Gln24-Asp25-Ile26-Nle27-D-Arg28-Har29-NH2 (Péptido 1} { [PhAc°, D-Arg2, PheípCl)6, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29] hGH-RH (1-29} NH2} A síntese é conduzida por etapas utilizando equipamento manual de síntese de péptidos em fase sólida. Rapidamente, neutralizam-se 720 mg (0,50 mirtole) de resina para-metilbenzi-drilamina (MBHA) (Bachem, Califórnia) com DIEA a 5% em CH2CI2 e lavam-se de acordo com o protocolo descrito no Quadro I. Durante 1 hora, agita-se no equipamento manual de síntese de péptidos em fase sólida uma solução de 500 mg (1,5 mmoles) de Boc-Har (N02)-OH em DMF-CH2C12 (1:1) com a resina neutralizada e 235 pl (1,5 mmoles) de DIC. Após a confirmação da conclusão da reacção de acoplamento pelo teste negativo da ninidrina, da desprotecção com TFA a 50% em CH2CI2, e da neutralização com DIEA a 50% em CH2C12, constrói-se a cadeia peptídica por etapas acoplando os seguintes aminoácidos protegidos pela ordem indicada sobre a resina para obter a sequência peptídica pretendida: Boc-D-Arg(Tos)-OH, Boc-Nle-OH, Boc-Ile--OH, Boc-Asp(OcHx)-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Lys(2C1Z)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser(Bzl)--OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val--OH, Boc-Lys(2C1Z)-GH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Tyr(2BrZ)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Asn-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Phe(pCl)--OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp(OcHx)-OH, Boc-D- Arg-(Tos)-OH, Boc-Tyr(2BrZ)-OH.

Em cima, representam-se esses restos de aminoácidos protegidos (também comummente obteníveis em Bachem Co.) de acordo com uma convenção perfeitamente aceite. O grupo protector apropriado para o grupo funcional da cadeia lateral 27 dos amínoácidos específicos aparece entre parênteses. Nas fórmulas anteriores os grupos OH indicam que cada terminal carboxílico desses restos é livre.

Os amínoácidos protegidos (1,5 mmoles cada) são acoplados com 235 pl (1,5 mmoles) de DIC com excepção de Boc--Asn-GH e Boc-Gln-OH que são acoplados com os seus ésteres HOBt pré-formados. Após a remoção do grupo protector N°-Boc da Tyr1, acila-se o péptido com 27 2 mg (2 mmoles) de ácido fenilacético (PhAc) utilizando 313 pl (2 mmoles) de DIC. A fim de separar o péptido da resina e desprotege-lo, agitam-se 2,18 g de resina seca contendo o péptido com 2 ml de m-cresol e 20 ml de ácido fluorídrico (HF) durante 1 hora à temperatura de 0 °C. Após evaporação do HF sob vazio, lava--se o resíduo com éter dietílico anidro e acetato de etilo. Dissolve-se o péptido clivado e desprotegido em ácido acético a 50% e separa-se da resina por filtração. Após diluição com água e liofilização, obtêm-se 1,51 g de produto bruto.

Controla-se o péptido bruto por HPLC analítica utilizando um cromatógrafo para líquidos Hewlett-Packard Modelo HP-1090 com uma coluna Vydac 218TP52 de fase reversa (2x250 mm, que contem gele de sílica C18, dimensão dos poros 300 Ã, dimensão das partículas 5 pm) (The Separations Group Inc., Hesperia, CA) e eluição gradiente linear, (por exemplo, 40-70% de B) com um sistema de solventes constituído por (A) solução aquosa de TFA a 0, 1% e (B) solução de TFA a 0,1% em solução aquosa de MeCN a 70%. Dissolvem-se 500 mg do péptido bruto em Ac0H/H20, agitam-se, filtram-se e aplicam-se em uma coluna ODS Beckman Ultraprep (21,2x150 mm, que contem gele de sílica C18, dimensão dos poros 300 Â, dimensão das partículas 10 pm). A coluna é eluída com o sistema de solventes descrito 28 antes de um modo gradiente linear (por exemplo, 30 a 55% de B em 120 minutos); velocidade do fluxo 6 ml/minuto. Monitoriza--se o eluente a 220 nm, e examinam-se as fracções por HPLC analítica. Reúnem-se as fracções com pureza superior a 95% e liofilizam-se para se obterem 98 mg do produto puro. A HPLC analítica realiza-se utilizando uma coluna Vydac C18 de fase reversa descrita antes e uma eluição isocrática com o sistema de solventes descrito antes com uma velocidade de fluxo de 0,2 ml/min. Monitorizam-se os picos a 220 e 280 nm. Por HPLC analítica avalia-se essencialmente a pureza do produto (>95%). A massa molecular verifica-se por espectrometria de massa por electroatomização, e confirma-se a aguardada composição em aminoácidos por análise desses aminoácidos.

EXEMPLO II

PhAc°-Tyr1-D-Arg2-Asp3-Ala4-Ile5-Phe (pCl) 6-Thr7-Asn8-Har9-

Tyr(Me 10 ,12

Arg11-LysiZ-Vali':í-Leui‘1-AbuiS-Glnlb-Leui '-Ser1H-Ala 13 ,14 15 ,16 ,19

Arg20-Lys21-Leu22-LeuZJ-Glní:‘i-Asp^o-Ile‘:D-Nle^/-D-Arg^8-Har^3-NH2 (Péptido 3) D-Arg2, Phe(pCl)6, Har9, Tyr (Me)10 Abu15, Nle27, D- „29 η { [PhAc°, -Arg28, HarZ8] hGH-RH (1-29) NH2} A síntese é conduzida por etapas utilizando equipamento manual de síntese de péptidos em fase sólida. Rapidamente, neutralizam-se 100 mg (0,070 mmole) de resina para-metilben-zidrilamina (MBHA) (Bachem, Califórnia) com DIEA a 5% em CH2CI2 e lavam-se de acordo com o protocolo descrito no Quadro I. Durante 1 hora, agita-se no equipamento manual de síntese de péptidos em fase sólida uma solução de 83 mg (0,25 mmole) de Boc-Har (N02) -OH em DMF-CH2C12 (1:1) com a resina neutralizada e 44 μΐ (0,275 mmole) de DIC. Após a confirmação da conclusão da reacção de acoplamento pelo teste negativo da ninidrina, a desprotecção com TFA a 50% em CH2C12, e a neutralização com DIEA a 50% em CH2C12, constrói-se a cadeia 29 peptídica por etapas acoplando os seguintes aminoácidos protegidos pela ordem indicada sobre a resina para se obter a sequência peptídica pretendida: Boc-D-Arg(Tos)-OH, Boc-Nle--0H, Boc-Ile-GH, Boc-Asp(OcHx)-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Lys(2C1Z)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser(Bzl)-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu--0H, Boc-Val-OH, Boc-Lys(2C1Z)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc--Tyr(Me)-OH, Boc-Har(N02) -OH, Boc-Asn-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Phe(pCl)-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp(OcHx)-OH, Boc-D-Arg(Tos)-OH, Boc-Tyr(2BrZ)-OH.

Em cima, representam-se esses restos de aminoácidos protegidos (também comummente obteníveis em Bachem Co.} de acordo com uma convenção perfeitamente aceite. 0 grupo protector apropriado para o grupo funcional da cadeia lateral dos aminoácidos específicos aparece entre parênteses. Nas fórmulas anteriores os grupos OH indicam que cada terminal carboxílico desses restos é livre.

Os aminoácidos protegidos (0,25 mxnole cada) são acoplados com 44 μΐ (0,275 mmole) de DIC com excepção de Boc--Asn-OH e Boc-Gln-OH que são acoplados com os seus ésteres HOBt pré-formados. Após a remoção do grupo protector N°-Boc da Tyr1, acila-se o péptido com 54 mg (0,4 mmole) de ácido fenilacético (PhAc) utilizando 70 μΐ (0,44 mmole) de DIC. A fim de separar o péptido da resina e desprotege-lo, agitam-se 206 mg de resina seca contendo o péptido com 0,5 ml de m-cresol e 5 ml de ácido fluorídrico (HF) durante 1 hora à temperatura de 0 °C. Após evaporação do HF sob vazio, lava-se o resíduo com éter dietílico anidro e acetato de etilo. Dissolve-se o péptido clivado e desprotegido em ácido acético 30 a 50% e separa-se da resina por filtração. Após diluição com água e liofilização, obtêm-se 112 mg de produto bruto.

Controla-se o péptido bruto por HPLC analítica utilizando um cromatógrafo para líquidos Hewlett-Packard Modelo HP-1090 com uma coluna Vydac 218TP52 de fase reversa (2x250 mm, que contem gele de sílica C18, dimensão dos poros 300 Ã, dimensão das partículas 5 pm) (The Separations Group Inc., Hesperia, CA) e eluição gradiente linear, (por exemplo, 40-70% de B) com um sistema de solventes constituído por (A) solução aquosa de TFA a 0,1% e (B) solução de TFA a 0,1% em solução aquosa de MeCN a 70%. Dissolvem-se 80 mg do péptido bruto em Ac0H/H20, agitam-se, filtram-se e aplicam-se em uma coluna Vydac 218TP5010 (10x250 mm) que contem gele de sílica C8. A coluna é eluída com o sistema de solventes descrito antes de um modo gradiente linear (por exemplo, 30 a 55% de B em 120 minutos); velocidade do fluxo 2 ml/minuto. Monitoriza--se o eluente a 220 nm, e examinam-se as fracções por HPLC analítica. Reúnem-se as fracções com pureza superior a 95% e liofilizam-se para se obterem 9,6 mg do produto puro. A HPLC analítica realiza-se utilizando a coluna Vydac C18 de fase reversa descrita antes e uma eluição isocrática com o sistema de solventes descrito antes com uma velocidade de fluxo de 0,2 ml/min. Monitorizam-se os picos a 220 e 280 nm. Por HPLC analítica avalia-se essencialmente a pureza do produto (>95%). A massa molecular verifica-se por espectrometria de massa por electroatomização, e confirma-se a aguardada composição em aminoácidos por análise desses aminoácidos. 31 O Péptido 2, e os Péptidos 4 a 30 sintetizam-se do mesmo modo que o Péptido 1 e o Péptido 3, exceptuando o facto desses péptidos conterem também outras substituições, para se obterem: [IndAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Arg9, Har29] hGH-RH (1-2 9) NH2 Péptido 2 Abu15, Nle27, D-Arg28, [ PhAc°, D-Arg2, Phe(pCI)6, Har9, Har29] hGH-RH (1-2 9} NH2 Péptido 4 Abu15, Nle27, D-Arg28, [Nac°, D-Arg2, Phe(pCl)6, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28,

Har29] hGH-RH (1-2 9) NH2 Péptido 5 [PhAc°, D-Arg2, Phe(pCl)6, Arg9, Tyr(Me)10, Abu15, Nle27, D- -Arg28, Har29] hGH-RH (1-29) NH2 Péptido 6 [PhAc°, His1, D-Arg2, Phe(pCl)6, - Arg9, r AbU15 , Nle27 , D-Arg28, Har29] hGH-RH (1- 2 9)NH2 Péptido 7 [Nac°, His1, D-Arg2, Phe (pCl) °, Arg9, Abu15, , Nle2' , D-Arg28, Har29] hGH-RH (1- 2 9)NH2 Péptido 8 [PhAc°, D-Arg2, Phe(pCl)6, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg29 ]hGH-RH(1- -29)NH2 Péptido 9 [ PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Abu15, -n 16 Arg , Nle27, D-Arg29 ] hGH- -RH (1-29)NH2 Péptido 10 [ PhAc3, D-Arg2, Phe(pCl)6, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29 ] hGH- -RH(1-29)NH2 Péptido 11 [PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Nle9, Abu15, Nle27, D-Arg29; ]hGH-RH(1- -29)NH2 Péptido 12 [PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Nle13, Nle14, Abu15, Nle27, D- -Arg29] hGH-RH (1 -29)NH2 Péptido 13 [PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Nle15, Nle27, D-Arg29] hGH-RH (1-2 9) NH2 Péptido 14 [PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Abu15, Nle18, Nle27, D-Arg29 ] hGH- -RH(1-29}NH2 Péptido 15

Nle27, D-Arg29]hGH- [PhAc°, D-Arg2, Phe(pCl)6, Tyr(Me)10, Abu15, -RH(1-29)NH2 Péptido 16 32 [PhAc0, D-Arg2, Phe (pCl) 6, Abu8, Tyr (Me) 10, Abu15, Nle2', D--Arg29] hGH-RH (1-29) NH2 Péptido 17 [PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, D-Abu8, Tyr (Me)10, Abu15, Nle27, D--Arg29] hGH-RH (1-2 9) NH2 Péptido 18 [PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Tyr (Me)10, Abu15, D-Arg27, D-Arg28, D-Arg29] hGH-RH (1-29) NH2 Péptido 19 [PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Tyr (Me)9, Abu15, D-Arg27, Arg28, D--Arg29] hGH-RH (1-29) NH2 Péptido 20 [PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Abu15, D-Arg -RH(1-29)NH2 Péptido 21 27, Arg28 , D-Arg29 ] hGH- [PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Abu8, Tyr (Me)10, Arg28, D-Arg29] hGH-RH (1-29) NH2 Péptido 22 Abu15, D-Arg27, [PhAc0, D-Arg2, Phe(pCi)6, D-Abu8, Tyr (Me)10, Arg28, D-Arg29] hGH-RH (1-29) NH2 Péptido 23 Abu15, D-Arg27, [PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Lys9, Har29] hGH-RH (1-29) NH2 Péptido 24 Abu15, Nle27, D-Arg28, [PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Orn9, Har29] hGH-RH (1-29) NH2 Péptido 25 Abu15, Nle27, D-Arg28, [PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, D-Arg9, Har29] hGH-RH (1-29) NH2 Péptido 26 Abu15, Nle27, D-Arg28, [PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, D-Har9, Har29] hGH-RH (1-2 9) NH2 Péptido 27 Abu15, Nle27, D-Arg28, [PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, D-Lys9, Har29] hGH-RH (1-29) NH2 Péptido 28 Abu15, Nle27, D-Arg28, [PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, D-Orn9, Har29] hGH-RH (1-29) NH2 Péptido 2 9 Abu15, Nle27, D-Arg28, [PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Cit9, Har29] hGH-RH (1-29) NH2 Péptido 30 Abu15, Nle27, D-Arg28, 33

ΕΧΕΜΡΙ.Ο III

Actividade Biológica

Testaram-se os péptidos da presente invenção em ensaios in vítro e in vivo quanto à sua capacidade para inibir a libertação da GH induzida pelos hGH-RH(1-29)NH2.

Sistema Pituitário de Camundongo Superfundido

Os análogos testaram-se in vítro utilizando um ensaio descrito anteriormente (S. Vigh e A.V. Schally, Peptides 5:241-347, 1984) com modificação (Z. Rekasi e A.V. Schally, P.N.A.S. 90:2146-2149, 1993).

Rapidamente, pré-incubam-se as células com os péptidos durante 9 minutos (3 ml) em diversas concentrações.

Imediatamente após a incubação, administra-se, durante 3 minutos, 1 ml dos hGH-RH (1-29) NH2 a 1 nM [resposta no minuto 0]. Para controlar a duração do efeito antagonista do análogo, utilizam-se os hGH-RH(1-29)NH? a lnM 30, 60, 90, e 120 minutos mais tarde durante 3 minutos [respostas nos minutos 30, 60, 90, 120]. Avaliam-se os valores integrais líquidos das respostas da GH. As respostas da GH são comparadas e expressam-se sob a forma de percentagem da resposta original da GH induzida pelos GH-RH(1-29)NH2 a 1 nM. Comparam-se os efeitos dos novos antagonistas ao do [Ac--Tyr1, D-Arg2] hGH-RH (1-29) NH2, o "Antagonista padrão" .

Radioimunodoseamento da Hormona do Crescimento

Em alíquotas de amostras da superfusão não diluídas e diluídas avaliaram-se os níveis da GH em camundongos por radioimunodoseamento (RIA) de anticorpos duplos utilizando materiais fornecidos pelo National Hormone e Pituitary Program, Baltimore, Maryland. Com um programa para computador desenvolvido no nosso instituto e incorporado na presente invenção a título de referência, analisaram-se os resultados 34 do RIA (V. Csernus e A.V. Schally, em Neuroendocrine Research Methods, Harwood Academic Greenstein, B.D. ed., Londres, pág. 71-109, 1991). A variação inter-doseamentos foi inferior a 15% e a variação intra-doseamentos foi inferior a 10%.

Doseamento da Ligação à GH-RH. Para determinar as características da ligação dos antagonistas da GH-RH desenvolveu-se um doseamento das ligações susceptiveis ao rádio-receptor (G. Halmos, A.V. Schally e tal., Receptor 3, 87-97, 1993), incorporado na presente invenção a titulo de referência. O doseamento baseia-se na ligação dos [His±, Nle27] hGH-RH (1-32) NH2 marcados a homogeneizados de membranas de pituitária anterior de camundongos. Os derivados iodados dos [His1, Nle27] hGH-RH (1-32) NH2 preparam-se pelo método da cloramina-T (F.C. Greenwood et al., Biochemistry 89:114-123, 1963), incorporado na presente invenção a título de referência. Para preparar membranas não tratadas utilizam-se pituitárias de camundongos Sprague-Dawley machos (250-300 g) Para análises de ligação por saturação, incubam-se homogeneizados de membranas com pelo menos 6 vezes a concentração da potência dos [His1, 125I-Tyr10, Nle27] hGH-RH (1--32)NH2, variando entre 0,005 e 0,35 nM na presença ou ausência de péptidos não marcados em excesso (1 μΜ).

Utilizando um contador de partículas γ determina-se a radioactividade do pequeno aglomerado esférico ("pellet"). As afinidades dos péptidos antagonistas ensaiados contra receptores de GH-RH da pituitária de camundongo determinam-se em experiências de ligação concorrentes. As afinidades de ligação finais calculam-se pela K± (constante de dissociação do complexo inibidor-receptor) e determinam-se pelos programas de computador Ligand PC e McPherson de Munson e Rodbard (P.J. Munson e D. Rodbard, Anal. Biochem. 107, 220- 35 -239, 1980). As afinidades relativas comparadas com as do [Ac-Tyr1, D-Arg2] hGH-RH (1-29) NH2, o antagonista padrão, calculam-se sob a forma de taxa de Ki do antagonista da GH-RH ensaiado relativamente à Ki do antagonista Padrão.

Testes in vivo 0 efeito antagonista da GH-RH dos análogos testou-se em jovens camundongos Sprague-Dawley machos (200-250 g). Em cada experiência utilizaram-se 5 grupos de 7 animais. Os compostos (80 pg/Kg) e os GH-RH(1-29)NH2 (3 pg/Kg) dissolveram-se em manitol a 5,5% e administraram-se endovenosamente na veia jugular dos camundongos sob anestesia com Nembutal. De acordo com o plano que se segue, entre os grupos variou o tempo decorrido entre a administração do antagonista e a da GH-RH. Ao primeiro grupo de animais administrou-se uma injecção de GH-RH 5 minutos após a administração do antagonista; aos segundo, terceiro e quarto grupos de animais, o intervalo de tempo decorrido entre a injecção do antagonista e a da GH-RH foi 15, 30, e 60 minutos, respectivamente. No grupo de controlo injectou-se primeiro o solvente individualmente em vez do antagonista, seguindo-se a injecção da GH-RH 5 minutos mais tarde.

Recolheram-se amostras de sangue de 0,4 ml para RIA da GH antes da administração do antagonista ("sangue 0"), e 5 minutos após a injecção de GH-RH ("sangue 1"). Em cada grupo calculou-se a resposta da GH como rGH= (GHsanguei/GHsangueo) , média ± S.E.M. das diferenças individuais. A inibição relativa da resposta da GH (%) em cada grupo tratado calculou-se pela expressão 10Ox (rGHtratado-1) / (rGHCOntroio-1) - 36

Resultados in vitro

No Quadro II e no Quadro III, respectívamente, estão resumidos os resultados das actividades antagonistas in vitro testadas em um sistema pituitário de camundongo superfundido e do ensaio de ligação. Como se pode observar a partir desses dados, as substituições presentes nas moléculas originam um enorme aumento na ligação ao receptor bem como na inibição da libertação da GH in vitro quando se compara com o antagonista padrão. 0 mais potente antagonista in vitro, o Péptido 1, originou a inibição total da libertação da GH induzida pela GH-RH em 90 minutos, nas condições padrão do ensaio. O primeiro sinal do restabelecimento da capacidade de resposta da GH-RH detectou-se 120 minutos após a exposição a esse análogo.

QUADRO II

Inibição da Libertação da GH em um Sistema Pituitário de Camundongo Superfundido

Antagonista Dose Inibição da libertação da GH (%) (nM) 0 30 60 90 120 minutos minutos minutos minutos minutos Antagonista 100 62,1 2,5 19 padrão: Péptido 1 30 100 100 100 100 94 Péptido 2 30 100 100 100 100 91 Péptido 3 30 85 98 91 92 87 Péptido 4 30 83 86 80 79 68 Péptido 5 30 79 77 59 58 50 Péptido 6 30 93 93 97 95 90 Péptido 7 30 97 92 82 77 65 Péptido 8 30 100 100 98 97 90 Péptido 9 30 91 87 79 72 59 Péptido 10 30 75 69 46 24 22 Péptido 11 30 96 89 80 56 42 Péptido 12 30 68 75 48 52 52 Péptido 16 30 65 87 83 56 65 Péptido 19 30 58 47 59 23 39 37

QUADRO III

Valores de Ki e Afinidades Relativas (R.A.) dos Antagonistas da hGH-RH Péptido Ki (nM) R.A. Padrão 2,94 1 Péptido 1 0,044 67 Péptido 2 0, 046 64 Péptido 3 0,068 43 Péptido 4 0,087 34 Péptido 5 0,036 82 Péptido 9 0,058 51 Péptido 10 0, 107 27 Péptido 11 0,071 41 Péptido 12 0,070 42 Péptido 16 0,070 42

Resultados ín vivo 0 Quadro IV mostra as respostas da GH sérica e as suas inibições relativas em camundongos pré-tratados com antagonistas da GH-RH. Todos os análogos testados (Péptido 1, Péptido 2, Péptido 3, Péptido 4, Péptido 8, Péptido 9, Péptido 11 e Péptido 16) produzem uma inibição forte e de duração prolongada da libertação da GH estimulada pelos hGH--RH(1-29)NH2. Os Péptido 1 e Péptido 2 são os imediatamente mais potentes, inibindo a resposta da GH em 95% e 91%, quando administrados 5 minutos antes dos hGH-RH(1-29)NH2. O efeito desses dois péptidos dura pelo menos 30 minutos. Por outro lado, o Péptido Íleo Péptido 3, que são ligeiramente menos potentes no imediato, apresentam uma extrema longa acção: os seus efeitos persistem durante pelo menos 60 minutos. 38

QUADRO IV

Respostas da GH Sérica e Inibições Relativas das Respostas da GH em Camundongos Pré-tratados com Antagonistas da GH-RH a Diferentes Intervalos de Tempo Antes da Administração dos hGH-RH(1-29)NH2

Antagonista Intervalo de tempo (minutos) Resposta média ± da GH S.E.M. Inibição relativa! Péptido 1 5 1,13 ± o, 13 95 15 t-1 co ± o, 13 68 30 1, 97 ± 0, 16 64 60 3,89 ± 0, 65 -8 controlo 3,68 ± 0, 78 0 Péptido 2 5 1,40 ± 0,29 91 15 3,45 ± 0,13 45 30 3,64 ± 0,71 41 60 5,41 ± 1,35 2 controlo 5, 47 ± 0, 97 0 Péptido 3 5 3,01 ± 0,41 68 15 3,63 ± 0,80 61 30 4,89 ± 0,95 41 60 5,36 ± 0,63 34 controlo 7,65 ± 0,66 0 Péptido 4 5 15 30 60 controlo 3,08 ± 0,58 7,73 ± 1,12 12,00 ± 2,54 11,88 ± 0,90 12,82 ± 1,38 82 43 7 8 0 Péptido 8 5 2,3 ± 0,3 74 15 3,6 ± 0,4 46 30 5,5 ± 0,6 8 60 5,8 ± 0,7 1 controlo 5,8 ± 0,5 0 39 Péptido 9 5 2,75 ± 0,75 75 15 3,85 ± 0,50 59 30 3,34 ± 0,30 67 60 7,32 ± 1,16 10 Péptido 11 5 15 30 60 controlo 5,15 13, 64 16, 04 16, 61 26,17 ± ± ± ± ± 1,11 1,41 4,36 6, 02 3,92 84 50 40 38 0 Péptido 16 5 2,89 ± 0,65 77 15 3,44 ± 0,62 70 30 5,24 ± 1,36 48 60 9, 19 ± 1,89 0 controlo 9, 13 ± 1,69 0

EXEMPLO IV

Testes oncológicos

As actividades antitumorais dos péptidos de acordo com a presente invenção testaram-se em diversos modelos de cancro. Compararam-se os efeitos antitumorais desses novos péptidos com os de análogos anteriores (MZ-4-71 e MZ-5-156 objecto da Patente de invenção norte-americana N° 5 550 212 e do Pedido de Patente de invenção norte-americano 08/642 472).

Efeito dos antagonistas da GH-RH sobre tumores mamários MXT de murganhos

Por via subcutânea implantaram-se em camundongos BDF fêmeas, tumores MXT independentes de estrogénios. Um dia após o transplante, dividiram-se os camundongos em grupos de 10 animais cada, e iniciou-se o tratamento. Aos camundongos dos grupos 1, 2, 3, e 4 administraram-se injecções individuais diárias de diversos antagonistas da GH-RH por via subcutânea em doses diárias de 20 pg durante 18 dias. Aos grupos 5 e 6, administraram-se os péptidos através de bombas osmóticas 40

Alzet libertando uma quantidade diária de 20 μα de péptido. Avaliaram-se os tumores regularmente, e calculou-se o volume tumoral. Sacrificaram-se os camundongos no dia 18 e avaliaram-se os pesos dos tumores.

Resultados

Os Péptido 1 e Péptido 3 exibiram um forte e similar efeito inibidor sobre cancros mamários MXT de camundongos. 0 tratamento com MZ-5-156 originou também a inibição significativa do crescimento tumoral, mas o seu efeito foi mais fraco do que o do Péptido 1 ou do Péptido 3 (ver Quadro V e Figura I).

QUADRO V

Efeito do Tratamento com Antagonistas da GH-RH sobre Tumores Mamários MXT de Camundongos

Grupo Volume dos tumores (mm3) Pesos dos tumores Número de No dia 14 No dia 18 (mg) C amundongos s obreviventes 1.Controlo 405111007 70401646 72691292 5 2.MZ-5-156 27171773 53681408* 48851480* 4 3.Péptido 1 inj. diária 29241654 43731381** 69641676 6 4.Péptido 3 inj. diária 19021349** 34651607** 52661906 8 5.Péptido 1 bomba 13291327** 34031584** 48101645* 7 6.Péptido 3 bomba 16881220** 42721295** 59391453 8 *p<0,05 **p<0,01

Efeito dos antagonistas da GH-RH sobre xenoenxertos de cancro mamário humano MDA-MB-468 em camundongos nus

Camundongos nus, portadores de xenoenxertos de cancros mamários humanos MDA-MB-468 independentes de hormonas, dividiram-se em grupos de 10 animais cada. Aos grupos tratados administraram-se injecções individuais diárias, por via subcutânea, de 20 pg de antagonistas da GH-RH. Para 41 comparação tratou-se um grupo com o Péptido 1, e tratou-se um segundo grupo com MZ-5-156. O grupo controlo injectou-se com solvente como veículo. 0 tratamento continuou durante 5 semanas. Avaliaram-se os tumores uma vez por semana e calculou-se o volume tumoral. Sacrificaram-se os camundongos no final da experiência e avaliaram-se os pesos dos tumores.

Resultados

Ambos os péptidos exerceram significativos efeitos de inibidores tumorais sobre os xenoenxertos dos cancros MDA-MB--468. No grupo injectado com o Péptido 1, 4 tumores exibiram regressão constante durante a experiência. Da mesma forma, o MZ-5-156 originou a regressão de 3 tumores. Após 5 semanas de tratamento esses cancros retornaram a pequenos vestígios de tecido semelhantes a escaras. A observação histológica desses tecidos revelou tumores epiteliais não diferenciados com considerável necrose e apenas uma estreita linha marginal de tecido tumoral vivo. Em contraste, nos animais de controlo todos os tumores progrediram uniformemente. Nos grupos tratados, o volume e o peso finais dos tumores apresentaram--se significativamente reduzidos (ver Quadro VI e Figura II), exibindo o Péptido 1 um efeito mais forte.

QUADRO VI

Efeito do Tratamento com Antagonistas da GH-RH sobre Xenoenxertos de Cancro da Mama Humano MDA-MB-468 em Camundongos Nus

Grupo Volume final do tumor (mm3) Peso do tumor (mg) N° de tumores que regrediram Controlo 477,5 ± 41,2 440,7 ± 37,7 0 Péptido 1 82,4 ± 29,1** 64,0 ± 28,7** 4 MZ-5-156 104,4 ± 32,2** 77,7 ± 31,7** 3 *p<0,05 **p<0,01 42

Efeito de antagonistas da GH-RH sobre xenoenxertos de cancro de cólon humano HT-29 em camundongos nus

Transplantaram-se cancros de cólon humanos HT-29 por via subcutânea em camundongos machos nus. Dezanove dias depois do transplante, dividiram-se os camundongos em grupos de 10 animais cada, e iniciou-se o tratamento. Aos camundongos administraram-se diariamente por via subcutânea injecções individuais de diversos antagonistas da GH-RH na dose de 20 pg por dia durante 6 semanas. Avaliaram-se os tumores regularmente, e calculou-se o volume tumoral. Sacrificaram-se os camundongos no final da experiência e determinaram-se os pesos dos tumores.

Resultados

Os péptidos Péptido 1 e MZ-5-156 apresentaram efeito inibidor igualmente forte sobre os cancros de cólon humanos HT-29. O tratamento com o Péptido 9 originou inibição menor mas ainda significativa do crescimento tumoral. Os Péptido 11 e MZ-4-71 exibiram apenas um pequeno efeito não significativo. (Os resultados estão resumidos no Quadro VII e na Figura III).

QUADRO VII

Efeito do Tratamento com Antagonistas da GH-RH sobre

Xenoenxertos de Cancro de Cólon Humano HT-29 em Camundongos Nus

Grupo Volume final do tumor (mm3) Peso do tumor (mg) Controlo 2117 ± 751 2364 ± 835 MZ-4-71 1953 ± 400 2189 ± 458 Mz-5-156 908 ± 195* 1012 ± 174* Péptido 11 1663 ± 610 1849 ± 681 Péptido 9 1194 ± 506* 1383 ± 576* Péptido 1 890 ± 322* 1354 ± 480* *p<0,05 43

Efeito do Péptido 1 antagonista da GH-RH sobre xenoenxertos de glioblastomas humanos U87MG em camundongos nus

Em camundongos implantaram-se por via subcutânea glioblastomas U87MG e quando os tumores atingiram o volume aproximado de 70 mm3 distribuíram-se os camundongos ao acaso por 2 grupos experimentais. Tratou-se um grupo com o Péptido 1 em injecções individuais diárias por via subcutânea de 20 pg durante 28 dias, ao mesmo tempo que o outro grupo serviu de controlo.

Resultados

Decorridas 4 semanas de tratamento, o Péptido 1 inibiu o crescimento tumoral em 77% face ao grupo de controlo, (ver Quadro VIII e Figura IV).

QUADRO VIII

Efeito do Tratamento com o Péptido 1 Antagonista da GH-RH sobre Xenoenxertos de Glioblastoma Humano U87MG

Grupo Volume final do tumor (mm3) Peso do tumor (mg) Controlo 3425 ± 723 4,7 ± 1,3 Péptido 1 817 ± 323** 1,4 ± 0,7** **p<0,01

Efeito de antagonistas da GH-RH sobre xenoenxertos de cancro da próstata humano PC-3 em camundongos nus

Em ambos os flancos de camundongos machos nus implantaram-se por via subcutânea fragmentos de 3 mm3 de tecido de cancro da próstata humano e independente de hormonas, PC-3. Quando os tumores atingiram o volume aproximado de 40-50 mm3 dividiram-se os camundongos por 3 grupos experimentais. Trataram-se o primeiro e o segundo grupos com os péptidos Péptido 3 e MZ-5-156, respectivamente, em injecções individuais diárias subcutâneas de 20 pg durante 44 21 dias, ao mesmo tempo que o terceiro grupo serviu de controlo. Os volumes tumorais avaliaram-se a intervalos semanais, os pesos tumorais avaliaram-se no fim da experiência.

Resultados

Os dois antagonistas da GH-RH inibiram o crescimento dos tumores PC-3 (ver Quadro IX e Figura V) . O Péptido 3 exerceu sobre o crescimento uma inibição mais forte (inibição de 65% sobre o volume tumoral e de 62% sobre o peso tumoral) do que o MZ-5-156 (52% e 46%, respectivamente).

QUADRO IX

Efeito do Tratamento com Antagonistas da GH-RH sobre Xenoenxertos de Cancro da Próstata Humano PC-3 em Camundongos Nus

Grupo Volume final do tumor (mm3) Peso do tumor (mg) Controlo 307,9 ± 64,5 191,8 ± 42,6 Péptido 3 107,9 + 12,5* 73,7 ± 11,9* Mz-5-156 148,9 ± 41 104,3 ± 27,2 *p<0,05

Lisboa, 27 de Setembro de 2006

Claims (12)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Péptido escolhido de entre o grupo de fórmula: X-R1-R2-Asp-Ala-R5-R6-Thr-R8-R9-R10-Arg-R12-R13-R14-R15-R16-Leu- -R18-R19-Arg-R21-R22-Leu~Gln-Asp-Ile~R27-R28-R29-NH2 na qual X representa PhAc, IndAc, Ibu, Nac, 1- ou 2-Npr ou Fpr, R1 representa Tyr ou His, R2 representa D-Arg ou D-Cit, R5 representa Ile ou Vai, R6 representa Phe, Nal ou Phe(Y), em que Y representa um átomo de F, Cl ou Br, R8 representa Asn, Gin, Ser, Thr, Ala, D-Asn, D-Gln, D-Ser, D-Thr, Abu, D-Abu ou Aib, R9 representa Arg, Har, Lys, Orn, D-Arg, D-Har, D-Lys, D-Orn, Cit, R10 representa Tyr ou Phe(Y), em que Y representa um átomo de H, F, Cl, ou Br ou um grupo OCH3, ,12 representa Lys, D-Lys, ou Orn, R13 representa Vai ou Nle, R14 representa Leu ou Nle, R15 representa Gly, Ala, Abu, Nle ou Gin, R16 representa Gin ou Arg, 1 8 R representa Ser ou Nle, R19 representa Ala ou Abu, R21 representa Lys ou Orn, R22 representa Leu, Ala ou Aib, R27 representa Met, Leu, Nle, Abu, ou D-Arg, po R representa Arg ou D-Arg, 9 q R representa Arg, D-Arg, Har ou D-Har, e os seus sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico. 9 opxqdaa \zbj^ -0 '^©TN 'ç^qv '0ΐ (3W) JAj; '66jy % (l3d)aiM 'j6j^-a 'o0"™3 PXnuuçj ap ' * x opóeoxpuTAxsa p moo opzrooB ®P °qs°dui03 9 ε opxqdoa 2HN(62-X)HH"HOTt6zj:BH 'ez-6·1^ -a \z^m %Tnqv 'οτ (ΘΗ) jAj, '6jbh % (TOd) 9¾ 'z6jcY-a ρχηιιιχοχ ap ' · x opòPoxpuxAxaj p moo opaoop &P °9s°duio3 S Z opxqdaq eHN(62 I)HH HDP Í6z^^E 'az£>JY-a \zzm ρχηιιαρχ ap '·χ JSTnqv '66JV % (TDd) aqd 'zÊJ¥_a ^°^11 oeÒBoipuiAiaj p moo opxooP ®P °9s°duio3 ρ I opxqdad ZHN{6£-X)HH-H9q[6^H %zÉ>^¥-a 'tz©TN '6^¥ '9{X3d)aqd 'ζβα¥~σ #03V^d] ρχηιιιχοχ ap '*χ opdPOxpuxAxax p moo opxooP SP °9s°duio3 £ 8 opxxdaa εΗΝ(6Ζ-Ι)ΗΗ-Η9ΐί[6^Η \ZÍ)JY-Q ^,ΘΧΝ ' 'ÇInq¥ '6àJY /9(T3d)aqd · zbJY"Q 'tSTH 'oDBN] L opxqdad zHN(6Z"3;)HH"H9lí f6zjeH \zbjv-a 'iS9™ ' ÇTnq¥ '65x¥ %(X3d)aqd '^Y"0 'xSTH '0°™] 9 opxqdad zHN(62_T) m^nOPÍ6Z^U '8ZÊJ^- -a \zzm %Tnq¥ \x(BH)z&I> % (X3d) aqd 'ζβ^¥_α 'o0¥qd] £ opxqdaa zHN (63-1) ΗΗ'ΗΟ1! t63^H \zbj^~ -α ',ζθιν %Tnq¥ '0ΐ (aW) jAi '63?η 'g (IDd) aqd 'ζβα¥~α VWd] Z opxqdaa ZHNÍ6Z-l)HH-H9q[6^^H '826jY-a \z^m 'STnq¥ '65xy '9(T3d)aqa ‘ Zb^-Q ^ovpui] I oPXqdaa 2HN (63-1) ΗΗ-Η3¥ [6ZjeH %z6J¥-Q \z^U %xncW \^Y %(X3d)aqd ‘ Z^-Q. xod opxnqxqsuoo odnχβ 0 ajqua ap opxqxoosa '·χ opòpoxpuxAxax p moo opjooe ap oqsodurco z Z 3

7. Composto de acordo com a reivindicação 1., de fórmula [PhAc0, His1, D-Arg2, Phe(pCl)6, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29] hGH-RH (1-29) NH2 Péptido 7

8. Composto de acordo com a reivindicação 1., de fórmula [Nac°, His1, D-Arg2, Phe(pCl)6, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29] hGH-RH (1-29) NH2 Péptido 8

9. Utilização de um polípéptido escolhido de entre o grupo de fórmula: X-R1-R2-Asp-Ala-R5-R6-Thr-R8-R9-R10-Arg-R12-R13-R14-R15-R16-Leu- -R18-R19-Arg-R21-R22-Leu-Gln-Asp-Ile-R27-R28-R29-NH2 na qual X representa PhAc, IndAc, Ibu, Nac, 1- ou 2-Npr ou Fpr, R1 representa Tyr ou His, R2 representa D-Arg ou D-Cit, R5 representa Ile ou Vai, R6 representa Phe, Nal ou Phe(Y), em que Y representa um átomo de F, Cl ou Br, R representa Asn, Gin, Ser, Thr, Ala, D-Asn, D-Gln, D-Ser, D-Thr, Abu, D-Abu ou Aib, R' representa Arg, Har, Lys, Orn, D-Arg, D-Har, D-Lys, D-Orn, Cit, R10 representa Tyr ou Phe(Y), em que Y representa um átomo de H, F, Cl, ou Br ou um grupo OCH3, R12 representa Lys, D-Lys, ou Orn, Rx3 representa Vai ou Nle, Rx4 representa Leu ou Nle, R15 representa Gly, Ala, Abu, Nle ou Gin, R16 representa Gin ou Arg, R18 representa Ser ou Nle, R19 representa Ala ou Abu, R21 representa Lys ou Orn, 4 R22 representa Leu, Ala ou Aib, R‘7 representa Met, Leu, Nle, Abu, ou D-Arg, R28 representa Arg ou D-Arg, R29 representa Arg, D-Arg, Har ou D-Har, e dos seus sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico, para a preparação de um medicamento para a supressão dos níveis excessivos da GH.

10. Utilização de um polipéptido escolhido de entre o grupo de fórmula: X-R1-R2-Asp-Ala-R5-R6-Thr-R8-R9-R10-Arg-R12-R13-R14-R15-R16-Leu- _Ri8_Ri9_Arg-R21-R22_Leu-Gln-Asp-Ile-R27-R28-R29-NH2 na qual X representa PhAc, IndAc, Ibu, Nac, 1- ou 2-Npr ou Fpr, R1 representa Tyr ou His, R2 representa D-Arg ou D-Cit, R5 representa Ile ou Vai, R6 representa Phe, Nal ou Phe(Y), em que Y representa um átomo de F, Cl ou Br, R8 representa Asn, Gin, Ser, Thr, Ala, D-Asn, D-Gln, D-Ser, D-Thr, Abu, D-Abu ou Aib, R9 representa Arg, Har, Lys, Orn, D-Arg, D-Har, D-Lys, D-Orn, Cit, R10 representa Tyr ou Phe(Y), em que Y representa um átomo de H, F, Cl, ou Br ou um grupo OCH3, R12 representa Lys, D-Lys, ou Orn, R13 representa Vai ou Nle, R14 representa Leu ou Nle, R15 representa Gly, Ala, Abu, Nle ou Gin, R16 representa Gin ou Arg, io R representa Ser ou Nle, R19 representa Ala ou Abu, R21 representa Lys ou Orn, 5 R22 representa Leu, Ala ou Aibr R27 representa Met, Leu, Nle, Abu, ou D-Arg, R representa Arg ou D-Arg, 90 R J representa Arg, D-Arg, Har ou D-Har, e dos seus sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico, para a preparação de um medicamento para o tratamento de cancros portadores de receptores do IGF-I ou do -II.

11. Utilização de um polipéptido escolhido de entre o grupo de fórmula: X-R1-R2-Asp-Ala-R5-R6-Thr-R8-R9-R10-Arg-R12-R13-R14-R15-R16-Leu- -R18-R19-Arg-R21-R22-Leu-Gln-Asp-Ile-RZ7-R28-R29-NH2 na qual X representa PhAc, IndAc, Ibu, Nac, 1- ou 2-Npr ou Fpr, R1 representa Tyr ou His, R2 representa D-Arg ou D-Cit, R5 representa Ile ou Vai, R6 representa Phe, Nal ou Phe(Y), em que Y representa um átomo de F, Cl ou Br, R8 representa Asn, Gin, Ser, Thr, Ala, D-Asn, D-Gln, D-Ser, D-Thr, Abu, D-Abu ou Aib, R9 representa Arg, Har, Lys, Orn, D-Arg, D-Har, D-Lys, D-Orn, Cit, R10 representa Tyr ou Phe(Y), em que Y representa um átomo de H, F, Cl, ou Br ou um grupo OCH3, R12 representa Lys, D-Lys, ou Orn, Ri3 representa Vai ou Nle, R14 representa Leu ou Nle, R15 representa Gly, Ala, Abu, Nle ou Gin, R16 representa Gin ou Arg, Rls representa Ser ou Nle, R19 representa Ala ou Abu, R21 representa Lys ou Orn, 6 R^" representa Leu, Ala ou Aib, R27 representa Met, Leu, Nle, Abu, ou D-Arg, R28 representa Arg ou D-Arg, R representa Arg, D-Arg, Har ou D-Har, e dos seus sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico, para a preparação de um medicamento para a inibição dos níveis do IGF-II em tumores (cancros) e da expressão de mARN pelo IGF-II nos mesmos tumores

12. Uso de acordo com a reivindicação 9., que consiste na utilização de um composto de fórmula [PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29] hGH-RH (1-29) NH2 Péptido 1

13. Uso de acordo com a reivindicação 9., que consiste na utilização de um composto de fórmula [PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Har9, Tyr(Me)10, Abu15, Nle27, D--Arg28, Har29] hGH-RH (1-29) NH2 Péptido 3

14. Uso de acordo com a reivindicação 10., que consiste na utilização de um composto de fórmula [PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29] hGH-RH (1-2 9) NH2 Péptido 1

15. Uso de acordo com a reivindicação 10., que consiste na utilização de um composto de fórmula [PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Har9, Tyr(Me)10, Abu15, Nle27, D--Arg28, Har29] hGH-RH (1-29) NH2 Péptido 3

16. Uso de acordo com a reivindicação 11., que consiste na utilização de um composto de fórmula [PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29] hGH-RH (1-2 9 )NH2 Péptido 1 7

17. U so de acordo com a reivindicação 11. , que consiste na utilização de um composto de fórmula [ PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Bar9, Tyr(Me)10, Abu15, Nle27, D--Arg28, Bar29] hGH-RH (1-29) NB2 Péptido 3 Lisboa, 27 de Setembro de 2006