ES2264279T3 - Analogos antagonistas de gh-rh que inhiben igf-i e igf-ii. - Google Patents
Analogos antagonistas de gh-rh que inhiben igf-i e igf-ii.Info
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Abstract
Péptido seleccionado del grupo que tiene la fórmula: X-R1-R2-Asp-Ala-R5-R6-Thr-R8-R9-R10-Arg-R12-R13-R14-R15-R16- Leu-R18-R19-Arg-R21-R22-Leu-Gln-Asp-Ile-R27-R28-R29-NH2 en la que X es PhAc, IndAc, lbu, Nac, 1- o 2-Npr, o Fpr, R1 es Tyr o His, R2 es D-Arg o D-Cit, R5 es Ile o Val, R6 es Phe, Nal o Phe(Y), en el que Y = F, Cl, Br, R8 es Asn, Gln, Ser, Thr, Ala, D-Asn, D-Gln, D-Ser, D-Thr, Abu, D-Abu, o Aib, R9 es Arg, Har, Lys, Orn, D-Arg, D-Har, D-Lys, D-Orn o Cit, R10 es Tyr o Phe(Y), en el que Y = H, F, Cl, Br, o OCH3, R12 es Lys, D-Lys, u Orn, R13 es Val o Nle, R14 es Leu o Nle, R15 es Gly, Ala, Abu, Nle o Gln, R16 es Gln o Arg, R18 es Ser o Nle, R19 es Ala o Abu, R21 es Lys u Orn, R22 es Leu, Ala o Aib, R27 es Met, Leu, Nle, Abu, o D-Arg, R28 es Arg o D-Arg, R29 es Arg, D-Arg, Har o D-Har, y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.
Description
Análogos antagonistas de GH-RH
que inhiben IGF-I e IGF-II.
Esta invención se realizó en parte con el apoyo
del Gobierno desde el Servicio de Investigación Médica del
departamento de asuntos de los veteranos (Veterans Affaire
Department). El Gobierno tiene ciertos derechos en esta
solicitud.
La presente invención se refiere a péptidos
sintéticos novedosos que inhiben la liberación de la hormona del
crecimiento desde la hipófisis en mamíferos, y a composiciones
terapéuticas que contienen estos péptidos novedosos.
La hormona del crecimiento ("GH") es un
péptido que tiene 191 aminoácidos que estimula la producción de
numerosos y diversos factores de crecimiento, por ejemplo factor de
crecimiento similar a la insulina (IGF-I) y
promueve así el crecimiento de numerosos tejidos (esqueleto, tejido
conjuntivo, músculos y vísceras) y actividades fisiológicas
(aumento de la síntesis de proteínas y ácido nucleico y la
lipólisis, pero disminución de la secreción de urea).
La liberación de GH está bajo el control de
factores de liberación e inhibición secretados por el hipotálamo.
El principal factor de liberación es la hormona de liberación de la
hormona del crecimiento ("GH-RH"); la hormona
de liberación de la hormona de crecimiento humana
("hGH-RH") es un péptido que tiene 44
aminoácidos. Los péptidos novedosos de la presente invención se
refieren a análogos de hGH-RH que tienen únicamente
residuos del 1 al 29
("hGH-RH(1-29)NH_{2}"),
es decir, a análogos del péptido que tiene la secuencia de
aminoácidos:
\vskip1.000000\baselineskip
Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile^{5}-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr^{10}-Arg-Lys-Val-Leu-Gly^{15}-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg^{20}-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp^{25}-Ile-Met-Ser-Arg^{29}-NH_{2}
\vskip1.000000\baselineskip
Se ha implicado a la GH en diversas
enfermedades. Una enfermedad en la que la GH está implicada es la
acromegalia, en la que están presentes unos niveles excesivos de
GH. Los huesos faciales y de las extremidades aumentados de manera
anormal de esta enfermedad pueden tratarse mediante la
administración de un antagonista de GH-RH.
Otras enfermedades que implican a la GH son la
retinopatía diabética y la nefropatía diabéticas. La lesión de la
retina y los riñones, respectivamente, de estas enfermedades, que se
supone debida a la GH, da como resultado ceguera o reducción de la
función renal. Esta lesión puede evitarse o ralentizarse mediante la
administración de un antagonista de GH-RH
eficaz.
Sin embargo, las principales aplicaciones de los
antagonistas de GH-RH serían en el campo del cáncer
(A.V. Schally et al, en Growth Hormona Secretagogues in
Clinical Practice, eds. B.B. & Walter, R.F., Dekker, Nueva York
páginas 145-162, 1998). IGF-I y -II
son mitógenos potentes para diversos cánceres. Suprimiendo la
secreción de GH, los antagonistas de GH-RH
disminuyen la síntesis de IGF-I en el hígado y en
otros tejidos. Los antagonistas de GH-RH también
reducen la producción autocrina y paracrina de IGF-I
y/o IGF-II por parte de diversos tumores. En
diversos cánceres experimentales, el tratamiento con antagonistas de
GH-RH produce una reducción de IGF-I
y -II, concomitante a la inhibición del crecimiento tumoral.
En un esfuerzo por intervenir en estas
enfermedades y en otros estados, algunos investigadores han
intentado controlar los niveles de GH utilizando somatostatina, un
inhibidor de la liberación de GH. Sin embargo, la somatostatina, si
se administra sola, no suprime los niveles de GH o
IGF-I hasta el grado deseado. Si se administra en
combinación con un antagonista de GH-RH, la
somatostatina mejoraría mucho más la supresión de los niveles de
IGF-I.
Los científicos han investigado diversas
modificaciones de GH-RH para elucidar la relación de
la estructura de GH-RH con su actividad en un
esfuerzo por proporcionar congéneres sintéticos con propiedades
agonistas o antagónicas mejoradas. Por tanto, pronto se estableció
que un fragmento de GH-RH que comprende de los
residuos 1 a 19, o
GH-RH(1-29), es la secuencia
mínima necesaria para la actividad biológica. Este fragmento
mantiene el 50% o más de la potencia de GH-RH
natural.
Se encontró que el primer antagonista de
GH-RH descrito, [Ac-Tyr^{1},
D-Arg^{2}]hGH-RH(1-29)NH_{2},
que se denomina generalmente en la bibliografía como el
"antagonista estándar", evitaba la activación de la adenilato
ciclasa de la hipófisis anterior de la rata mediante
hGH-RH(1-29)NH_{2}.
El mismo péptido bloqueó la acción de GH-RH sobre
sus receptores en la hipófisis y el hipotálamo, e inhibió la
secreción pulsátil de la hormona del crecimiento.
Un número considerable de patentes y artículos
en la bibliografía pública describen análogos de
GH-RH que o bien actúan como agonistas de
GH-RH (es decir, actúan para estimular la liberación
de GH) o como antagonistas de GH-RH (es decir,
actúan para inhibir la liberación de GH). La mayoría de estos
péptidos derivan de la secuencia de péptido
GH-RH(1-29), con
modificaciones estructurales específicas que explican sus
propiedades agonistas o antagonistas.
Así, la patente de los EE.UU. nº 4.659.693
describe análogos agonistas de GH-RH que contienen
ciertos residuos
N,N'-dialquil-omega-guanidino
alfa-aminoacilo en posición 2 de la secuencia
GH-RH(1-29).
La solicitud publicada WO 91/16923 revisa
intentos iniciales para alterar la estructura secundaria de
hGH-RH mediante la modificación de su secuencia de
aminoácidos. Estos intentos iniciales incluyen: reemplazar
Tyr^{1}, Ala^{2}, Asp^{3} o Asn^{8} con sus
D-isómeros; reemplazar Asn^{8} con L- o
D-Ser, D-Arg, Asn, Thr, Gln o
D-Lys; reemplazar Ser^{9} con Ala para mejorar la
cualidad de amfifílica de la región; y reemplazar Gly^{15} con
Ala o Aib. Cuando R^{2} en los análogos es D-Arg,
y R^{8}, R^{9}, y R^{15} se sustituyen tal como se indica
anteriormente, se dice que se obtiene como resultado la actividad
antagonista. Se dice que estos péptidos antagonistas son adecuados
para la administración como composiciones farmacéuticas para tratar
estados asociados con unos niveles excesivos de GH, por ejemplo,
acromegalia.
Se dijo que la actividad antagonista del análogo
de hGH-RH
"[Ser^{9}-\Psi[CH_{2}-NH]-Tyr^{10}]hGH-RH(1-29)"
de la patente de los EE.UU. nº 5.084.555 se obtenía como resultado
del enlace pseudopeptídico (es decir, un enlace peptídico reducido
a una unión [CH_{2}-NH]) entre los residuos
R^{9} y R^{10}. Sin embargo, se dijo que las propiedades
antagónicas de
[Ser^{9}-\Psi[CH_{2}-NH]-Tyr^{10}]hGH-RH(1-29)
eran inferiores a las del antagonista estándar,
[N-Ac-Tyr^{1},
D-Arg^{2}]hGH-RH(1-29)-NH_{2}.
La patente de los EE.UU. nº 5.550.212 y la
solicitud de patente de los EE.UU. nº 08/642.472, cedida al mismo
cesionario como la presente solicitud, describe análogos de
hGH-RH(1-29)NH_{2}
de los que se dice que tiene propiedades antagonistas mejoradas y
una duración de acción prolongada. Se cree que estas propiedades se
obtienen como resultado del reemplazo de diversos aminoácidos y la
acilación con ácidos aromáticos o no polares en el extremo N
terminal de
hGH-RH(1-29)NH_{2}.
Se observa que en la patente de los EE.UU. y la solicitud de
patente de los EE.UU. anteriores, R^{9} es siempre Ser, R^{16}
es Gln o un aminoácido que forma un puente de lactama (es decir
Glu), R^{28} es Ser, Asn, Asp, Ala o Abu, y R^{29} es Agm,
Arg-NH_{2}, Arg-OH,
Cit-NH_{2}, Cit-OH,
Har-NH_{2}, Har-OH, o un
aminoácido que forma un puente de lactama (es decir, Lys u Orn).
Se proporciona una serie novedosa de análogos
sintéticos de
hGH-RH(1-29)NH_{2}.
Estos análogos inhiben la actividad de la hGH-RH
endógena, y por lo tanto evitan la liberación de la hormona del
crecimiento. La mayor potencia inhibidora de los nuevos análogos,
tal como se compara con las descritas previamente, se obtiene como
resultado del reemplazo de diversos aminoácidos.
Específicamente, la invención se refiere a
péptidos que comprenden la fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
X-R^{1}-R^{2}-Asp-Ala-R^{5}-R^{6}-Thr-R^{8}-R^{9}-R^{10}-Arg-R^{12}-R^{13}-R^{14}-R^{15}-R^{16}-Leu-R^{18}-R^{19}-Arg-R^{21}-R^{22}-Leu-Gln-Asp-Ile-R^{27}-R^{28}-R^{29}-NH_{2}
\vskip1.000000\baselineskip
en la que X es PhAc, IndAc, lbu,
Nac, 1- o 2-Npr, o
Fpr,
R^{1} es Tyr o His,
R^{2} es D-Arg o
D-Cit,
R^{5} es Ile o Val,
R^{6} es Phe, Nal o Phe(Y), en el que Y
= F, Cl, Br,
R^{8} es Asn, Gln, Ser, Thr, Ala,
D-Asn, D-Gln, D-Ser,
D-Thr, Abu, D-Abu, o Aib,
R^{9} es Arg, Har, Lys, Orn,
D-Arg, D-Har, D-Lys,
D-Orn o Cit,
R^{10} es Tyr o Phe(Y), en el que Y =
H, F, Cl, Br, o OCH_{3},
R^{12} es Lys, D-Lys, u
Orn,
R^{13} es Val o Nle,
R^{14} es Leu o Nle,
R^{15} es Gly, Ala, Abu, Nle o Gln,
R^{16} es Gln o Arg,
R^{18} es Ser o Nle,
R^{19} es Ala o Abu,
R^{21} es Lys u Orn,
R^{22} es Leu, Ala o Aib,
R^{27} es Met, Leu, Nle, Abu, o
D-Arg,
R^{28} es Arg o D-Arg,
R^{29} es Arg, D-Arg, Har o
D-Har,
y sales farmacéuticamente aceptables de los
mismos.
Entre las realizaciones preferidas están los
péptidos en los que X es PhAc, IndAc o Nac, R^{1} es Tyr o His,
A^{2} es D-Arg, R^{5} es Ile, R^{6} es
Phe(pCl), R^{8} es Asn o Abu, R^{9} es Arg o Har, Lys,
Orn, D-Arg, D-Har,
D-Lys, D-Orn, o Cit, R^{10} es Tyr
o Tyr(Me), R^{12} es Lys, R^{13} es Val o Nle, R^{14}
es Leu o Nle, R^{15} es Abu, Ala, o Nle, R^{16} es Gln o Arg,
R^{18} es Ser o Nle, R^{19} es Ala o Abu, R^{21} es Lys,
R^{27} es Nle o D-Arg, R^{28} es
D-Arg o Arg, R^{29} es D-Arg, Har
o D-Har.
Se observa que los residuos de aminoácidos desde
el 30 hasta el 44 de la molécula de GH-RH natural no
parecen ser esenciales para la actividad; ni su identidad parece
ser crítica. Por tanto, parece que la adición de algunos de o todos
estos residuos de aminoácidos adicionales al extremo C terminal de
los análogos de
hGH-RH(1-29)NH_{2}
de la presente invención no afectará a la eficacia de estos análogos
como antagonistas de GH-RH. Si se añadieran algunos
de o todos estos aminoácidos al extremo C terminal de los análogos
de
hGH-RH(1-29)NH_{2},
los residuos de aminoácidos añadidos
podrían ser los mismos que los residuos del 30 al 44 en la secuencia de hGH-RH natural o equivalentes razonables.
podrían ser los mismos que los residuos del 30 al 44 en la secuencia de hGH-RH natural o equivalentes razonables.
Los péptidos sintéticos se sintetizan mediante
un método adecuado tal como mediante técnicas en fase sólida
exclusiva, mediante técnicas en fase sólida parcial, mediante
condensación de fragmentos o mediante en fase de disolución
clásica.
Cuando se sintetiza los análogos de esta
invención mediante el método en fase sólida, el residuo del extremo
C terminal (aquí, R^{29}) se une de manera apropiada (se ancla) a
un soporte sólido inerte (resina) mientras que porta grupos
protectores para su grupo alfa-amino (y, cuando
resulte apropiado, para su grupo funcional de cadena lateral). Tras
la finalización de esta etapa, se retira el grupo protector de
alfa-amino del residuo de aminoácido anclado y se
añade el siguiente aminoácido, R^{28}, teniendo su grupo
alfa-amino (así como cualquier grupo funcional de
cadena lateral apropiado) protegido de manera adecuada, y así
sucesivamente. Los grupos protectores del extremo N terminal se
retiran después de que se ha añadido cada residuo, pero todavía no
se han retirado los grupos protectores de cadena lateral. Tras haber
unidos todos los aminoácidos deseados en la secuencia apropiada, el
péptido se separa del soporte y se libera del (todos los)
grupo(s) protector(es) de cadena lateral bajo
condiciones que son mínimamente destructivas para los residuos de la
secuencia. Esto se sigue de una purificación cuidadosa y una
caracterización escrupulosa del producto sintético, para garantizar
así que, en efecto, la estructura deseada es la obtenida.
Se prefiere particularmente proteger la función
alfa-amino de los aminoácidos durante la etapa de
acoplamiento con un grupo protector sensible a ácidos o bases.
Tales grupos protectores deben tener las propiedades de ser
estables en las condiciones de la formación de uniones de péptido,
al tiempo que se puedan retirar fácilmente sin la destrucción de la
cadena peptídica creciente y sin la racemización de ninguno de los
centros quirales contenidos en la misma. Grupos protectores de
alfa-amino adecuados son Boc y Fmoc.
Los péptidos antagonistas de
hGH-RH, o sales de estos péptidos, pueden formularse
en formas farmacéuticas que contengan cantidades eficaces de los
mismos y administrarse a seres humanos o animales con fines
terapéuticos o diagnósticos. Los péptidos pueden utilizarse para
suprimir los niveles de GH y tratar los estados asociados con
niveles excesivos de GH, por ejemplo, retinopatía y nefropatía
diabéticas, y acromegalia. Además se proporcionan métodos para
tratar estas enfermedades mediante la administración de una
composición de la invención a un individuo que necesite un
tratamiento de este tipo. Sin embargo, los principales usos de los
antagonistas de GH-RH están en el campo del cáncer,
por ejemplo cánceres humanos de mama, pulmón, colon, cerebro,
páncreas, y próstata en los que están presentes los receptores para
IGF-I o IGF-II.
La figura I es un gráfico de los cambios de
volumen en los cánceres de mama de ratones MXT durante el
tratamiento con ciertos antagonistas de GH-RH
frente a los días de tratamiento.
La figura II es un gráfico de los cambios de
volumen de cánceres de mama humanos
MDA-MB-468 en ratones desnudos
durante el tratamiento con ciertos antagonistas de
GH-RH frente a los días de tratamiento.
La figura III es un gráfico de los cambios de
volumen de cánceres de colon humanos HT-29 en
ratones desnudos durante el tratamiento con ciertos antagonistas de
GH-RH frente a los días de tratamiento.
La figura IV es un gráfico de los cambios de
volumen de cánceres de gioblastomas humanos U87MG en ratones
desnudos durante el tratamiento con ciertos antagonistas de
GH-RH frente a los días de tratamiento.
La figura V es un gráfico de los cambios de
volumen de cánceres de próstata humanos PC-3 en
ratones desnudos durante el tratamiento con ciertos antagonistas de
GH-RH frente a los días de tratamiento.
La nomenclatura utilizada para definir los
péptidos es la especificada por el Comisionado de la
IUPAC-IUB sobre nomenclatura bioquímica, en la que,
según la representación convencional, el grupo amino del extremo N
terminal aparece a la izquierda y el grupo carboxilo del extremo C
terminal aparece a la derecha. El término "aminoácido natural"
tal como se utiliza en el presente documento significa uno de los
L-aminoácidos comunes, que aparecen en la
naturaleza hallados en proteínas que aparecen en la naturaleza: Gly,
Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Thr, Lys, Arg, Asp, Asn, Glu, Gln, Cys,
Met, Phe, Tyr, Pro, Trp e His. Cuando el residuo de aminoácido
natural tiene formas isoméricas, es la forma L del aminoácido la que
se representa en el presente documento a menos que se indique
expresamente lo contrario.
En los antagonistas de GH-RH
también se incorporan aminoácidos no codificados, o análogos de
aminoácidos. (aminoácidos "no codificados" son los aminoácidos
que no están entre los aproximadamente 20 aminoácidos naturales
hallados en los péptidos que aparecen en la naturaleza). Entre los
aminoácidos no codificados y los análogos de aminoácidos que pueden
utilizarse en los péptidos antagonistas de hGH-RH se
encuentran los siguientes: por Abu se quiere decir ácido
alfa-aminobutírico, por Aib se quiere decir ácido
alfa-aminoisobutírico, por Har se quiere decir
homoarginina, por Nal se quiere decir
2-naftil-alanina, por Nle se quiere
decir norleucina, y por Orn se quiere decir ornitina. Cuando estos
aminoácidos no codificados, o análogos de aminoácidos, tienen
formas isoméricas, es la forma L del aminoácido la que se representa
a menos que se indique expresamente lo contrario.
Abu ácido
\alpha-aminobutírico
Ac acetilo
AcOH ácido acético
Ac_{2}O anhídrido acético
Aib ácido
\alpha-aminoisobutírico
Boc terc.butiloxicarbonilo
Bom benciloximetilo
2BrZ
2-bromo-benciloxicarbonilo
cHx ciclohexilo
Cit citrulina (ácido
2-amino-5-ureidovalérico)
2CIZ
2-cloro-benciloxicarbonilo
DCM diclorometano
DIC
N,N'-diisopropilcarbodiimida
DIEA diisopropiletilamina
DMF dimetilformamida
Fmoc fluorenilmetiloxicarbonilo
Fpr 3-fenilpropionilo
GH hormona del crecimiento
GH-RH hormona de liberación de
GH
Har homoarginina
HBTU hexaflourofosfato de
2-(1H-Benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio
hGH-RH GH-RH
humana
HOBt 1-hidroxibenzotriazol
HPLC cromatografía de líquidos de alta
resolución
Ibu isobutirilo
IndAc
indol-3-acetilo
MBHA
para-metilbenzhidrilamina
MeOH metanol
MeCN acetonitrilo
Nac 1-naftilacetilo
Nal 2-naftilalanina
NMM N-metilmorfolina
Npr naftilpropionilo
PAM fenilacetamidometilo
Phe(pCl)
para-cloro-fenilalanina
PhAc fenilacetilo
rGH-RH rat GH-RH
de rata
RP-HPLC HPLC en fase
invertida
TFA ácido trifluoroacético
Tos para-toluenosulfonilo
Tyr(Me) tirosina metiléter
Z benciloxicarbonilo
Los análogos de hGH-RH de la
presente invención se diseñaron para aumentar las afinidades de los
péptidos por el receptor, para mejorar la estabilidad metabólica y
maximizar la estructura secundaria amfifílica de las moléculas.
Muchos de estos análogos producen una inhibición muy eficaz y
duradera de la liberación de GH estimulada por
hGH-RH(1-29)NH_{2}
in vitro e in vivo.
\vskip1.000000\baselineskip
Se prefieren especialmente las siguientes
realizaciones como que tienen una actividad biológica notable:
| [PhAc^{0}, D-Arg^{2}, Phe(pCl)^{6}, Arg^{9}, Abu^{15}, Nle^{27}, D-Arg^{28}, Har^{29}]hGH-RH(1-29)NH_{2} | Péptido 1 |
| [IndAc^{0}, D-Arg^{2}, Phe(pCl)^{6}, Arg^{9}, Abu^{15}, Nle^{27}, D-Arg^{28}, Har^{29}]hGH-RH(1-29)NH_{2} | Péptido 2 |
| [PhAc^{0}, D-Arg^{2}, Phe(pCl)^{6}, Har^{9}, Tyr(Me)^{10}, Abu^{15}, Nle^{27}, D-Arg^{28}, Har^{29}]hGH-RH(1-29)NH_{2} | Péptido 3 |
| [PhAc^{0}, D-Arg^{2}, Phe(pCl)^{6}, Har^{9}, Abu^{15}, Nle^{27}, D-Arg^{28}, Har^{29}]hGH-RH(1-29)NH_{2} | Péptido 4 |
| [Nac^{0}, D-Arg^{2}, Phe(pCl)^{6}, Arg^{9}, Abu^{15}, Nle^{27}, D-Arg^{28}, Har^{29}]hGH-RH(1-29)NH_{2} | Péptido 5 |
| [PhAc^{0}, D-Arg^{2}, Phe(pCl)^{6}, Arg^{9}, Tyr(Me)^{10}, Abu^{15}, Nle^{27}, D-Arg^{28}, Har^{29}]hGH-RH(1-29)NH_{2} | Péptido 6 |
| [PhAc^{0}, His^{1}, D-Arg^{2}, Phe(pCl)^{6}, Arg^{9}, Abu^{15}, Nle^{27}, D-Arg^{28}, Har^{29}]hGH-RH(1-29)NH_{2} | Péptido 7 |
| [Nac^{0}, His^{1}, D-Arg^{2}, Phe(pCl)^{6}, Arg^{9}, Abu^{15}, Nle^{27}, D-Arg^{28}, Har^{29}]hGH-RH(1-29)NH_{2} | Péptido 8 |
| [PhAc^{0}, D-Arg^{2}, Phe(pCl)^{6}, Lys^{9}, Abu^{15}, Nle^{27}, D-Arg^{28}, Har^{29}]hGH-RH(1-29)NH_{2} | Péptido 24 |
| [PhAc^{0}, D-Arg^{2}, Phe(pCl)^{6}, Orn^{9}, Abu^{15}, Nle^{27}, D-Arg^{28}, Har^{29}]hGH-RH(1-29)NH_{2} | Péptido 25 |
| [PhAc^{0}, D-Arg^{2}, Phe(pCl)^{6}, D-Arg^{9}, Abu^{15}, Nle^{27}, D-Arg^{28}, Har^{29}]hGH-RH(1-29)NH_{2} | Péptido 26 |
| [PhAc^{0}, D-Arg^{2}, Phe(pCl)^{6}, D-Har^{9}, Abu^{15}, Nle^{27}, D-Arg^{28}, Har^{29}]hGH-RH(1-29)NH_{2} | Péptido 27 |
| [PhAc^{0}, D-Arg^{2}, Phe(pCl)^{6}, D-Lys^{9}, Abu^{15}, Nle^{27}, D-Arg^{28}, Har^{29}]hGH-RH(1-29)NH_{2} | Péptido 28 |
| [PhAc^{0}, D-Arg^{2}, Phe(pCl)^{6}, D-Orn^{9}, Abu^{15}, Nle^{27}, D-Arg^{28}, Har^{29}]hGH-RH(1-29)NH_{2} | Péptido 29 |
| [PhAc^{0}, D-Arg^{2}, Phe(pCl)^{6}, Cit^{9}, Abu^{15}, Nle^{27}, D-Arg^{28}, Har^{29}]hGH-RH(1-29)NH_{2} | Péptido 30 |
\vskip1.000000\baselineskip
Seis realizaciones muy preferidas tienen las
fórmulas:
PhAc^{0}-Tyr^{1}-D-Arg^{2}-Asp^{3}-Ala^{4}-Ile^{5}-Phe(pCl)^{6}-Thr^{7}-Asn^{8}-Arg^{9}-Tyr^{10}-Arg^{11}-Lys^{12}-Val^{13}-Leu^{14}-Abu^{15}-Gln^{16}-Leu^{17}-Ser^{18}-Ala^{19}-Arg^{20}-Lys^{21}-Leu^{22}-Leu^{23}-Gln^{24}-Asp^{25}-Ile^{26}-Nle^{27}-D-Arg^{28}-Har^{29}-NH_{2}
\hskip3cmPéptido 1
IndAc^{0}-Tyr^{1}-D-Arg^{2}-Asp^{3}-Ala^{4}-Ile^{5}-Phe(pCl)^{6}-Thr^{7}-Asn^{8}-Arg^{9}-Tyr^{10}-Arg^{11}-Lys^{12}-Val^{13}-Leu^{14}-Abu^{15}-Gln^{16}-Leu^{17}-Ser^{18}-Ala^{19}-Arg^{20}-Lys^{21}-Leu^{22}-Leu^{23}-Gln^{24}-Asp^{25}-Ile^{26}-Nle^{27}-D-Arg^{28}-Har^{29}-NH_{2}
\hskip3cmPéptido 2
PhAc^{0}-Tyr^{1}-D-Arg^{2}-Asp^{3}-Ala^{4}-Ile^{5}-Phe(pCl)^{6}-Thr^{7}-Asn^{8}-Har^{9}-Tyr(Me)^{10}-Arg^{11}-Lys^{12}-Val^{13}-Leu^{14}-Abu^{15}-Gln^{16}-
Leu^{17}-Ser^{18}-Ala^{19}-Arg^{20}-Lys^{21}-Leu^{22}-Leu^{23}-Gln^{24}-Asp^{25}-Ile^{26}-Nle^{27}-D-Arg^{28}-Har^{29}-NH_{2}
Leu^{17}-Ser^{18}-Ala^{19}-Arg^{20}-Lys^{21}-Leu^{22}-Leu^{23}-Gln^{24}-Asp^{25}-Ile^{26}-Nle^{27}-D-Arg^{28}-Har^{29}-NH_{2}
\hskip2.1cmPéptido 3
PhAc^{0}-Tyr^{1}-D-Arg^{2}-Asp^{3}-Ala^{4}-Ile^{5}-Phe(pCl)^{6}-Thr^{7}-Asn^{8}-Arg^{9}-Tyr(Me)^{10}-Arg^{11}-Lys^{12}-Val^{13}-Leu^{14}-Abu^{15}-Gln^{16}-
Leu^{17}-Ser^{18}-Ala^{19}-Arg^{20}-Lys^{21}-Leu^{22}-Leu^{23}-Gln^{24}-Asp^{25}-Ile^{26}-Nle^{27}-D-Arg^{28}-Har^{29}-NH_{2}
Leu^{17}-Ser^{18}-Ala^{19}-Arg^{20}-Lys^{21}-Leu^{22}-Leu^{23}-Gln^{24}-Asp^{25}-Ile^{26}-Nle^{27}-D-Arg^{28}-Har^{29}-NH_{2}
\hskip2.1cmPéptido 6
PhAc^{0}-His^{1}-D-Arg^{2}-Asp^{3}-Ala^{4}-Ile^{5}-Phe(pCl)^{6}-Thr^{7}-Asn^{8}-Arg^{9}-Tyr^{10}-Arg^{11}-Lys^{12}-Val^{13}-Leu^{14}-Abu^{15}-Gln^{16}-Leu^{17}-
Ser^{18}-Ala^{19}-Arg^{20}-Lys^{21}-Leu^{22}-Leu^{23}-Gln^{24}-Asp^{25}-Ile^{26}-Nle^{27}-D-Arg^{28}-Har^{29}-NH_{2}
Ser^{18}-Ala^{19}-Arg^{20}-Lys^{21}-Leu^{22}-Leu^{23}-Gln^{24}-Asp^{25}-Ile^{26}-Nle^{27}-D-Arg^{28}-Har^{29}-NH_{2}
\hskip3cmPéptido 7
Nac^{0}-His^{1}-D-Arg^{2}-Asp^{3}-Ala^{4}-Ile^{5}-Phe(pCl)^{6}-Thr^{7}-Asn^{8}-Arg^{9}-Tyr^{10}-Arg^{11}-Lys^{12}-Val^{13}-Leu^{14}-Abu^{15}-Gln^{16}-Leu^{17}-
Ser^{18}-Ala^{19}-Arg^{20}-Lys^{21}-Leu22-Leu^{23}-Gln^{24}-Asp^{25}-Ile^{26}-Nle^{27}-D-Arg^{28}-Har^{29}-NH_{2}
Ser^{18}-Ala^{19}-Arg^{20}-Lys^{21}-Leu22-Leu^{23}-Gln^{24}-Asp^{25}-Ile^{26}-Nle^{27}-D-Arg^{28}-Har^{29}-NH_{2}
\hskip2,9cmPéptido 8
\vskip1.000000\baselineskip
Bajo una convención bien establecida, estos
pueden abreviarse tal como sigue:
| [PhAc^{0}, D-Arg^{2}, Phe(pCl)^{6}, Arg^{9}, Abu^{15}, Nle^{27}, D-Arg^{28}, Har^{29}]hGH-RH(1-29)NH_{2} | Péptido 1 |
| [IndAc^{0}, D-Arg^{2}, Phe(pCl)^{6}, Arg^{9}, Abu^{15}, Nle^{27}, D-Arg^{28}, Har^{29}]hGH-RH(1-29)NH_{2} | Péptido 2 |
| [PhAc^{0}, D-Arg^{2}, Phe(pCl)^{6}, Har^{9}, Tyr(Me)^{10}, Abu^{15}, Nle^{27}, D-Arg^{28}, Har^{29}]hGH-RH(1-29)NH_{2} | Péptido 3 |
| [PhAc^{0}, D-Arg^{2}, Phe(pCl)^{6}, Arg^{9}, Tyr(Me)^{10}, Abu^{15}, Nle^{27}, D-Arg^{28}, Har^{29}]hGH-RH(1-29)NH_{2} | Péptido 6 |
| [PhAc^{0}, His^{1}, D-Arg^{2}, Phe(pCl)^{6}, Arg^{9}, Abu^{15}, Nle^{27}, D-Arg^{28}, Har^{29}]hGH-RH(1-29)NH_{2} | Péptido 7 |
| [Nac^{0}, His^{1}, D-Arg^{2}, Phe(pCl)^{6}, Arg^{9}, Abu^{15}, Nle^{27}, D-Arg^{28}, Har^{29}]hGH-RH 1-29)NH_{2} | Péptido 8 |
\vskip1.000000\baselineskip
Se sintetizan los péptidos mediante métodos
adecuados tales como las técnicas en fase sólida exclusiva, mediante
técnicas en fase sólida parcial, mediante condensación de
fragmentos o mediante síntesis en fase de disolución clásica. Por
ejemplo, las técnicas en fase sólida exclusiva se exponen en el
manual "Solid Phase Peptide Synthesis", J.M. Stewart y J.D.
Young, Pierce Chem. Company, Rockford, 111, 1984 (2ª. ed.), y M.
Bodanszky, "Principles of Peptide Synthesis", Springer Verlag,
1984. Los péptidos antagonistas de hGH-RH se
preparan preferiblemente utilizando síntesis en fase sólida, tal
como la generalmente descrita por Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85,
pág. 2149 (1963), aunque también pueden utilizarse otras síntesis
químicas equivalentes conocidas en la técnica tal como se ha
mencionado anteriormente.
La síntesis se lleva a cabo con aminoácidos que
están protegidos en su grupo alfa-amino.
Preferiblemente se utiliza grupos protectores de tipo uretano (Boc
o Fmoc) para la protección del grupo alfa-amino. El
grupo protector preferido es Boc.
En la síntesis en fase sólida, el resto de
aminoácido protegido en N-alfa que forma el grupo
aminoacilo del péptido final en el extremo C terminal se une a un
soporte de resina polimérica a través de una unión química. Tras la
finalización de la reacción de acoplamiento, se retira de manera
selectiva el grupo protector del alfa-amino para
permitir que tengan lugar las reacciones de acoplamiento posteriores
en el extremo amino terminal, preferiblemente con TFA al 50% en DCM
cuando el grupo protector de N-alfa es Boc. Los
aminoácidos restantes con grupos alfa-amino
protegidos con Boc de manera similar se acoplan gradualmente al
grupo amino libre del aminoácido precedente en la resina para
obtener la secuencia de péptido deseada. Debido a que los residuos
de aminoácidos están acoplados al grupo alfa-amino
del resto del extremo C terminal, el crecimiento de los péptidos
análogos de hGH-RH sintético comienza en el extremo
C terminal y progresa hacia el extremo N terminal. Cuando se
obtiene la secuencia deseada, el péptido se acila en el extremo N
terminal, y se retira del polímero de soporte.
Cada aminoácido protegido se utiliza en exceso
(2,5 ó 3 equivalentes) y, normalmente, las reacciones de
acoplamiento se llevan a cabo en DCM, DMF o mezclas de los mismos.
El grado de finalización de la reacción de acoplamiento se
monitoriza en cada fase mediante la reacción de ninhidrina. En casos
en los que se determina el acoplamiento incompleto, se repite el
procedimiento de acoplamiento, o se lleva a cabo un procedimiento de
formación de caperuza mediante acetilación de los grupos amino sin
reaccionar, antes de retirar el grupo protector de
alfa-amino antes del acoplamiento del siguiente
aminoácido.
En la tabla I se muestra un ciclo de síntesis
típico.
| Etapa | Reactivo | Tiempo de mezcla (min) |
| 1. Desprotección | TFA al 50% en DCM | 5+25 |
| lavado con DCM | 1 | |
| lavado con 2-propanol | 1 | |
| 2. Neutralización | DIEA al 5% en DCM | 1 |
| lavado con DCM | 1 | |
| lavado con MeOH | 1 | |
| DIEA al 5% en DCM | 3 | |
| lavado con MeOH | 1 | |
| lavado con DCM (3 veces) | 1-1 | |
| 3. Acoplamiento | 3 equiv. de Boc-aminoácido en DCM o | |
| DMF + 3 equiv. de DIC o el éster HOBt | ||
| preformado del Boc-aminoácido | 60 | |
| lavado con MeOH | 2 | |
| lavado con DCM | 2 | |
| 4. Acetilación | Ac_{2}O en DCM (30%) | 10+20 |
| (si fuera apropiado) | lavado con MeOH (3 veces) | 2 |
| lavado con DCM (3 veces) | 2 |
Tras la finalización de la síntesis, puede
efectuarse la separación del péptido de la resina utilizando
procedimientos bien conocidos en la química de péptidos.
Algunos de los residuos de aminoácidos de los
péptidos tienen grupos funcionales de cadena lateral que son
reactivos con los reactivos utilizados en el acoplamiento o
desprotección. Cuando tales grupos laterales están presentes,
grupos protectores adecuados se unen a estos grupos funcionales para
evitar que se produzcan reacciones químicas indeseables durante las
reacciones utilizadas para formar los péptidos. Se siguen las
siguientes reglas generales para la selección de un grupo protector
de cadena lateral particular: (a) el grupo protector
preferiblemente mantiene sus propiedades protectoras y no se
desprende en condiciones de acoplamiento, (b) el grupo protector
debe ser estable en las condiciones de retirada el grupo protector
de alfa-amino en cada etapa de la síntesis, (c) el
grupo protector de cadena lateral debe poder eliminarse con la
finalización de la síntesis de la secuencia de aminoácidos deseada,
en las condiciones de reacción que no alterarán de manera
indeseables la cadena de péptidos.
Preferiblemente, los grupos funcionales de
cadena lateral reactivos se protegen tal como sigue: bencilo para
Thr y Ser; 2-bromobenciloxicarbonilo para Tyr;
p-tolueno-sulfonilo o nitro para Arg
y Har; 2-clorobenciloxicarbonilo o
fluorenilmetiloxicarbonilo para Lys, Orn; benciloximetilo para His;
y ciclohexilo o fluorenilmetilo para Asp y Glu. Las cadenas
laterales de Asn y Gln están sin proteger.
Los péptidos antagonistas de
hGH-RH pueden sintetizarse en una variedad de
polímeros de soporte, es decir, MBHA, Merrifield, PAM o resinas
Wang. Cuando se utilizan para la síntesis aminoácidos protegidos con
Boc en N-alfa, la resina preferida es MBHA. En este
caso, se obtienen péptidos con extremo C terminal amidado con la
separación de la fase de soporte.
En primer lugar, se une el aminoácido del
extremo C terminal a la resina MBHA neutralizada, y entonces se
llevan a cabo los acoplamientos de aminoácidos posteriores. Cada
aminoácido protegido se acopla en, aproximadamente, un exceso molar
del triple, con respecto a los residuos amino libres unidos a la
resina, y el acoplamiento puede llevarse a cabo en un medio tal
como DMF:CH_{2}Cl_{2} (1:1) o en DMF o CH_{2}Cl_{2} solo. La
selección de un reactivo de acoplamiento apropiado está dentro de
la experiencia de la técnica. Reactivos de acoplamiento
particularmente adecuados son
N,N'-diisopropilcarbodiimida (DIC), HBTU combinado
con HOBt. El éxito de la reacción de acoplamiento en cada fase de
la síntesis se monitoriza, preferiblemente, mediante la reacción de
la ninhidrina. En casos en los que se produce un acoplamiento
incompleto, o bien se repite el procedimiento de acoplamiento, o
bien se acetilan los residuos de amino sin reaccionar unidos a la
resina utilizando Ac_{2}O/DCM, antes de retirar el grupo
protector de alfa-amino.
La acilación final del extremo N terminal del
péptido se realiza de la misma manera que los acoplamientos
previos, con la diferencia de que se utiliza el ácido carboxílico
apropiado en lugar de un aminoácido.
Cuando la síntesis está completa, el péptido se
separa de la fase de soporte. La retirada del péptido de la resina
se lleva a cabo mediante un pretratamiento con un reactivo tal como
fluoruro de hidrógeno líquido que también separa los grupos
protectores de cadena lateral restantes.
De manera adecuada, se trata el
péptido-resina secado y protegido con una mezcla que
consiste en 1,0 ml de m-cresol y 10 ml de fluoruro
de hidrógeno anhidro por gramo de péptido-resina
durante 60 minutos a 0ºC para separar el péptido de la resina, así
como para retirar todos los grupos protectores de cadena lateral.
Tras la retirada del fluoruro de hidrógeno bajo una corriente de
nitrógeno y vacío, se hacen precipitar los péptidos libres con
éter, se filtran, se lavan con éter y acetato de etilo, se extraen
con ácido acético al 50%, y se liofilizan.
Puede efectuarse la purificación de los péptidos
brutos utilizando procedimientos bien conocidos en la química de
péptidos. Por ejemplo, puede llevarse a cabo la purificación en un
sistema HPLC MacRabbit (Rainin Instrument Co. Inc., Woburn, MA) con
un fotómetro UV Knauer y un registrador Kipp y Zonen BD40 utilizando
una columna de fase invertida Vydac 218TP5010 (10 x 250 mm,
empaquetada con gel de sílice C18, 300 \ring{A} de tamaño de poro,
5 \mum de tamaño de partícula) (The Separations Group Inc.,
Hesperia, CA). Se eluye la columna con un sistema disolvente que
consiste en (A) TFA acuoso al 0,1% y (B) TFA al 0,1% en MeCN acuoso
al 70% en un modo de gradiente lineal (por ejemplo,
30-55% de B en 120 minutos). Se monitoriza el
eluyente a 220 nm, y se examinan las fracciones mediante HPLC
analítica utilizando un cromatógrafo líquido
Hewlett-Packard modelo HP-1090 y se
agrupan para dar una pureza máxima. Se lleva a cabo la HPLC
analítica en una columna de fase invertida Vydac 218TP52 (2 x 250
mm, C18, 300 \ring{A}, 5 \mum) utilizando una elución isocrática
con un sistema disolvente que consiste en (A) y (B) definidos
anteriormente. Se monitorizan los picos a 220 y 280 nm. Se juzga que
los péptidos son sustancialmente (> 95%) puros median-
te HPLC analítica. Se confirma también la composición de aminoácidos esperada mediante análisis de aminoácidos.
te HPLC analítica. Se confirma también la composición de aminoácidos esperada mediante análisis de aminoácidos.
Los péptidos de la invención pueden
administrarse en forma de sales no tóxicas, farmacéuticamente
aceptables tales como sales de adición de ácido. Ejemplos de tales
sales de adición son clorhidrato, bromhidrato, sulfato, fosfato,
fumarato, gluconato, tanato, maleato, acetato, citrato, benzoato,
succinato, alginato, pamoato, malato, ascorbato, tartarato, y
similares. Antagonistas particularmente preferidos son sales de baja
solubilidad, por ejemplo, sales de pamoato y similares. Éstas
muestran una larga duración de actividad.
Los compuestos de la presente invención se
administran de manera adecuada a sujetos humanos o animales por vía
s.c., i.m., o i.v., intranasal o mediante inhalación pulmonar; o en
una forma de depósito (por ejemplo, microcápsulas, microgránulos,
implantes similares a barras cilíndricas) formulada a partir de un
polímero biodegradable adecuado (tal como
D,L-lactida-coglicolida),
prefiriéndose los primeros dos modos de depósito. Otros modos
equivalentes de administración también están dentro del alcance de
esta invención, es decir, goteo continuo, inyecciones de depósito,
bombas de infusión y modos de liberación por tiempos tales como
microcápsulas y similares. La administración es en cualquier
excipiente inyectable fisiológicamente aceptable, siendo aceptable
solución salina fisiológica, aunque también pueden utilizarse otros
excipientes conocidos en la técnica.
Preferiblemente, los péptidos se administran por
vía parenteral, intramuscular, subcutánea o intravenosa con un
excipiente farmacéuticamente aceptable tal como solución salina
isotónica. Alternativamente, los péptidos pueden administrarse como
una pulverización intranasal con un excipiente adecuado o mediante
inhalación pulmonar. Una vía de administración adecuada es una
forma de depósito formulada a partir de un polímero biodegradable
adecuado, por ejemplo,
poli-D,L-lactida-coglicolida
como microcápsulas, microgránulos o implantes cilíndricos que
contienen compuestos antagonistas dispersos.
La cantidad de péptido necesario depende del
modo de administración y del resultado que se pretenda. En general,
el intervalo de dosificación está entre de 1 - 100 \mug/kg de peso
corporal del receptor por día.
Pueden utilizarse los antagonistas de
hGH-RH en el tratamiento de estados producidos por
un exceso de hormona de crecimiento, por ejemplo, acromegalia, que
se manifiesta por un aumento anormal de los huesos de la cara y las
extremidades. También pueden utilizarse los antagonistas de
GH-RH para tratar la nefropatía diabética (la
principal causa de ceguera en los diabéticos) y la retinopatía
diabética, en las que la lesión del ojo y los riñones,
respectivamente, se supone que se debe a la GH.
Los antagonistas de hGH-RH están
diseñados para bloquear la unión y por tanto la acción de
GH-RH, que estimula la secreción de GH, que a su
vez estimula la producción de IGF-I. Los
antagonistas de GH-RH pueden administrarse solos o
junto con análogos a somatostatina, una combinación que suprime de
manera más completa los niveles de IGF-I. Es
ventajoso administrar antagonistas de GH-RH más que
somatostatina debido al hecho de que los antagonistas de
GH-RH pueden utilizarse en situaciones en los que
los sitios DIAN no tienen receptores de somatostatina.
Sin embargo, las aplicaciones principales de los
antagonistas de GH-RH están en el campo del cáncer.
Esto se basa en las siguientes consideraciones: los antagonistas de
GH-RH están diseñados para bloquear la unión y por
tanto la acción de GH-RH, que estimula la secreción
de GH, que a su vez estimula la producción del factor de
crecimiento similar a la insulina I (IGF-I) también
llamado somatomedina-C. Se ha establecido bien la
implicación de IGF-I
(somatomedina-C) en el cáncer de mama, cáncer de
próstata, cáncer de colon, cánceres óseos y otros tumores malignos,
y los análogos de somatostatina solo no suprimen de manera adecuada
los niveles de GH e IGF-I. Se necesita una
supresión completa de los niveles o secreción de
IGF-I para una mejor inhibición del crecimiento
tumoral. La producción autocrina de IGF-I por parte
de diversos tumores también podría estar bajo control de
GH-RH y podría, por tanto, inhibirse mediante
antagonistas de GH-RH. Los antagonistas de
GH-RH también podrían inhibir la producción de
IGF-I. Unos antecedentes teóricos más detallados de
las solicitudes de GH-RH en el campo de la
oncología (cáncer) es tal como sigue: los receptores para
IGF-I están presentes en cánceres de mama, cánceres
de próstata, cánceres de pulmón,
cánceres de colon, cánceres de cerebro, cánceres pancreáticos humanos primarios, y en carcinomas de células renales.
cánceres de colon, cánceres de cerebro, cánceres pancreáticos humanos primarios, y en carcinomas de células renales.
La presencia de receptores de
IGF-I en estos tumores parece estar relacionada con
la transformación en tumor maligno y la proliferación de estos
cánceres. El IGF-I puede actuar como factor de
crecimiento endocrino, paracrino o autocrino para diversos cánceres
humanos, es decir, el crecimiento de estos neoplasmas es dependiente
de IGF-I. Los antagonistas de GH-RH
mediante la supresión de la secreción de GH disminuirían la
producción de IGF-I. Ya que el
IGF-I estimula el crecimiento de estos diversos
neoplasmas (cánceres), la disminución de los niveles circulantes de
IGF-I debe conducir a la inhibición del crecimiento
tumoral. Es posible que los antagonistas de GH-RH
también pudieran disminuir la producción paracrina o autocrina de
IGF-I mediante los tumores, lo cual también debe
conducir a la inhibición de la proliferación de cáncer. Estas
visiones están en consonancia con conceptos modernos de oncología
clínica. Los antagonistas de GH-RH deben darse solos
o junto con análogos de somatostatina y una combinación alcanzaría
una supresión más completa de los niveles de IGF-I,
la eliminación de los niveles de IGF-I en los
tejidos, por ejemplo, en osteosarcomas humanos, así como en cáncer
de mama, cáncer de colon, cáncer de próstata, y cáncer de pulmón de
células no pequeñas (NSCLC, "non-SCLC").
La ventaja de los antagonistas de
GH-RH sobre los análogos de somatostatina se basa en
el hecho de que pueden utilizarse antagonistas de
GH-RH para la supresión de tumores que no tienen
receptores de somatostatina, por ejemplo, sarcomas osteogénicos
humanos.
Los análogos antagonistas de
GH-RH han demostrado suprimir el crecimiento de
diversos tumores in vivo. Este efecto se ejerce, en parte, a
través de la inhibición del eje
GHRH-GH-IGF. No obstante, el control
autocrino/paracrino de la proliferación por parte de
IGF-II también es un factor importante en muchos
tumores. La interferencia con esta ruta autocrina estimulante del
crecimiento ofrece una aproximación al control tumoral. Los análogos
antagonistas de GH-RH,
MZ-4-71 {[Ibu^{0}, Tyr^{1},
D-Arg^{2}, Abu^{15},
Nle^{27}]hGH-RH(1-28)Agm}
y MZ-5-156 {[PhAc^{0},
D-Arg^{2}, Abu^{15},
Nle^{27}]hGH-RH(1-28)Agm}
inhibieron significativamente la velocidad de proliferación de
líneas celulares de cáncer mamario
(MDA-MB-468,
ZR-75-1), prostático
(PC-3 y DU-145) y pancreático
(MiaPaCa-2, SW-1990 y
Capan-2) in vitro tal como se muestran
mediante pruebas colorimétricas y de incorporación de
[^{3}H]-timidina, redujeron la expresión de
ARN_{m} de IGF-II en las células y la
concentración de IGF-II secretado en el medio de
cultivo. Los mismos antagonistas de GH-RH produjeron
resultados similares in vivo (inhibición de la proliferación
y reducción de la producción de IGF-II) en tumores
de próstata (PC-3, DU-145),
adenocarcinoma renal (Caki-l) y carcinoma de pulmón
de células no pequeñas (H157). Estos hallazgos sugieren que los
análogos antagonistas de GH-RH pueden inhibir el
crecimiento tumoral no sólo inhibiendo el eje
GHRH-GH-IGF-I, sino
también reduciendo la producción de IFG-II en
ciertas células tumorales, interrumpiendo así su ruta reguladora
autocrina.
La presente invención se describe en conexión
con los siguientes ejemplos que se exponen sólo con fines
ilustrativos. En los ejemplos, se utilizan aminoácidos protegidos
ópticamente activos en la configuración L excepto donde se indique
específicamente.
Los siguientes ejemplos exponen métodos
adecuados de síntesis de antagonistas de GH-RH
novedosos mediante la técnica en fase sólida.
\hskip0.5cm(Péptido 1)
La síntesis se lleva a cabo de manera progresiva
utilizando equipamiento manual de síntesis de péptidos en fase
sólida. Brevemente, se neutraliza resina de
para-metilbenzhidrilamina (MBHA) (Bachem,
California) (720 mg, 0,50 mmoles) con DIEA al 5% en
CH_{2}Cl_{2} y se lava según el protocolo descrito en la tabla
I. Se agita la disolución de
Boc-Har(NO_{2})-OH (500 mg,
1,5 mmoles) en DMF-CH_{2}Cl_{2} (1:1) con la
resina neutralizada y DIC (235 \mul, 1,5 mmoles) en un aparato
manual de síntesis de péptidos en fase sólida durante 1 hora. Tras
la finalización de la reacción de acoplamiento se prueba mediante la
prueba de ninhidrina negativa, desprotección con TFA al 50% en
CH_{2}Cl_{2}, y neutralización con DIEA al 5% en
CH_{2}Cl_{2}, la cadena de péptidos se construye de manera
progresiva mediante el acoplamiento de los siguientes aminoácidos
protegidos en el orden indicado sobre la resina para obtener la
secuencia peptídica deseada:
Boc-D-Arg(Tos)-OH,
Boc-Nle-OH,
Boc-Ile-OH,
Boc-Asp(OcHx)-OH,
Boc-Gln-OH,
Boc-Leu-OH,
Boc-Leu-OH,
Boc-Lys(2ClZ)-OH,
Boc-Arg(Tos)-OH,
Boc-Ala-OH,
Boc-Ser(Bzl)-OH,
Boc-Leu-OH,
Boc-Gln-OH,
Boc-Abu-OH,
Boc-Leu-OH,
Boc-Val-OH,
Boc-Lys(2ClZ)-OH,
Boc-Arg(Tos)-OH,
Boc-Tyr(2BrZ)-OH,
Boc-Arg(Tos)-OH,
Boc-Asn-OH,
Boc-Thr(Bzl)-OH,
Boc-Phe(pCl)-OH,
Boc-Ile-OH,
Boc-Ala-OH,
Boc-Asp(OcHx)-OH,
Boc-D-Arg(Tos)-OH,
Boc-Tyr(2BrZ)-OH.
Estos residuos de aminoácido protegidos (también
disponibles, normalmente, de Bachem Co.) se representan
anteriormente según una convención bien aceptada. El grupo
protector adecuado para el grupo funcional de cadena lateral de
aminoácidos particulares aparece entre paréntesis. Los grupos OH de
las fórmulas anteriores indican que cada extremo carboxilo terminal
del residuo está libre.
Se acoplan los aminoácidos protegidos (1,5
mmoles de cada uno) con DIC (235 \mul, 1,5 mmoles) con las
excepciones de Boc-Asn-OH y
Boc-Gln-OH que se acoplan con sus
ésteres de HOBt preformados. Tras la retirada del grupo protector
N^{a}-Boc de Tyr^{1}, se acila el péptido con
ácido fenilacético (PhAc) (272 mg, 2 mmoles) utilizando DIC (313
\mul, 2 mmoles).
Con el fin de separar el péptido de la resina y
desprotegerlo, se agita la resina de péptido secada (2,18 g) con 2
ml de m-cresol y 20 ml de fluoruro de hidrógeno a
0ºC durante 1 hora. Tras la evaporación del HF a vacío, se lava el
remanente con dietiléter y acetato de etilo secos. Se disuelve el
péptido separado y desprotegido en ácido acético al 50% y se
se-
para de la resina mediante filtración. Tras la dilución con agua y la liofilización, se obtienen 1,51 g de producto bruto.
para de la resina mediante filtración. Tras la dilución con agua y la liofilización, se obtienen 1,51 g de producto bruto.
Se comprueba el péptido bruto mediante HPLC
analítica utilizando un cromatógrafo líquido de
Hewlett-Packard modelo HP-1090 con
una columna de fase invertida Vydac 218TP52 (2 x 250 mm, empaquetada
con gel de sílice C18, 300 \ring{A} de tamaño de poro, 5 \mum
de tamaño de partícula) (The Separations Group Inc., Hesperia, CA)
y una elución de gradiente lineal, (por ejemplo,
40-70% de B) con un sistema disolvente que consiste
en (A) TFA acuoso al 0,1% y (B) TFA al 0,1% en MeCN acuoso al 70%.
Se disuelven 500 mg de péptido bruto en AcOH/H_{2}O, se agitan,
se filtran y se aplican sobre una columna ODS Beckman Ultraprep
(21,2 x 150 mm, empaquetada con gel de sílice, 300 \ring{A} de
tamaño de poro, 10 \mum de tamaño de partícula). Se eluye la
columna con un sistema disolvente descrito anteriormente en un modo
de gradiente lineal (por ejemplo, 30-55% de B en 120
minutos); velocidad de flujo 6 ml/min. Se monitoriza el eluyente a
220 nm, y las fracciones se examinan mediante HPLC analítica. las
fracciones con pureza superior al 95% se agrupan y se liofilizan
para dar 98 mg de producto puro. Se lleva a cabo la HPLC analítica
en una columna de fase invertida Vydac C18 descrita anteriormente
utilizando una elución isocrática con un sistema disolvente descrito
anteriormente, con una velocidad de flujo de 0,2 ml/min. Se
monitorizan los picos a 220 y 280 nm. Se juzga que el producto es
sustancialmente (> 95%) puro mediante HPLC analítica. Se
comprueba la masa molecular mediante una espectrometría de masa por
electropulverización ("electro-spray"), y la
composición de aminoácidos esperada se confirma mediante análisis
de aminoácidos.
\hskip0.5cm(Péptido 3)
Se lleva a cabo la síntesis de manera progresiva
utilizando equipamiento manual de síntesis de péptidos en fase
sólida. Brevemente, se neutraliza resina de
para-metilbenzhidrilamina (MBHA) (Bachem,
California) (100 mg, 0,070 mmoles) con DIEA al 5% en
CH_{2}Cl_{2} y se lava según el protocolo descrito en la tabla
I. Se agita la disolución de
Boc-Har(NO_{2})-OH (83 mg,
0,25 mmoles) en DMF-CH_{2}Cl_{2} (1:1) con la
resina neutralizada y DIC (44 \mul, 0,275 mmoles) en un
equipamiento manual de síntesis de péptidos en fase sólida durante
1 hora. Tras la finalización de la reacción de acoplamiento se
prueba mediante la prueba de ninhidrina negativa, desprotección con
TFA al 50% en CH_{2}Cl_{2}, y neutralización con DIEA al 5% en
CH_{2}Cl_{2}, la cadena de péptidos se construye de manera
progresiva mediante el acoplamiento de los siguientes aminoácidos
protegidos en el orden indicado sobre la resina para obtener la
secuencia peptídica deseada:
Boc-D-Arg(Tos)-OH,
Boc-Nle-OH,
Boc-Ile-OH,
Boc-Asp(OcHx)-OH,
Boc-Gln-OH,
Boc-Leu-OH,
Boc-Leu-OH,
Boc-Lys(2ClZ)-OH,
Boc-Arg(Tos)-OH,
Boc-Ala-OH,
Boc-Ser(Bzl)-OH,
Boc-Leu-OH,
Boc-Gln-OH,
Boc-Abu-OH,
Boc-Leu-OH,
Boc-Val-OH,
Boc-Lys(2ClZ)-OH,
Boc-Arg(Tos)-OH,
Boc-Tyr(Me)-OH,
Boc-Har(NO_{2})-OH,
Boc-Asn-OH,
Boc-Thr(Bzl)-OH,
Boc-Phe(pCl)-OH,
Boc-Ile-OH,
Boc-Ala-OH,
Boc-Asp(OcHx)-OH,
Boc-D-Arg(Tos)-OH,
Boc-Tyr(2BrZ)-OH.
Estos residuos de aminoácido protegidos (también
disponibles, normalmente, de Bachem Co.) se representan
anteriormente según una convención bien aceptada. El grupo
protector adecuado para el grupo funcional de cadena lateral de
aminoácidos particulares aparece entre paréntesis. Los grupos OH de
las fórmulas anteriores indican que cada extremo carboxilo terminal
de residuo está libre.
Se acoplan los aminoácidos protegidos (0,25
mmoles de cada uno) con DIC (44 \mul, 0,275 mmoles) con las
excepciones de Boc-Asn-OH y
Boc-Gln-OH que se acoplan con sus
ésteres de HOBt preformados. Tras la retirada del grupo protector
N^{a}-Boc de Tyr^{1}, se acila el péptido con
ácido fenilacético (PhAc) (54 mg, 0,4 mmoles) utilizando DIC (70
\mul, 0,44 mmoles).
Con el fin de separar el péptido de la resina y
desprotegerlo, se agita la resina de péptido secada (206 mg) con
0,5 ml de m-cresol y 5 ml de fluoruro de hidrógeno
(HF) a 0ºC durante 1 hora. Tras la evaporación del HF a vacío, se
lava el remanente con dietiléter y acetato de etilo secos. Se
disuelve el péptido separado y desprotegido en ácido acético al 50%
y se separa de la resina mediante filtración. Tras la dilución con
agua y la liofilización, se obtienen 112 mg de producto bruto.
Se comprueba el péptido bruto mediante HPLC
analítica utilizando un cromatógrafo líquido de
Hewlett-Packard modelo HP-1090 con
una columna de fase invertida Vydac 218TP52 (2 x 250 mm, empaquetada
con gel de sílice C18, 300 \ring{A} de tamaño de poro, 5 \mum
de tamaño de partícula) (The Separations Group Inc., Hesperia, CA)
y una elución de gradiente lineal, (por ejemplo,
40-70% de B) con un sistema disolvente que consiste
en (A) TFA acuoso al 0,1% y (B) TFA al 0,1% en MeCN acuoso al 70%.
Se disuelven 80 mg de péptido bruto en AcOH/H_{2}O, se agitan, se
filtran y se aplican sobre una columna Vydac 218TP5010 (10 x 250 mm,
empaquetada con gel de sílice, 300 \ring{A} de tamaño de poro, 10
\mum de tamaño de partícula). Se eluye la columna con un sistema
disolvente descrito anteriormente en un modo de gradiente lineal
(por ejemplo, 30-55% de B en 120 minutos); velocidad
de flujo 2 ml/min. Se monitoriza el eluyente a 220 nm, y se
examinan las fracciones mediante HPLC analítica. Se agrupan las
fracciones con pureza superior al 95% y se liofilizan para dar 9,6
mg de producto puro. Se lleva a cabo la HPLC analítica en una
columna de fase invertida Vydac C18 descrita anteriormente
utilizando una elución isocrática con un sistema disolvente
descrito anteriormente, con una velocidad de flujo de 0,2 ml/min.
Se monitorizan los picos a 220 y 280 nm. Se juzga que el producto es
sustancialmente (> 95%) puro mediante HPLC analítica. Se
comprueba la masa molecular mediante una espectrometría de masa por
electropulverización, y se confirma la composición de aminoácidos
esperada mediante análisis de aminoácidos.
Se sintetizan el péptido 2, y los péptidos 4 a
30 de la misma manera que el péptido 1 y el péptido 3, excepto en
que estos péptidos contienen además otras sustituciones, para
dar:
| [IndAc^{0}, D-Arg^{2}, Phe(pCl)^{6}, Arg^{9}, Abu^{15}, Nle^{27}, D-Arg^{28}, Har29]hGH-RH(1-29)NH_{2} | Péptido 2 |
| [PhAc^{0}, D-Arg^{2}, Phe(pCl)^{6}, Har^{9}, Abu^{15}, Nle^{27}, D-Arg^{28}, Har^{29}]hGH-RH(1-29)NH_{2} | Péptido 4 |
| [Nac^{0}, D-Arg^{2}, Phe(pCl)^{6}, Arg^{9}, Abu^{15}, Nle^{27}, D-Arg^{28}, Har^{29}]hGH-RH(1-29)NH_{2} | Péptido 5 |
| [PhAc^{0}, D-Arg^{2}, Phe(pCl)^{6}, Arg^{9}, Tyr(Me)^{10}, Abu^{15}, Nle^{27}, D-Arg^{28}, Har^{29}]hGH-RH(1-29)NH_{2} | Péptido 6 |
| [PhAc^{0}, His^{1}, D-Arg^{2}, Phe(pCl)^{6}, Arg^{9}, Abu^{15}, Nle^{27}, D-Arg^{28}, Har^{29}]hGH-RH(1-29)NH_{2} | Péptido 7 |
| [Nac^{0}, His^{1}, D-Arg^{2}, Phe(pCl)^{6}, Arg^{9}, Abu^{15}, Nle^{27}, D-Arg^{28}, Har^{29}]hGH-RH(1-29)NH_{2} | Péptido 8 |
| [PhAc^{0}, D-Arg^{2}, Phe(pCl)^{6}, Arg^{9}, Abu^{15}, Nle^{27}, D-Arg^{29}]hGH-RH(1-29)NH_{2} | Péptido 9 |
| [PhAc^{0}, D-Arg^{2}, Phe(pCl)^{6}, Abu^{15}, Arg^{16}, Nle^{27}, D-Arg^{29}]hGH-RH(1-29)NH_{2} | Péptido 10 |
| [PhAc^{0}, D-Arg^{2}, Phe(pCl)^{6}, Abu^{15}, Nle^{27}, Arg^{28}, Har^{29}]hGH-RH(1-29)NH_{2} | Péptido 11 |
| [PhAc^{0}, D-Arg^{2}, Phe(pCl)^{6}, Nle^{9}, Abu^{15}, Nle^{27}, D-Arg^{29}]hGH-RH(1-29)NH_{2} | Péptido 12 |
| [PhAc^{0}, D-Arg^{2}, Phe(pCl)^{6}, Nle^{13}, Nle^{14}, Abu^{15}, Nle^{27}, D-Arg^{29}]hGH-RH(1-29)NH_{2} | Péptido 13 |
| [PhAc^{0}, D-Arg^{2}, Phe(pCl)^{6}, Nle^{15}, Nle^{27}, D-Arg^{29}]hGH-RH(1-29)NH_{2} | Péptido 14 |
| [PhAc^{0}, D-Arg^{2}, Phe(pCl)^{6}, Abu^{15}, Nle^{18}, Nle^{27}, D-Arg^{29}]hGH-RH(1-29)NH_{2} | Péptido 15 |
| [PhAc^{0}, D-Arg^{2}, Phe(pCl)^{6}, Tyr(Me)^{10}, Abu^{15}, Nle^{27}, D-Arg^{29}]hGH-RH(1-29)NH_{2} | Péptido 16 |
| [PhAc^{0}, D-Arg^{2}, Phe(pCl)^{6}, Abu^{8}, Tyr(Me)^{10}, Abu^{15}, Nle^{27}, D-Arg^{29}]hGH-RH(1-29)NH_{2} | Péptido 17 |
| [PhAc^{0}, D-Arg^{2}, Phe(pCl)^{6}, D-Abu^{8}, Tyr(Me)^{10}, Abu^{15}, Nle^{27}, D-Arg^{29}]hGH-RH(1-29)NH_{2} | Péptido 18 |
| [PhAc^{0}, D-Arg^{2}, Phe(pCl)^{6}, Tyr(Me)^{10}, Abu^{15}, D-Arg^{27}, Arg^{28}, D-Arg^{29}]hGH-RH(1-29)NH_{2} | Péptido 19 |
| [PhAc^{0}, D-Arg^{2}, Phe(pCl)^{6}, Tyr(Me)^{9}, Abu^{15}, D-Arg^{27}, Arg^{28}, D-Arg^{29}]hGH-RH(1-29)NH_{2} | Péptido 20 |
| [PhAc^{0}, D-Arg^{2}, Phe(pCl)^{6}, Abu^{15}, D-Arg^{27}, Arg^{28}, D-Arg^{29}]hGH-RH(1-29)NH_{2} | Péptido 21 |
| [PhAc^{0}, D-Arg^{2}, Phe(pCl)^{6}, Abu^{8}, Tyr(Me)^{10}, Abu^{15}, D-Arg^{27}, Arg^{28}, D-Arg^{29}]hGH-RH(1-29)NH_{2} | Péptido 22 |
[PhAc^{0}, D-Arg^{2},
Phe(pCl)^{6}, D-Abu^{8},
Tyr(Me)^{10}, Abu^{15},
D-Arg^{27}, Arg^{28},
D-Arg^{29}]hGH-RH(1-29)NH_{2}
Péptido 23
| [PhAc^{0}, D-Arg^{2}, Phe(pCl)^{6}, Lys^{9}, Abu^{15}, Nle^{27}, D-Arg^{28}, Har^{29}]hGH-RH(1-29)NH_{2} | Péptido 24 |
| [PhAc^{0}, D-Arg^{2}, Phe(pCl)^{6}, Orn^{9}, Abu^{15}, Nle^{27}, D-Arg^{28}, Har^{29}]hGH-RH(1-29)NH_{2} | Péptido 25 |
| [PhAc^{0}, D-Arg^{2}, Phe(pCl)^{6}, D-Arg^{9}, Abu^{15}, Nle^{27}, D-Arg^{28}, Har^{29}]hGH-RH(1-29)NH_{2} | Péptido 26 |
| [PhAc^{0}, D-Arg^{2}, Phe(pCl)^{6}, D-Har^{9}, Abu^{15}, Nle^{27}, D-Arg^{28}, Har^{29}]hGH-RH(1-29)NH_{2} | Péptido 27 |
| [PhAc^{0}, D-Arg^{2}, Phe(pCl)^{6}, D-Lys^{9}, Abu^{15}, Nle^{27}, D-Arg^{28}, Har^{29}]hGH-RH(1-29)NH_{2} | Péptido 28 |
| [PhAc^{0}, D-Arg^{2}, Phe(pCl)^{6}, D-Orn^{9}, Abu^{15}, Nle^{27}, D-Arg^{28}, Har^{29}]hGH-RH(1-29)NH_{2} | Péptido 29 |
| [PhAc^{0}, D-Arg^{2}, Phe(pCl)^{6}, Cit^{9}, Abu^{15}, Nle^{27}, D-Arg^{28}, Har^{29}]hGH-RH(1-29)NH_{2} | Péptido 30 |
Se probaron los péptidos de la presente
invención en ensayos in vitro e in vivo para
determinar su capacidad para inhibir la liberación de GH inducida
por
hGH-RH(1-29)NH_{2}.
Se probaron los análogos in vitro en un
ensayo descrito anteriormente (S. Vigh y A.V. Schally, Peptides
5:241-347, 1984) modificado (Z. Rekasi y A.V.
Schally, P.N.A.S. 90:2146-2149, 1993).
Brevemente, se preincuban las células con
péptidos durante 9 minutos (3 ml) a diversas concentraciones.
Inmediatamente después de la incubación, se administra
hGH-RH(1-29)NH_{2} 1
nM durante 3 minutos (1ml) [respuesta de minuto 0]. Para comprobar
la duración del efecto antagonista del análogo, se aplica
hGH-RH(1-29)NH_{2} 1
nM a los 30, 60, 90 y 120 minutos durante 3 minutos [respuesta de
minuto 30, 60, 90, 120]. Se evalúan los valores integrales netos de
las respuestas de GH. Se comparan las respuestas de GH con y se
expresan como porcentaje de la respuesta de GH original inducida
por
hGH-RH(1-29)NH_{2} 1
nM. Se compara el efecto de los nuevos antagonistas con el del
"antagonista estándar", [Ac-Tyr^{1},
D-Arg^{2}]hGH-RH(1-29)NH_{2}.
Se midieron los niveles de GH de rata en
alícuotas de muestras de super-perfusión sin diluir
y diluidas mediante radioinmunoensayo con doble anticuerpo
utilizando materiales facilitados por el Programa nacional de la
hipófisis y las hormonas ("National Hormone and Pituitary
Program"), Baltimore, Maryland. Los resultados de RIE se
analizaron mediante un programa informático desarrollado en nuestro
instituto (V. Csernus y A. V. Schally, en Neuroendocrine Research
Methods, Harwood Academia (GReenstein, B.D. ed., Londres, págs.
71-109, 1991), incorporado en el presente documento
mediante referencia. La variación entre ensayos fue inferior al 15%
y la variación intra ensayo fue inferior al 10%.
Ensayo de unión de GH-RH. Se
desarrolló un ensayo de unión de radiorreceptor sensible para
determinar las características de unión de los antagonistas de
GH-RH (G. Halmos, A.V. Schally et al.,
Receptor 3, 87-97, 1993), incorporado en el
presente documento mediante referencia. El ensayo se basa en la
unión de [His^{1},
Nle^{27}]hGH-RH(1-32)NH_{2}
marcado a homogeneizados de membrana de la hipófisis anterior de
rata. Se preparan derivados yodados de [His^{1},
Nle^{27}]hGH-RH(1-32)NH_{2}
mediante el método de cloramina-T (F.C. Greenwood
et al., Biochemistry 89: 114-123, 1963),
incorporado en el presente documento mediante referencia. Se
utilizan hipófisis de ratas macho Sprague-Dawley
(250 - 300 g) para preparar membranas en bruto. Para el análisis
saturación de unión, se incuban los homogeneizados de membrana con
al menos 6 concentraciones de [His^{1,}
^{125}I-Tyr^{10},
Nle^{27}]hGH-RH(1-32)NH_{2},
que oscilan desde 0,005 hasta 0,35 nM en presencia o ausencia de un
exceso de péptido sin marcar (1 \muM).
Se cuenta el aglomerado para determinar la
radioactividad en un contador-\gamma. Se
determinan las afinidades de los péptidos antagonistas probados
frente a los receptores de GH-RH de hipófisis de
rata en experimentos de unión competitivos. Se estiman las
afinidades de unión finales mediante K_{i} (constante de
disociación del complejo inhibidor-receptor) y se
determinan mediante los programas informáticos de PC Ligand y
McPherson de Munson y Rodbard (P.J. Munson y D. Rodbard, Anal.
Biochem. 107, 220-239, 1980). Se calculan afinidades
relativas en comparación con [Ac-Tyr^{1},
D-Arg^{2}]hGH-RH(1-29)NH_{2},
el antagonista estándar, como la razón de K_{i} del antagonista
de GH-RH probado con respecto a la K_{i} del
antagonista estándar.
Se probó el efecto antagonista de
GH-RH de los análogos en ratas macho jóvenes
Sprague-Dawley (200-250 g). En cada
experimento, se utilizaron 5 grupos de 7 animales cada uno. Se
disolvieron los compuestos (80 \mug/kg) y
GH-RH(1-29)NH_{2} (3
\mug/kg) en manitol al 5,5% y se administraron por vía intravenosa
en la vena yugular de las ratas bajo anestesia con Nembutal. El
tiempo transcurrido entre las administraciones del antagonista y
GH-RH varió entre los grupos, según el siguiente
programa. El primer grupo de animales recibió una inyección de
GH-RH 5 minutos después de la administración del
antagonista; para el segundo, tercero y cuarto grupo de animales,
el intervalo de tiempo transcurridos entre la inyección del
antagonista y la de GH-RH fue de 15, 30, y 60
minutos, respectivamente. Se inyectó primero al grupo control con el
disolvente solo en lugar del antagonista, seguido de una inyección
de GH-RH a los 5 minutos.
Se extrajeron muestras de sangre de 0,4 ml para
determinar RIE de GH antes de la administración del antagonista
("sangre 0"), y 5 minutos después de la inyección de
GH-RH ("sangre 1"). Se calculó la respuesta de
GH en cada grupo como rGH= (GH_{sangre \ 1}/GH_{sangre \ 0}),
media \pm E.E.M. de las diferencias individuales. Se calculó la
inhibición relativa de la respuesta de GH (%) en cada grupo tratado
como 100 x
(rGH_{tratado}-1)/(rGH_{control}-1).
Los resultados de las actividades antagonistas
in vitro probados en el sistema de hipófisis de rata
super-perfundida y el ensayo de unión se resumen en
la tabla II y tabla III, respectivamente. Tal como puede observarse
a partir de estos datos, las sustituciones presentes en las
moléculas producen un gran aumento en la unión del receptor así
como en la inhibición de la liberación de GH in vitro en
comparación con el antagonista estándar. El antagonista más potente
in vitro, el péptido 1, produjo una inhibición completa de la
liberación de GH inducida por GH-RH durante 90
minutos, en condiciones de prueba estándar. Se detectó el primer
signo de la recuperación de la capacidad de respuesta a
GH-RH a los 120 minutos de la exposición a este
análogo.
| Antagonista | Dosis | Inhibición de la liberación de GH (%) | ||||
| (nM) | ||||||
| 0 min | 30 min | 60 min | 90 min | 120 min | ||
| Antagonista estándar | 100 | 62,1 | 2,5 | 19 | ||
| Péptido 1 | 30 | 100 | 100 | 100 | 100 | 94 |
| Péptido 2 | 30 | 100 | 100 | 100 | 100 | 91 |
| Péptido 3 | 30 | 85 | 98 | 91 | 92 | 87 |
| Péptido 4 | 30 | 83 | 86 | 80 | 79 | 68 |
| Péptido 5 | 30 | 79 | 77 | 59 | 58 | 50 |
| Péptido 6 | 30 | 93 | 93 | 97 | 95 | 90 |
| Péptido 7 | 30 | 97 | 92 | 82 | 77 | 65 |
| Péptido 8 | 30 | 100 | 100 | 98 | 97 | 90 |
| Péptido 9 | 30 | 91 | 87 | 79 | 72 | 59 |
| Péptido 10 | 30 | 75 | 69 | 46 | 24 | 22 |
| Péptido 11 | 30 | 96 | 89 | 80 | 56 | 42 |
| Péptido 12 | 30 | 68 | 75 | 48 | 52 | 52 |
| Péptido 16 | 30 | 65 | 87 | 83 | 56 | 65 |
| Péptido 19 | 30 | 58 | 47 | 59 | 23 | 39 |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
| Péptido | K_{i} (nM) | A.R. | |
| Estándar | 2,94 | 1 | |
| Péptido 1 | 0,044 | 67 | |
| Péptido 2 | 0,046 | 64 | |
| Péptido 3 | 0,068 | 43 | |
| Péptido 4 | 0,087 | 34 | |
| Péptido 5 | 0,036 | 82 | |
| Péptido 9 | 0,058 | 51 | |
| Péptido 10 | 0,107 | 27 | |
| Péptido 11 | 0,071 | 41 | |
| Péptido 12 | 0,070 | 42 | |
| Péptido 16 | 0,070 | 42 |
La tabla IV muestra las respuestas de GH en
suero y sus inhibiciones relativas en ratas pretratadas con
antagonistas de GH-RH. Todos los análogos probados
(péptido 1, péptido 2, péptido 3, péptido 4, péptido 8, péptido 9,
péptido 11 y péptido 16) producen una inhibición fuerte y duradera
de la liberación de GH estimulada por
hGH-RH(1-29)NH_{2}.
El péptido 1 y el péptido 2 son los más potentes a corto plazo,
inhibiendo la respuesta de GH en un 95% y un 91%, cuando se dan 5
minutos antes de
hGH-RH(1-29)NH_{2}.
El efecto de estos dos péptidos dura durante al menos 30 minutos.
Por otra parte, los péptidos, péptido 11 y péptido 3, que son
ligeramente menos potentes a corto plazo, son de acción prolongada
extremadamente: su efecto persiste durante al menos 60 minutos.
\vskip1.000000\baselineskip
| Antagonista | Intervalo de | Media de respuesta | % de inhibición | |
| tiempo (min) | de GH \pm E.E.M. | relativa | ||
| Péptido 1 | 5 | 1,13 \pm 0,13 | 95 | |
| 15 | 1,87 \pm 0,13 | 68 | ||
| 30 | 1,97 \pm 0,16 | 64 | ||
| 60 | 3,89 \pm 0,65 | -8 | ||
| control | 3,68 \pm 0,78 | 0 | ||
| Péptido 2 | 5 | 1,40 \pm 0,29 | 91 | |
| 15 | 3,45 \pm 0,13 | 45 | ||
| 30 | 3,64 \pm 0,71 | 41 | ||
| 60 | 5,41 \pm 1,35 | 2 | ||
| control | 5,47 \pm 0,97 | 0 | ||
| Péptido 3 | 5 | 3,01 \pm 0,41 | 68 | |
| 15 | 3,63 \pm 0,80 | 61 | ||
| 30 | 4,89 \pm 0,95 | 41 | ||
| 60 | 5,36 \pm 0,63 | 34 | ||
| control | 7,65 \pm 0,66 | 0 | ||
| Péptido 4 | 5 | 3,08 \pm 0,58 | 82 | |
| 15 | 7,73 \pm 1,12 | 43 | ||
| 30 | 12,00 \pm 2,54 | 7 | ||
| 60 | 11,88 \pm 0,90 | 8 | ||
| control | 12,82 \pm 1,38 | 0 | ||
| Péptido 8 | 5 | 2,3 \pm 0,3 | 74 | |
| 15 | 3,6 \pm 0,4 | 46 | ||
| 30 | 5,5 \pm 0,6 | 8 | ||
| 60 | 5,8 \pm 0,7 | 1 | ||
| control | 5,8 \pm 0,5 | 0 | ||
| Péptido 9 | 5 | 2,75 \pm 0,75 | 75 | |
| 15 | 3,85 \pm 0,50 | 59 | ||
| 30 | 3,34 \pm 0,30 | 67 | ||
| 60 | 7,32 \pm 1,16 | 10 | ||
| Péptido 11 | 5 | 5,15 \pm 1,11 | 84 | |
| 15 | 13,64 \pm 1,41 | 50 | ||
| 30 | 16,04 \pm 4,36 | 40 | ||
| 60 | 16,61 \pm 6,02 | 38 | ||
| control | 26,17 \pm 3,92 | 0 | ||
| Péptido 16 | 5 | 2,89 \pm 0,65 | 77 | |
| 15 | 3,44 \pm 0,62 | 70 | ||
| 30 | 5,24 \pm 1,36 | 48 | ||
| 60 | 9,19 \pm 1,89 | 0 | ||
| control | 9,13 \pm 1,69 | 0 |
\newpage
Se probaron las actividades antitumorales de los
péptidos de la presente invención en diversos modelos de cáncer. Se
compararon los efectos antitumorales de estos nuevos péptidos con
los de análogos anteriores (MZ-4-71
y MZ-5-156, objetos de la patente de
los EE.UU. 5.550.212 y la solicitud de patente de los EE.UU.
08/642.472.
Se transplantaron de manera subcutánea (s.c.)
tumores MXT estrógeno-independientes en ratones
hembra BDF. Un día después del transplante, se dividieron los
ratones en grupos de 10 animales cada uno, y se comenzó el
tratamiento. Los ratones de los grupos 1, 2, 3 y 4 recibieron
diariamente inyecciones únicas de diversos antagonistas de
GH-RH por vía sc. a una dosis de 20 \mug por día
durante 18 días. En los grupos 5 y 6, se administraron los péptidos
mediante bombas osmóticas Alzet que liberaban una cantidad diaria de
20 \mug de péptido. Se midieron los tumores regularmente, y se
calculó el volumen tumoral. Se sacrificaron los ratones en el día
18 y se midieron los pesos de los
tumores.
tumores.
Los péptidos, péptido 1 y péptido 3, tuvieron un
efecto inhibidor fuerte similar sobre los cánceres mamarios de
ratón MXT. El tratamiento con
MZ-5-156 también dio como resultado
una inhibición significativa del crecimiento tumoral, pero su
efecto fue más débil que el del péptido 1 o el péptido 3 (véanse la
tabla V y la figura I).
| Grupo | Volumen del tumor (mm^{3}) | Pesos del tumor | Número de ratones | |
| (mg) | que sobreviven | |||
| En el día 14 | En el día 18 | |||
| 1. Control | 4051 \pm 1007 | 7040 \pm 646 | 7269 \pm 292 | 5 |
| 2. MZ-5-156 | 2717 \pm 773 | 5368 \pm 408* | 4885 \pm 480* | 4 |
| 3. Péptido 1 inyección | ||||
| \; \; diaria | 2924 \pm 654 | 4373 \pm 381** | 6964 \pm 676 | 6 |
| 4. Péptido 3 inyección | ||||
| \; \; diaria | 1902 \pm 349** | 3465 \pm 607** | 5266 \pm 906 | 8 |
| 5. Péptido 1 bomba | 1329 \pm 327** | 3403 \pm 584** | 4810 \pm 645* | 7 |
| 6. Péptido 3 bomba | 1688 \pm 220** | 4272 \pm 295** | 5939 \pm 453 | 8 |
| *p<0,05 \; **p<0,01 |
Se dividieron ratones desnudos que portaban
xenoinjertos de cáncer de mama humano
hormona-independiente
MDA-MB-468 en grupos de 10 animales
cada uno. Los grupos tratados recibieron inyecciones únicas diarias
por vía s.c. de 20 \mug de antagonistas de GH-RH.
Se trató un grupo con péptido 1, se trató un segundo grupo con
MZ-5-156 para la comparación. Se
inyectó el grupo control con el disolvente vehículo. Se continuó el
tratamiento durante 5 semanas. Se midieron los tumores una vez a la
semana y se calculó el volumen tumoral. Se sacrificaron los ratones
al final del experimento y se midieron los pesos de los tumores.
Ambos péptidos ejercieron efectos inhibidores de
tumor significativos sobre xenoinjertos de
MDA-MB-468. En el grupo inyectado
con el péptido 1, mostraron 4 tumores una regresión constante
durante el experimento. De manera similar, el
MZ-5-156 provocó la regresión de 3
tumores. A las 5 semanas de tratamiento estos cánceres
experimentaron una regresión hasta remanentes titulares similares a
pequeñas cicatrices. El examen histológico de estos tejidos reveló
tumores epiteliales sin diferenciar con una necrosis extensiva y
sólo una línea marginal estrecha de tejido tumoral vivo. Por el
contrario, aumentaron todos los tumores en los animales control a
un ritmo constante. Se redujeron significativamente el volumen y el
peso de los tumores finales en los grupos tratados (véanse la tabla
VI y la figura II), teniendo el péptido 1 el efecto más fuerte.
| Grupo | Volumen del tumor final | Peso del tumor | Número de tumores que | |
| (mm^{3}) | (mg) | experimentaron regresión | ||
| Control | 477,5 \pm 41,2 | 440,7 \pm 37,7 | 0 | |
| Péptido 1 | 82,4 \pm 29,1** | 64,0 \pm 28,7** | 4 | |
| MZ-5-156 | 104,4 \pm 32,2** | 77,7 \pm 31,7** | 3 | |
| +p<0,05 \; **p<0,01 |
Se transplantaron de manera s.c. cánceres de
colon humano HT-29 en ratones desnudos macho. A los
19 días del transplante, se dividieron los ratones en grupos de 10
animales cada uno, y se comenzó el tratamiento. Los ratones
recibieron diariamente inyecciones únicas de diversos antagonistas
de GH-RH por vía s.c. a una dosis de 20 \mug por
día durante 6 semanas. Se midieron los tumores regularmente, y se
calculó el volumen tumoral. Se sacrificaron los ratones al final
del experimento y se midieron los pesos de los tumores.
Los péptidos, péptido 1 y
MZ-5-156, tuvieron un efecto
inhibitorio igualmente fuerte sobre cánceres de colon humano
HT-29. El tratamiento con péptido 9 dio como
resultado una inhibición menos, pero todavía significativa, del
crecimiento tumoral. El péptido 11 y
MZ-4-71 sólo tuvieron poco efecto no
significativo. (Los resultados se resumen en la tabla VII y la
figura III).
\vskip1.000000\baselineskip
| Grupo | Volumen del tumor final | Peso del tumor | |
| (mm^{3}) | (mg) | ||
| Control | 2117 \pm 751 | 2364 \pm 835 | |
| MZ-4-71 | 1953 \pm 400 | 2189 \pm 458 | |
| MZ-5-156 | 908 \pm 195* | 1012 \pm 174* | |
| Péptido 11 | 1663 \pm 610 | 1849 \pm 681 | |
| Péptido 9 | 1194 \pm 506* | 1383 \pm 576* | |
| Péptido 1 | 890 \pm 322* | 1354 \pm 480* | |
| *p<0,05 |
\vskip1.000000\baselineskip
Se implantaron glioblastomas U87MG por vía s.c.
en ratones y cuando los tumores alcanzaron un volumen de
aproximadamente 70 mm^{3} se dividieron los ratones
aleatoriamente en 2 grupos experimentales. Se trató un grupo con
péptido 1 en inyecciones diarias únicas por vía s.c. de 20 \mug
durante 28 días, mientras que el otro grupo sirvió como
control.
El tratamiento con péptido 1 inhibió el
crecimiento tumoral en un 77% frente al grupo control, tras 4
semanas de tratamiento (véase la tabla VIII y la figura IV).
\vskip1.000000\baselineskip
| Grupo | Volumen del tumor final | Peso del tumor | |
| (mm^{3}) | (g) | ||
| Control | 3425 \pm 723 | 4,7 \pm 1,3 | |
| Péptido 1 | 817 \pm 323** | 1,4 \pm 0,7** | |
| **p<0,01 |
\vskip1.000000\baselineskip
Se implantaron por vía s.c. piezas de 3 mm^{3}
de tejido de cáncer de próstata
hormona-independiente humano PC-3
en ambos flancos de ratones desnudos macho. Cuando los tumores
alcanzaron un volumen de aproximadamente 40-50
mm^{3} se dividieron los ratones en 3 grupos experimentales. Se
trataron el primer y el segundo grupos con péptidos, péptido 3 y
Mz-5-156, respectivamente, en
inyecciones diarias únicas por vía s.c. de 20 \mug durante 21
días, mientras que el tercer grupo sirvió como control. Se midieron
los volúmenes de los tumores a intervalos semanales, se midieron
los pesos de los tumores al final del experimento.
Ambos antagonistas de GH-RH
inhibieron el crecimiento de tumores PC-3 (véanse la
tabla IX y la figura V). El péptido 3 ejerció una inhibición de
crecimiento más fuerte (un 65% de inhibición en el volumen del tumor
y un 62% en el peso del tumor) que el
MZ-5-156 (un 52% y un 46%,
respectivamente).
\vskip1.000000\baselineskip
| Grupo | Volumen del tumor final | Peso del tumor | |
| (mm^{3}) | (mg) | ||
| Control | 307,9 \pm 64,5 | 191,8 \pm 42,6 | |
| Péptido 3 | 107,9 \pm 12,5* | 73,7 \pm 11,9* | |
| MZ-5-156 | 148,9 \pm 41 | 104,3 \pm 27,2 | |
| *p<0,05 |
Claims (17)
1. Péptido seleccionado del grupo que tiene la
fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
X-R^{1}-R^{2}-Asp-Ala-R^{5}-R^{6}-Thr-R^{8}-R^{9}-R^{10}-Arg-R^{12}-R^{13}-R^{14}-R^{15}-R^{16}-Leu-R^{18}-R^{19}-Arg-R^{21}-R^{22}-Leu-Gln-Asp-Ile-R^{27}-R^{28}-R^{29}-NH_{2}
\vskip1.000000\baselineskip
en la que X es PhAc, IndAc, lbu,
Nac, 1- o 2-Npr, o
Fpr,
R^{1} es Tyr o His,
R^{2} es D-Arg o
D-Cit,
R^{5} es Ile o Val,
R^{6} es Phe, Nal o Phe(Y), en el que Y
= F, Cl, Br,
R^{8} es Asn, Gln, Ser, Thr, Ala,
D-Asn, D-Gln, D-Ser,
D-Thr, Abu, D-Abu, o Aib,
R^{9} es Arg, Har, Lys, Orn,
D-Arg, D-Har, D-Lys,
D-Orn o Cit,
R^{10} es Tyr o Phe(Y), en el que Y =
H, F, Cl, Br, o OCH_{3},
R^{12} es Lys, D-Lys, u
Orn,
R^{13} es Val o Nle,
R^{14} es Leu o Nle,
R^{15} es Gly, Ala, Abu, Nle o Gln,
R^{16} es Gln o Arg,
R^{18} es Ser o Nle,
R^{19} es Ala o Abu,
R^{21} es Lys u Orn,
R^{22} es Leu, Ala o Aib,
R^{27} es Met, Leu, Nle, Abu, o
D-Arg,
R^{28} es Arg o D-Arg,
R^{29} es Arg, D-Arg, Har o
D-Har,
y sales farmacéuticamente aceptables de los
mismos.
2. Compuesto según la reivindicación 1
seleccionado del grupo que consiste en
3. Compuesto según la reivindicación 1 que tiene
la fórmula [PhAc^{0}, D-Arg^{2},
Phe(pCl)^{6}, Arg^{9}, Abu^{15}, Nle^{27},
D-Arg^{28},
Har^{29}]hGH-RH(1-29)NH_{2}
Péptido 1.
4. Compuesto según la reivindicación 1 que tiene
la fórmula [IndAc^{0}, D-Arg^{2},
Phe(pCl)^{6}, Arg^{9}, Abu^{15}, Nle^{27},
D-Arg^{28},
Har^{29}]hGH-RH(1-29)NH_{2}
Péptido 2.
5. Compuesto según la reivindicación 1 que tiene
la fórmula [PhAc^{0}, D-Arg^{2},
Phe(pCl)^{6}, Har^{9},
Tyr(Me)^{10}, Abu^{15}, Nle^{27},
D-Arg^{28},
Har^{29}]hGH-RH(1-29)NH_{2}
Péptido 3.
6. Compuesto según la reivindicación 1 que tiene
la fórmula [PhAc^{0}, D-Arg^{2},
Phe(pCl)^{6}, Arg^{9},
Tyr(Me)^{10}, Abu^{15}, Nle^{27},
D-Arg^{28},
Har^{29}]hGH-RH(1-29)NH_{2}
Péptido 6.
7. Compuesto según la reivindicación 1 que tiene
la fórmula [PhAc^{0}, His^{1}, D-Arg^{2},
Phe(pCl)^{6}, Arg^{9}, Abu^{15}, Nle^{27},
D-Arg^{28},
Har^{29}]hGH-RH(1-29)NH_{2}
Péptido 7.
8. Compuesto según la reivindicación 1 que tiene
la fórmula [Nac^{0}, His^{1}, D-Arg^{2},
Phe(pCl)^{6}, Arg^{9}, Abu^{15}, Nle^{27},
D-Arg^{28},
Har^{29}]hGH-RH(1-29)NH_{2}
Péptido 8.
9. Uso de un polipéptido seleccionado del grupo
que tiene la fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
X-R^{1}-R^{2}-Asp-Ala-R^{5}-R^{6}-Thr-R^{8}-R^{9}-R^{10}-Arg-R^{12}-R^{13}-R^{14}-R^{15}-R^{16}-Leu-R^{18}-R^{19}-Arg-R^{21}-R^{22}-Leu-Gln-Asp-Ile-R^{27}-R^{28}-R^{29}-NH_{2}
\vskip1.000000\baselineskip
en la que X es PhAc, IndAc, lbu,
Nac, 1- o 2-Npr, o
Fpr,
R^{1} es Tyr o His,
R^{2} es D-Arg o
D-Cit,
R^{5} es Ile o Val,
R^{6} es Phe, Nal o Phe(Y), en el que Y
= F, Cl, Br,
R^{8} es Asn, Gln, Ser, Thr, Ala,
D-Asn, D-Gln, D-Ser,
D-Thr, Abu, D-Abu, o Aib,
R^{9} es Arg, Har, Lys, Orn,
D-Arg, D-Har, D-Lys,
D-Orn o Cit,
R^{10} es Tyr o Phe(Y), en el que Y =
H, F, Cl, Br, o OCH_{3},
R^{12} es Lys, D-Lys, u
Orn,
R^{13} es Val o Nle,
R^{14} es Leu o Nle,
R^{15} es Gly, Ala, Abu, Nle o Gln,
R^{16} es Gln o Arg,
R^{18} es Ser o Nle,
R^{19} es Ala o Abu,
R^{21} es Lys u Orn,
R^{22} es Leu, Ala o Aib,
R^{27} es Met, Leu, Nle, Abu, o
D-Arg,
R^{28} es Arg o D-Arg,
R^{29} es Arg, D-Arg, Har o
D-Har,
y sales farmacéuticamente aceptables de los
mismos, para la preparación de un medicamento para la supresión de
los niveles excesivos de GH.
\newpage
10. Uso de un polipéptido seleccionado del grupo
que tiene la fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
X-R^{1}-R^{2}-Asp-Ala-R^{5}-R^{6}-Thr-R^{8}-R^{9}-R^{10}-Arg-R^{12}-R^{13}-R^{14}-R^{15}-R^{16}-Leu-R^{18}-R^{19}-Arg-R^{21}-R^{22}-Leu-Gln-Asp-Ile-R^{27}-R^{28}-R^{29}-NH_{2}
\vskip1.000000\baselineskip
en la que X es PhAc, IndAc, lbu, Nac, 1- o
2-Npr, o Fpr,
R^{1} es Tyr o His,
R^{2} es D-Arg o
D-Cit,
R^{5} es Ile o Val,
R^{6} es Phe, Nal o Phe(Y), en el que Y
= F, Cl, Br,
R^{8} es Asn, Gln, Ser, Thr, Ala,
D-Asn, D-Gln, D-Ser,
D-Thr, Abu, D-Abu, o Aib,
R^{9} es Arg, Har, Lys, Orn,
D-Arg, D-Har, D-Lys,
D-Orn o Cit,
R^{10} es Tyr o Phe(Y), en el que Y =
H, F, Cl, Br, o OCH_{3},
R^{12} es Lys, D-Lys, u
Orn,
R^{13} es Val o Nle,
R^{14} es Leu o Nle,
R^{15} es Gly, Ala, Abu, Nle o Gln,
R^{16} es Gln o Arg,
R^{18} es Ser o Nle,
R^{19} es Ala o Abu,
R^{21} es Lys u Orn,
R^{22} es Leu, Ala o Aib,
R^{27} es Met, Leu, Nle, Abu, o
D-Arg,
R^{28} es Arg o D-Arg,
R^{29} es Arg, D-Arg, Har o
D-Har,
y sales farmacéuticamente aceptables de los
mismos, para la preparación de un medicamento para tratar un cáncer
que porta receptores para IGF-I o -II.
11. Uso de un polipéptido seleccionado del grupo
que tiene la fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
X-R^{1}-R^{2}-Asp-Ala-R^{5}-R^{6}-Thr-R^{8}-R^{9}-R^{10}-Arg-R^{12}-R^{13}-R^{14}-R^{15}-R^{16}-Leu-R^{18}-R^{19}-Arg-R^{21}-R^{22}-Leu-Gln-Asp-Ile-R^{27}-R^{28}-R^{29}-NH_{2}
\vskip1.000000\baselineskip
en la que X es PhAc, IndAc, lbu,
Nac, 1- o 2-Npr, o
Fpr,
R^{1} es Tyr o His,
R^{2} es D-Arg o
D-Cit,
R^{5} es Ile o Val,
R^{6} es Phe, Nal o Phe(Y), en el que Y
= F, Cl, Br,
R^{8} es Asn, Gln, Ser, Thr, Ala,
D-Asn, D-Gln, D-Ser,
D-Thr, Abu, D-Abu, o Aib,
R^{9} es Arg, Har, Lys, Orn,
D-Arg, D-Har, D-Lys,
D-Orn o Cit,
R^{10} es Tyr o Phe(Y), en el que Y =
H, F, Cl, Br, o OCH_{3},
R^{12} es Lys, D-Lys, u
Orn,
R^{13} es Val o Nle,
R^{14} es Leu o Nle,
R^{15} es Gly, Ala, Abu, Nle o Gln,
R^{16} es Gln o Arg,
R^{18} es Ser o Nle,
R^{19} es Ala o Abu,
R^{21} es Lys u Orn,
R^{22} es Leu, Ala o Aib,
R^{27} es Met, Leu, Nle, Abu, o
D-Arg,
R^{28} es Arg o D-Arg,
R^{29} es Arg, D-Arg, Har o
D-Har,
y sales farmacéuticamente aceptables de los
mismos, para la preparación de un medicamento para la inhibición de
niveles de IGF-II en tumores (cánceres) y la
expresión de ARN_{m} de IGF-II en los mismos
tumores.
12. Uso según la reivindicación 9 que comprende
utilizar un compuesto que tiene la fórmula
13. Uso según la reivindicación 9 que comprende
utilizar un compuesto que tiene la fórmula
14. Uso según la reivindicación 10 que comprende
utilizar un compuesto que tiene la fórmula
15. Uso según la reivindicación 10 que comprende
utilizar un compuesto que tiene la fórmula
16. Uso según la reivindicación 11 que comprende
utilizar un compuesto que tiene la fórmula
17. Uso según la reivindicación 11 que comprende
utilizar un compuesto que tiene la fórmula
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