ES2200178T3 - Analogos de hgh-rh(1-29)nh2 que tienen actividad antagonista. - Google Patents
Analogos de hgh-rh(1-29)nh2 que tienen actividad antagonista.Info
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Abstract
SE EXPONE UN PEPTIDO DEL GRUPO QUE TIENE LAS FORMULAS: AL ) X - R 1 - R 2 - R 3 - R 4 - R 5 R 6 - THR - R 8 - R 9 - R 10 - R 11 R SUP,12 - VAL - LEU - R 15 - GLN - LEU - SER - R 19 - R 20 - R 21 - LEU - LEU - GLN - ASP - ILE R 27 - R 28 - R 29 , EN DONDE X ES H, AC, AQC, IAC, BRPROP, FOR, IBU, NAC, 2 - NAC, 1 - O 2 - NPT, 1 - O 2 NPR, PHAC, FPR O CUALQUIER OTRO GRUPO ACILO AROMATICO O NO POLAR, R 1 ES TYR, HIS O PHE(Y), EN DONDE Y = H, F, CL, BR, NO 2 , NH2 , CH 3 O OCH 3 , R 2 ES D ARG, D - CIT, D - HAR, D - LYS, D - TIC O D - OM, R 3 ES ASP, D - ASP, ALA, D - ALA O GLY, R 4 ES ALA, ABU O GLY, R 5 ES ILE, ALA O GLY, R 6 ES PHE, TIC, ALA, PRO, TPI, NAL O PHE(Y), EN DONDE Y = H, F, CL, BR, NO 2 , NH 2 , CH 3 U OCH 3 , R 8 ES ASN, GLN, SER, THR, VAL, LEU, ILE, ALA, D - ALA, D - ASN, D - GLN, D - THR, D - LEU, ABU, D - ABU, NLE O AIB, R 9 ES SER, R 10 ES TYR O PHE(Y), EN DONDE Y = H, F, CL, BR, NO 2 , CH 3 U OCH 3 , R 11 ES ARG, D - ARG O CIT, R 12 ES LYS, D - LYS, CIT, D - CIT, OM, D - OM, NLE O ALA, R 15 ES GLY, ALA, ABU O GLN, R SUP,19 ES ALA O ABU, R 20 ES ARG, D - ARG O CIT, R 21 ES LYS, D - LYS, OM O CIT, R 27 ES MET, NLE O ABU, R 28 ES SER, ASN, ASP, ALA O ABU, R 29 ES AGM, ARG - NH SU B,2 , ARG - OH, CIT - NH 2 , CIT - OH, HAR NH 2 O HAR - OH, Y BE ) X - A 1 - B 2 - A 3 - R 4 R 5 - R 6 - THR - A 8 - SER R 10 - R 1 1 - B 12 - VAL - LEU - R 15 A 16 - A 17 SER - R 19 - R 20 - B 21 - LEU - LEU - GLN - A SUP,25 - ILE - R 27 - R 28 B 29 , EN DONDE SE FORMA UN PUENTE DE LACTAMO ENTRE CUALQUIERA DE LOS PARES DE POSICIONES 1,2; 2,3; 8,12; 16,20; 1721; 21,25; 25,29 O DE AMBAS POSICIONES 8,12 Y 21,25, Y X ES H, AC, AQC, IAC, BRPROP, FOR, IBU, NAC, 2 - NAC, 1 - O 2 - NPT, 1 O 2 - NPR, PHAC, FPR O CUALQUIER OTRO GRUPO ACILO AROMATICO O NO POLAR, A ES GLU, D - GLU, GLN, ASP, D - ASP, ASN, ABU, LEU, TYR, HIS, PHE(Y), EN DONDE Y = H, F, CL, BR, NO 2 , NH 2 , CH 3 U OCH 3 , SER, THR, VAL, ILE, ALA, D - ALA, D ASN, D - GLN, D - THR, D - LEU, ABU, D - ABU, NLE O AIB, B ES LYS, D - LYS, ARG, D - ARG, OM, D - OM O AGM; R 4 ES ALA, ABU O GLY, R 5 ES I LE, ALA O GLY, R 6 ES PHE, TIC, TPI, NAL O PHE(Y), EN DONDE Y = H, F, CL, BR, NO 2 , NH 2 , CH 3 U OCH SUB ,3 , R 10 ES TYR O PHE(Y), EN DONDE Y = H, F, CL, BR, NO SUB,2 , NH 2 , CH 3 U OCH 3 , R 15 ES GLY, A LA, ABU O GLN, R 27 ES MET, NLE O ABU, R 28 ES SER, ASN, ASP, ALA O ABU Y SUS SALES FARMACEUTICAMENTE ACEPTABLES.
Description
Análogos de
hGH-RH(1-29)NH_{2}
que tienen actividad antagonista.
La presente invención se refiere a péptidos
sintéticos novedosos que inhiben la liberación de la hormona del
crecimiento de la pituitaria en mamíferos, y a composiciones
terapéuticas que contienen estos péptidos novedosos.
La hormona del crecimiento ("GH") es un
péptido que tiene 191 aminoácidos, que estimula la producción de
numerosos factores de crecimiento diferentes, por ejemplo,
IGF-1, y así promueve el crecimiento de numerosos
tejidos (esqueleto, tejido conjuntivo, músculo y víscera) y
actividades fisiológicas (aumentando la síntesis de ácidos
nucleicos y proteínas y la lipólisis, pero disminuyendo la
secreción de urea).
La liberación de la GH está controlada por los
factores de liberación e inhibición segregados por el hipotálamo.
El factor de liberación principal es la hormona liberadora de la
hormona del crecimiento (''GH-RH); la hormona
liberadora de la hormona del crecimiento humana
(''hGH-RH'') es un péptido que tiene 44
aminoácidos. Los péptidos novedosos de la presente invención se
refieren a análogos de la hGH-RH que tienen sólo
los restos 1 a 29
(''hGH-RH(1-29)NH_{2}''),
es decir, a análogos del péptido que tienen la secuencia de
aminoácidos:
Tyr-Ala-Asp-Ala-lle^{5}-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr^{10}-Arg-Lys-Val-Leu-Gly^{15}
-GIn-Leu-Ser-Ala-Arg^{20}-Lys-Leu-Leu-Gin-Asp^{25}-lle-Met-Ser-Arg^{29}-NH_{2}
La GH se ha implicado en varias enfermedades. Una
enfermedad en la que está implicada la GH es la acromegalia, en la
que hay presentes niveles excesivos de GH. Los huesos faciales y de
las extremidades anormalmente dilatados de esta enfermedad se
pueden tratar administrando un antagonista de la
GH-RH.
Otras enfermedades que implican la GH son la
retinopatía diabética y nefropatía diabética. El daño a la retina y
riñones respectivamente en estas enfermedades, que se cree que se
debe a la GH, da como resultado la ceguera o reducción de la
función renal. Sin embargo, este daño se puede prevenir o retrasar
por la administración de un antagonista de la GH-RH
eficaz.
En un esfuerzo para intervenir en estas
enfermedades y otros estados, algunos investigadores han intentado
controlar los niveles de GH usando somatostatina, un inhibidor de
la liberación de la GH. Sin embargo, la somatostatina, si se
administra sola, no suprime los niveles de la GH o
IGF-1 en un grado deseado. Si se administrara
combinada con un antagonista de la GH-RH, la
somatostatina mejoraría la supresión de los niveles de
IGF-I mucho mejor.
Otros autores han investigado diferentes
modificaciones de la GH-RH para elucidar la relación
entre la estructura de la GH-RH y su actividad en
un esfuerzo de proporcionar congéneres sintéticos con mejores
propiedades agonistas o antagonistas. (La síntesis puede ser por un
método en fase sólida, descrito en la patente de EE.UU. 4.914.189,
o en fase líquida como se describe en la patente de EE.UU.
4.707.541). Así, en un estudio, se encontró que la síntesis de la
GH-RH sin su resto N-terminal -- es
decir, formación de
hGH-RH(2-44) -- da como
resultado un análogo que tiene actividad de liberación de la GH que
es sólo 0,1% de la GH-RH. En contraste, la síntesis
de un análogo de la GH-RH sin sus restos 30 a 44 --
es decir, síntesis de
hGH-RH(1-29)NH_{2}''
-- da como resultado un análogo que retiene el 50% o más de la
potencia natural de la hGH-RH. La síntesis de
análogos incluso más cortos -- por ejemplo,
GH-RH(1-28)NH_{2} o
GH-RH(1 -27)NH_{2} -- dio como
resultado una bioactividad sustancialmente menor. Estos resultados
indican que la secuencia 1-29 es importante para la
bioactividad de la GH-RH.
En otro estudio se encontró que la acetilación
del resto aminoácido N-terminal de la
GH-RH, o su sustitución por un isómero D --
formando así [Ac-Tyr^{1}]GH- RH o
[D-Tyr^{1}]GH-RH --
disminuye la capacidad de los análogos para liberar la GH al
2-3% de la GH-RH. Estos análogos
también tienen menos afinidad in vitro por los sitios de
unión de la GH-RH. En contraste, se encuentra que
la acetilación del grupo alfa-amino del resto 1 de
la
hGH-RH(1-29)NH_{2}
-- formando así
[AcTyr^{1}]hGH-RH(1-29)NH_{2}
-- aumenta la potencia in vivo frente a la de
GH-RH en 10 o más veces.
En otros estudios, se encontró que
[Ac-Tyr^{1},
D-Arg^{2}]hGH-RH(1-29)NH_{2}
antagoniza la activación de la adenilato-ciclasa de
la pituitaria anterior de rata por la
hGH-RH(1-29)NH_{2}.
Se encontró que el mismo péptido bloquea la acción de la
GH-RH en sus receptores en la pituitaria y el
hipotálamo, e inhibe la secreción intermitente de la hormona del
crecimiento.
Algunas modificaciones descritas de la
GH-RH, han dado como resultado actividad agonista.
La patente de EE.UU. 4.659.693 describe agonistas de la
hGH-RH(1-29) que tienen la
fórmula:
R^{1}-R^{2}-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-
Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-lle-R^{27}-Ser-Arg-NH_{2},
en la que R^{1} es H, Tyr o His; R^{2} puede
ser diferentes restos; y R^{27} es Nle. Se dice que estos
agonistas estimulan la liberación del factor de liberación de la
hormona del crecimiento (''GRF'') y por lo tanto son adecuados en
composiciones farmacéuticas. (''GRF'' es simplemente un sinónimo de
la GH-RH, y en lo sucesivo se usa esta última
abreviatura, a pesar del uso de GRF en el documento de EE.UU.
4.659.693 y otras
publicaciones).
La patente de EE.UU. 4.914.189 describe otros
análogos de la GH-RH que son agonistas. En estos
agonistas, el grupo del extremo N terminal Q^{1}CO-, donde
Q^{1} significa ciertos grupos alquilo omega o
alfa-omega-sustituidos, puede ser
Tyr o desamino-Tyr; el grupo del extremo C terminal
NH-Q^{2}, donde Q^{2} significa ciertos grupos
omega-guanidino-(alquilo inferior), puede ser Agm;
y R^{27} puede ser Nle. Se dice que estos análogos son
estimulantes extremadamente potentes de la liberación de GH, y que
poseen una alta resistencia a la degradación enzimática in
vivo debido al grupo omega-guanidino-(alquilo
inferior) en el extremo C terminal.
La solicitud publicada WO 91/16923 revisa los
intentos anteriores de alterar la estructura secundaria de la
hGH-RH modificando su secuencia de aminoácidos.
Entre estos intentos anteriores se incluyen: sustitución de
Tyr^{1}, Ala^{2}, Asp^{3} o Asn^{8} por sus isómeros D;
sustitución de Ser^{9} por Ala para potenciar el carácter
anfipático de la región; y sustitución de Asn8 por L- o
D-Ser, D-Arg, Asn, Thr, Gln o
D-Lys. Se dice que algunas de estas modificaciones
potencian la actividad liberadora de la GH. El documento WO
91/16923 también establece que la sustitución del Asn8 por Ala
induce un enorme aumento de la actividad liberadora de la GH. Los
péptidos que se dice que tienen este beneficio tienen la
fórmula:
[R^{1},R^{2},Ala^{8},R^{15},Nle^{27}]hGH-RH(1-29)
-NH_{2},
donde R^{1} es Dat o A-R^{1},
donde A es acilo inferior o bencilo, y R^{1} incluye Tyr e His;
R^{2} es Ala, D-Ala o N-Me-
D-Ala
(N-metil-D-Ala); y
R^{15} puede incluir Gly, Ala o Aib. Una realización preferida
tiene R^{8,9,15} como Ala. Hay que indicar que R^{8} en esta
publicación no es nunca Asn. Se describen además composiciones
farmacéuticas para potenciar el
crecimiento.
La solicitud de patente europea número de serie
0413839A, presentada el 22 de agosto de 1989, cedida al mismo
cesionario de la presente solicitud, describe análogos de
hGH-RH(1-29)-NH_{2}
que se dice que tienen una liberación potenciada de la GH. Los
análogos de esta solicitud sustituyen los restos 1, 2, 8, 12, 15,
27, 28 y 29 como sigue: R^{1} puede ser Tyr o Dat; R^{2} puede
ser L o D Ala; R^{8} puede ser Asn o Ser; R^{12} puede ser
isómeros L o D de Lys, Arg u Orn; R^{15} puede ser Gly o Ala;
R^{27} puede ser Nle; R^{28} puede ser Asp, Asn o Ser; y
R^{29} puede ser Agm. Sin embargo, el resto 6 no se sustituye
nunca: siempre es Phe.
El documento WO 95/16707 describe análogos
sintéticos de la
hGH-RH(1-29)-NH_{2}
que tienen sustituciones de diferentes aminoácidos y acilado el
extremo N terminal, y presentan una duración antogonista
prolongada. Las realizaciones incluyen análogos de la fórmula:
X-R^{l}-R^{2}-R^{3}-R^{4}-R^{5}-R^{6}-Thr-R^{8}-Ser-Tyr-
R^{11}-R^{12}-Val-Leu-
R^{15}-Gln-Leu-Ser-R^{19}-R^{20}-R^{21}-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-
R^{27}_R^{28}-R^{29} en la que X es nada, H,
Ac, Iac, BrProp, For, Ibu, Nac, 2- Nac, 1- ó 2-Npt,
1- ó 2-Npr o Aqc, R^{1} es Tyr, His, Glu o Glt,
R^{2} es D-Arg, D-Cit,
D-Har, D-Lys o
D-Orn, R^{3} es Asp, Ala o Gly, R^{4} es Ala o
Gly, R^{5} es Ile, Ala o Gly, R^{6} es Phe, Ala, Pro, Tpi, NaI
o Phe(Y), en el que Y es F, Cl, Br, NO2, CH3 u OCH3, R^{8}
es Asn, Ser, Val, Ile, Ala, Abu, Nle o Aib, R^{11} es Arg,
D-Arg o Cit, R^{12} es Lys, D-Lys,
Cit o Ala, R^{15} es Gly, Ala, Abu o Gln, R^{19} es Ala o Abu,
R^{20} es Arg, D-Arg o Cit, R^{21} es Lys,
D-Lys o Cit, R^{27} es Met, Nle o Abu, R^{28}
es Ser, Asp o Abu, R^{29} es Agm, Arg-NH_{2},
Arg-OH, Cit-NH_{2},
Cit-OH, Har-NH_{2} o
Har-OH, con la condición de que cuando R^{1} sea
Glt, X es nada y cuando X sea H, R^{15} es distinto de Gly, y sus
sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables.
La publicación "Syntheses and biological
activities of highly potent antagonists of growth
hormone-releasing hormone" de Zarandi et al. en
Proceedings of National Academy Sciences in USA, Vol- 91, pp
12298-12302, de diciembre de 1994, se refiere a la
síntesis, purificación y el ensayo biológico de 22 antagonistas de
la hormona liberadora de la hormona de crecimiento humana
(hGH-RH). En los 28 ó 29 aminoácidos de la
secuencia N-terminal de la hGH-RH,
todos los análogos contenían D-Arg^{2}, Phe
(pCl)^{6}, Abu^{15} y Nle^{27} y la mayoría de ellos
tenían sustituyentes Agm^{29}. En el sistema celular de
pituitaria de rata superfundida, todos los análogos inhibían de
forma más potente la liberación de la hormona del crecimiento
inducida por la GH-RH que el antagonista de la
GH-RH patrón, [Ac-Tyr^{1},
D-Arg^{2}]hGHRH-(1 -29)NH_{2}.
El documento EP 365779 Al describe análogos del
factor de liberación de la hormona del crecimiento de fórmula
R^{1}-R^{2}-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-A-Ser-Tyr-Arg-B-Val-
Leu-R^{3}-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-B-Leu-Leu-Gln-A-Ile-R^{4}-R^{5}-R^{6}-X
en la que R^{1} es Tyr, desNH_{2}-Tyr,
Ac-Tyr, His,
N-metil-L- Tyr; R^{3} es Ala,
D-Ala,
N-metil-D-Ala;
R^{3} es Gly, Ala, Leu, Val, Ile, Nle, Nva,
\beta-Ala, \alpha-Aib; R^{4}
es Met, Leu, Nle, Ile, R^{5} es Ser, Asn; R^{6} es una
secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consta de Arg-
Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-
Leu y sus fragmentos donde el fragmento está limitado en número a
1-15 aminoácidos desde el extremo carboxilo; X es
OH, NH_{2}, NR^{7}R^{8} donde R^{7} y R^{8} son H o
alquilo inferior; A es Asp, Asn, Glu, Gln, ácido
a-aminoadípico, ácido
\alpha-aminopimélico; B es Lys, Orn, ácido
diaminopropiónico, ácido diaminobutírico con la condición de que B
en la posición 21 no sea Lys, o A en la posición 25 no sea Asp, y
sus sales farmacéuticamente aceptables. Dichos análogos del factor
de liberación de la hormona del crecimiento pueden tener
opcionalmente ciclaciones en las posiciones 21, 25 u 8, 12 y 21,
25.
\newpage
Se describía todavía otra modificación de la
hGH-RH en la patente de EE.UU. 5.183.660, donde la
GH-RH se conjugaba con derivados de polietilén
glicol. Se decía que el conjugado resultante presentaba menor
antigenicidad, retraso de la depuración biológica in vivo, y
actividad fisiológica durante un periodo de tiempo mayor.
En varias de estas investigaciones, se encontró
que variantes de los análogos agonistas de la
hGH-RH, tenían actividad antagonista más que
agonista. Así, en el documento US 4.659.693 (donde R^{2} puede ser
algunos restos D-Arg sustituidos con grupos
alquilo), se dice que cuando R^{1} es H, los análogos de la
hGH-RH actúan como antagonistas. Igualmente, en el
documento WO 91/16923, tratado antes, si R^{2} en los análogos es
D-Arg, y R^{8}, R^{9} y R^{15} están
sustituidos como se ha indicado antes, se dice que el resultado es
actividad antagonista. Se dice que estos péptidos antagonistas son
adecuados para administrar en forma de composiciones farmacéuticas
para tratar estados asociados con niveles excesivos de la GH, por
ejemplo, la acromegalia.
La actividad antagonista del análogo de la
hGH-RH
"[Ser^{9}-\Psi[CH_{2}-NH]
-Tyr^{10}] hGH-RH (1-29)" de la
patente de EE.UU. 5.084.555, se decía que resultaba del enlace
pseudopéptido (es decir, un enlace peptídico reducido a un enlace
[CH_{2}-NH]) entre los restos R^{9} y R^{10}.
(Hay que indicar que aunque esta patente usaba la fórmula
"\Psi[CH_{2} -NH]" aparentemente redundante para el
enlace pseudopeptídico, realmente sólo se había introducido uno de
dichos enlaces en el péptido). Sin embargo, se decía que las
propiedades antagonistas de
[Ser^{9}-\Psi[CH_{2}-NH]
-
Tyr^{10}]hGH-RH(1-29)
eran inferiores a un antagonista convencional,
[N-Ac-Tyr^{1},
D-Arg^{2}] -GH-RH
(1-29) NH_{2}.
La patente de EE.UU. 5.084.442 describe análogos
de lactama cíclicos de la GH-RH que son agonistas.
La introducción del puente lactama en péptidos o proteínas se sabe
que reduce el número de conformaciones posibles. La incorporación
de restricciones en los péptidos biológicamente activos puede
mejorar la unión del receptor y dar como resultado análogos que
tienen actividad biológica potenciada o prolongada.
Se proporciona una nueva serie de análogos
sintéticos de
hGH-RH-(1-29)NH_{2}. Estos
análogos inhiben la actividad de la hGH-RH
endógena, y por lo tanto previenen la liberación de hormona del
crecimiento. Se cree que esta inhibición resulta de la sustitución
de diferentes aminoácidos y acilación con ácidos aromáticos o no
polares en el extremo N terminal de hGH-RH-(1
-29)NH_{2}. Los análogos presentan una duración antagonista
prolongada.
Específicamente, la invención se refiere a
péptidos que comprenden las fórmulas:
De acuerdo con el convenio establecido, éstas se
pueden abreviar como sigue:
De acuerdo con el convenio establecido, éstas se
pueden abreviar como sigue:
Hay que indicar que los restos aminoácido 30 a 44
de la molécula natural de GH-RH no parece que sean
esenciales para la actividad; ni su identidad parece que sea
crítica. Por lo tanto, parece que la adición de algunos o todos
estos restos aminoácido adicionales al extremo C terminal de los
análogos de
hGH-RH(1-29)-NH_{2}
de la presente invención no afectará a la eficacia de estos
análogos como antagonistas de la GH-RH. Si se
añadieran algunos o todos estos aminoácidos al extremo C terminal
de los análogos
hGH-RH(1-29)-NH_{2},
los restos aminoácido añadidos podrían ser los mismos restos 30 a
44 de la secuencia natural de la hGH-RH o
equivalentes razonables.
Los péptidos sintéticos se sintetizan por un
método adecuado tal como por técnicas en fase sólida exclusivas,
por técnicas en fase sólida parciales, por condensación de
fragmentos o por síntesis clásica en fase de disolución.
Cuando los análogos de esta invención se
sintetizan por el método en fase sólida, el resto C terminal (aquí,
R^{29}) se une (se ancla) adecuadamente a un soporte sólido
inerte (resina) mientras lleva grupos protectores para su grupo
alfa-amino (y cuando sea adecuado, para su grupo
funcional de la cadena lateral). Después de completar esta etapa,
se elimina el grupo protector del alfa-amino del
resto aminoácido anclado, y se añade el siguiente resto aminoácido,
R^{28}, que tiene su grupo alfa-amino (así como
cualquier grupo funcional de la cadena lateral adecuado)
adecuadamente protegido, y así sucesivamente. Se eliminan los
grupos protectores de los extremos N después de añadir cada resto,
pero los grupos protectores de la cadena lateral todavía no se
eliminan. Después de haber unido todos los aminoácidos deseados en
la secuencia adecuada, el péptido se escinde del soporte y se
libera de todos los grupos protectores de las cadenas laterales en
condiciones que son mínimamente destructivas frente a los restos en
la secuencia. A esto le sigue una cuidadosa purificación y
escrupulosa caracterización del producto sintético, para garantizar
así que la estructura deseada es realmente la obtenida.
Se prefiere particularmente proteger la función
alfa-amino de los aminoácidos durante la etapa de
acoplamiento, con un grupo protector sensible a ácido o base.
Dichos grupos protectores deben tener las propiedades de ser
estables en condiciones de formación del enlace peptídico, y a la
vez poder eliminarse fácilmente sin destrucción de la cadena
peptídica en crecimiento y sin racemización de ninguno de los
centros quirales que contenga. Grupos protectores del
alfa-amino adecuados son Boc y Fmoc.
Los péptidos antagonistas de la
hGH-RH, o sales de estos péptidos, se pueden
formular en formas de dosificación farmacéutica que contienen
cantidades eficaces de éstos, y administrar a seres humanos o
animales para propósitos terapéuticos o de diagnóstico. Los
péptidos se pueden usar para suprimir los niveles de GH y tratar
estados asociados con niveles excesivos de la GH, por ejemplo,
retinopatía y nefropatía diabética, y acromegalia. También se
proporciona el uso de compuestos de la invención para preparar un
medicamento para usar en métodos para tratar estas enfermedades por
administración de una composición de la invención a un individuo
que necesite dicho tratamiento. Sin embargo, los usos principales
de los antagonistas de la GH-RH están en el campo
del cáncer, por ejemplo cánceres humanos de mama, pulmón, colon,
cerebro, y páncreas, donde están presentes los receptores del
IGF-1.
La figura 1 es una representación gráfica de los
cambios de volumen de cánceres pancreáticos humanos SW 1990 en
ratones sin sistema inmune durante el tratamiento con algunos
antagonistas de la GH-RH frente a los días de
tratamiento.
La nomenclatura usada para definir los péptidos
es la especificada por el Comité de Nomenclatura Bioquímica de la
IUPAC-IUB, en la que de acuerdo con la
representación convencional, el grupo amino en el extremo N
terminal aparece a la izquierda y el grupo carboxilo en el extremo
C terminal aparece a la derecha. La expresión "aminoácido
natural" tal como se usa aquí significa uno de los
L-aminoácidos que se encuentran normalmente de
forma natural en las proteínas naturales: Gly, Ala, Val, Leu, Ile,
Ser, Thr, Lys, Arg, Asp, Asn, Glu, Gin, Cys, Met, Phe, Tyr, Pro, Trp
e His. Cuando el resto aminoácido natural tiene formas isómeras, la
que se representa aquí es la forma L del aminoácido salvo que se
indique expresamente otra cosa.
También se incorporan en los antagonistas de la
GH- RH aminoácidos no codificados o análogos de aminoácidos.
(Aminoácidos "no codificados" son los aminoácidos que no están
entre los aproximadamente 20 aminoácidos naturales encontrados
naturalmente en los péptidos). Entre los aminoácidos no codificados
o análogos de aminoácidos que se pueden usar en los péptidos
antagonistas de la hGH-RH están los siguientes: por
Abu se entiende ácido
alfa-amino-butírico, por Agm se
entiende agmatina
(1-amino-4-guanidino-butano),
por Aib se entiende ácido
alfa-amino-isobutírico, por Har se
entiende homoarginina, por hPhe se entiende homofenilalanina, por
Nal se entiende 2-naftil-alanina,
por Nle se entiende norleucina, y por Tic se entiende ácido
1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina -carboxílico. Cuando
estos aminoácidos no codificados o análogos de aminoácidos, tienen
formas isómeras, la que se representa es la forma L del aminoácido
salvo que se indique expresamente otra cosa.
Las abreviaturas usadas aquí son:
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
Abu \+ ácido \alpha -aminobutírico\cr Ac \+
acetilo\cr AcOH \+ ácido acético\cr Ac _{2} O \+ anhídrido
acético\cr Agm \+ agmatina
(1-amino-4-guanidino-butano)\cr
Aib \+ ácido
alfa-amino-isobutírico\cr Aqc \+
antraquinona-2-carbonilo\cr BHA \+
bencidrilamina\cr Boc \+ terc-butiloxicarbonilo\cr
BOP \+ hexafluorofosfato de
benzotriazol-l-il-oxi-tris-(dimetilamino)-fosfonio\cr
BrProp \+ bromopropionilo\cr cHx \+ ciclohexilo\cr Cit \+
citrulina (ácido
2-amino-5-ureidovalérico)\cr
DCM \+ diclorometano\cr DIC \+
N,N'-diisopropilcarbodiimida\cr DIEA \+
diisopropiletilamina\cr DMF \+ dimetilformamida\cr Fpr \+
3-fenilpropionilo\cr GH \+ hormona de
crecimiento\cr GH-RH \+ hormona liberadora de la
GH\cr Har \+ homoarginina\cr HBTU \+ hexafluorofosfato de
2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio\cr
hGH-RH \+ GH-RH humana\cr HOBt \+
1-hidroxibenzotriazol\cr hPhe \+
homofenilalanina\cr HPLC \+ cromatografía de líquidos de alta
resolución\cr IAc \+ yodoacetilo\cr Ibu \+ isobutirilo\cr MeOH \+
metanol\cr McCN \+ acetonitrilo\cr MBHA \+
para-metilbencidrilamina\cr Nac \+
1-naftilacetilo\cr 2-Nac \+
2-naftilacetilo\cr Nal \+
2-naftilalanina\cr NMM \+
N-metilmorfolina\cr Npr \+ naftilpropionilo\cr Npt
\+ naftoilo\cr Phe(pCl) \+
para-cloro-fenilalanina\cr PhAc \+
fenilacetilo\cr rGH-RH \+ GH-RH de
rata\cr RP-HPLC \+ HPLC de fase inversa\cr SPA \+
sulfofenoxi\cr TFA \+ ácido trifluoroacético\cr Tic \+
1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina\cr Tos \+
para-toluenosulfonilo\cr Tpl \+ ácido
2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol-3-carboxílico\cr
Tyr(Me) \+ tirosina-metil-éter\cr Z \+
benciloxicarbonilo\cr}
Los análogos de la hGH-RH de la
presente invención se diseñaron para aumentar las afinidades de los
péptidos por el receptor, para mejorar la estabilidad metabólica y
maximizar la estructura secundaria anfipática de las moléculas.
Muchos de estos análogos producen inhibición muy eficaz y de larga
duración de la liberación de GH estimulada por
hGH-RH(1-29)NH_{2}
in vitro e in vivo.
Las siguientes realizaciones son especialmente
preferidas ya que tienen extraordinaria bioactividad:
Los péptidos se sintetizan por un método adecuado
tal como por técnicas en fase sólida exclusivas, por técnicas en
fase sólida parciales, por condensación de fragmentos o por
síntesis clásica en fase de disolución. Por ejemplo, las técnicas
de síntesis en fase sólida exclusivas se exponen en el libro de
texto "Solid Phase Peptide Synthesis", J.M. Stewart and J.D.
Young, Pierce Chem. Company, Rockford, 111, 1984 (2ª ed.), y M.
Bodanszky, "Principles of Peptide Synthesis", Springer Verlag,
1984. Los péptidos antagonistas de la hGH-RH se
preparan preferiblemente usando síntesis en fase sólida, tal como
la descrita generalmente por Merrifield, J. Am. Chem. Soc.,
85, p. 2149 (1963), aunque también se pueden usar otras síntesis
químicas equivalentes conocidas en la técnica como se ha mencionado
previamente.
La síntesis se lleva a cabo con aminoácidos que
están protegidos en su grupo alfa-amino. Se usan
preferiblemente grupos protectores de tipo uretano (Boc o Fmoc)
para proteger el grupo alfa-amino. El grupo
protector preferido es Boc.
En la síntesis en fase sólida, el resto
aminoácido N-alfa-protegido que
forma el grupo aminoacilo del final del péptido en el extremo C
terminal se une a un soporte de resina polímera mediante un enlace
químico. Después de completarse la reacción de acoplamiento, el
grupo protector del alfa-amino se elimina
selectivamente para permitir que tengan lugar las posteriores
reacciones de acoplamiento en el extremo amino, preferiblemente con
TFA al 50% en DCM cuando el grupo
N-alfa-protector es Boc. Los demás
aminoácidos igualmente con grupos alfa-amino
protegidos con Boc se acoplan progresivamente al grupo amino libre
del aminoácido precedente en la resina, para obtener la secuencia
peptídica deseada. Debido a que los restos aminoácido se acoplan al
grupo alfa-amino del resto del extremo C terminal,
el crecimiento de los péptidos sintéticos análogos de la
hGH-RH empieza en el extremo C terminal y avanzan
hacia el extremo N terminal. Cuando se ha obtenido la secuencia
deseada, el péptido se acila, si es adecuado, y se elimina del
polímero soporte.
Cada aminoácido protegido se usa en exceso (2,5 ó
3 equivalentes) y las reacciones de acoplamiento normalmente se
llevan a cabo en DCM, DMF o sus mezclas. El grado con el que se
completa la reacción de acoplamiento se controla en cada etapa por
la reacción de la ninhidrina. En los casos en los que se determina
acoplamiento incompleto, se repite el procedimiento de acoplamiento
antes de eliminar el grupo protector del alfa-amino
antes del acoplamiento del siguiente aminoácido.
En la tabla I se muestra un ciclo de síntesis
típico.
Protocolo para un ciclo sintético típico
usando la estrategia con
Boc
| Etapa | Reactivo | Tiempo de |
| mezcla | ||
| (min) | ||
| 1. Desprotección | TFA al 50% en DCM | 5 + 25 |
| lavado con DCM | 1 | |
| lavado con 2-propanol | 1 | |
| 2. | DIEA al 5% en DCM | 1 |
| Neutralización | lavado con DCM | 1 |
| lavado con MeOH | 1 | |
| DIEA al 5% en DCM | 3 | |
| lavado con MeOH | 1 | |
| lavado con DCM (3 veces) | 1-1 | |
| 3.A Acoplamiento | 3 eq. de Boc-aminoácido en | |
| DCM o DMF + 3 eq. de DIC o | ||
| del éster de HOBt del Boc- | ||
| aminoácido previamente | ||
| formado | 60 | |
| lavado con MeOH | 2 | |
| lavado con DCM | 2 | |
| 3.4. Acetilación | Ac_{2}O en DCM (30%) | 10 + 20 |
| (si es adecuada) | lavado con MeOH (3 veces) | 2 |
| lavado con DCM (3 veces) | 2 |
Después de completarse la síntesis, la escisión
del péptido de la resina se puede realizar usando procedimientos
conocidos en la química de péptidos.
Algunos de los restos aminoácido de los péptidos
tienen grupos funcionales en las cadenas laterales que son
reactivos con los reactivos usados en el acoplamiento o
desprotección. Cuando dichos grupos de las cadenas laterales están
presentes, se unen grupos protectores adecuados a estos grupos
funcionales para evitar que se produzcan reacciones químicas
indeseables durante las reacciones usadas para formar los péptidos.
Se siguen las siguientes reglas generales para seleccionar un
grupo protector de una cadena lateral particular: (a) el grupo
protector preferiblemente retiene sus propiedades protectoras y no
se escinde en las condiciones de acoplamiento, (b) el grupo
protector debe ser estable en las condiciones para eliminar el
grupo protector del alfa-amino en cada etapa de la
síntesis, (c) el grupo protector de la cadena lateral debe poder
eliminarse cuando se completa la síntesis de la secuencia de
aminoácidos deseada, en condiciones de reacción que no alteren
indeseablemente la cadena peptídica.
Las etapas sintéticas iniciales usadas aquí se
describen en la patente de EE.UU. 4.914.189 que se incorpora aquí
como referencia. Se hace referencia en particular a los Ejemplos I
a IV de esa patente.
Los grupos funcionales reactivos de la cadena
lateral preferiblemente se protegen como sigue: bencilo para Thr y
Ser; 2,6-diclorobenciloxicarbonilo para Tyr;
p-toluenosulfonilo para Arg;
2-clorobenciloxicarbonilo o
fluorenilmetiloxicarbonilo para Lys, Orn; y ciclohexilo o
fluorometilo para Asp y Glu. Las cadenas laterales de Asn y Gln no
están protegidas.
Los péptidos antagonistas de la
hGH-RH se pueden sintetizar en una variedad de
polímeros soporte. Estos polímeros soporte pueden ser resina amino
tales como resinas amino-metilo, resinas
bencidrilamina, resinas p-metilbencidrilamina y
similares. Boc-R^{29} es el material inicial
unido a la fase soporte, adecuadamente
Boc-Arg(Tos)-OH o
Boc-Agm.
Para sintetizar péptidos que tienen Agm en el
extremo C terminal, se prefiere que la fase soporte [SP] sea una
resina amino-metilo. El grupo guanidino de Boc- Agm
se une al polímero soporte por un grupo puente estable pero
fácilmente escindible. Se ha encontrado que dicho puente se puede
proporcionar fácilmente por el resto
sulfonil-fenoxi-acetilo. El
alfa-amino Boc- protegido de Agm se hace reaccionar
con el ácido
clorosulfonil-fenoxi-acético:
Cl
-SO_{2}-\phi-O-CH_{2}-COOH
para
formar
Boc-Agm^{29}-SO_{2}-\phi-O-CH_{2}-COOH.
Después este compuesto se acopla con el polímero
soporte [SP] usando DIC o BOP como reactivo activante, para
dar:
Boc-Agm^{29}-SO_{2}-\phi-O-CH_{2}-CO-
[SP]
Para sintetizar péptidos que tienen
Arg-NH_{2} en el extremo C terminal, se acopla
Boc-Arg(Tos)-OH a la resina
BHA o MBHA neutralizada usando DIC o BOP como reactivo
activante.
Utilizando la resina con Agm
Boc-protegido (California Peptide Res. Inc.), (o la
resina con Boc- Arg(Tos)), el propio péptido se puede
construir adecuadamente por síntesis en fase sólida de forma
convencional. La selección de un reactivo de acoplamiento adecuado
depende del experto en la técnica. Son particularmente adecuados
como reactivos de acoplamiento
N,N'-diisopropil-carbodiimida (DIC)
o el reactivo activante de carboxilo BOP.
Cada aminoácido protegido se acopla con un exceso
molar de aproximadamente 3 veces, con respecto al(los)
resto(s) aminoácido unido(s) a la resina, y el
acoplamiento se puede llevar a cabo en un medio tal como DMF :
CH_{2}Cl_{2} (1:1) o sólo en DMF o en CH_{2}Cl_{2}. En los
casos en los que se produce el acoplamiento incompleto, se repite
el procedimiento de acoplamiento antes de eliminar el grupo
protector del alfa-amino. El éxito de la reacción
de acoplamiento en cada etapa de la síntesis se controla
preferiblemente por la reacción de la ninhidrina.
En el caso de formación de puente lactama, los
grupos protectores de la cadena lateral (Fmoc y OFm) de la Lys u
Orn y Asp o Glu respectivamente de la resina péptido protegido con
Boc, se eliminan selectivamente con piperidina al 20% en DMF.
La formación del puente lactama se lleva a cabo
en el soporte sólido usando el agente de acoplamiento HBTU.
Cuando se ha completado la síntesis, el péptido
se escinde de la fase soporte. La eliminación del péptido de la
resina se lleva a cabo por tratamiento con un reactivo tal como
fluoruro de hidrógeno líquido, el cual también escinde el resto de
los grupos protectores de las cadenas laterales.
Adecuadamente, la resina-péptido
protegida seca se trata con una mezcla que consta de 1,0 ml de
m-cresol y 10 ml de fluoruro de hidrógeno anhidro
por gramo de péptido-resina durante 60 min a 0°C
para escindir el péptido de la resina, así como para eliminar los
grupos protectores de la cadena lateral. Después de eliminar el
fluoruro de hidrógeno con una corriente de nitrógeno y vacío, los
péptidos libres se hacen precipitar con éter, se filtran, se lavan
con éter y acetato de etilo, se extraen con ácido acético al 50%, y
se liofilizan.
La purificación de los péptidos brutos se puede
llevar a cabo usando procedimientos conocidos en la química de
péptidos. Por ejemplo, la purificación se puede llevar a cabo en un
sistema de HPLC MacRabbit (Rainin Instrument Co. Inc., Woburn, MA)
con un fotómetro de DV Knauer y un registrador K_{i}pp and Zonen
BD40, usando una columna VYDAC 228TP de 10 x 250 mm empaquetada con
gel de sílice C8 (tamaño de poros 3 A, tamaño de partículas 10
\mum) (Rainin Inc.). La columna se eluye con un sistema de
disolvente que consta de (A) TFA acuoso al 0,1W y (B) TFA al 0,1W
en MecN acuoso al 70%, en un modo de gradiente lineal (por ejemplo,
30-65% de B en 120 min). El eluyente se controla a
220 nm, y las fracciones se examinan por HPLC analítica usando un
cromatógrafo de líquidos Hewlett-Packard modelo
HP-1090 y se juntan para dar la máxima pureza. La
HPLC analítica se lleva a cabo en una columna de fase inversa C18
W-Porex (4,6 x 250 mm, tamaño de partículas 5
\mum, tamaño de poros 300 \ring{A}) (Phenomenex, Rancho Palos
Verdes, CA), usando elución isocrática con un sistema de disolvente
que consta de (A) y (B) como se han definido antes. Los picos se
controlan a 220 y 280 nm. Los péptidos se considera que están
sustancialmente puros (>95%) por HPLC analítica. La composición
de aminoácidos esperada también se confirma por análisis de
aminoácidos.
\newpage
Los péptidos de la invención se pueden
administrar en forma de sales no tóxicas, farmacéuticamente
aceptables, tales como sales de adición de ácido. Son ilustrativas
de dichas sales de adición de ácido hidrocloruro, hidrobromuro,
sulfato, fosfato, fumarato, gluconato, tanato, maleato, acetato,
citrato, benzoato, succinato, alginato, pamoato, malato, ascorbato,
tartrato, y similares. Los antagonistas particularmente preferidos
son sales de baja solubilidad, por ejemplo, sales de pamoato y
similares. Éstas presentan una actividad de larga duración.
Los compuestos de la presente invención se
administran adecuadamente a sujetos humanos o animales por vía
s.c., i.m. o i.v.; vía intranasal o por inhalación pulmonar; o en
forma de un depósito (por ejemplo, microcápsulas, microgránulos o
varillas cilíndricas como implantes) formulados con un polímero
biodegradable adecuado (tal como
D,L-lactida-co-glicólido),
prefiriéndose los dos primeros modos de depósito. También están
dentro del alcance de la invención otros modos de administración
equivalentes, es decir, gota a gota continuo, inyecciones de
depósito, bomba de infusión y modos de liberación en el tiempo
tales como microcápsulas y similares. La administración es en
cualquier vehículo inyectable fisiológicamente aceptable, siendo
aceptable la solución salina fisiológica, aunque también se pueden
usar otros vehículos conocidos en la técnica.
Los péptidos se administran preferiblemente por
vía parenteral, intramuscular, subcutánea o intravenosa con un
vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina
isotónica. Alternativamente, los péptidos se pueden administrar
como un pulverizador intranasal con un vehículo adecuado o por
inhalación pulmonar. Una vía de administración adecuada es una
forma de depósito formulada con un polímero biodegradable adecuado,
por ejemplo,
poli-D,L-lactida-coglicólido,
en forma de microcápsulas, microgránulos o implantes cilíndricos que
contienen compuestos antagonistas dispersos.
La cantidad de péptido necesaria depende del modo
de administración y del resultado pretendido. En general, el
intervalo de dosificación es entre 1-100 \mug/kg
de peso corporal del receptor por día.
Los antagonistas de la hGH-RH se
pueden usar para tratar estados producidos por exceso de la hormona
de crecimiento, por ejemplo acromegalia, que se manifiesta por un
aumento anormal de los huesos de la cara y extremidades. Los
antagonistas de la GH-RH también se pueden usar
para tratar la nefropatía diabética (la causa principal de ceguera
en diabéticos) y la retinopatía diabética, en las que el daño en
los ojos y riñones respectivamente se cree que se debe a la GH.
Los antagonistas de la hGH-RH se
diseñan para bloquear la unión y por lo tanto la acción de la
GH-RH, la cual estimula la secreción de la GH, que
a su vez estimula la producción del IGF-1. Los
antagonistas de la GH-RH se pueden administrar
solos o junto con análogos de somastatina, una combinación que
suprime de forma más completa los niveles de IGF-1.
Es ventajoso administrar antagonistas de la GH-RH
en lugar de somastatina debido al hecho de que los antagonistas de
la GH-RH se pueden usar en situaciones en las que
los sitios diana no tienen receptores de somastatina.
Sin embargo, las aplicaciones principales de los
antagonistas de la GH-RH están en el campo del
cancer. Esto se basa en las siguientes consideraciones: los
antagonistas de la GH-RH se diseñan para bloquear la
unión y por lo tanto la acción de la GH-RH, la cual
estimula la secreción de GH, que a su vez estimula la producción
del factor de crecimiento 1 para insulina (IGF-1)
llamado también somatomedina C. La implicación del
IGF-1 (somatomedina C) en el cáncer de mama, cáncer
de próstata, cáncer de colon, tumores óseos y otros tumores
malignos está bien establecida, y los análogos de somastatina solos
no suprimen adecuadamente los niveles de GH y
IGF-1. Es necesario una supresión completa de los
niveles de IGF-1 para inhibir mejor el crecimiento
del tumor. La producción autocrina del IGF-1 por
diferentes tumores también podría estar controlada por la
GH-RH y por lo tanto, podría ser inhibida por
antagonistas de la GH-RH. Los antagonistas de la
GH-RH también pueden inhibir la producción del
IGF-1. Antecedentes teóricos más detallados de las
aplicaciones de la GH-RH en el campo de la
oncología (cáncer) son los siguientes: Los receptores del
IGF-1 están presentes en cánceres de mama humano
primarios, en cánceres de pulmón, en cánceres de colon humano, en
cánceres de cerebro humano, y en cánceres de pancreas humano.
La presencia de receptores de
IGF-1 en estos tumores parece que está relacionada
con la transformación maligna y proliferación de estos cánceres.
El IGF-1 puede actuar como factor de crecimiento
endocrino, paracrino o autocrino para diferentes cánceres humanos,
es decir, el crecimiento de estos neoplasmas depende del
IGF-1. Los antagonistas de la GH-RH
al suprimir la secreción de GH reducirían la producción de
IGF-1. Puesto que el IGF-1 estimula
el crecimiento de estos diferentes neoplasmas (cánceres), la
reducción de los niveles de IGF-I en la circulación
debería conducir a la inhibición del crecimiento del tumor. Es
posible que los antagonistas de la GH-RH también
puedan reducir la producción paracrina o autocrina del
IGF-1 por los tumores, lo cual también debería
conducir a la inhibición de la proliferación del cáncer. Estos
puntos de vista están de acuerdo con los conceptos modernos de la
oncología clínica. Los antagonistas de la GH-RH
deben darse solos o junto con análogos de somastatina, y una
combinación lograría una supresión más completa de los niveles de
IGF-1, y eliminación de los niveles de
IGF-1 en los tejidos, por ejemplo, en osteosarcomas
humanos, así como en el cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de
próstata, y cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP).
La ventaja de los antagonistas de la
GH-RH sobre los análogos de somastatina se basa en
el hecho de que los antagonistas de la GH-RH se
pueden usar para suprimir tumores que no tienen receptores de
somastatina, por ejemplo, sarcomas osteogénicos humanos.
La presente invención se describe en relación con
los siguientes ejemplos, que se exponen sólo con el propósito de
ilustrar. En los ejemplos, se usan aminoácidos protegidos
ópticamente activos en la configuración L excepto cuando se indique
específicamente.
Los siguientes ejemplos exponen métodos adecuados
para sintetizar antagonistas novedosos de la GH-RH
por la técnica en fase sólida.
La secuencia sintética inicial usada en la
presente invención e indicada en el encabezamiento superior se
describe en los Ejemplos I a IV de la patente de EE.UU.
4.914.189.
Ejemplo comparativo
V
La síntesis se lleva a cabo progresivamente
usando equipo de síntesis de péptidos en fase sólida manual.
Brevemente, se neutraliza resina de bencidrilamina (BHA) (Bachem,
California) (100 mg, 0,044 mmoles) con DIEA al 5% en
CH_{2}Cl_{2}, y se lava de acuerdo con el protocolo descrito en
la tabla 1. La disolución de
Boc-Cit-OH (61 mg, 0,25 mmoles) en
DMF-CH_{2}Cl_{2} (1:1) se agita con la resina
neutralizada y DIC (44 \mul, 0,275 mmoles) en un equipo de
síntesis de péptidos en fase sólida manual durante 1 hora. Después
de probar que la reacción de acoplamiento se ha completado por el
ensayo negativo de la ninhidrina, desproteger con TFA al 50% en
CH_{2}Cl_{2}, y neutralizar con DIEA al 5% en CH_{2}Cl_{2},
la cadena peptídica se construye progresivamente por acoplamiento a
la resina de los siguientes aminoácidos protegidos en el orden
indicado, para obtener la secuencia peptídica deseada:
Estos restos aminoácido protegidos (también
disponibles normalmente en Bachem Co.) se representan arriba de
acuerdo con un convenio aceptado. El grupo protector adecuado para
el grupo funcional de la cadena lateral de los aminoácidos
particulares aparece entre paréntesis. Los grupos OH en las
formulas anteriores indican que cada carboxilo terminal del resto
está libre.
Los aminoácidos protegidos (0,25 mmoles cada uno)
se acoplan con DIC (44 \mul, 0,275 mmoles) con excepción de
Boc-Asn-OH y
Boc-Gln-OH que se acoplan con sus
ésteres de HOBt previamente formados. Después de eliminar el grupo
protector N\alpha-Boc de la Tyr^{1}, el péptido
se acila con ácido isobutírico (Ibu) (75 mg, 0,4 mmoles) usando DIC
(70 \mul, 0,44 mmoles).
Con el fin de escindir el péptido de la resina y
desprotegerlo, la resina-péptido seca (138 mg) se
agita con 0,5 ml de m-cresol y 5 ml de fluoruro de
hidrógeno (HF) a 0°C durante 1 hora. Después de evaporar el HF a
vacío, el resto se lava con éter dietílico seco y acetato de
etilo.
El péptido escindido y desprotegido se disuelve
en ácido acético al 50% y se separa de la resina por filtración.
Después de diluir con agua y liofilización, se obtienen 34 mg del
producto bruto.
El péptido bruto se comprueba por HPLC analítica
usando un cromatógrafo de líquidos Hewlett-Packard
modelo HP-1090 con una columna de fase inversa C18
W-Porex (4,6 x 250 mm, tamaño de partículas 5
\mum, tamaño de poros 300 \ring{A}, de Phenomenex, Rancho Palos
Verdes, CA) y elución con gradiente lineal (por ejemplo,
40-70% de B) con un sistema de disolvente que
consta de (A) TFA acuoso al 0,1% y (B) TFA al 0,1W en MeCN acuoso
al 70%. Se disuelven 34 mg del péptido bruto en AcOH/H_{2}O, se
agita, se filtra y se aplica a una columna VYDAC 228TP (10 x 250
mm) empaquetada con gel de sílice C8. La columna se eluye con el
sistema de disolvente descrito antes en un modo de gradiente lineal
(por ejemplo, 30-55% de B en 120 min); caudal 2
ml/min. El eluyente se controla a 220 nm, y las fracciones se
examinan por HPLC analítico. Las fracciones con pureza mayor que
95% se juntan y se liofilizan para dar 1,2 mg de producto puro. El
HPLC analítico se lleva a cabo en una columna de fase inversa C18
W-Porex antes descrita, usando una elución
isocrática con el sistema de disolvente antes descrito con un
caudal de 1,2 ml/min. Los picos se controlan a 220 y 280 nm. Se
considera que el producto está sustancialmente puro (>95%) por
HPLC analítica. La composición de aminoácidos esperada también se
confirma por análisis de aminoácidos.
Los péptidos 2 y 3 se sintetizan de la misma
forma que el Péptido 1, excepto que
Boc-Asn-OH8 se sustituye por
Boc-Abu-OH (0,25 mmoles), y los
péptidos resultantes se acilan con ácido isobutírico o ácido
fenilacético, respectivamente, para dar:
La síntesis se lleva a cabo progresivamente
usando equipo de síntesis de péptidos en fase sólida manual.
Brevemente, se desprotege la resina
Boc-Agm-SPA-aminometilo
(California Peptide Research Co., Inc., California) (200 mg, 0,06
mmoles) con TFA al 50% en CH_{2}Cl_{2}, se neutraliza con DIEA
al 5% en CH_{2}Cl_{2}, y se lava como se describe en la tabla
I. La disolución de Boc- Ser(Bzl)-OH (55 mg,
0,18 mmoles) en DMF-CH_{2}Cl_{2} (1:1) se agita
con la resina
H-Agm-SPA-aminometilo
y DIC (31 \mul, 0,2 mmoles) en un equipo de síntesis de péptidos
en fase sólida manual durante 1 hora. Después de probar que la
reacción de acoplamiento se ha completado por el ensayo negativo de
la ninhidrina, desproteger con TFA al 50% en CH_{2}Cl_{2}, y
neutralizar con DIEA al 5% en CH_{2}Cl_{2}, y lavar como se
describe en la tabla I, la cadena peptídica se construye
progresivamente por acoplamiento a la resina de los siguientes
aminoácidos protegidos en el orden indicado:
Los aminoácidos protegidos (0,18 mmoles cada uno)
se acoplan con DIC (31 \mul, 0,2 mmoles) con las excepciones de
Boc-Asn-OH y
Boc-Gln-OH que se acoplan con sus
ésteres de HOBt previamente formados. Después de eliminar el grupo
protector N\alpha-Boc de la Tyr^{1}, el péptido
se acila con ácido fenilacético (66 mg, 0,55 mmoles) usando DIC (88
\mul, 0,55 mmoles) como agente de acoplamiento.
Con el fin de escindir el péptido de la resina y
desprotegerlo, la resina-péptido seca (148 mg) se
agita con 0,5 ml de m-cresol y 5 ml de fluoruro de
hidrógeno (HF) a 0°C durante 1 hora. Después de evaporar el HF a
vacío, el resto se lava con éter dietílico seco y acetato de etilo.
El péptido escindido y desprotegido se disuelve en ácido acético al
50% y se separa de la resina por filtración. Después de dilución
con agua y liofilización, se obtienen 62 mg de producto bruto.
Se disuelven 62 mg del péptido antagonista de la
GH-RH en AcOH/H_{2}O y se purifica por
RP-HPLC usando el mismo procedimiento y equipos
descritos en el Ejemplo V. El producto se considera que está
sustancialmente puro (>95%) por HPLC analítica. Se proporciona
confirmación de la estructura por análisis de aminoácidos.
Los péptidos 4, 5, 6, 7, 15, 16, 25, y 26 se
sintetizan de la misma forma que el Péptido 1, excepto que estos
péptidos también contienen otras sustituciones,
para dar:
Péptido # 26 (Compuesto comparativo)
La síntesis se lleva a cabo progresivamente
usando equipo de síntesis de péptidos en fase sólida manual.
Brevemente, se neutraliza resina de bencidrilamina (BHA) (Bachem,
California) (100 mg, 0,044 mmoles) con DIEA al 5% en
CH_{2}Cl_{2}, y se lava de acuerdo con el protocolo descrito en
la tabla 1. La disolución de
Boc-Arg(Tos)-OH (107 mg,
0,25 mmoles) en DMF-CH_{2}Cl_{2} (1:1) se agita
con la resina neutralizada y DIC (44 \mul, 0,275 mmoles) en un
equipo de síntesis de péptidos en fase sólida manual durante 1
hora. Después de probar que la reacción de acoplamiento se ha
completado por el ensayo negativo de la ninhidrina, desproteger con
TFA al 50% en CH_{2}Cl_{2}, y neutralizar con DIEA al 5% en
CH_{2}Cl_{2}, la cadena peptídica se construye progresivamente
añadiendo los siguientes aminoácidos protegidos a la resina en el
orden indicado, para obtener la secuencia peptídica deseada:
Los aminoácidos protegidos (0,25 mmoles cada uno)
se acoplan con DIC (44 \mul, 0,275 mmoles) con las excepciones de
Boc-Asn-OH y
Boc-Gln-OH que se acoplan con sus
ésteres de HOBt previamente formados. Después de eliminar el grupo
protector N^{\alpha}-Boc de la Tyr^{1}, el
péptido se acila con ácido fenilacético (PhAc) (54 mg, 0,4 mmoles)
usando DIC (70 \mul, 0,44 mmoles).
Con el fin de escindir el péptido de la resina y
desprotegerlo, la resina-péptido seca (171 mg) se
agita con 0,5 ml de m-cresol y 5 ml de fluoruro de
hidrógeno (HF) a 0°C durante 1 hora. Después de evaporar el HF a
vacío, el resto se lava con éter dietílico seco y acetato de etilo.
El péptido escindido y desprotegido se disuelve en ácido acético al
50% y se separa de la resina por filtración. Después de diluir con
agua y liofilización, se obtienen 98 mg del producto bruto.
El péptido bruto se comprueba por HPLC analítica
usando un cromatógrafo de líquidos Hewlett-Packard
modelo HP-1090 con una columna de fase inversa C18
W-Porex (4,6 x 250 mm, tamaño de partículas 5
\mum, tamaño de poros 300 \ring{A}, de Phenomenex, Rancho Palos
Verdes, CA) y elución con gradiente lineal (por ejemplo,
40-70% de B) con un sistema de disolvente que consta
de (A) TFA acuoso al 0, 1% y (B) TFA al 0,1% en MeCN acuoso al 70%.
Se disuelven 60 mg del péptido bruto en AcOH/H_{2}O, se agita,
se filtra y se aplica a una columna VYDAC 228TP (10 x 250 mm)
empaquetada con gel de sílice C8. La columna se eluye con el
sistema de disolvente descrito antes en un modo de gradiente lineal
(por ejemplo, 30-55% de B en 120 min); caudal 2
ml/min. El eluyente se controla a 220 nm, y las fracciones se
examinan por HPLC analítica. Las fracciones con pureza mayor que
95% se juntan y se liofilizan para dar 2,6 mg de producto puro. La
HPLC analítica se lleva a cabo en una columna de fase inversa C18
W-Porex antes descrita, usando una elución
isocrática con el sistema de disolvente antes descrito con un
caudal de 1,2 ml/min. Los picos se controlan a 220 y 280 nm. Se
considera que el péptido está sustancialmente puro (>95%) por
HPLC analítica. La composición de aminoácidos esperada también se
confirma por análisis de aminoácidos.
Los péptidos 10, 11, 12, 13 y 14 se sintetizan de
la misma forma que el Péptido 9, excepto que estos péptidos
también contienen otras sustituciones, para dar:
La síntesis se lleva a cabo progresivamente
usando equipo de síntesis de péptidos en fase sólida manual.
Brevemente, se neutraliza resina de bencidrilamina (BHA) (Bachem,
California) (100 mg, 0,044 mmoles) con DIEA al 5t en
CH_{2}Cl_{2}, y se lava de acuerdo con el protocolo descrito en
la tabla 1. La disolución de
Boc-Arg(Tos)-OH (107 mg,
0,25 mmoles) en DMF-CH_{2}Cl_{2} (1:1) se agita
con la resina neutralizada y DIC (44 \mul, 0,275 mmoles) en un
equipo de síntesis de péptidos en fase sólida manual durante 1
hora. Después de probar que la reacción de acoplamiento se ha
completado por el ensayo negativo de la ninhidrina, desproteger con
TFA al 50% en CH_{2}Cl_{2}, y neutralizar con DIEA al 5% en
CH_{2}Cl_{2}, la cadena peptídica se construye progresivamente
por acoplamiento a la resina de los siguientes aminoácidos
protegidos en el orden indicado, para obtener la secuencia
peptídica deseada:
Los aminoácidos protegidos (0,25 mmoles cada uno)
se acoplan con DIC (44 \mul, 0,275 mmoles) con excepción de
Boc-Asn-OH y
Boc-Gln-OH que se acoplan con sus
ésteres de HOBt previamente formados. Después de eliminar el grupo
protector N^{\alpha}-Boc de la Tyr^{1}, el
péptido se acila con ácido fenilacético (PhAc) (75 mg, 0,4 mmoles)
usando DIC (70 \mul, 0,44 mmoles). El péptido acilado se
desprotege con piperidina al 20% en DMF durante lh 20 minutos para
dar las cadenas laterales libres de la Glu^{17} y Lys^{21}.
Después de lavar la resina, se forma el puente lactama con el
reactivo HBTU (110 mg, 0,275 mmoles) en DMF-DCM
(1:1) que contenía DIEA (137 \mul, 0,55 mmoles) y HOBt (39 mg,
0,275 mmoles) durante 3 horas (ensayo de la ninhidrina de Kaiser
negativo).
Con el fin de escindir el péptido de la resina y
desprotegerlo, la resina-péptido seca (53,1 mg) se
agita con 0,5 ml de m-cresol y 5 ml de fluoruro de
hidrógeno (HF) a 0°C durante 1 hora. Después de evaporar el HF a
vacío, el resto se lava con éter dietílico seco y acetato de etilo.
El péptido escindido y desprotegido se disuelve en ácido acético al
50% y se separa de la resina por filtración. Después de dilución
con agua y liofilización, se obtienen 13,7 mg del producto
bruto.
El péptido bruto se comprueba por HPLC analítica
usando un cromatógrafo de líquidos Hewlett-Packard
modelo HP-1090 con una columna de fase inversa C18
W- Porex (4,6 x 250 mm, tamaño de partículas 5 \mum, tamaño de
poros 300 \ring{A}, de Phenomenex, Rancho Palos Verdes, CA) y
elución con gradiente lineal (por ejemplo, 40-70% de
B) con un sistema de disolvente que consta de (A) TFA acuoso al
0,1W y (B) TFA al 0,1W en MecN acuoso al 70%. Se disuelve el
péptido bruto en AcOH/H_{2}O, se agita, se filtra y se aplica a
una columna VYDAC 228TP (10 x 250 mm) empaquetada con gel de sílice
C8. La columna se eluye con el sistema de disolvente descrito antes
en un modo de gradiente lineal (por ejemplo, 30-55%
de B en 120 min); caudal 2 ml/min. El eluyente se controla a 220
nm, y las fracciones se examinan por HPLC analítica. Las fracciones
con pureza mayor que 95% se juntan y se liofilizan para dar 0,96 mg
de producto puro. La HPLC analítica se lleva a cabo en una columna
de fase inversa C18 W-Porex antes descrita, usando
una elución isocrática con el sistema de disolvente antes descrito
con un caudal de 1,2 ml/min. Los picos se controlan a 220 y 280 nm.
Se considera que el péptido está sustancialmente puro (>95%) por
HPLC analítica. La composición de aminoácidos esperada también se
confirma por análisis de aminoácidos.
Los péptidos 17, 19 y 20 se sintetizan de la
misma forma que el Péptido 18, excepto que además de otras
sustituciones se forma el puente lactama entre las posiciones 8,12
ó 25,29, para dar:
\newpage
Los péptidos 21, 22, 23 y 24 se sintetizan de la
misma forma que el péptido 18, excepto que además de otras
sustituciones, se forma el puente lactama tanto entre las
posiciones 8,12 como 21,25, para dar:
Se probó la capacidad de los péptidos de la
presente invención, así como los compuestos comparativos, para
inhibir la liberación de GH inducida por
hGH-RH(1-29)NH_{2},
en un ensayo in vitro e in vivo.
Los análogos se ensayaron in vitro en un
ensayo descrito con anterioridad (S. Vigh and A.V. Schally,
Peptides 5:241-347, 1984) con modificación
(Z. Rekasi and A.V. Schally, P.N.A.S.
90:2146-2149, 1993).
Brevemente, las células se preincuban con los
péptidos durante 9 minutos (3 ml) con diferentes concentraciones.
Inmediatamente después de la incubación, se administra
hGH-RH(1-29)NH_{2} 1
nM durante 3 minutos (1 ml) (respuesta del minuto 0). Para
comprobar la duración del efecto antagonista del análogo, se
aplica
hGH-RH(1-29)NH_{2} 1
nM 30, 60, 90 y 120 minutos después durante 3 minutos [respuestas
de los 30, 60, 90, 120 min]. Se evalúan los valores integrales
finales de las respuestas de la GH. Las respuestas de la GH se
comparan y se expresan como porcentaje de la respuesta de la GH
original inducida con
hGH-RH(1-29)NH_{2} 1
nM. El efecto de los nuevos antagonistas se compara con el de
[Ac-Tyr^{1}, D-Arg^{2}]
hGH-RH (1-29) NH_{2}, el
"antagonista patrón".
Se midieron los niveles de GH de rata en partes
alícuotas de muestras de superfusión sin diluir y diluidas por
radioinmunoensayo de doble anticuerpo usando materiales
suministrados por The National Hormone and Pituitary Program,
Baltimore, Maryland. Los resultados del RIA se analizaron con un
programa de ordenador desarrollado en el instituto de los autores
de la invención (V. Csernus and A.V. Schally, Harwood Academic
(Greenstein, B.C. ed., London, pp. 71-109, 1991),
incorporado por la presente como referencia. La variación entre
ensayos era menor que 15%, y la variación dentro del ensayo era
menor que 10%.
Se desarrolló un ensayo de unión de
radiorreceptor sensible para determinar las características de
unión de los antagonistas de GH-RH (G. Halmos, A.V.
Schally et al., Receptor 3, 87-97, 1993),
incorporada por la presente como referencia. El ensayo se basa en
la unión de [His^{1},
Nle^{27}]hGH-RH(1-32)NH_{2}
marcado a homogeneizados de membrana de pituitaria anterior de
rata. Los derivados yodados de
[His^{1},Nle^{27}]hGH-RH(1-32)NH_{2}
se preparan por el método de la cloramina-T (F.C.
Greenwood et al., Biochemistry 89:114-123,
1963), incorporado por la presente como referencia. Se usan
pituitarias de ratas Sprague-Dawley
(250-300 g) para preparar membranas brutas. Para
los análisis de unión de saturación, los homogeneizados de membrana
se incuban con al menos 6 concentraciones de
[His^{1,125}I-Tyr^{10},Nle^{27}]hGH-RH(1-32)NH_{2},
en el intervalo de 0,005 a 0,35 nM, en presencia o ausencia de
exceso de péptido no marcado (1 \muM).
Se cuenta la radiactividad del sedimento en un
contador \gamma. Las afinidades de los péptidos antagonistas
probados en los receptores de GH-RH de pituitaria de
rata se determinan en experimentos de unión competitivos. Las
afinidades de unión finales se calculan por la K_{i} (constante de
disociación del complejo inhibidor-receptor) y se
determinan por el programa de ordenador Ligand PC de Munson y
Rodbard de acuerdo con la modificación de McPherson. Se calculan
las afinidades relativas comparadas con
[Ac-Tyr^{1}, D-Arg^{2}]
hGH-RH (1-29) NH_{2}, el
antagonista patrón, como la relación de K_{i} del antagonista de
GH-RH probado a la K_{i} del antagonista
patrón.
Se anestesian ratas
Sprague-Dawley macho adulto con pentobarbital (6
mg/100 g de peso corporal, i.p.). Se toman muestras de sangre de la
vena yugular 30 min después de inyección de pentobarbital. Un
grupo de 7 animales recibe
hGH-RH(1-29)NH_{2}
como control. A otros grupos de ratas se les inyecta
[Ac-Tyr^{1},
D-Arg^{2}]hGH-RH(1-29)NH_{2}
como antagonista patrón, o uno de los péptidos antagonistas 30
segundos antes de la
hGH-RH(1-29)NH_{2},
el cual se administra con una dosis de 2-3 \mug/kg
de peso corporal. Se toman muestras de sangre de la vena yugular 5
y 15 minutos después de inyectar los antagonistas. Se miden los
niveles de GH por RIA. Las potencias de los antagonistas se calcula
por el análisis factorial de Bliss y Marks con límites de confianza
de 95%, y se basan en las dosis de 100 y 400 \mug/kg de peso
corporal del antagonista patrón y 20 y 80 \mug/kg de peso
corporal de los antagonistas probados. La significación estadística
se evaluó por la nueva prueba de rangos múltiples de Duncan.
Los resultados de las actividades antagonistas
in vitro probadas en el sistema de pituitaria de rata
superfundida y en el ensayo de unión se resumen en la tabla II y
tabla III, respectivamente. Como puede verse a partir de estos
datos, la acilación de los análogos con PhAc o Ibu que contienen
sustitución combinada por Phe(pCl)^{6} o Nal^{6},
Abu^{15} o Ala^{15}, Nle^{27}, Asp^{28}, Agm^{29} o
Arg^{29}-NH_{2}, y/o puente lactama, producen
un gran aumento de la unión al receptor así como de la inhibición
de la liberación de GH in vitro e in vivo. Los
antagonistas
son los antagonistas más eficaces in
vitro.
La tabla IV muestra los niveles de GH en el
suero en ratas previamente tratadas con antagonistas de la
GH-RH. Los péptidos 7, 8, 9, 11, 13 y 18 producen
una inhibición significativamente mayor y más larga de la
liberación de GH estimulada por la
hGH-RH(1-29)NH_{2}
que el antagonista patrón. En los experimentos in vivo, el
Péptido 8 (MZ-5-156) inhibe la
liberación de GH inducida por
hGH-RH(1-29)NH_{2},
en mayor grado que MZ-4-71
[Ibu^{0}, D-Arg^{2}, Phe
(pCl)^{6},Abu^{15},Nle^{27}]
hGH-RH(1-28)Agm, el
antagonista previamente más eficaz.
Inhibición de la liberación de GH en el
sistema de pituitaria de rata
superfundida
| Péptido | Dosis | Inhibición de la liberación de la GH | ||||
| (%) | ||||||
| (nM) | 0 min | 30 min | 60 min | 90 min | 120 min | |
| Antagonista | 100 | 62,1 | 2,5 | 19 | ||
| patrón | ||||||
| Péptido 1* | 3 | 60,1 | 12,4 | 11,5 | ||
| 30 | 98 | 49,2 | 37,6 | |||
| Péptido 2* | 3 | 27,4 | 16,2 | 48,4 | 30,2 | |
| 30 | 94,7 | 53,0 | 24,4 | 41,8 | ||
| Péptido 3* | 30 | 97,4 | 32,2 | 35,9 | 42,1 | |
| Péptido 4* | 3 | 28 | 21,3 | 15 | ||
| 30 | 76,7 | 53,4 | 32 | |||
| Péptido 5* | 30 | 97,1 | 93,9 | 80,1 | 56,9 | |
| Péptido 6* | 30 | 86,3 | 89,9 | 78,9 | 87,6 | 62,7 |
| Péptido 7* | 30 | 96,3 | 41,5 | 21,5 | 23,2 | 20,6 |
| Péptido 8* | 3 | 78,8 | 73,3 | 65,9 | 54,9 | |
| 10 | 88,8 | 83,5 | 64,9 | 51,7 | 42,3 | |
| 30 | 94,5 | 90,0 | 71,5 | 65,0 | 55,6 | |
| Péptido 9 | 30 | 92,0 | 80,6 | 58,9 | 46,7 | 46,0 |
| Péptido 10* | 30 | 84,8 | 35,2 | 38,2 | 29,8 | 33,8 |
| Péptido 11 | 30 | 92,3 | 80,9 | 73,3 | 63,2 | 55,7 |
| Péptido 15* | 30 | 85,5 | 65,2 | 56,1 | 44,0 | 46,7 |
| Péptido 16* | 30 | 85,2 | 12,3 | 25,1 | 14,8 | 36,0 |
| Péptido 12* | 30 | 87,0 | 61,0 | 37,0 | 34,0 | 41,0 |
| Péptido 13 | 30 | 92,3 | 90,0 | 77,3 | 64,7 | 61,1 |
| Péptido 14* | 30 | 87,0 | 32,0 | 6,0 | 12,0 | 24,0 |
| Péptido 17 | 30 | 87,3 | 46,4 | 10,7 | 17,4 | |
| Péptido 18 | 30 | 96,8 | 79,4 | 68,3 | 47,1 | |
| Péptido 21 | 30 | 79,6 | 56,5 | 47,5 | 53,4 | |
| Péptido 22 | 30 | 65,8 | 37,7 | 24,9 | 26,8 | |
| Péptido 23 | 30 | 54,5 | 28,3 | 16,3 | 21,0 | |
| Péptido 19* | 30 | 17,5 | 0,0 | 11,2 | 14,0 | |
| Péptido 20* | 30 | 11,0 | 0,0 | 0,0 | 13,0 | |
| Péptido 24* | 30 | 46,0 | 6,0 | 26,0 | 31,0 | |
| *Compuestos comparativos |
Valores de K_{i} y afinidades relativas
(A.R.) de antagonistas de la
hGH-RH
| Péptido | K_{i} (nM) | A.R. |
| Patrón | 3,37 \pm 0,14 | 1 |
| Péptido 3 (Compuesto comparativo) | 0,301 \pm 0,14 | 11,19 |
| Péptido 5 | 0,096 | 35,10 |
| Péptido 8 | 0,0159 \pm 0,01 | 48,84 |
| Péptido 18 | 0,159 \pm 0,04 | 21,19 |
| Péptido 11 | 0,059 \pm 0,001 | 57,12 |
| Péptido 23 | 0,456 | 7,39 |
\newpage
Niveles de hormona del crecimiento en el suero
en ratas previamente tratadas con diferentes antagonistas de la
GH-RH en diferentes intervalos de tiempo antes de
GH-RH(1-29)NH_{2}
con una dosis de 3
\mug/kg
| Tratamiento de | Dosis | Niveles de GH en el | |||
| inhibición | suero | ||||
| (via | (\mug/kg) | ||||
| intravenosa) | (ng/ml) | % | |||
| GH-RH(1-29)NH_{2} | 3,0 | 695,15 \pm 95,40 | 0% | ||
| Péptido 18 | 2 min | 80 | 370,31 \pm 48,26 | 47%** | |
| 15 min | 80 | 564,74 \pm 76,99 | N.S. | ||
| Péptido 9 | 2 min | 80 | 450,21 \pm 68,38 | 35% | |
| GH-RH(1-29)NH_{2} | 3,0 | 703,34 \pm 93,01 | 0% | ||
| Péptido 8 | 2 min | 80 | 177,13 | \pm | 75% |
| 31,75** | |||||
| 15 min | 80 | 183,91 | \pm | 74% | |
| 26,19** | |||||
| GH-RH(1-29)NH_{2} | 3,0 | 724,68 \pm 93,01 | 0% | ||
| Péptido 8 | 30 min | 80 | 567,46 \pm 50,70 | 22% N.S. | |
| 60 min | 80 | 582,41 \pm 70,18 | 20% N.S. | ||
| GH-RH(1-29)NH_{2} | 3,0 | 883,36 | \pm | 0% | |
| 148,34 | |||||
| Péptido 13 | 2 min | 80 | 316,01 | \pm | 64% |
| 68,24** | |||||
| 15 min | 80 | 641,73 | \pm | 27% | |
| 92,01* | |||||
| GH-RH(1-29)NH_{2} | 3,0 | 703,34 \pm 93,01 | 0% | ||
| Péptido 7* | 2 min | 80 | 611,07 | \pm | 31% |
| 87,75* | |||||
| 15 min | 80 | 688,39 | \pm | N.S. | |
| 107,91 | |||||
| GH-RH(1-29)NH_{2} | 3,0 | 724,68 \pm 93,01 | 0% | ||
| Péptido A | 15 min | 80 | 585,33 | \pm | 43% |
| 89,34. | |||||
| 30 min | 80 | 788,39 \pm 96,93 | 23% N.S. | ||
| Los datos se expresan como media \pm ETM | |||||
| * p <0,05 frente a control | |||||
| ** p <0,01 frente a control | |||||
| NS no significativo | |||||
| * Compuesto comparativo |
Se trasplantaron pequeños trozos de un tumor SW-
1990 que se desarrollaba en un ratón sin sistema inmune, por vía
s.c., a los costados derechos de 60 ratones macho sin sistema
inmune. Diez días después del trasplante, se agruparon 40 ratones
con los tumores bien crecidos en 4 grupos con igual volumen medio
del tumor (16 mm^{3}) en cada grupo. El tratamiento empezó 13
días después del trasplante y se continuó durante 44 días. Los
grupos se muestran en la tabla. Se midieron los tumores y se
calculó el volumen semanalmente. En la tabla VI se muestran los
cambios de volumen de los tumores. El día 45 de tratamiento los
ratones se sacrificaron con anestesia de Metofane, por desangrado
de la aorta abdominal. Se recogió la sangre, y se determinaron los
pesos del tumor y órganos.
Se está realizando la histología, los estudios de
receptor y la determinación de los niveles de hormona en la
sangre.
Los datos de volumen de los tumores y los pesos
de los tumores al final del experimento se muestran en la tabla. El
tratamiento con 10 ug/día del Péptido # 8 dio como resultado una
inhibición significativa del crecimiento de los cánceres
SW-1990 como se muestra por los datos de volumen y
peso. El Péptido A no tuvo un efecto significativo en los tumores.
Los pesos del cuerpo, hígado, riñón y bazo no mostraron diferencias
significativas respecto a los valores del control.
Efecto del tratamiento con antagonistas de la
GH-RH en los pesos de tumores y volumen final de
tumores de cánceres pancreáticos humanos SW-1990 en
ratones sin sistema inmune.
| Grupo | Tratamiento | Dosis | Número | Pesos de | Volumen |
| n° | mg/kg | de | los tumores | final del | |
| ratones | (mg) | tumor, mm^{3} | |||
| 1 | Control | 10 | 1467 \pm 374 | 1291 \pm 301 | |
| 2 | Péptido A | 10 | 10 | 1467 \pm 595 | 1183 \pm 342 |
| 3 | Péptido A | 40 | 10 | 1297 \pm 258 | 902 \pm 156 |
| 4 | Péptido 8 | 10 | 10 | 931 \pm 330 | 612 \pm 220* |
| * p < 0,05 |
Péptido A:
[Ibu^{0}-D-Arg^{2}-Phe(pCl)^{8}-Abu^{16}-Nle^{27}]hgH-RH
(1-28)Agm
Claims (3)
1. Péptido seleccionado del grupo que tiene las
fórmulas:
2. Uso de un compuesto de la reivindicación 1,
para preparar un medicamento para suprimir los niveles excesivos
de la GH en un paciente que lo necesite.
3. Uso de un compuesto de la reivindicación 1,
para preparar un medicamento para tratar a un paciente que tiene
un cáncer que lleva receptores para el IGF-1.
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