DE69723448T2

DE69723448T2 - Hgh-rh(1-29)nh2 analoge mit antagonistischer aktivität

Info

Publication number: DE69723448T2
Application number: DE69723448T
Authority: DE
Inventors: V. Andrew SCHALLY; Marta Zarandi; Katalin Toth
Original assignee: Tulane University
Current assignee: Tulane University
Priority date: 1996-05-03
Filing date: 1997-05-02
Publication date: 2004-05-19
Anticipated expiration: 2017-05-03
Also published as: JP2001501585A; ATE244731T1; CA2253663A1; DK0914340T3; PT914340E; AU3117297A; US5942489A; CA2253663C; EP0914340A1; DE69723448D1; WO1997042223A1; ES2200178T3; EP0914340B1; ZA973793B

Description

ERFINDUNGSGEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft neue synthetische Peptide, welche die Freisetzung von Wachstumhormon aus der Hypophyse von Säugetieren hemmen und diese neuen Peptide enthaltende therapeutische Zusammensetzungen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Das Wachstumshormon („GH") ist ein Peptid mit 191 Aminosäuren, welches die Bildung zahlreicher unterschiedlicher Wachstumsfaktoren stimuliert, wie zum Beispiel von IGF-1 und so das Wachstum zahlreicher Gewebe (Skelett, Bindegewebe, Muskel und Eingeweide) und physiologische Wirksamkeiten fördert (Erhöhung der Nukleinsäure- und Proteinsynthese und Lipolyse, jedoch die Harnstoffsekretion erniedrigt).
Die Freisetzung von GH steht unter der Steuerung von Freisetzungs- und Hemmungsfaktoren, die durch den Hypothalamus abgesondert werden. Der primäre Freisetzungsfaktor ist das, das Wachstumshormon freisetzende Hormon („GH-RH"); das menschliche Wachstumshormon freisetzende Hormon („hGH-RH") ist ein Peptid mit 44 Aminosäuren. Die neuen Peptide gemäß vorliegender Erfindung betreffen Analoga von hGH-RH mit lediglich Resten 1 bis 29 („hGH-RH(1-29)NH₂"), d. h. Analoga des Peptids, welches folgende Aminosäuresequenz hat:
GH wurde mit verschiedenen Erkrankungen in Verbindung gebracht. Eine Erkrankung, an der GH beteiligt ist, ist die Akromegalie, bei der übermäßige GH-Spiegel vorliegen. Die abnorm vergrößerten Gesichts- und Extremitätenknochen dieser Erkrankung können durch Verabreichung eines GH-RH-Antagonisten behandelt werden.
Weitere Krankheiten, welche das GH mit sich bringt, sind die diabetische Retinopathie und die diabetische Nephropathie. Es wird angenommen, dass die Ursache für den Netzhaut- bzw. Nierenschaden bei diesen Erkrankungen dem GH zuzuschreiben ist, die zur Blindheit und Verringerung der Nierenfunktion führt. Dieser Schaden kann jedoch durch Verabreichung eines wirksamen GH-RH-Antagonisten verhindert oder verlangsamt werden.
Im Bemühen, in diese Erkrankung und andere Zustände einzugreifen, versuchten einige Forscher, durch Verwendung von Somatostatin, eines Inhibitors der Freisetzung von GH, die GH-Spiegel zu regulieren. Jedoch unterdrückt Somatostatin, wenn es allein verabreicht wird, nicht die GH- oder IGF-1-Spiegel auf den erwünschten Grad. Wenn Somatostatin in Kombination mit einem GH-RH-Antagonisten verabreicht wird, verbessert es die Unterdrückung von IGF-1-Spiegeln viel besser.
Andere Forscher untersuchten verschiedene Modifikationen von GH-RH, um das Verhältnis der Struktur von GH-RH zu dessen Wirksamkeit in dem Bemühen aufzuklären, synthetische Verwandte zur Verfügung zu stellen, die verbesserte agonistische oder antagonistische Eigenschaften aufweisen. (Die Synthese kann durch ein Festphasen-Verfahren, das in US-Patent 4,914,189 beschrieben ist, oder in flüssiger Phase erfolgen, wie in US-Patent 4,707,541 beschrieben.) So wurde bei einer Untersuchung gefunden, dass die Synthese von GH-RH ohne dessen N-terminalen Rest, d. h. die Bildung von hGH-RH(2-44), zu einem Analogen führt, das eine GH freisetzende Wirksamkeit aufweist, die lediglich 0,1% derjenigen von GH-RH ist. Im Gegensatz hierzu führt die Synthese eines GH-RH-Analogen ohne dessen Reste 30 bis 44, d. h. die Synthese von hGH-RH(1-29)NH₂, zu einem Analogen, welches 50% oder mehr der Wirksamkeit von nativem hGH-RH beibehält. Die Synthese von noch kürzeren Analogen, wie zum Beispiel von GH-RH(1-28)NH₂ oder GH-RH(1-27)NH₂, führt zu einer wesentlich geringeren Biowirksamkeit. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Sequenz 1–29 für die Bioaktivität von GH-RH wichtig ist.
In einer anderen Studie wurde gefunden, dass die Acetylierung des N-endständigen Aminosäurerests von GH-RH oder ihr Ersetzen mit einem D-Isomeren – wobei sich [Ac-Tyr¹]GH-RH oder [D-Tyr¹]GH-RH bildet – die Fähigkeit des Analogen, GH freizusetzen, auf 2 bis 3% derjenigen von GH-RH verringert. Diese Analoga haben auch eine geringere Affinität in vitro für GH-RH-Bindungsstellen. Im Gegensatz hierzu wurde gefunden, dass die Acetylierung der Alpha-Aminogruppe des Restes 1 im hGH-RH(1-29)NH₂ – unter Bildung von [AcTyr¹]hGH-RH(1-29)NH₂ – die Wirksamkeit in vivo über diejenige von GH-RH um das 10fache oder mehr erhöht.
Bei weiteren Untersuchungen wurde gefunden, dass [Ac-Tyr¹,D-Arg²]hGH-RH(1-29)NH₂ die Aktivierung der Adenylatcyclase der vorderen Rattenhypophyse durch hGH-RH(1-29)NH₂ antagonisiert. Es wurde gefunden, dass das gleiche Peptid die Wirkung von GH-RH an dessen Rezeptoren in der Hypophyse und dem Hypothalamus blockiert und die pulsierende Wachstumshormonsekretion hemmt.
Verschiedene berichtete Modifikationen von GH-RH führten zur agonistischen Wirksamkeit. Das US-Patent 4,659,693 offenbart Agonisten von hGH-RH(1-29) der Formel: R¹-R²-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-R²⁷-Ser-Arg-NH₂, worin R¹ H, Tyr oder His ist; R² verschiedene Reste sein kann; und R²⁷ Nle ist. Diese Agonisten sollen die Freisetzung des Wachstumhormon-freisetzenden Faktors („GRF") stimulieren und somit in pharmazeutischen Zusammensetzungen geeignet sein. („GRF" ist lediglich ein Synonym für GH-RH und letztere Abkürzung wird im Folgenden verwendet, obgleich der Begriff „GRF" in US-Patent 4,659,693 und anderen Veröffentlichungen benutzt wird.) Das US-Patent 4,914,189 offenbart andere Analoga von GH-RH, welche Agonisten sind. Bei diesen Agonisten kann die N-endständige Gruppe Q¹CO-, worin Q¹ bestimmte omega- oder alpha-omega-substituierte Alkylgruppen bezeichnet, Tyr oder des-amino-Tyr sein; die C-endständige Gruppe NH-Q², worin Q² bestimmte niedere omega-Guanidino-Alkylgruppen bedeutet, Agm sein; während R²⁷ Nle sein kann. Diese Analoga sollen extrem wirksame Stimulantien der GH-Freisetzung sein und sich in vivo einer hohen Beständigkeit gegenüber einem enzymatischen Abbau in Folge der omega-Guanidino-niederen Alkylgruppe am C-Terminus erfreuen.
Die veröffentlichte Anmeldung WO 91/16923 gibt einen Überblick über frühere Versuche, die Sekundärstruktur von hGH-RH durch Modifizierung seiner Aminosäuresequenz zu verändern. Diese früheren Versuche umfassen: Den Ersatz von Tyr¹, Ala², Asp³ oder Asn⁸ durch ihre D-Isomeren; den Ersatz von Ser⁹ durch Ala, um die Amphilizität des Bereichs zu erhöhen; und den Ersatz von Asn⁸ durch L- oder D-Ser, D-Arg, Asn, Thr, Gln oder D-Lys. Es wird gesagt, das bestimmte dieser Modifizierungen die Aktivität der GH-Freisetzung erhöht. WO 91/16923 gibt ebenfalls an, dass der Ersatz von Asn⁸ mit Ala eine enorme Erhöhung der Wirksamkeit der Freisetzung von GH bewirkt. Die Peptide, von denen gesagt wird, dass sie diesen Vorteil besitzen, haben die Formel: (R¹,R²,Ala⁸,R¹⁵,Nle²⁷]hGH-RH(1-29)-NH₂. worin R¹ Dat oder A-R¹ ist, wobei A ein niederer Acyl- oder der Benzylrest ist, und R¹ Tyr und His umfasst; R² Ala, D-Ala oder N-Me-D-Ala (N-Methyl-D-Ala) ist; und R¹⁵ Gly, Ala oder Aib umfasst. Eine bevorzugte Ausführungsform hat R^8,9,15 als Ala. Es wird darauf hingewiesen, dass R⁸ in dieser Veröffentlichung niemals Asn ist. Pharmazeutische Zusammensetzungen zur Erhöhung des Wachstums sind ferner offenbart.
Die europäische Patentanmeldung 0 413 839 A, angemeldet am 22. August 1989, abgetreten an die gleichen Bevollmächtigten wie bei vorliegender Erfindung, offenbart Analoga von hGH-RH(1-29)-NH₂, die eine erhöhte Freisetzung von GH besitzen sollen. Bei den Analoga dieser Anmeldung sind die Reste 1, 2, 8, 12, 15, 27, 28 und 29 wie folgt ersetzt: R¹ kann Tyr oder Dat sein; R² kann L- oder D-Ala sein; R⁸ kann Asn oder Ser sein; R¹² kann ein L- oder D-Isomer von Lys, Arg oder Orn sein; R¹⁵ kann Gly oder Ala sein; R²⁷ kann Nle sein; R²⁸ kann Asp, Asn oder Ser sein; und R²⁹ kann Agm sein. Jedoch ist der Rest 6 niemals ersetzt: Er ist immer Phe.
WO 95/16707 offenbart synthetische Analoga von hGH-RH(1-29)NH₂ mit Substitutionen verschiedener Aminosäuren und am N-Terminus acyliert, die eine verlängerte antagonistische Wirkungsdauer zeigen. Ausführungsformen umfassen Analoga der Formel: X-R¹-R²-R³-R⁴-R⁵-R⁶-Thr-R⁸-Ser-Tyr-R¹¹-R¹²-Val-Leu-R¹⁵-Gln-Leu-Ser-R¹⁹-R²⁰-R²¹-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-R²⁷-R²⁸-R²⁹ worin X nil, H, Ac, Iac, BrProp, For, Ibu, Nac, 2-Nac, 1- oder 2-Npt, 1- oder 2-Npr oder Aqc, R¹ Tyr, His, Glu oder Glt, R² D-Arg, D-Cit, D-Har, D-Lys oder D-Orn, R³ Asp, Ala oder Gly, R⁴ Ala oder Gly, R⁵ Ile, Ala oder Gly, R⁶ Phe, Ala, Pro, Tpi, Nal oder Phe(Y) sind, worin Y F, Cl, Br, NO₂, CH₃ oder OCH₃, R⁸ Asn, Ser, Val, Ile, Ala, Abu, Nle oder Aib, R" Arg, D-Arg oder Cit, R¹² Lys, D-Lys, Cit oder Ala, R¹⁵ Gly, Ala, Abu oder Gln, R¹⁹ Ala oder Abu, R²⁰ Arg, D-Arg oder Cit, R²¹ Lys, D-Lys oder Cit, R²⁷ Met, Nle oder Abu, R²⁸ Ser, Asp oder Abu, R²⁹ Agm, Arg-NH₂, Arg-OH, Cit-NH₂, Cit-OH, Har-NH₂ oder Har-OH sind, mit der Maßgabe, dass, wenn R¹ Glt ist, X 0 ist und dass, wenn X H ist, R¹⁵ ein anderer Rest als Gly ist, und deren pharmazeutisch brauchbaren Säureadditionssalze.
Die Veröffentlichung „Synthesis and biological activities of highly potent antagonists of growth hormone-releasing hormone" von Zarandi et al. in Proceedings of National Academy Sciences in USA, Vol. 91, Seiten 12298–12302, von Dezember 1994 betrifft die Synthese, Reinigung und das biologische Testen von 22 Antagonisten des das menschliche Wachstumshormon freisetzenden Hormons (hGHRH). Innerhalb der N-terminalen Aminosäuresequenz 28 oder 29 von hGHRH enthielten alle Analogen D-Arg², Phe(pCl)⁶, Abu¹⁵ und Nle²⁷, und die meisten derselben hatten Substituenten Agm²⁹. Im superfundierten Rattenhypophyse-Zellsystem hemmten alle Analogen die durch GHRH bewirkte Freisetzung des Wachstumshormons wirksamer als der GHRH-Standardantagonist [Ac-Tyr¹,D-Arg²]hGHRH-(1-29)NH₂.
Die EP 0 365 779 A1 beschreibt Analoge des das Wachstumshormon freisetzenden Faktors der Formel R¹-R²-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-A-Ser-Tyr-Arg-B-Val-Leu-R³-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-B-Leu-Leu-Gln-A-lle-R⁴-R⁵-R⁶-X, worin R¹ Tyr, des NH₂ Tyr, Ac-Tyr, His, Nmethyl-L-Tyr; R² Ala, D-Ala, N-methyl-D-Ala; R³ Gly, Ala, Leu, Val, Ile, Nle, Nva, βAla, α-Aib; R⁴ Met, Leu, Nle, Ile; R⁵ Ser, Asn; R⁶ eine aus der Gruppe ausgewählte Aminosäuresequenz, die besteht aus Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gla-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu und Fragmenten desselben sind, wobei das Fragment in seiner Anzalil um 1 bis 15 Aminsäuren vom Carboxylende vermindert ist, X OH, NH₂, NR⁷R⁸ ist, wobei R⁷ und R⁸ Wasserstoff oder eine niedere Alkylgruppe sind; A Asp, Asn, Glu, Gln, alpha-Aminoadipinsäure, alpha-Aminopimelinsäure ist; B Lys, Orn, Diaminpropionsäure, Diaminobuttersäure mit der Maßgabe ist, dass entweder B an der Stellung 21 nicht Lys ist oder A an der Stellung 25 nicht Asp ist, und deren pharmazeutisch brauchbare Salze. Diese Analogen des das Wachstumshormon freisetzenden Faktors können gegebenenfalls an den Stellungen 21, 25 oder 8, 12 und 21, 25 Zyklisierungen besitzen.
Eine noch andere Modifikation von hGH-RH wurde im US-Patent 5,183,660 offenbart, wo GH-RH mit Polyethylenglykolderivaten konjugiert war. Das erhaltene Konjugat soll eine verminderte antigene Wirkung, eine Verzögerung der biologischen Clearance in vivo und über eine längere Zeit hinweg physiologische Wirksamkeit zeigen.
Bei einigen dieser Untersuchungen wurde gefunden, dass Varianten der agonistischen Analoga von hGH-RH antagonistische, anstatt agonistische Wirksamkeit hatten. So wird in US-Patent 4,659,693 beschrieben, dass die Analoga von hGH-RH, (bei denen R2 bestimmte D-Arg-Reste, die mit Alkylgruppen substituiert sind, sein kann), als Antagonisten wirken, wenn R¹ Wasserstoff ist. In ähnlicher Weise wird in der zuvor diskutierten Druckschrift WO 91/16923 gesagt, dass sich eine antagonistische Wirksamkeit ergibt, wenn R² bei den Analoga D-Arg ist, und R⁸, R⁹ und R¹⁵ wie zuvor angegeben substituiert sind. Die antagonistischen Peptide sollen zur Verabreichung als pharmazeutische Zusammensetzungen zur Behandlung von Zuständen, welche mit übermäßigen Spiegeln von GH verbunden sind, wie zum Beispiel bei der Akromegalie, geeignet sein.
Die antagonistische Wirksamkeit der hGH-RH-Analoga „[Ser⁹-ψ[CH₂-NH]-Tyr¹⁰]hGH-RH(1-29)" des US-Patent 5,084,555 soll sich aus der Pseudopeptidbindung (d. h. einer auf eine Bindung [CH₂-NH] verringerte Peptidbindung) zwischen den Resten R⁹ und R¹⁰ ergeben. (Es wird vermerkt, dass, obgleich dieses Patent die anscheinend überflüssige Formel „ψ[CH₂-NH]" für die Pseudopeptidbindung benutzt, tatsächlich lediglich eine derartige Bindung in das Peptid eingeführt worden war.) Jedoch wird gesagt, dass die antagonistischen Eigenschaften von [Ser⁹-ψ[CH₂NH]-Tyr¹⁰]hGH-RH(1-29) denjenigen eines herkömmlichen Antagonisten, [N-Ac-Tyr¹,D-Arg²]GH-RH(1-29)-NH₂, unterlegen waren.
Das US-Patent 5,084,442 offenbart zyklische Lactam-Analoga von GH-RH, welche Agonisten sind. Die Einführung der Lactambrücke in Peptide oder Proteine verringert bekanntlich die Anzahl möglicher Konformationen. Die Einarbeitung von Beschränkungen in biologisch wirksame Peptide kann die Rezeptorbindung verbessern und zu Analoga mit einer erhöhten oder verlängerten biologischen Wirkung führen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es wird eine neue Reihe synthetischer Analoga von hGH-RH(1-29)NH₂ zur Verfügung gestellt. Diese Analoga hemmen die Wirksamkeit von endogenem hGH-RH und verhindern deshalb die Freisetzung von Wachstumshormon. Es wird angenommen, dass diese Hemmung sich aus dem Ersatz verschiedener Aminosäuren und der Acylierung mit aromatischen oder nicht-polaren Säuren am N-Terminus von GH-RH(1-29)NH₂ ergibt. Die Analoga zeigen eine verlängerte antagonistische Dauer.
Im Speziellen betrifft vorliegende Erfindung Peptide, umfassend die Formeln:
Unter gut eingeführter Übereinkunft können diese wie folgt abgekürzt werden:
Unter gut eingeführter Übereinkunft können diese wie folgt abgekürzt werden:
Es wird darauf hingewiesen, dass die Aminosäurereste von 30 bis 44 des nativen GH-RH-Moleküls für die Wirksamkeit nicht wesentlich erscheinen, noch scheint ihre Identität kritisch zu sein. Deshalb scheint es, dass die Hinzufügung einiger oder sämtlicher dieser weiteren Aminosäurereste zum C-Terminus der erfindungsgemäßen Analoga von hGH-RH(1-29)-NH₂ die Wirksamkeit derselben als GH-RH-Antagonisten nicht beeinflusst. Wenn einige oder alle dieser Aminosäuren dem C-Terminus von den Analoga von hGH-RH(1-29)-NH₂ zugefügt werden, können die hinzugefügten Aminosäurereste die gleichen wie die Reste 30 bis 44 in der nativen hGH-RH-Sequenz oder vernünftige Äquivalente derselben sein.
Syntheseverfahren
Die synthetischen Peptide werden durch ein geeignetes Verfahren, wie zum Beispiel durch ausschließliche Festphasenverfahren, durch partielle Festphasenverfahren, durch Fragmentkondensation oder durch klassische Lösungsphasenverfahren hergestellt.
Wenn die Analoga gemäß vorliegender Erfindung durch das Festphasenverfahren hergestellt werden, wird der Rest am C-Terminus (hier: R²⁹ in geeigneter Weise an einen inerten festen Träger gebunden (an einem Kunstharz verankert), während die alpha-Aminogruppe (und, falls zweckmäßig, die funktionelle Seitenkettengruppe) Schutzgruppen tragen. Nach Abschluss dieser Stufe wird die alpha-Aminoschutzgruppe von dem verankerten Aminosäurerest entfernt, und der nächste Aminosäurerest, R²⁸, wird zugegeben, wobei seine alpha-Aminogruppe (ebenso wie irgendeine geeignete funktionelle Seitenkettengruppe) in geeigneter Weise geschützt ist usw. Nach Zugabe eines jeden Restes werden die N-terminalen Schutzgrppen entfernt, jedoch werden die Seitenkettenschutzgruppen noch nicht entfernt. Nachdem sämtliche erwünschten Aminosäuren in der geeigneten Reihenfolge gebunden wurden, wird das Peptid vom Träger gespalten und von allen Seitenkettengruppen unter Bedingungen befreit, welche hinsichtlich der Reste in der Reihenfolge minimal schädlich sind. Danach schließt sich eine sorgfältige Reinigung und gewissenhafte Charakterisierung des synthetischen Produkts an, um zu gewährleisten, dass auch die erwünschte Struktur in der Tat erhalten wurde.
Es wird besonders bevorzugt, während der Kopplungsstufe die alpha-Aminofunktion der Aminosäuren mit einer gegenüber Säure oder Base empfindlichen Schutzgruppe zu schützen. Derartige Schutzgruppen sollten die Eigenschaften besitzen, bei den Bedingungen der Bildung der Peptidbindung stabil zu sein, jedoch ohne Zerstörung der wachsenden Peptidkette und ohne Razemisierung eines der hierin enthaltenen chiralen Zentren leicht entfernbar zu sein. Geeignete alpha-Aminoschutzgruppen sind Boc und Fmoc.
Medizinische Anwendungen
Die Antagonistpeptide hGH-RH oder die Salze dieser Peptide können in pharmazeutische Dosierungsformen mit einem Gehalt an wirksamen Mengen derselben formuliert und an Menschen oder Tiere zu therapeutischen oder diagnostischen Zwecken verabreicht werden. Die Peptide können zur Senkung von GH-Spiegeln und zur Behandlung von Zuständen verwendet werden, die mit übermäßigen GH-Spiegeln verbunden sind, wie zum Beispiel diabetische Rhetinopathie und Nephropathie sowie Acromegalie. Auch wird die Verwendung von Verbindungen gemäß der Erfindung zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei Behandlungsmethoden dieser Krankheiten durch Verabreichung einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung an einen Patienten, der eine derartige Behandlung benötigt, bereit gestellt. Die Hauptverwendungen der GH-RH-Antagonisten liegen jedoch auf dem Krebsgebiet, beispielsweise bei menschlichen Karzinomen der Brust, Lunge, des Dickdarms, Gehirns und der Bauchspeicheldrüse, wo die Rezeptoren für IGF-1 vorhanden sind.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist ein Diagramm, in dem die Volumenveränderungen von menschlichen Bauchspeicheldrüsen-Karzinomen SW 1990 in kahlen Mäusen während der Behandlung mit bestimmten GH-RH-Antagonisten gegen die Behandlungstage aufgetragen sind.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
A. Abkürzungen
Die zur Definition der Peptide benutzte Nomenklatur ist diejenige, welche vom IUPAC-IUB Bevollmächtigten über die biochemische Nomenklatur ausgewiesen ist, wobei in Übereinstimmung mit der herkömmlichen Darstellung die Aminogruppe am N-Terminus links, und die Carboxylgruppe am C-Terminus rechts erscheint. Der im Vorliegenden verwendete Begriff „natürliche Aminosäure" bedeutet eine der üblichen, in natürlich auftretenden Proteinen, natürlich vorkommenden L-Aminosäuren: Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Thr, Lys, Arg, Asp, Asn, Glu, Gln, Cys, Met Phe, Tyr, Pro, Trp und His. Wenn der natürliche Aminosäurerest isomere Formen hast, ist es die L-Form der Aminosäure, welche im Vorliegenden wiedergegeben wird, wenn nicht ausdrücklich anders angegeben.
Nicht-kodierte Aminosäuren oder Aminosäurenanaloga sind auch in die GH-RH-Antagonisten einbezogen. („Nicht-kodierte" Aminosäuren sind diejenigen Aminosäuren, welche nicht unter den annähernd 20 natürlichen Aminosäuren sind, welche in natürlich vorkommenden Peptiden gefunden werden.) Unter den nicht-kodierten Aminosäuren oder Aminosäureanaloga, welche in den hGH-RH-Antagonisten-Peptiden verwendet werden können, sind folgende: Unter Abu wird alpha-Aminobuttersäure, unter Agm Agmatin (1-Amino-4-guanidinobutan), unter Aib alpha-Aminoisobuttersäure, unter Har Homoarginin, unter hPhe Homophenylalamin, unter Nal 2-Naphthylalanin, unter Nle Norleucin verstanden, während unter Tic 1,2,3,4-Tetrahydroisochinolin-Carbonsäure verstanden wird. Wenn diese nicht-kodierten Aminosäuren oder Aminosäureanaloga isomere Formen haben, ist es die L-Form der Aminosäure, welche wiedergegeben wird, wenn nicht ausdrücklich anders angegeben.

Abkürzungen, die im Vorliegenden benutzt werden, sind:

Abu	α-Aminobuttersäure
Ac	Acetyl
AcOH	Essigsäure
Ac₂O	Acetanhydrid
Agm	Agmatin (1-Amino-4-guanidinobutan)
Aib	α-Aminoisobuttersäure
Aqc	Anthrachinon-2-carbonyl
BHA	Benzhydrylamin
Boc	tert. Butyloxycarbonyl
BOP	Benzotriazol-1-yl-oxytris-(dimethylamino)-phosphoniumhexafluorphosphat
BrProp	Brompropionyl
cHx	Cyclohexcyl
Cit	Citrullin (2-Amino-5-Ureidovaleriansäure)
DCM	Dichlormethan

DIC	N,N'-Diisopropylcarbodiimid
DIEA	Diisopropylethylamin
DMF	Dimethylformamid
Für	3-Phenylpropionyl
GH	Wachstumshormon
GH-RH	GH freisetzendes Hormon
Har	Homoarginin
HBTU	2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat
hGH-RH	menschliches GH-RH
HOBt	1-Hydroxybenzotriazol
hPhe	Homophenylalanin
HPLC	Hochleistungs-Flüssigchromatografie
IAc	Jodacetyl
Ibu	Isobutyryl
MeOH	Methanol
MeCN	Acetonitril
MBHA	para-Methylbenzhydrylamin
Nac	1-Naphthylacetyl
2-Nac	2-Naphthylacetyl
Nal	2-Naphthylalanin
NMM	N-Methylmorpholin
Npr	Naphthylpropionyl
Npt	Naphthoyl
Phe(φCl)	para-Chlorphenylalanin
PhAc	Phenylacetyl
rGH-RH	GH-RG der Ratte
RP-HPLC	Umkehrphasen-HPLC
SPA	Sulfophenoxy
TFA	Trifluoressigsäure
Tic	1,2, 3,4-Tetrahydroisochinolin
Tos	para-Toluolsulfonyl
Tpi	2,3,4,9-Tetrahydro-1H-pyridol3,4-b]indol-3-carbonsäure
Tyr(Me)	Tyrasinmethylether
Z	Benzyloxycarbonyl

B. Die GH-RH-Analoga
Die hGH-RH-Analoga vorliegender Erfindung sind zur Erhöhung der Affinitäten der Peptide an dem Rezeptor, zur Verbesserung der Stoffwechselstabilität und zur Maximierung der amphiphilen sekundären Struktur der Moleküle bestimmt. Viele dieser Analoga bewirken eine sehr wirksame und lang anhaltende Hemmung der in vitro und in vivo durch hGH-RH(1-29)NH₂ stimulierten GH-Freisetzung.
Folgende Ausführungsformen werden aufgrund ihrer bemerkenswerten Biowirksamkeit speziell bevorzugt:
C. Herstellungsverfahren
1. Syntheseübersicht
Die Peptide werden durch ein geeignetes Verfahren synthetisiert, wie zum Beispiel durch ausschließliche Verfahren der Festphase, durch Verfahren der partiellen Festphase, durch Fragmentkondensation oder durch klassische Synthese der Lösungsphase. Beispielsweise sind die in den Monografien „Solid Phase Peptide Synthesis", J. M. Stewart und J. D. Young, Pierce Chem. Company, Rockford, USA, 111, 1984 (2. Auflage) und M. Bodanszky, „Principles of Peptide Synthesis", Springer Verlag, 1984, dargelegten Verfahren der ausschließlichen Festphase-Synthese brauchbar. Die hGH-RH-Antagonistenpeptide werden vorzugsweise unter Anwendung der Festphasen-Synthese hergestellt, wie zum Beispiel derjenigen, welche durch Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85, Seite 2149 (1963), allgemein beschrieben sind, obgleich andere gleichwertige bekannte chemische Synthesen auch angewandt werden können, wie zuvor erwähnt wurde.
Die Synthese wird mit den Aminosäuren durchgeführt, welche an ihrer alpha-Aminogruppe geschützt sind. Schutzgruppen vom Urethantyp (Boc oder Fmoc) werden vorzugsweise zum Schutz der alpha-Aminogruppe verwendet. Die bevorzugte Schutzgruppe ist Boc.
Bei der Festphasensynthese wird der geschützte N-alpha-Aminosäurerest, welcher die Aminoacylgruppe des Endpeptids am C-Terminus bildet, an einem Träger aus einem Polymerharz über eine chemische Bindung befestigt. Nach Abschluss der Kopplungsreaktion wird die alpha-Aminoschutzgruppe selektiv entfernt, um ein Stattfinden nachfolgender Kopplungsreaktionen am Amino-Terminus vorzugsweise mit 50% TFA in DCM zu ermöglichen, wenn die N-alpha-Schutzgruppe Boc ist. Die restlichen Aminosäuren mit ähnlichen durch Boc geschützten alpha-Aminogruppen werden stufenweise an die freie Aminogruppe der vorhergehenden Aminosäure am Kunstharz gekoppelt, um die gewünschte Peptidsequenz zu erhalten. Weil die Aminosäurereste an die alpha-Aminogruppe des C-Terminus-Restes gekoppelt werden, beginnt das Wachstum der synthetischen hGH-RH-Analoga-Peptide am C-Terminus und schreitet in Richtung des N-Terminus fort. Wenn die erwünschte Sequenz erreicht wurde, wird das Peptid, wenn dies zweckmäßig ist, acyliert, und es wird von dem Polymerträger entfernt.
Jede geschützte Aminosäure wird im Überschuss (2,5 oder 3 Äquivalente) verwendet, und die Kopplungsreaktionen werden üblicherweise in DCM, DMF oder deren Gemischen durchgeführt. Das Ausmaß des Abschlusses der Kopplungsreaktion wird in jeder Stufe durch Umsetzung mit Ninhydrin überwacht. In Fällen, wo eine unvollständige Kopplung ermittelt wird, wird das Kopplungsverfahren vor der Entfernung der alpha-Aminoschutzgruppe vor dem Koppeln der nächsten Aminosäure wiederholt.
Ein typischer Synthesezyklus ist in Tabelle I gezeigt.
TABELLE I Protokoll für einen typischen Synthesezyklus unter Anwendung der Boc-Strategie
Anm.: Boc: tert.-Butyloxycarbonyl
Nach Abschluss der Synthese kann die Abspaltung des Peptids vom Kunstharz unter Anwendung von in der Peptidchemie gut bekannter Verfahren bewirkt werden.
Einige der Aminosäurereste der Peptide haben funktionelle Seitenkettengruppen, welche mit Reagentien reaktiv sind, die beim Koppeln oder bei der Schutzgruppenentfernung benutzt werden. Wenn derartige Seitenkettengruppen vorliegen, werden geeignete Schutzgruppen mit diesen funktionellen Gruppen verbunden, um sie vor unerwünschten chemischen Reaktionen zu schützen, die während der zur Bildung der Peptide benutzten Umsetzungen auftreten. Bei der Auswahl einer besonderen Seitenkettenschutzgruppe folgt man nachfolgenden allgemeinen Richtlinien: (a) die Schutzgruppe behält vorzugsweise ihre Schutzeigenschaften und wird nicht unter den Kopplungsbedingungen abgespalten, (b) die Schutzgruppe sollte unter Bedingungen zur Entfernung der alpha-Aminoschutzgruppe bei jeder Synthesestufe stabil sein, (c) die Seitenkettenschutzgruppe muss beim Abschluss der Synthese der erwünschten Aminosäuresequenz unter Reaktionsbedingungen entfernbar sein, welche die Peptidkette nicht in unerwünschter Weise verändern.
Die anfänglichen Synthesestufen, welche im Vorliegenden angewandt werden, sind in US-Patent 4,914,189 offenbart, welches durch Bezugnahme in vorliegende Beschreibung einbezogen wird. Es wird insbesondere auf die Beispiele I bis IV hierin Bezug genommen.
Die reaktiven funktionellen Seitenkettengruppen werden vorzugsweise wie folgt geschützt: Benzyl für Thr und Ser; 2,6-Dichlorbenzyloxycarbonyl für Tyr; p-Toluolsulfonyl für Arg; 2-Chlorbenzyloxycarbonyl oder Fluorenylmethyloxycarbonyl für Lys, Orn; und Cyclohexyl oder Fluorenylmethyl für Asp und Glu. Die Seitenketten von Asn und Gln sind ungeschützt.
2. Kopplung von R²⁹ an den polymeren Träger
Die hGH-RH-Antagonisten-Peptide können auf den verschiedensten Polymeren als Träger hergestellt werden. Diese Trägerpolymeren können Aminoharze sein, wie zum Beispiel Aminomethylharze, Benzhydrylaminharze, p-Methylbenzhydrylaminharze und dergl. Boc-R²⁹ ist das an die Trägerphase, zweckmäßigerweise Boc-Arg(Tos)-OH oder Boc-Agm, gebundene Anfangsmaterial.
Zur Synthese von Peptiden mit Agm am C-Terminus wird bevorzugt, dass die Trägerphase [SP] ein Aminomethylharz ist. Die Guanidino-Gruppe von Boc-Agm ist an das Trägerpolymer über eine stabile, jedoch leicht abspaltbare Überbrückungsgruppe gebunden. Es wurde gefunden, dass eine solche Überbrückung durch den Sulfonylphenoxyacetylrest leicht bereitgestellt werden kann. Die alpha-Amino-Bocgeschützte Gruppe Agm wird mit der Chlorsulfonylphenoxyessigsäure Cl-SO₂-φ-O-CH₂-COOH unter Bildung von Boc-Agm²⁹-SO₂-φ-O-CH₂-COOH umgesetzt.
Diese Verbindung wird sodann an das Trägerpolymer [SP] unter Verwendung von DIC oder BOP als aktivierendes Reagens unter Bildung von Boc-Agm²⁹-SO₂-φ-O-CH₂-CO-[SP] umgesetzt.
Zur Synthese von Peptiden, welche Arg-NH₂ am C-Terminus aufweisen, wird Boc-Arg(Tos)-OH an das neutralisierte BHA oder MBHA-Harz unter Verwendung von DIC oder BOP als Aktivierungsmittel gekoppelt.
3. Stufenweises Koppeln von Aminosäureresten
Unter Verwendung des mit Boc geschützten Agm-Harzes (California Peptide Res. Inc.), (oder des Boc-Arg(Tos)-Harzes), kann das Peptid selbst durch Festphasensynthese auf herkömmliche Weise in geeigneter Art und Weise hergestellt werden. Die Auswahl eines geeigneten Kopplungsmittels liegt innerhalb der Kenntnis des Fachmanns. Als Kopplungsmittel besonders geeignete Verbindungen sind N,N'-Diisopropylcarbodiimid (DIC) oder das BOP-Carboxyl-Aktivierungsmittel.
Jede geschützte Aminosäure wird in etwa dreifachem molarem Überschuss angekoppelt bezüglich des harzgebundenen Aminoacylrests oder der harzgebundenen Aminoacylreste, und das Koppeln kann in einem Medium wie DMF : CH₂Cl₂ im Verhältnis 1 : 1 oder in DMF oder CH₂Cl₂ allein durchgeführt werden. In Fällen, wo ein unvollständiges Koppeln auftritt, wird das Kopplungsverfahren vor Entfernung der alpha-Aminoschutzgruppe wiederholt. Der Erfolg der Kopplungsreaktion jeder Stufe der Synthese wird vorzugsweise durch Umsetzung mit Ninhydrin überwacht.
Im Falle der Bildung einer Laktambrücke werden die Seitenkettenschutzgruppen (Fmoc und OFm) von Lys oder Orn bzw. Asp oder Glu des Boc-geschützten Peptidharzes selektiv mit 20% Piperidin in DMF entfernt. Die Bildung der Laktambrücke wird am festen Träger unter Verwendung von HBTU als Kopplungsmittel erreicht.
4. Entfernung es Peptids von dem Trägerpolymer
Wenn die Synthese vollständig ist, wird das Peptid von der Trägerphase abgespalten. Die Entfernung des Peptids vom Kunstharz wird durch Behandlung mit einem Reagens wie flüssiger Flusssäure durchgeführt, welche auch alle restlichen Seitenkettenschutzgruppen abspaltet.
Geeigneterweise wird das getrocknete und geschützte Peptidharz mit einem Gemisch behandelt, das aus 1,0 ml m-Kresol und 10 ml wasserfreiem Fluorwasserstoff pro Gramm Peptidharz besteht, 60 Minuten bei 0°C behandelt, um das Peptid vom Kunstharz abzuspalten sowie alle Seitenkettenschutzgruppen zu entfernen. Nach Entfernung des Fluorwasserstoffs unter einem Stickstoffstrom und Vakuum werden die freien Peptide mit Ether ausgefällt, filtriert, mit Ether und Ethylacetat gewaschen, mit 50%iger Essigsäure extrahiert und gefriergetrocknet.
5. Reinigung
Die Reinigung der rohen Peptide kann unter Anwendung von in der Peptidchemie gut bekannter Verfahren bewirkt werden. Beispielsweise kann die Reinigung mit einem MacRabbit-HPLC-System (Rainin Instrument Co. Inc., Woburn, MA, USA) mit einem Knauer UV-Fotometer und einem Kipp und Zonen BD40-Recorder unter Verwendung einer mit C8 Silikagel (Porengröße: 300 A, Teilchengröße: 10 um) (Rainin Inc.) gepackten Säule VYDAC 228TP der Abmessung 10 × 250 mm durchgeführt werden. Die Säule wird mit einem Lösungsmittelsystem, bestehend aus (A) 0,1% wässriger TFA und (B) 0,1% iger TFA in 70% wässrigem McCN auf Art eines linearen Gradienten eluiert (zum Beispiel 30–65% B in 120 Minuten). Der Eluent wird bei 220 nm überwacht, und die Fraktionen werden durch analytische HPLC unter Verwendung eines Flüssigkeitschromatografen Hewlett-Packard Modell HP-1090 geprüft und koordiniert, um eine maximale Reinheit zu ergeben. Die analytische HPLC wird an einer Umkehrphasenkolonne W-Porex C18 (4,6 × 250 mm, 5 um Teilchengröße, 300 Å Porengröße) (Phenomenex, Rancho Palos Verdes, CA, USA) durchgeführt unter Verwendung einer isokratischen Elution mit einem Lösungsmittelsystem, das aus zuvor definiertem (A) und (B) besteht. Die Peaks werden bei 220 und 280 nm überwacht. Durch analytische HPLC wird beurteilt, ob die Peptide im wesentlichen ( > 95%) rein sind. Die erwartete Aminosäurezusammensetzung wird auch durch Aminosäureanalyse bestätigt.
D. Pharmazeutische Zusammensetzung
Die erfindungsgemäßen Peptide können in Form von pharmazeutisch brauchbaren, nichttoxischen Salzen, wie Säureadditionssalzen, verabreicht werden. Beispiele für derartige Säureadditionssalze sind das Hydrochlorid, Hydrobromid, Sulfat, Phosphat, Fumarat, Gluconat, Tannat, Maleat, Acetat, Citrat, Benzoat, Succinat, Alginat, Pamoat, Malat, Ascorbat, Tartrat und dergl. Insbesonders bevorzugte Antagonisten sind Salze geringer Löslichkeit, wie zum Beispiel Pamoatsalze und dergl. Diese zeigen ein langes Anhalten der Wirksamkeit.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung werden geeigneterweise an menschliche Patienten oder Tiere subkutan, intramuskulär oder intravenös, intranasal oder durch Lungeninhalation oder in einer Depotform (wie zum Beispiel als Mikrokapseln, Mikrogranalien oder zylinderstabähnliche Implantate), formuliert aus einem bioabbaubaren geeigneten Polymeren (wie zum Beispiel D,L-Lactide-Coglycolid) verabreicht, wobei die ersten beiden Depotarten bevorzugt werden. Andere äquivalente Verabreichungsarten liegen auch innerhalb des Umfangs vorliegender Erfindung, d.h.. ein kontinuierlicher Tropf, Depotinjektionen, durch eine Infusionspumpe und Arten der zeitlichen Freisetzung, wie zum Beispiel Mikrokapseln und dergl. Die Verabreichung erfolgt in irgendeinem physiologisch annehmbaren injizierbaren Träger, wobei eine physiologische Kochsalzlösung akzeptabel ist, obgleich andere bekannte Träger auch benutzt werden können.
Die Peptide werden vorzugsweise parenteral, intramuskulär, subkutan oder intravenös mit einem pharmazeutisch brauchbaren Träger wie isotonischer Kochsalzlösung verabreicht. Die Peptide können aber auch mit einem geeigneten Träger als Intranasal-Spray oder durch Lungeninhalation verabreicht werden. Ein geeigneter Verabreichungsweg ist eine aus einem geeigneten bioabbaubaren Polymeren formulierte Depotform wie zum Beispiel aus Poly-D,L-lactid-coglycolid als Mikrokapseln, Mikrogranalien oder zylindrischen Implantaten mit einem Gehalt an den dispergierten antagonistischen Verbindungen.
Die benötigte Peptidmenge hängt von der Art der Verabreichung und dem beabsichtigten Ergebnis ab. In der Regel liegt der Dosierungsbereich zwischen 1–100 μg/kg Körpergewicht des Patienten pro Tag.
E. Therapeutische Verwendungen von GH-RH-Antagonisten
hGH-RH-Antagonisten können bei der Behandlung von Zuständen verwendet werden, welche durch überschüssiges Wachstumshormon verursacht sind, beispielsweise Acromegalie, welche sich durch eine anormale Vergrößerung der Knochen des Gesichts und der Extremitäten äußert. Die GH-RH-Antagonisten können auch zur Behandlung diabetischer Nephropathie (die Hauptursache der Erblindung von Diabetikern) und der diabetischen Retinopathie benutzt werden, bei denen man annimmt, dass die Augen- bzw. Nierenschäden auf GH zurückzuführen sind.
Die hGH-RH-Antagonisten sind dazu bestimmt, die Bindung und damit die Wirkung von GH-RH, welches die Sekretion von GH stimuliert, das seinerseits die Bildung von IGF-1 stimuliert, zu blockieren. GH-RH-Antagonisten können allein oder zusammen mit Somatostatin-Analogen verabreicht werden, eine Kombination, die die IGF-1-Spiegel vollständiger senkt. Es ist vorteilhaft, aufgrund der Tatsache Antagonisten von GH-RH anstelle von Somatostatin zu verabreichen, dass GH-RH-Antagonisten in Situationen verabreicht werden können, wo Zielstellen keine Somatostatinrezeptoren besitzen.
Jedoch liegen die Hauptanwendungen von GH-RH-Antagonisten auf dem Krebsgebiet. Dem liegen folgende Erwägungen zugrunde: GH-RH-Antagonisten sind dazu bestimmt, die Bindung und damit die Wirkung von GH-RH zu blockieren, das die Sekretion von GH stimuliert, welches seinerseits die Bildung des insulinähnlichen Wachstumsfaktors 1 (IGF-1), auch Somatomedin-C genannt, stimuliert. Das Beteiligtsein von IGF-1 (Somatomedin-C) beim Brustkrebs, Prostatakrebs, Dickdarmkrebs, Knochentumoren und anderen malignen Karzinomen ist gut begründet, und Somatostatin-Analoge allein senken GH und IGF-1-Spiegel nicht ausreichend. Eine vollständige Senkung von IGF-1-Spiegeln oder Sekretion ist für eine bessere Hemmung des Tumorwachstums erforderlich. Eine autokrine Bildung von IGF-1 durch verschiedene Tumoren könnte auch unter Steuerung von GH-RH sein und deshalb durch GH-RH-Antagonisten gehemmt werden. GH-RH-Antagonisten könnten auch die Bildung von IGF-1 hemmen. Ein detaillierterer theoretischer Hintergrund der Anwendungen von GH-RH auf dem Gebiet der Onkologie (Karzinome) ist folgender: Die Rezeptoren für IGF-1 liegen bei primären menschlichen Brustkarzinomen, Lungenkarzinomen, menschlichen Dickdarmkarzinomen und menschlichen Gehirntumoren sowie in menschlichen Bauchspeicheldrüsenkarzinomen vor.
Die Anwesenheit von IGF-1-Rezeptoren bei diesen Tumoren scheint in Beziehung zur malignen Umwandlung und zur Proliferation dieser Karzinome in Beziehung zu stehen. IGF-1 kann als endokriner, parakriner oder autokriner Wachstumsfaktor für verschiedene menschliche Karzinome wirken, d. h. das Wachstum dieser Neoplasmen hängt von IGF-1 ab. GH-RH-Antagonisten können durch Unterdrückung der GH-Sekretion die Bildung von IGF-1 verringern. Da IGF-1 das Wachstum dieser verschiedenen Neoplasmen (Karzinome) stimuliert, sollte die Senkung der zirkulierenden IGF-1-Spiegel zur Hemmung des Tumorwachstums führen. Es ist möglich, dass GH-RH-Antagonisten auch die parakrine oder autokrine Bildung von IGF-1 durch die Tumoren verringern kann, welches ebenfalls zur Hemmung der Krebsproliferation führen sollte. Diese Ansichten stimmen mit den modernen Konzepten der klinischen Onkologie überein. Die GH-RH-Antagonisten sollten allein oder zusammen mit Somatostatin-Analogen verabreicht werden, und eine Kombination würde eine vollständigere Senkung der IGF-1-Spiegel erreichen, eine Ausscheidung von Gewebe-Spiegeln von IGF-1 bei menschlichen Osteosarkomen sowie Brustkrebs; Dickdarmkrebs, Prostatakrebs und nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (nicht-SCLC).
Der Vorteil von GH-RH-Antagonisten über Somatostatin-Analoge beruht auf der Tatsache, dass GH-RH-Antagonisten zur Unterdrückung von Tumoren benutzt werden können, die keine Somatostatin-Rezeptoren besitzen, wie zum Beispiel menschliche osteogene Sarkome.
Vorliegende Erfindung wird im Zusammenhang mit den nachfolgenden Beispielen beschrieben, welche nur zum Zweck der Veranschaulichung dargelegt sind. In den Beispielen werden optisch aktive geschützte Aminosäuren in der L-Konfiguration verwendet mit der Ausnahme, wo dies speziell vermerkt ist.
Folgende Beispiele legen geeignete Verfahren zur Herstellung der neuen GH-RH-Antagonisten nach dem Festphasenverfahren dar.
BEISPIEL I
Synthese von Boc-agmatin
BEISPIEL II
Synthese von 4-Chlorsulfonylphenoxyessigsäure (Cl-SPA)
BEISPIEL III
Boc-agmatin-[SPA]
BEISPIEL IV
Kopplung von Boc-agmatin-[SPA] an die Trägerphase
Die im Vorliegenden verwendete, anfängliche synthetische Sequenz, die durch die vorherigen Titel angegeben ist, ist in den Beispielen I bis IV des US-Patents 4,914,189 offenbart.
Vergleichsbeispiel V
Die Synthese wird stufenweise unter Verwendung einer manuellen Festphasen-Peptidsyntheseanlage durchgeführt. Kurz gesagt, wird Benzhydrylamin (BHA)-Harz (Bachem, Kalifornien, USA) (100 mg, 0,044 mMol) mit 5% igem DIEA in CH₂Cl₂ neutralisiert und gemäß dem in Tabelle 1 beschriebenen Protokoll gewaschen. Die Lösung von Boc-Cit-OH (61mg, 0,25 mMol) in DMF/CH₂Cl₂ (im Verhältnis von 1 : 1) wird mit dem neutralisierten Harz und DIC (44 μl, 0,275 mMol) in einer manuellen Festphasen-Peptidsynthese-Anlage eine Stunde lang geschüttelt. Nach Abschluss der Kopplungsreaktion, der sich durch einen negativen Ninhydrin-Test erweist, Entfernung der Schutzgruppe mit 50% igem TFA in CHCl₂ und Neutralisierung mit 5% igem DIEA in CH₂Cl₂ wird die Peptidkette stufenweise durch Kopplung folgender geschützter Aminosäuren in der angegebenen Reihenfolge an das Kunstharz aufgebaut, um die gewünschte Peptidsequenz zu erhalten: Boc-Ser(Bzl)-OH, Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Asp(OcHx)-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Lys(2-Cl-Z)-OH,
Diese geschützten Aminosäurereste (auch üblicherweise erhältlich von Bachem Co.) sind zuvor gemäß einer gut akzeptierten Übereinkunft wiedergegeben. Die geeignete Schutzgruppe für die funktionelle Seitenkettengruppe spezieller Aminosäuren erscheint in Klammern. Die OH-Gruppen in den obigen Formeln geben an, dass der Carboxyl-Terminus eines jeden Restes frei ist.
Die geschützten Aminosäuren (jeweils 0,25 mMol) werden mit DIC (44 μl, 0,275 mMol) mit den Ausnahmen von Boc-Asn-OH und Boc-Gln-OH gekoppelt, welch letztere mit ihren zuvor gebildeten HOBt-Estern gekoppelt werden. Nach Entfernung der N^a-Boc-Schutzgruppe von Tyr¹ wird das Peptid mit Isobuttersäure (Ibu) (75 mg, 0,4 mMol) unter Verwendung von DIC (70 μl, 0,44 mMol) acyliert.
Um das Peptid von dem Kunstharz abzuspalten und zur Entfernung seiner Schutzgruppen wird das getrocknete Peptidharz (138 mg) mit 0,5 ml m-Kresol und 5 ml Fluorwasserstoff (HF) bei 0°C eine Stunde gerührt. Nach Verdampfen des Fluorwasserstoffs unter Vakuum wird der Rückstand mit trockenem Diethylether und Ethylacetat gewaschen. Das abgespaltene und von Schutzgruppen befreite Peptid wird in 50% iger Essigsäure gelöst und von dem Kunstharz abfiltriert. Nach Verdünnung mit Wasser und Gefriemocknen werden 34 mg Rohprodukt erhalten.
Das Rohprodukt wird durch analytische HPLC unter Verwendung eines Flüssigkeitschromatografen Hewlett-Packard Modell HP-1090 mit einer Umkehrphasen-Säule W-Porex C18 (4,6 × 250 mm, Teilchengröße: 5 μm, Porengröße: 300 A von Phenomenex, Rancho Palos Verdes, CA, USA) und einem linearen Elutionsgradienten (wie zum Beispiel 40–70% B) mit einem Lösungsmittelsystem überprüft, das aus (A) 0,1% iger wässriger TFA und (B) 0,1% TFA in 70% igem wässrigen McCN besteht. 34 mg des rohen Peptids werden in AcOH/H₂O gelöst, gerührt, filtriert und auf eine mit C8 Silikagel gepackte Säule VYDAC 228TP (10 × 250 mm) aufgebracht. Die Säule wird mit einem Lösungsmittelsystem eluiert, das zuvor beschrieben wurde, auf die Weise eines linearen Gradienten (wie zum Beispiel 30–55% B innerhalb von 120 Minuten); die Strömungsrate ist 2 ml/min. Das Eluierungsmittel wird bei 220 nm überwacht, und die Fraktionen werden durch analytische HPLC überprüft. Die Fraktionen mit einer Reinheit von mehr als 95% werden vereint und gefriergetrocknet, um zu 1,2 mg reinem Produkt zu führen. Die analytische HPLC wird mit der weiter oben beschriebenen Umkehrphasen-Säule W-Porex C 18 durchgeführt unter Anwendung einer isokratischen Elution mit dem oben beschriebenen Lösungsmittelsystem bei einer Strömungsrate von 1,2 ml/min. Die Peaks werden bei 220 und 280 nm überwacht. Durch analytische HPLC wird beurteilt, ob das Produkt im wesentlichen (> 95%) rein ist. Die erwartete Aminosäurezusammensetzung wird auch durch Aminosäureanalysen bestätigt.
Die Peptide 2 und 3 werden auf die gleiche Weise wie Peptid 1, jedoch mit der Ausnahme synthetisiert, dass Boc-Asn-OH⁸ durch Boc-Abu-OH (0,25 mMol) ersetzt wird, und die erhaltenen Peptide werden mit Isobuttersäure bzw. Phenylessigsäure acyliert, um zu ergeben:
BEISPIEL VI
Die Synthese wird stufenweise unter Verwendung einer manuellen Anlage für die Festphasen-Peptidsynthese durchgeführt. Kurz gesagt, wird Boc-Agm-SPAaminomethyl-Harz (California Peptide Research Co., Inc., Kalifornien, USA) (200 mg, 0,06 mMol) mit 50% iger TFA in CH₂Cl₂ von der Schutzgruppe befreit, mit 5% igem DIEA in CH₂Cl₂ neutralisiert und wie in Tabelle I beschrieben gewaschen. Die Lösung von Boc-Ser(Bzl)-OH (55 mg, 0,18 mMol) in DMF/CH₂Cl₂ (im Verhältnis von 1 : 1) wird mit dem H-Agm-SPA-aminomethyl-Harz und DIC (31 μl, 0,2 mMol) in einer manuellen Anlage zur Festphasen-Peptidsynthese eine Stunde geschüttelt. Nach Nachweis des Abschlusses der Kopplungsreaktion durch einen negativen Ninhydrin-Test, Entfernung der Schutzgruppe mit 50% iger TFA in CH₂Cl₂ und Neutralisation mit 5% DIEA in CH₂Cl₂ und Waschen, wie in Tabelle I beschrieben, werden zum stufenweisen Aufbau der Peptidkette nachfolgende geschützte Aminosäuren in der angegebenen Reihenfolge an das Harz gekoppelt: Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Asp(OcHx)-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Lys(2-Cl-Z)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser(Bzl)-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Lys(2-Cl-Z)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Tyr(2,6-diCl-Z)-OH, Boc-Ser(Bzl)-OH, Boc-Asn-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Phe(pCl)-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp(OcHx)-OH, Boc-D-Arg(Tos)-OH und Boc-Tyr(2,6-diCl-Z)-OH.
Die geschützten Aminosäuren (jeweils 0,18 mMol) werden mit DIC (31 μl, 0,2 mMol) gekoppelt, mit den Ausnahmen von Boc-Asn-OH und Boc-Gln-OH, welche mit ihren vorgeformten HOBt-Estern gekoppelt werden. Nach Entfernung der N^a-Boc-Schutzgruppe von Tyr¹ wird das Peptid mit Phenylessigsäure (66 mg, 0,5 mMol) unter Verwendung von DIC als Kopplungsmittel (88 μl, 0,55 mMol) acyliert.
Zur Abspaltung des Peptids von dem Kunstharz und um es von Schutzgruppen zu befreien, wird das getrocknete Peptidharz (148 mg) mit 0,5 ml m-Kresol und 5 ml Fluorwasserstoff (HF) bei 0°C eine Stunde gerührt. Nach Verdampfen von HF unter Vakuum wird der Rückstand mit trockenem Diethylether und Ethylacetat gewaschen. Das abgespaltene und von Schutzgruppen befreite Peptid wird in 50% iger Essigsäure gelöst und von dem Harz abfiltriert. Nach Verdünnung mit Wasser und Gefriertrocknen fallen 62 mg Rohprodukt an.
62 mg des GH-RH-Antagonisten-Peptids werden in AcOH/H₂O aufgelöst und durch RP-HPLC unter Anwendung des gleichen Verfahrens und der gleichen Vorrichtungen gereinigt, wie sie im Beispiel V beschrieben sind. Durch analytische HPLC wird beurteilt, ob das Produkt im wesentlichen (> 95%) rein ist. Die Bestätigung der Struktur wird durch Aminosäureanalyse bereit gestellt.
Die Peptide 4, 5, 6, 7, 15, 16, 25 und 26 werden auf die gleiche Weise wie Peptid 1, jedoch mit der Ausnahme hergestellt, dass diese Peptide auch andere Substitutionen enthalten, wobei erhalten werden:
BEISPIEL VII
Die Synthese wird stufenweise unter Verwendung eines manuellen Geräts zur Festphasen-Peptidsynthese durchgeführt. Kurz gesagt, es wird Benzhydrylamin (BHA)-Harz (Bachem, Kalifornien, USA) (100 mg, 0,044 mMol) mit 5% DIEA in CH₂Cl₂ neutralisiert und gemäß dem in Tabelle 1 beschriebenen Frotokoll gewaschen. Die Lösung von Boc-Arg(Tos)-OH (107 mg, 0,25 mMol) in DMF-CH₂Cl₂ (im Verhältnis von 1 : 1) wird mit dem neutralisierten Kunstharz und DIC (44 μl, 0,275 mMol) in einer manuellen Anlage zur Festphasen-Peptidsynthese eine Stunde geschüttelt. Nach Abschluss der Kopplungsreaktion, der durch einen negativen Ninhydrintest nachgewiesen wird, Entfernung der Schutzgruppen mit 50% iger TFA in CH₂Cl₂ und Neutralisieren mit 5% DIEA in CH₂Cl₂ wird die Peptidkette stufenweise aufgebaut, indem man folgende geschützte Aminosäuren in der angegebenen Reihenfolge am Kunstharz aufbaut, um die gewünschte Peptidsequenz zu erhalten: Boc-Ser(Bzl)-OH, Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Asp(OcHx)-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boe-Leu-OH, Boc-Lys(2-Cl-Z)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser(Bzl)-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Lys(2-Cl-Z)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Tyr(2,6-diCl-Z)-OH, Boc-Ser(Bzl)-OH, Boc-Asn-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Phe(pCl)-OH, Boc-Ile-OH, Boe-Ala-OH, Boc-Asp(OcHx)-OH, Boc-D-Arg(Tos)-OH und Boc-Tyr(2,6-diCl-Z)-OH.
Die geschützten Aminosäuren (jeweils 0,25 mMol) werden mit DIC (44 μl, 0,275 mMol) gekoppelt, mit den Ausnahmen von Boc-Asn-OH und Boc-Gln-OH, welche mit ihren zuvor gebildeten HOBt-Estern gekoppelt werden. Nach Entfernung der N^a-Boc-Schutzgruppe von Tyr¹ wird das Peptid mit Phenylessigsäure (PhAc) (54 mg, 0,4 mMol) unter Verwendung von DIC (70 μl, 0,44 mMol) acyliert.
Zur Abspaltung des Peptids von dem Kunstharz und Entfernung seiner Schutzgruppen wird das getrocknete Peptidharz (171 mg) mit 0,5 ml m-Kresol und 5 ml Fluorwasserstoff (HF) bei 0°C eine Stunde gerührt. Nach Verdampfen von HF unter Vakuum wird der Rückstand mit trockenem Diethylether und Ethylacetat gewaschen. Das abgespaltete und von Schutzgruppen befreite Peptid wird in 50% iger Essigsäure gelöst und von dem Harz abfiltriert. Nach Verdünnen mit Wasser und Gefriertrocknen werden 98 mg Rohprodukt erhalten.
Das rohe Peptid wird durch analytische HPLC unter Verwendung eines Hewlett-Packard Modell HP-1090 mit einer Umkehrphasen-Säule W-Porex C18 (4,6 × 250 mm, Teilchengröße: 5 μl, Porengröße: 300 R, erhältlich von Phenomenex, Rancho Palos Verdes, CA, USA) und einer linearen Gradientenelution (zum Beispiel 40–70% B) mit einem Lösungsmittelsystem überprüft, das aus (A) 0,1% einer wässrigen TFA und (B) 0,1% TFA in 70% igem wässrigen McCN besteht. 60 mg des rohen Peptids wird in AcOH/H₂O gelöst, gerührt, filtriert und auf eine mit C8-Silikagel gepackte Säule VYDAC 228TP (10 × 250 mm) aufgebracht. Die Säule wird mit einem zuvor beschriebenen Lösungsmittelsystem auf die Art eines linearen Gradienten (zum Beispiel 30–55% B innerhalb von 120 Minuten) bei einer Strömungsrate von 2 ml/min eluiert. Das Elutionsmittel wird bei 220 nm überwacht, und die Fraktionen werden durch analytische HPLC geprüft. Die Fraktionen mit einer Reinheit von mehr als 95% werden vereint und gefriergetrocknet, wobei 2,6 mg reines Produkt anfallen. Die analytische HPLC wird mit einer oben beschriebenen Umkehrphasen-Säule W-Porex C18 unter Anwendung einer isokratischen Elution mit einem weiter oben beschriebenen Lösungsmittelsystem bei einer Strömungsrate von 1,2 ml/min durchgeführt. Die Peaks werden bei 220 und 280 nm überwacht. Durch analytische HPLC wird beurteilt, ob das Peptid im wesentlichen (> 95%) rein ist. Die erwartete Aminosäurezusammensetzung wird auch durch Aminosäureanalyse bestätigt.
Die Peptide 10, 11, 12, 13 und 14 werden auf die gleiche Weise wie das Peptid 9, jedoch mit der Ausnahme hergestellt, dass diese Peptide auch andere Substitutionen enthalten, wobei erhalten werden:
BEISPIEL VIII
Unter Verwendung einer manuellen Anlage zur Festphasen-Peptidsynthese wird die Synthese stufenweise durchgeführt. Kurz gesagt, wird das Benzhydrylamin (BHA)-Harz (Bachem, Kalifornien, USA) (100 mg, 0,044 mMol) mit 5% DIEA in CH₂Cl₂ neutralisiert und gemäß dem in Tabelle 1 beschriebenen Protokoll gewaschen. Die Lösung von Boc-Arg(Tos)-OH (107 mg, 0,25 mMol) in DMF-CH₂Cl₂ (im Verhältnis von 1 : 1) wird mit dem neutralisierten Kunstharz und DIC (44 μl, 0,275 mMol) in einer manuellen Anlage zur Festphasen-Peptidsynthese eine Stunde geschüttelt. Nach Nachweis des Abschlusses der Kopplungsreaktion durch einen negativen Ninhydrintest, Entfernung der Schutzgruppen mit 50% iger TFA in CH₂Cl₂ und Neutralisation mit 5 DIEA in CH₂Cl₂ wird die Peptidkette stufenweise durch Koppeln folgender geschützter Aminogruppen in der angegebenen Reihenfolge an das Kunstharz aufgebaut, um die erwünschte Peptidsequenz zu erhalten: Boc-Ser(Bzl)-OH, Boc-Nle-OH, Boc-De-OH, Boc-Asp(OcHx)-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boe-Leu-OH, Boc-Lys(Fmoc)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser(Bzl)-OH, Boc-Glu(Fm)-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Lys(2-Cl-Z)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Tyr(2,6-diCl-Z)-OH, Boc-Ser(Bzl)-OH, Boc-Ser(Bzl)-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Phe(pCl)-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp(OcHx)-OH, Boc-D-Arg(Tos)-OH, Boc-Tyr(2,6-diCl-Z)-OH.
Die geschützten Aminosäuren (jeweils 0,25 mMol) werden mit DIC (44 μl, 0,275 mMol) gekoppelt, mit den Ausnahmen von Boc-Asn-OH und Boc-Gln-OH, welche mit ihren zuvor gebildeten HOBt-Estern gekoppelt werden. Nach Entfernung der N^a-Boc-Schutzgruppe von Tyr¹ wird das Peptid mit Phenylessigsäure (PhAc) (75 mg, 0,4 mMol) unter Verwendung von DIC (70 μl, 0,44 mMol) acyliert. Das acylierte Peptid wird von seinen Schutzgruppen mit 20% Piperidin in DMF während 1 plus 20 Minuten befreit, um zu freien Seitenketten von Glu¹⁷ und Lys²¹ zu führen. Nach Waschen des Kunstharzes wird die Laktambrücke mit HBTU-Reagens (110 mg, 0,275 mMol) in DMF-DCM (im Verhältnis von 1 : 1) mit einem Gehalt an DIEA (137 μl, 0,55 mMol) und HOBt (39 mg, 0,275 mMol) während 3 Stunden gebildet (negativer Kaiser-Ninhydrin-Test).
Zur Abspaltung des Peptids von dem Kunstharz und zur Entfernung seiner Schutzgruppen wird das getrocknete Peptidharz (53,1 mg) mit 0,5 ml m-Kresol und 5 ml Fluorwasserstoff (HF) bei 0°C eine Stunde gerührt. Nach Verdampfen von HF unter Vakuum wird der Rückstand mit trockenem Diethylether und Ethylacetat gewaschen. Das abgespaltete und von Schutzgruppen befreite Peptid wird in 50% iger Essigsäure gelöst und von dem Harz abfiltriert. Nach Verdünnung mit Wasser und Gefriertrocknen werden 13,7 mg Rohprodukt erhalten.
Das rohe Peptid wird durch analytische HPLC unter Verwendung eines Flüssigkeitschromatografen Hewlett-Packard Modell HP-1090 mit einer Umkehrphasen-Säule W-Porex C18 (4,6 × 250 mm, Teilchengröße: 5 μl, Porengröße: 300 Å, erhältlich von Phenomenex, Rancho Palos Verdes, CA, USA) und eines linearen Elutionsgradienten (zum Beispiel 40–70% B) mit einem Lösungsmittelsystem überprüft, das besteht aus (A) 0,1% einer wässrigen TFA und (B) 0,1% TFA in 70% igem wässrigen McCN. Das rohe Peptid wird in AcOH/H₂O gelöst, gerührt, filtriert und auf eine mit C8-Silikagel gepackte Säule VYDAC 228TP (10 × 250 mm) aufgebracht. Die Säule wird mit einem zuvor beschriebenen Lösungsmittelsystem auf die Art eines linearen Gradienten (zum Beispiel 30–55% B während 120 Minuten) bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 2 ml/min eluiert. Das Elutionsmittel wird bei 220 nm überwacht, und die Fraktionen werden durch analytische HPLC geprüft. Fraktionen mit einer Reinheit von mehr als 95% werden vereint und gefriergetrocknet, um zu 0,96 mg Reinprodukt zu führen. Die analytische HPLC wird mit einer zuvor beschriebenen Umkehrphasen-Säule W-Porex C18 unter Anwendung einer isokratischen Elution mit einem weiter oben beschriebenen Lösungsmittelsystem bei einer Strömungsrate von 1,2 ml/min durchgeführt. Die Peaks werden bei 220 und 280 nm überwacht. Durch analytische HPLC wird beurteilt, ob das Peptid im wesentlichen (> 95%) rein ist. Die erwartete Aminosäurezusammensetzung wird auch durch Aminosäureanalyse bestätigt.
Die Peptide 17, 19 und 20 werden auf die gleiche Weise wie das Peptid 18 hergestellt, jedoch mit der Ausnahme, dass zusätzlich zu anderen Substitutionen zwischen den Stellungen 8, 12 oder 25, 29 die Laktambrücke gebildet ist, wobei erhalten werden:
Die Peptide 21, 22, 23 und 24 werden auf die gleiche Weise wie das Peptid 18 hergestellt, jedoch mit der Ausnahme, dass zusätzlich zu anderen Substitutionen zwischen beiden Stellungen 8, 12 und 21, 25 eine Laktambrücke gebildet ist, unter Bildung von:
BEISPIEL IX
Biologische Wirksamkeit
Die erfindungsgemäßen Peptide sowie die Vergleichsverbindungen wurden in einem in vitro und in vivo-Test auf ihre Fähigkeit getestet, die durch hGH-RH(1-29)NH₂ eingeleitete Freisetzung von GH zu hemmen.
Rattenhypophyse-Superfusionssystem
Die Analoga wurden in vitro in einem früher beschriebenen Test (S. Vigh und A. V. Schally, Peptides 5: 241–347, 1984) mit Modifikation (Z. Rekasi und A. V. Schally, P. N. A. S. 90: 2146–2149, 1993) getestet.
Kurz gesagt, es werden die Zellen mit Peptiden (3 ml) während 9 Minuten bei verschiedenen Konzentrationen vorinkubiert. Unmittelbar nach der Inkubation wird 1 nM hGH-RH(1-29)NH₂ (1 ml) 3 Minuten verabreicht [Reaktion bei 0 Minuten]. Um die Dauer der antagonistischen Wirkung des Analogen zu überprüfen, wird 1 nM hGH-RH(1-29)NH₂ 30, 60, 90 und 120 Minuten später 3 Minuten angewandt [Reaktionen nach 30, 60, 90, 120 Minuten]. Die integralen Nettowerte der GH-Reaktionen werden bewertet. Die GH-Reaktionen werden mit der ursprünglichen, durch 1 nM GH-RH(1-29)NH₂ bewirkten GH-Reaktion verglichen und als Prozentsatz derselben ausgedrückt. Die Wirkung der neuen Antagonisten wird mit derjenigen von [Ac-Tyr¹, D-Arg²]hGH-RH(1-29)NH₂, dem „Standardantagonisten", verglichen.
Wachstumshormon-Radioimmunassav
Die GH-Spiegel von Ratten wurden in gleichen Anteilen von unverdünnten und verdünnten Superfusionsproben durch einen doppelten Antikörper-Radioimmunassay unter Verwendung von Materialien gemessen, welche von The National Hormone and Pituitary Program, Baltimore, Maryland, USA, geliefert wurden. Die Ergebnisse der RIAs wurden mit einem in unserem Institut entwickelten Computer-Programm analysiert (V. Csernus und A. V. Schally, Harwood Academic, Greenstein, B. C., Herausg., London, S. 71–109, 1991), das durch Bezugnahme in vorliegende Beschreibung einbezogen wird. Die Variation zwischen den Tests war weniger als 15% , und diejenige innerhalb des Tests war weniger als 10% .
GH-RH Bindungstest
Zur Bestimmung der Bindungseigenschaften der Antagonisten von GH-RH wurde ein empfindlicher Radiorezeptor-Bindungstest entwickelt (G. Halmos, A. V. Schally u. a., Receptor 3, 87–97, 1993), welcher durch Bezugnahme in vorliegende Beschreibung einbezogen wird. Dem Test liegt die Bindung einer markierten Verbindung [His¹, Nle²⁷]hGH-RH(1-32)NH₂ an Homogenate der vorderen Rattenhypophysenmembran zugrunde. Jodierte Derivate von [His¹, N1e²⁷]hGH-RH(1-32)NH₂ werden nach dem Chloramin-T-Verfahren hergestellt (F. C. Greenwood u. a., Biochemistry 89: 114–123, 1963), welches durch Bezugnahme in vorliegende Beschreibung einbezogen wird. Zur Herstellung der rohen Membranen wurden Hypophysen von männlichen Sprague-Dawley-Ratten (250–300 g) verwendet. Zu Sättigungsbindungsanalysen werden Membranhomogenate mit mindestens 6 Konzentrationen von [His^1,125, I-Tyr¹⁰, N1e²⁷]hGH-RH(1-32)NH₂ im Bereich von 0,005 bis 0,35 nM in Gegenwart oder Abwesenheit überschüssigen nicht-markierten Peptids (1 μM) inkubiert.
Das Pellet wird auf seine Radioaktivität in einem y-Zähler ausgezählt. Die Affinitäten der getesteten Antagonistenpeptide zu Rattenhypophyse-GH-RH-Rezeptoren werden in Wettbewerbsbindungsversuchen bestimmt. Die Bindungsendaffinitäten werden anhand von K_i (Dissoziationskonstante des Inhibitor-Rezeptor-Komplex) geschätzt und durch das Liganden-PC-Computerprogramm von Munson und Rodbard, modifiziert von McPherson, bestimmt. Die relativen Affinitäten im Vergleich zu [Ac-Tyr¹, D-Arg²]hGH-RH(1-29)NH₂, dem Standardantagonisten, werden als das Verhältnis von K_; des getesteten GH-RH-Antagonisten zum K_i-Wert des Standardantagonisten berechnet.
Tests in vivo
Ausgewachsene männliche Sprague-Dawley-Ratten werden mit Pentobarbital (6 mg/ 100 g Körpergewicht, intraperitoneal) anästhesiert. 30 Minuten nach der Injektion des Pentobarbitals werden aus der Jugularvene Blutproben entnommen. Eine Gruppe von 7 Tieren erhält als Kontrolle hGH-RH(1-29)NH₂. Andere Gruppe der Ratten werden mit [Ac-Tyr¹, D-Arg²]hGH-RH(1-29)NH₂ als Standardantagonist oder mit einem Antagonistenpeptid 30 Sekunden vor dem hGH-RH(1-29)NH₂ injiziert, welches in einer Dosis von 2–3 μg/kg Körpergewicht, verabreicht wird. Die Blutproben werden aus der Jugularvene 5 und 15 Minuten nach der Injektion der Antagonisten entnommen. Die GH-Spiegel werden durch RIA gemessen. Die Wirksamkeiten der Antagonisten werden durch die faktorielle Analyse von Bliss und Marks mit 95%igen Verlässlichkeitsgrenzen berechnet, und ihnen werden die Dosen von 100 und 400 μg/kg Körpergewicht, des Standardantagonisten, sowie 20 und 80 μg/kg Körpergewicht, des getesteten Antagonisten, zugrunde gelegt. Die statistische Signifikanz wurde nach dem neuen Mehrfachbereichstests von Duncan bewertet.
Ergebnisse in vitro
Die in einem Rattenhypophysen-Superfusionssystem getesteten Ergebnisse der Antagonistenwirksamkeiten in vitro sind in Tabelle II bzw. in Tabelle III zusammengefasst. Wie aus diesen Daten ersichtlich ist, verursacht eine Acylierung der Analogen mit PhAc oder Ibu, welche eine D-Arg²-Substitution, kombiniert mit Phe(pCl)6 oder Nal⁶, Abu⁸, Abu¹⁵ oder Ala¹⁵, Nle²⁷, Asp²⁸, Agm29 oder Arg²⁹-NH₂ enthalten, und/oder eine Laktambrücke einen immensen Anstieg der Rezeptorbindung sowie der Hemmung der GH-Freisetzung in vitro und in vivo. Die Antagonisten [PhAc⁰, D-Arg², pCl-Phe⁶, Abu¹⁵, Nle²⁷]hGH-RH(1-28)Agm[MZ-5-156], [PhAc⁰, D-Arg², Phe(pCl)6, Abu8,28, Ala¹⁵, Nle²⁷]hGH-RH(1-29)NH₂[MZ-5-208], [PhAc⁰, D-Arg², Phe(pCl)6, Abu⁸, Ala¹⁵, Nle²⁷]hGH-RH(1-29)NH₂[MZ-5-192], [PhAc⁰, D-Arg², Phe(pCl)6, Ala¹⁵, Nle²⁷, Asp²⁸]hGH-RH(1-28)Agm[MZ-5-116], und cyclo^17,21 [PhAc⁰, D-Arg², Phe(pCl)6, Ser⁸, Ala¹⁵, Glu¹⁷, Nle²⁷]hGH-RH(1-29)NH₂ sind die in vitro wirksamsten Antagonisten.
Ergebnisse in vivo
Tabelle IV zeigt die Serum-GH-Spiegel bei mit GH-RH-Antagonisten vorbehandelten Ratten. Die Peptide 7, 8, 9, 11, 13 und 18 führen zu einer signifikant größeren und länger anhaltenden Hemmung der durch hGH-RH(1-29)NH₂ stimulierten GH-Freisetzung als der Standardantagonist. Bei Versuchen in vivo hemmt das Peptid 8 (MZ-5-156) eine durch hGH-RH(1-29)NH₂ bewirkte Freisetzung von GH in einem größeren Ausmaß als MZ-4-71, [Ibu⁰, D-Arg², Phe(pCl)⁶. Abu¹⁵, Nle²⁷]hGH-RH(1-28)Agm, dem bislang wirksamsten Antagonisten.
TABELLE II Hemmung der Freisetzung von GH im Rattenhypophyse-Superfusionssystem
TABELLE III Werte K_i und relative Affinitäten (R. A) von hGH-RH-Antagonisten
TABELLE IV Spiegel des Serum-Wachstumshormons bei mit verschiedenen GH-RH-Antagonisten bei unterschiedlichen Zeitabständen vor GH-RH(1-29)NH₂ mit einer Dosis von 3 μg/kg vorbehandelten Ratten
Wirkung von GH-RH-Antagonisten auf menschliche Bauchspeicheldrüsenkarzinome SW 1990 bei kahlen Mäusen
Kleine Stücke eines in einer kahlen Maus wachsenden Tumors SW-1990 wurden subkutan in die rechte Seite einer männlichen 60 nu/nu kahlen Maus transplantiert. 10 Tage nach der Transplantation wurden 40 Mäuse mit gut gewachsenen Tumoren in 4 Gruppen mit gleichem mittleren Tumorvolumen (16 mm³) in jeder Gruppe unterteilt. Die Behandlung begann 13 Tage nach Transplantation und wurde 44 Tage fortgesetzt. Die Gruppen sind in der Tabelle angeführt. Die Tumore wurden gemessen, und ihr Volumen wurde wöchentlich berechnet. Die Veränderungen des Tumorvolumens sind in Tabelle VI gezeigt. Am Tag 45 der Behandlung wurden die Mäuse unter Metofan-Betäubung durch Ausbluten aus der abdominalen Aorta geopfert. Das Blut wurde gesammelt, und die Tumor- und Organgewichte wurden bestimmt.
Die Histologie, Rezeptorstudien und Bestimmung der Hormonblutspiegel sind in Durchführung.
Erlebnisse
Die Daten für das Tumorvolumen und die Tumorgewichte am Ende des Versuchs sind in der Tabelle gezeigt. Eine Behandlung mit 10 μg/Tag des Peptids 8 führte zu einer signifikanten Hemmung des Wachstums von Karzinomen SW-1990, wie sich aus den Volumen- und Gewichtsdaten ergibt. Das Peptid A hatte keine signifikante Wirkung auf die Tumore. Die Körper-, Leber-, Nieren- und Milzgewichte zeigten keinen signifikanten Unterschied von den Kontrollwerten.
Die Wirkung der Behandlung mit GH-RH-Antagonisten auf die Tumorgewichte und das Tumorendvolumen von in kahlen Mäusen wachsenden menschlichen Bauchspeicheldrüsenkarzinomen SW-1990 war wie folgt:
TABELLE V

Claims

Peptid ausgewählt aus der Gruppe mit den Formeln:
Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikaments zur Senkung außerordentlich hoher GH-Werte bei einem Patienten, der das Medikament benötigt.
Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Patienten mit Krebs, der Rezeptoren für IGF-1 aufweist.