DD217808A5 - Verfahren zur herstellung von saeugetier-pgrf - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Saeugetier-PGRF fuer die therapeutische Verabreichung und die diagnostische Anwendung bei Saeugern einschliesslich Menschen. Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung von neuen Verbindungen, die fuer die Stimulierung der Freisetzung von Hypophysenhinterlappen-Wachstumshormon bei Saeugern einsetzbar sind sowie fuer die Beschleunigung des Wachstums nichthumaner Warmblueter. Erfindungsgemaess werden Peptide der FormelH-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-R34-Asn-Gln-Glu-R38-Gly-R-40-R41-R, wobei R fuer OH oder NH2 steht, R34 fuer Ser oder Ala steht, R38 fuer Arg oder Ser steht, R40 fuer Ala oder Arg steht und R41 fuer Arg, Arg-Ala, Arg-Ala-Arg, Arg-Ala-Arg-Leu oder des -R41 steht oder deren Analoga mit wohlbekannten Substitutionen und/oder Additions- wie auch nichttoxische Salze saemtlicher vorgenannter Verbindungen hergestellt.
Description
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Anwendungsgebiet der Erfindung ' "" '. '
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines Peptids, welches Einfluß auf die Funktion der Hirnanhangdrüse bei Menschen und anderen Säugern ausübt. Speziell bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Peptid, welches die Freisetzung von Wachstumshormon durch die Hirnanhangdrüse beschleunigt.
Seit den frühen fünfziger Jahren ist den Physiologen und Klinikern bekannt, daß der Hypothalamus des Hirns sämtliche sekretorischen Funktionen der Adenohypophyse steuert. Diese Steuerung erfolgt neurohumoral, wobei spezialisierte I
neurosekretorische Neuronen im Hypothalamus spezielle Polypeptide produzieren, deren Rolle und Wirkung jeweils darin besteht, die Sekretion eines jeden Hormons des Hypophysenhinterlappens akut und chronisch auszulösen. Ein hypothalamischer Freisetzungsfaktor ist bislang für die Hypophysenhinterlappen-Hormone Thyrotropin und Prolaktin (der Tripeptid-TRF), für das die Gonadotropine des Hypophysenhinterlappens lueinisierende Hormon sowie das follikelanregende Hormon (der Decapeptid-LRF, LH, GnRH oder Gn-RF) sowie für die Hypophysenhinterlappen-Hormone Betaendorphin und Adrenokortikotropin (der 41-Aminosäure-Polypeptid-CRF) charakterisiert worden. Zusätzlich ist ein hemmender Faktor charakterisiert worden: Hypothalamus-Somatostatin hemmt beim Hypophysenhinterlappenspiegel die Sekretion von ι
Wachstumshormon. Jeder dieser hypothalamischen Freisetzungsfaktoren sowie Somatostatin ist durch Totalsynthese reproduziert worden, und viele Analoga der natürlichen Strukturen sind synthetisiert worden — einige davon mit weit größerer Aktivität als die natürlichen Verbindungen.
Bislang ist noch kein entsprechender hypothalamischer Freisetzungsfaktor für das Hypophysenhinterlappen-Wachstumshormon oder Somatotropin charakterisiert worden, wenngleich für seine Existenz zahlreiche physiologische und klinische Beweise vorliegen. Eines der Hauptprobleme bei der Isolation und Charakterisierung des hypothalamischen Wachsti^mshormon-Freisetzungsfaktors (im folgenden GRF genannt) besteht darin, daß das aktive Peptid in jedem hypothalamischen Fragment in unendlich kleinen Mengen vorhanden zu sein scheint, von denen wir annehmen, daß sie im Bereich von 50 bis 150 Famtomol liegen. Dies ist weit weniger als alles, was für die anderen hypothalamischen Freisetzungsfaktoren berechnet worden ist. Im Einklang mit dieser Feststellung steht das Ergebnis, daß der hypothalamische GRF von außerordentlich hoher Wirksamkeit ist.
Als weiteres Hauptproblem bei der Isolation von hypothalamischem GRF hat sich gezeigt, daß in hypothalamischen Extrakten sehr große Mengen von Somatostatin vorhanden sind, welche selbstverständlich jeden Versuch einer Biountersuchung verhindern oder durch abweichende Ergebnisse beeinträchtigt würden. Während der letzten fünf Jahre haben mehrere Laboratorien den Anspruch erhoben, den hypothalamischen GRF isoliert und charakterisiert zu haben; alle diese Ansprüche beschäftigen sich mit Artefakten, wie dies später durch die Autoren anerkannt wurde (Schally, A, V. S. et al., J. Biol. Chem. 246. 6647,1971; Veber, D. F. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 45,235,1971). Derartige inkorrekte Ansprüche können teilweise mit der Schwierigkeit von biologischen Wertbestimmungen erklärt werden, die sich mit der Ermittlung der Freisetzung von Wachstumshormon befassen.
Ziel der Erfindung
Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung von neuen Verbindungen, die für die Stimulierung der Freisetzung von Wachstumshormon einsetzbar sind sowie für die Beschleunigung des Wachstums nichthumaner Warmblüter.
Darlegung des Wesens der Erfindung
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, das Peptid, welches die Freisetzung von Wachstumshormon durch die Hirnanhangdrüse beschleunigt, zu identifizieren und ein Verfahren zu seiner synthetischen Herstellung aufzufinden. Erfindungsgemäß ist aus einem humanen Inselzelltumor ein 44-Rest Polypeptid isoliert, gereinigt, charakterisiert, synthetisiert und getestet worden, welches die Freisetzung von Wachstumshormon (GH) durch die Hypophysenhinterlappen-Drüse beschleunigt. Dieses Peptid hat die Sequenz:
H-Tyr-Ala-Asp-Äla-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH^ Es wird angenommen, daß es sich dabei um PGRF (für humanes pankreatisches GRF) handelt; auf das Peptid wird im folgenden mit dieser Bezeichnung und auch mit dem Begriff Somatocrinin Bezug genommen. Desgleichen wurden zwei andere hoch gereinigte Peptide isoliert, welche GH-freisetzende Wirkung zeigen und bei denen es sich um PGRF (1 ...37) freie Säure und um PGRF (1 ...40) freie Säure handelt. Diese Peptide können dazu verwendet werden, das Wachstum von Warmblütern sowie von kaltblütigen Tieren in Aquikultur zu beschleunigen.
Erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung beinhalten PGRF, ein daraus abgeleitetes Analogon oder biologisch aktive Fragmente davon oder ein nichttoxisches Salz von einer der vorgenannten Formen, dispergiert in einem pharmazeutisch annehmbaren flüssigen oder festen Trägerstoff. Derartige pharmazeutische Zusammensetzungen können in der klinischen Medizin — sowohl der Human- als auch der Veterinärmedizin — in akuter oder chronischer Verabreichung für diagnostische oder therapeutische Zwecke eingesetzt werden. . ''.'
Zur Definition der Peptide wird die von Schroder & Lubke vorgeschriebene Nomenklatur („The Peptides", Academic Press, 1965) verwendet, wobei in Übereinstimmung mit konventionellen Darstellungsweisen die Amino-Gruppe am N-Terminal links erscheint und die Carboxyl-Gruppe am C-Terminal rechts erscheint. Wo der Aminosäure-Rest isomere Formen aufweist, so wird — sofern nicht ausdrücklich anderweitig vermerkt — die L-Form der Aminosäure dargestellt. Die Erfindung vermittelt synthetische PGRF-Peptide der folgenden Formel: N
H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-GIn-GIn-GIy-GIu-R34-ASn-GIn-GIu-R38-GIy-R40-R4I-R, in welcher R für OH oder NH2 steht, R34 für Ser oder AIa steht, R38 für Arg oder Ser steht, R40 für AIa oder Arg steht und R41 für Arg, Arg-Ala, Arg-Ala-Arg, Arg-Ala-Arg-Leu oder des-R41 steht. Desgleichen eingeschlossen sind biologisch aktive Fragmente, bei denen R auch entweder OH oder NH2 sein kann.
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Die Peptide werden durch eine geeignete Methode synthetisiert, so etwa durch ausschließlich Festphasen-Techniken, durch teilweise Festphasen-Techniken, durch Fragment-Kondensation, durch klassische Lösungs-Verknüpfungen oder vermittels Anwendung der unlängst entwickelten rekombinanten DNS-Techniken. Die Techniken der ausschließlichen Festphasen-Synthese beispielsweise sind im Textbuch „Solid-Phase Peptide Synthesis", Stewart & Young, Freeman & Co., San Francisco, 1969 dargelegt und werden durch die Offenlegung der US-PS 4105603 nach VaIe et al., herausgegeben am 9. August 1978, exemplifiziert. Die Synthesemethode der Fragment-Kondensation wird in der US-PS 3972859 (3· August 1976) exemplifiziert. Weitere anwendbare Synthesen werden durch die US-PS 3842067 (15.Oktober 1974) und die US-PS 3862925 (28. Januar 1975) exemplifiziert. Um den Anforderungen einer großtechnischen Herstellung^ entsprechen, werden zur Herstellung der synthetischen Peptide wahrscheinlich die rekombinanten DNS-Techniken angewendet werden.
Gemeinsam mit den Synthesen des Verknüpfungs-Typs ist dabei der Schutz der labilen Seitenkettengruppen der verschiedenen Aminosäurekomponenten mit geeigneten schützenden Gruppen, welche verhindern, daß es an jener Stelle zu einer chemischen Reaktion kommt, bis die Gruppe endgültig entfernt ist. Gemeinsam ist üblicherweise auch der Schutz einer Alpha-Amino-Gruppe auf einer Aminosäure oder einem Fragment, während jenes Gebilde an der Carboxyl-Gruppe reagiert, worauf anschließend die selektive Beseitigung der Alpha-Amino schützenden Gruppe erfolgt, um zu ermöglichen, daß die darauffolgende Reaktion an jener Stelle stattfinden kann. Dementsprechend ist es auch üblich, daß als einer der Syntheseschritte eine Intermediärverbindung erzeugt wird, welche jeden einzelnen der Aminosäure-Reste mit Lokalisierung in seiner gewünschten Sequenz in der Peptid-Kette beinhaltet und wobei die seitenkettenschützenden Gruppen an die passenden Reste geknüpft sind.
Als ebenfalls innerhalb des Geltungsbereiches der vorliegenden Erfindung befindlich erachtet werden Intermediärprodukte der Formel: X'-TyrtX^-Ala-AsptX^-Ala-ile-Phe-ThriX^-Asn-SerlX^-TyriX^-ArgiX^-LysiX^-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-SeriX^-Ala-Arg(X6)-Lys(X7)-Leu-Leu-Gln-Asp(X3)-lle-Met-Ser(X5)-Arg(X6)-Gln-Gln-Gly-Glu(X3)-R34(X5)-Asn-Gln-Glu(X3)-R38(X5 oder X^)-GIy-R4p(x®)-Arg(X6)-Ala-Arg(X6)-Leu-X8, in welcher X* entweder Wassersoff oder einer Alpha-Amino schützenden Gruppe entspricht. Bei den unter X1 ins Auge gefaßten Alpha-Amino schützenden Gruppen handelt es sich um jene, die im Rahmen der schrittweisen Synthese von Polypeptiden als brauchbar bekannt sind. Zu den unter X1 erfaßten Klassen der Alpha-Amino schützenden Gruppen gehören (1) schützende Gruppen des Acyl-Typs wie etwa Formyl, Trifluoroacetyl, Phthalyl, Toluensulfonyl (tos), Benzensulfonyl, Nitrophenylsulfenyl, Tritylsulfenyl, o-Nitrophenoxyacetyl, Chloroacetyl, Acetyl und •y-Chlorobutyral; (2) schützende Gruppen des aromatischen Urethan-Typs wie etwa Benzyloxycarbonyl(Z) und substituierte Z wie etwa p-Chlorobenzyloxycarbonyl, p-Nitrobenzyloxycarbonyl, p-Bromobenzyloxycarbonyi, p-Methoxybenzyloxycarbonyl; (3) schützende Gruppen des aliphatischen Urethan-Typs wie etwa t-Butyloxycarbonyl (BOC), Diisopropylmethoxycarbonyl, Isopropyloxycarbonyl, Ethoxycarbonyl, Allyloxycarbonyl; (4) schützende Gruppen des Cycloalkyl-Urethan-Typs wie etwa Cyclopentyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl und Cyclohexyloxycarbonyl; (5) schützende Gruppen des Thiourethan-Typs wie etwa Phenylthiocarbonyl; (6) schützende Gruppen des Alkyl-Typs wie etwa Triphenylmethyl (Trityl), Benzyl; (7) Trialkylsilan-Gruppen wie etwa Trimethylsilan. Die bevorzugte Alpha-Amino schützende Gruppe ist BOC.
X2 ist eine schützende Gruppe für die phenolische Hydroxyl-Gruppe von Tyr, ausgewählt aus jener Gruppe, die sich aus Tetrahydropyranyl, tert.-Butyl, Trityl, BzI, CBZ, 4Br-CBZ und 2,6-Dichlorobenzyl zusammensetzt. Die bevorzugte schützende Gruppe ist 2,6-Dichlorobenzyl. X2 kann Wasserstoff sein, was bedeutet, daß sich keine schützende Gruppe auf der Hydroxyl-Gruppe befindet. ,
X3 ist Wasserstoff oder eine esterbildende schützende Gruppe für die Carboxyl-Gruppe von Asp oder GIu, sie wird unter BzI, 2,6-Dichlorobenzyl, Methyl und Ethyl ausgewählt.
X4 und X* sind schützende Gruppen für die Hydroxyl-Gruppe von Thr und Ser und werden unter Acetyl, Benzoyl, tert.-Butyl, Trityl, Tetrahydropyranyl, BzI, 2,6-Dichlorobenzyl und CBZ ausgewählt. Die bevorzugte schützende Gruppe ist BzI. X4 und/oder Xs können Wasserstoff sein, was wiederum bedeutet, daß sich keine schützende Gruppe auf der Hydroxyl-Gruppe befindet. X6 ist eine schützende Gruppe für die Guanidino-Gruppe von Arg, ausgewählt aus jener Gruppe, die sich aus Nitro, Tos, CBZ, Adamantyloxycarbonyl und BOC zusammensetzt, oder X6 ist Wasserstoff.
X7 ist Wasserstoff oder eine schützende Gruppe für den Seitenketten-Aminosubstituenten von Lys. Charakteristisch für geeignete seitenkettenaminoschützende Gruppen sind 2-Chlorobenzyloxycarbonyl (2-CI-Z), Tos, CBZ, t-Amyloxycarbonyl und BOC.
Die Auswahl einer seitenkettenaminoschützenden Gruppe trägt keinen kritischen Charakter, es muß sich allerdings um eine Gruppe handeln, die während der Deprotektion der Alpha-Amino-Gruppen während der Synthese nicht entfernt wird. Mithin kann es sich bei der Alpha-Amino schützenden Gruppe und der seitenkettenaminoschützenden Gruppe nicht um ein und dieselbe Gruppe handeln.
X8 wird aus jener Klasse ausgewählt, die sich aus OH, OCH3, Estern, Amiden, Hydrazinen, -O-CH2-Harzträger und -NH-Harzträger zusammensetzt, wobei die Gruppen außer OH und Amiden im weiten Sinne als schützende Gruppen angesehen werden. In der Formel für das Intermediärprodukt ist mindestens eine der Gruppen X1, X2, X3, X4, Xs, X8, X7 und X8 eine schützende Gruppe. . ' .
Beim Auswählen einer speziellen seitenkettenschützenden Gruppe zwecks Einsatz bei er Synthese der Peptide sind die folgenden Regeln zu beachten: (a) die schützende Gruppe sollte in jedem Schritt der Synthese unter den für die Beseitigung der Alpha-Amino schützende Gruppe ausgewählten Reaktionsbedingungen gegenüber dem Reagenten stabil sein; (b) die schützende Gruppe sollte ihre schützenden Eigenschaften beibehalten und sollte unter Verknüpfungsbedingungen nicht abgespalten werden, und (c) die seitenkettenschützende Gruppe sollte bei Vollendung der Synthese der die gewünschte Aminosäure enthaltenden Sequenz entfernbar sein; dies unter Reaktionsbedingungen, welche die Peptid kette nicht verändern. Die Peptide werden vorzugsweise unter Nutzung der Festphasen-Synthese hergestellt, wie sie etwa von Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85, S.2149 (1963) beschrieben wird, wenngleich —wie eingangs erwähnt — auch anderweitige äquivalente, im Fachgebiet bekannte chemische Synthesen zur Anwendung gebracht werden. Die Festphasen-Synthese geht vom C-terminalen Ende des Peptids aus, indem eine geschützte Alpha-Aminogruppe an ein geeignetes Harz angekoppelt wird. Ein derartiges Ausgangsmaterial kann hergestellt werden, indem
tt-aminö-geschütztes Leu oder AIa vermittels einer Esterbindung an ein chloromethyliertes Harz oder an ein Hydroxymethyl-Harz angelagert wird, oder aber vermittels einer Amid-Bindung an ein BHA-Harz oder MBHA-Harz angelagert wird. Die Zubereitung des Hydroxymethyl-Harzes wird von Bodansky et al., Chem. Ind. (London) 38,1597-98 (1966) beschrieben. Die Herstellung
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eines solchen Harzes wird von Stewart et al., „Solid Phase Peptide Synthesis" (Freeman & Co., San Francisco 1969), Kapitel 1, $. 1-6, beschrieben. BHA-und MBHA-Harzträger sind im Handel erhältlich und werden im allgemeinen nur dann verwendet, wenn das zu synthetisierende gewünschte Polypeptid am C-Terminal ein a-Carboxamid aufweist.
Entsprechend der Vorgehensweise nach Monahan und Gilon, Biopolymer 12, S. 2513-2519,1973, wird durch BOC geschütztes Ala an das chloromethylierte Harz gekoppelt, wenn beispielsweisegewünschtwird,das40-Aminosäure-Peptidzu synthetisieren. Nach dem Anknüpfen von BOO-AIa an den Harzträger wird die α-amino-schützende Gruppe entfernt, so etwa durch Einsatz von Trifluoroessigsäure (TFA) in Methylenchlorid, TFA allein oder HCI in Dioxan. Die Deprotektion wird bei einer Temperatur zwischen etwa O0C und Raumtemperatur vorgenommen. Es können auch andere Spaltungs-Reagenten und -Bedingungen für die Entfernung der spezifischen a-amino-schützenden Gruppen genutzt werden, wie dies bei Schroder & Lubke, „The Peptides", 1, S. 72-75 (Academic Press 1965) beschrieben ist.
Nach dem Entfernen der α-amino-schützenden Gruppe von AIa werden die verbleibenden a-amino- und seitenkettengeschützten Aminosäuren schrittweise in der gewünschten Reihenfolge angeknüpft, um die weiter oben definierte Intermediärverbindung zu gewinnen oder—alternativ hierzu — um jede Aminosäure separat in die Synthese einzubringen, wobei einige von ihnen vor dem Eingeben in den Festphasen-Reaktor aneinander gekoppelt werden können. Die Auswahl eines passenden Verknüpfungs-Reagenten liegt im Ermessen des Fachmannes. Als Verknüpfungs-Reagent besonders geeignet ist N1N'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCCI).
Die im Rahmen der Festphasen-Synthese der Peptide verwendeten aktivierenden Reagenten sind im einschlägigen Fachgebiet wohlbekannt. Beispiele für geeignete aktivierende Reagenten sind: (1) Carbodiimide wie etwa Ν,Ν'-Diisopropylcarbodiimid, N-Ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid; (2) Cyanamide wie etwa N,N'-Dibenzylcyanamid; (3) Ketoimine; (4) Isoxazolium-Salze wie etwa N-äthyl-5-phenyl-isoxazolium-3'-sulfonat; (5) monozyklische stickstoffhaltige heterozyklische Amide von aromatischem Charakter, welche ein bis vier Stickstoffatome im Ring enthalten, so etwa Imidazolide, Pyrazolide und 1,2,4-Triazolide. Zu den spezifisch brauchbaren heterozyklischen Amiden gehören Ν,Ν'-Carbonyl-di-imidazol und N,N'-carbonyl-di-1,2,4-triazol; (6) alkoxyliertes Acetylen wie etwa Ethoxyacetylen; (7) Reagenten, weiche mit der Carboxyl-Komponente der Aminosäure ein gemischtes Anhydrid bilden, so etwa Ethylchloroformiat und Isobutylchloroformiat sowie (8) Reagenten, die mit der Carboxyl-Komponente der Aminosäure einen aktiven Ester bilden, wie etwa stickstoffhaltige heterozyklische Verbindungen mit einer Hydroxy-Gruppe auf einem Rindstickstoff, wie z.B. N-Hydroxyphthalimid, N-Hydroxysukzinimid und i-Hydroxybenzotriazol (HOBT). Weitere aktivierende Reagenten sowie deren Einsatz in der Peptid-Verknüpfung werden von Schroder & Lubke (siehe weiter oben) in Kapitel III und von Kapoor, J. Pharm. Sei., 59, S. 1-27 (1970) beschrieben. Jede geschützte Aminosäure oder Aminosäuren-Sequenz wird in etwa zweifachem oder darüber hinausgehendem Überschuß in den Festphasen-Reaktor eingeleitet, wobei die Verknüpfung in einem Medium aus Dimethylformamid (DMF):CH2CI2(1:1) oder in DMF oder CH2CI2 allein durchgeführt werden kann. In Fällen, in denen es zu einer unvollständigen Verknüpfung kam, wird die Verknüpfungsprozedur vor dem Entfernen der α-amino-schützenden Gruppe sowie vor dem Anknüpfen der nächsten Aminosäure wiederholt. Der Erfolg der Verknüpfungsreaktion wird in jeder Phase der Synthese vermittels der Ninhydrin-Reaktion überwacht, wie sie von E.Kaiser et al., Anal. Biochem. 34,595(1970) beschrieben wurde.
Nachdem die gewünschte Aminosäuresequenz vervollständigt worden ist, wird das intermediäre Peptid vom Harzträger durch Behandlung mit einem Reagenten wie etwa flüssigem Fluorwasserstoff entfernt, welcher nicht nur das Peptid vom Harz abspaltet, sondern auch sämtliche übrigen seitenkettenschützenden Gruppen X*, X3, X4, X5, Xs, X7 und X8 sowie die a-amino- schützende Gruppe X1 spaltet, um auf diese Weise das Peptid zu gewinnen.
Als alternativer Weg kann das Intermediär-Peptid vom Trägerharz vermittels Alkoholyse separiert werden, worauf der zurückgewonnene C-terminale Alkylester durch Hydrolyse zur Säure umgewandelt wird. Etwaige seitenkettenschützende Gruppen können dann in der weiter oben beschriebenen Weise oder auch durch anderweitige bekannte Vorgehensweisen wie etwa vermittels katalytischer Reduktion (z.B. Pd auf BaSO4) abgespalten werden. Bei Einsatz von Fluorwasserstoff zur.Spaltung werden zu Reiniguhgszwecken Anisol und Methylethylsulfid in das Reaktionsgefäß einbezogen.
Das folgende Ausführungsbeispiel legt die bevorzugte Methode des Synthetisierens von PGRF durch die Festphasen-Technik dar. Dabei zeigt sich natürlich, daß die Synthese eines entsprechend kürzeren Peptid-Fragmentes in der gleichen Weise vorgenommen wird, indem lediglich die erforderliche Anzahl an Aminosäuren an jedem Ende der Kette eliminiert wird; nichtsdestoweniger geht man gegenwärtig von der Annahme aus, daß biologisch aktive Fragmente die angezeigte Sequenz am N-Terminal enthalten sollten. .
Die Erfindung wird nachstehend an einigen Beispielen näher erläutert.
Ausführungsbeispiel I . ·
Die Synthese der PGRF (1 ...44) freien Säure mit der Formel H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-OH erfolgt schrittweise unter Einsatz eines Beckman 990-Peptidsynthetisierers auf einem chloromethylierten Harz, welches 0,9 Mäqu. Cl/g enthält. Das Anknüpfen von BOC-Leu in das Harz erfolgt unter Anwendung der allgemeinen Vorgehensweise, wie sie von Monahan et al. in Biopolymers, Bd. 12 (1973) S.2513-2519 dargelegt ist, und es resultiert in der Substitution von etwa 0,22mMoll Leu pro Gramm Harz. Sämtliche hierbei verwendeten Lösungsmittel werden vermittels Hindurchperlenlassen eines inerten Gases — vorzugsweise Helium — sorgfältig entgast, um so die Abwesenheit von Sauerstoff zu gewährleisten, welcher den Schwefel des Met-Restes in unerwünschter Weise oxydieren könnte.
Nach der Deprotektion und Neutralisation wird die Peptid-Kette Schritt für Schritt auf dem Harz aufgebaut. Deprotektion, Neutralisation sowie Zusetzen jeder einzelnen Aminosäure werden in allgemeiner Übereinstimmung mit der Vorgehensweise realisiert, wie sie im Detail von Guillemin et al., US-PS 3904594 dargelegt wird. Die Verknüpfungen werden speziell in Befolgung des nachstehend aufgeführten Schemas vorgenommen.
-4- 252 054
Schema
Schritt Reagenten und Operationen Mischzeiten
, min
1 CHzClj-Wäsche (zweimal) 0,5
2 50%igeTrifluoressigsäure (TFA)+ 0,5
5%igesi,2-Ethandithio in CH2CI2
einmal .3 . · ' 50%igeTrifluoressigsäure (TFA)+
5%iges1,2-Ethandithio in CH2CI2 20,0
(einmal)
4 CH2CI2-Wäsche (dreimal) 0,5
5 CH3OH-Wäsche (zweimal) 0,5
6 10%igesTriethylamin (Et3N) in CH2CI2
Neutralisation (zweimal) 0,5
7 CH3OH-Wäsche (zweimal) « 0,5
8 10%igesTriethylamin (Et3N) in CH2CI2
Neutralisation (zweimal) 0,5
9 CH3OH-Wäsche (zweimal) . 0,5
10 CH2CI2-WaSdIe (zweimal) «0,5
11 xBoc-Aminosäure(1 mMol/g Harz) plus
äquivalente Menge Dicyclohexylcarbodiimid
(DCC)inCH2CI2 120
12 CH2CI2-Wäsche (einmal) 0,5
13 50%iges Dimethylformamid in CH2CI2-
Wäsbhe (zweimal) . ' 0,5
14 10%iges Triethylamin (Et3N) in 0,5
CH2CI2-Wäsche (einmal) -
15 ., CH3OH-Wäsche (zweimal) 0,5
16 CH2CI2-Wäsche (zweimal) , 0,5
17 25%iges Essigsäureanhydrid in CH2CI2
(2ml/gHarz) 20,0
18 CH2CI2-Wäsche (zweimal) 0,5
19 CHgOH-Wäsche (zweimal) 0,5
"Für die Anknüpfung von Asn und GIn wurde in diesen Schritt ein 1,136 molarer Überschuß an 1-Hydroxybenzotriazol (HOBt) einbezogen.
In Kürze: Für die Verknüpfungs-Reaktion wird 1 mMol BOC-geschützter Aminosäure in Methylenchlorid pro Gramm Harz plus 1 Äquivalent 0,5 molares DCCI in Methylenchlorid oder 30%iges DMF in Methylenchlorid über zwei Stunden hinweg verwendet. Wird Arg angeknüpft, dann wird ein Gemisch aus 10%igem DMF und Methylenchlorid verwendet. Als die Hydroxylseitenkettenschützende Gruppe für Ser und Thr wird BzI verwendet. Als die schützende Gruppe für die Lys-Seitenkette wird 2-Chloro-benzyloxycarbonyl (2CI-Z) verwendet. Tos wird eingesetzt, um die Guanidino-Gruppe von Arg zu schützen, und die GIu- oder Asp-Carboxyl-Gruppe wird als der Bzl-Ester geschützt. Die phenolische Hydroxyl-Gruppe von Tyr wird mit 2,6-Dichlorobenzyl geschützt. Am Ende der Synthese wird die folgende Zusammensetzung gewonnen: X^TyriX^-Ala-AspiX^-Ala-lle-Phe-ThriX'iJ-Asn-SeriX^-TyrlX^-ArgiX^-Lysi^J-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-SeriX^-Ala-ArgiX6)-73563536
Ala-Arg(X6)-Leu-X8
in welcher X1 für BOC steht, X2 für 2,6-Dichlorobenzyl steht, X3 für Benzyl-Ester steht, X4 für BzI steht, X6 für BzI steht, X6 für Tos steht, X7 für 2CI-Z steht und X8 für-O-CHz-Benzenpolystyren-Harzträger steht.
Nachdem der finale Tyr-Rest an das Harz angeknüpft worden ist, wird die BOC-Gruppe mit 45%iger TFA in CH2CI2 beseitigt. Um das verbleibende geschützte Peptid-Harz zu spalten und zu entschützen, wird es mit 1,5ml Anisol, 0,25ml Methylethysulfid urjd 10ml Fluorwasserstoff (HF) pro Gramm Peptid-Harz bei -20°C eine halbe Stunde lang sowie eine weitere halbe Stunde lang bei 0°C behandelt. Nach Eliminierung des Fluorwasserstoffs unter starkem Vakuum wird der Peptid-Harzrest abwechselnd mit trockenem Diethylether und mit Chloroform gewaschen, worauf das Peptid dann mit entgaster 2 N wäßriger Essigsäure extrahiert wird. Gefriertrocknung des Essigsäure-Extraktes liefert dann ein weißes, flockiges Material. Das gespaltene und entschützte Peptid wird dann in 30%iger Essigsäure aufgelöst und einer Sephadex G-50-Feingelfiltration unterzogen.
Das Peptid wird dann weiter gereinigt; dies erfolgt durch CM-32 Carboxymethylcellulose (Whatman) Kationenaustauschchromatografie (1,8 χ 18cm, VBatt = 50ml) unter Nutzung eines konkaven Gradienten, der durch Abtropfen von 110,4M NH4OAc, pH 6,5, in einen 400ml 0,01 M NH4OAc, pH 4,5, enthaltenden Mischkolben erzeugt wurde. Die abschließende Reinigung erfolgt vermittels Verteilungschromatografie auf Sephadex G-5Ö Feinträger (Pharmacia) mit einem Lösungsmittelsystem aus nBuOH: EtOH: Pyridin: 0,2%N HOAc (4:1:1:7). Die Einzelheiten der Reinigung sind generell bei Ling et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 95,945 (1980) dargelegt. Die chrotnatografischen Fraktionen werden vermittels Dünnschichtchromatografie sorgfältig überwacht, wobei lediglich die Fraktionen mit wesentlicher Reinheit zusammengefaßt würden. ,
Die Aminosäure-Analyse wird nach der Hydrolyse in verschlossenen Röhren nach der in Anal. Biochem. 126,144-156 (1982) beschriebenen Methode vorgenommen, wobei ein Liquimat-Ill-Aminosäureanalysator eingesetzt wird, um die Korrektheit der gewonnenen Sequenz zu kontrollieren. Dabei wurden die folgenden Resultate angezeigt: Asx(3,62), Thr(0,75),Ser(3,5),Glx(6,83), Giy(2,87), Ala(5,10), Val(0,9), Met(1,23), lle(1,84), Leu(5,045),Tyr(2,09), Phe(0,91), Lys(2,31), und Arg(6,61). Die Analyse bestätigte die korrekte Sequenz. -
-5- 252 054 7
Ausführungsbeispiel II ,
Die Synthese von PGRF (1 ...40) mit der Formel H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-OH wird schrittweise unter Einsatz eines Beckman 990 Peptid-Synthetisierers auf einem chloromethylierten Harz in der in Ausführungsbeispiel I beschriebenen Weise durchgeführt. Das Peptid wird nach Anwendung von Dünnschichtchromatografie und HPLC als im wesentlichen rein befunden.
Die nach der Hydrolyse durchgeführte Aminosäure-Analyse zur Kontrolle der korrekten Sequenz erbrachte die folgenden Ergebnisse: Asx(3,89), Thr(0,88), Ser(3,66), Glx(7,04), Gly(3,07), Ala(4,02), Val(0,96), Met(1,01), lle(1,86), Leu(4,28), Tyr(2,Q), Phe(0,86), Lys(2,24) und Arg(4,15). Die Analyse bestätigte die korrekte Sequenz.
Die Synthese von PGRF (1...34)-freie Säure mit der Formel H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-OH erfolgt schrittweise unter Einsatz eines Beckman 990 Peptid-Synthetisierers auf einem chloromethylierten Harz in der in Ausführungsbeispiel I beschriebenen Weise. Das Peptid wird nach Anwendung von Dünnschichtchromatografie und HPLC als im wesentlichen rein befunden. Die nach der Hydrolyse durchgeführte Aminosäure-Analyse zur Kontrolle der korrekten Sequenz erbrachte die folgenden Ergebnisse: Asx(2,87), Thr(0,78), Ser(3,78), Glx{5,11), GIy(1,93), Ala(3,03), Val(0,88), Met(0,96), lle(1,88), Leu(4,14). Tyr(2,05), PheCI,07), Lys(2,29) und Arg(3,22). Die Analyse bestätigte die korrekte Sequenz.
Die Synthese von PGRF (1 ...31 !-freier Säure mit der Formel H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-OH erfolgt schrittweise unter Einsatz eines Beckman 990 Peptid-Synthetisiererschauf cloromethyliertem Harz in der in Ausführungsbeispiel I beschriebenen Weise. Das Peptid wird nach Anwendung von Dünnschichtchromatografie und HPLC als im wesentlichen rein befunden. Die nach der Hydrolyse durchgeführte Aminosäure-Analyse zur Kontrolle der korrekten Sequenz erbrachte die folgenden Ergebnisse: Asx(2,73), Thr(0,75), Ser(2,77), Glx(3,95), Gly(0,98), Ala(3,06), Val(0,80), Met(0,98),He(1,77) Leu(4,28), Tyr(2,23), Phe(1,14), Lys(2,34) und Arg{3,22). Die Analyse bestätigte die korrekte Sequenz.
Die Synthese von PGRF (1 ...28)-freier Säure mit der Formel H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-OH erfolgt schrittweise unter Einsatz eines Beckman 990 Peptid-Synthetisierers auf einem chloromethylierten Harz in der in Ausführungsbeispiel I beschriebenen Weise. Das Peptid wird nach Anwendung von Dünnschichtchromatografie und HPLC als im wesentlichen rein befunden.
Die nach der Hydrolyse durchgeführte Aminosäure-Analyse zur Kontrolle der korrekten Sequenz erbrachte die folgenden Ergebnisse: Asx(2,66), Thr(0,73), Ser{2,66), Glx(1,98), Gly{0,81), Ala(2,89), Val(0,90), Met(1,15), lle(1,72), Leu(4,14), Tyr(2,43), Phe(1,58), Lys(2,15) und Arg(2,19). Die Analyse bestätigte die korrekte Sequenz. '
Ausführungsbeispiel Hl
Die Synthese von PGRF (1 ...44)-Amid mit der Formel H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-lle-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2 erfolgt schrittweise unter Einsatz eines Beckman 990 Peptid-Synthetisierers auf einem MBHA-Harz in der in Ausführungsbeispiel I beschriebenen Weise. Dieses Peptid wird nach Anwendung von Dünnschichtchromatografie und HPLC als im wesentlichen rein befunden. ' . . '
Die nach der Hydrolyse durchgeführte Aminosäure-Analyse zur Kontrolle der korrekten Sequenz erbrachte die folgenden Ergebnisse: Asx(3,75), Thr(0,80), Ser(3,60), Glx(6,98), Gly(3,16), Ala(5,04), Val(0,77), Met(1,02), lle(1,79), Leu(5,41),Tyr(2,03), Phe(0,84), Lys(2,39), und Arg(6,43). Die Analyse bestätigte die korrekte Sequenz.
Ausführungsbeispiel IV '
Die Synthese eines PGRF-Analogons mit der Formel H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ala-Asn-Gln-Glu-Ser-Gly-Arg-OH erfolgt schrittweise unter Einsatz eines Beckman 990 Peptid-Synthetisierers auf einem chloromethyliertem Harz in der in Ausführungsbeispiel I beschriebenen Weise. Das Peptid wird nach Anwendung von Dünnschichtchromatografie und HPLC als im wesentlichen rein befunden. Die nach der Hydrolyse durchgeführte Aminosäure-Analyse zur Kontrolle der korrekten Sequenz erbrachte die folgenden Ergebnisse: Asx(4,35), Thr(1,06), Ser(3,80), Glx(7,53), Gly(2,96), Ala(4,05), Val(0,97), Met(0,86), lle"(1,94), Leu(3,70), Tyr{2,06), Phe(1,06), Lys(2,05) und Arg(3,53)
Die Analyse bestätigte die korrekte Sequenz.
Ausführungsbeispiel V - --· —— — — —-
Die Synthese eines PGRF(I ...40)-Amids mit der Formel H^Tyr-Ala-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-lle-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-NHz erfolgt schrittweise unter Einsatz eines Beckman 990 Peptid-Synthetisierers auf einem MBHA-Harz in der in Ausfghrungsbeispiel I beschriebenen Weise. DiesesPeptid wird nach Anwendung von Dünnschichtchromatografie und HPLC als im wesentlichen rein befunden. Die nach der Hydrolyse durchgeführte Aminosäure-Analyse zur Kontrolle der korrekten Sequenz erbrachte die folgenden Ergebnisse: Asx(3,76),Thr(0,88), Ser(3,68), Glx(6,89),Gly(3,12), Ala(4,08), Val(0,88), Met(1,36), Me(1,76), Leu(4,24)(Tyr(2,00), Phe(0,80), Lys(2,32) und Arg(4,16). Die Analyse bestätigte die korrekte Sequenz.
Ausführungsbeispiel Vl
Die Synthese von PGRF(I ...37)-freier Säure mit der Formel H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-OH erfolgt schrittweise unter Einsatz eines Beckman 990 Peptid-Synthetisierers auf einem chloromethylierten Harz in der in Ausführungsbeispiel I beschriebenen Weise. Das Peptid wird nach Anwendung von Dünnschichtchromatographie und HPLC als im,wesentlichen rein befunden.
. : : y . -6- 252 054 1
Die nach der Hydrolyse durchgeführte Aminosäure-Analyse zur Kontrolle der korrekten Sequenz erbrachte die folgenden Ergebnisse: Asx(3,92), Thr(0,79), Ser(3,62), Glx(7,05), Gly(1,97), Ala(3,17), Val(1,03), Met(1,0), lle(1,91), Leu(4,37), Tyr(1,86), Phe(Q,76), Lys(2,15) und Arg(3,40). Die Analyse bestätigte die korrekte Sequenz.
Ausführungsbeispiel ViA
Die Synthese von PGRF(I ...37)-Amid mit der Formel H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Glri-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-lle-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-NHz erfolgt schrittweise unter Einsatz eines Beckman 990 Peptid-Synthetisierers auf einem MBHA-Harz in der in Ausführungsbeispiel I beschriebenen Weise. Das Peptid wird nach Anwendung von Dünnschichtchromatografie und HPLC als im wesentlichen rein erachtet. Die nach der Hydrolyse durchgeführte Aminosäure-Analyse zur Kontrolle der korrekten Sequenz erbrachte die folgenden Ergebnisse: Asx(4,02), Thr(0,80), Ser(3,49), Glx(6,90), Gly(1,92), Ala(3,08), VaK 1,05), Met(1,01), lle(1,77), Leu(4,05), Tyr(2,02), Phe(1,14), Lys(2,50), und Arg(3,27). Die Analyse bestätigte die korrekte Sequenz, ,
Ausführungsbeispiel VII
Zwecks Bestimmung der Effektivität der Peptide hinsichtlich der Beschleunigung der Freisetzung von Wachstumshormon wurden unter Verwendung von synthetischem PGRF(I ...40) des Ausführungsbeispieles Il in vitro Untersuchungen in Form eines Nebeneinander-Vergleiches mit äquimolaren Konzentrationen des extrahierten und gereinigten nativen PGRF(I ...40) sowie eines GRF-Bezugsstandards mit einer bekannten Wirksamkeit hinsichtlich der Beschleunigung der Freisetzung von Wachstumshormon aus Hypophysenhinterlappen-Zellen durchgeführt. Der GRF-Bezugsstandard isfbei Brazeau et al.. Endocrinology, Bd. 110, A538 (1982) beschrieben und definiert; er wird in einer Präparatmenge verwendet (Ursprung: Ratten-Hypothalamus), welche eine hinsichtlich der Wachstumshormon-Freisetzung in einem Einschicht-Bioassay mit Hypophysenhinterlappen-Zellen halbmaximale Reaktion erzeugt. Es werden Kulturen verwendet, welche die Zellen von Ratten-Hypophysenhinterlappen-Drüsen beinhalten, wobei letztere wiederum etwa vier bis fünf Tage zuvor entfernt worden waren. Sowohl Kulturen eines definierten Standard-Mediums als auch Kulturen, von denen angenommen wird, daß sie für die Sekretion von Wachstumshormon optimal sind, werden für die vergleichende Prüfung herangezogen, wie sie verallgemeinernd bei Brazeau et al. in Regulatory Peptides,. 1,255,1981, beschrieben ist. Die Inkubation mit der zu prüfenden Substanz wird 3 bis 4h lang durchgeführt; Aliquote des Kulturmediums werden entnommen und verarbeitet, um ihre Gehalte an immunoreaktivem Wachstumshormon (ir GH) vermittels eines gut-charakterisierten Radioimmunoassays zu messen.
Die Resultate dieser vergleichenden Untersuchung zeigen, daß—in äquimolaren Verhältnissen—der synthetische PGRF(T. ..40) die volle biologische Wirksamkeit des nativen Peptids aufweist, wie dies aus Tabelle I hervorgeht. Die ED50 des synthetischen Peptide beträgt etwa 113 Pikogramm, dies entspricht einer weit größeren Stärke, als sie irgendein anderes bisher als Wachstumshormon-freisetzender Faktor beanspruchtes Molekül nachgewiesen hat.
'TabelleI ' ' " . · ' .
CRF Bezugsstandard Wachstumshormon-Sekre-
.- ' tion in vitro, % der Kontrol-
'.'. ' _' · 'en '.... .·' ' ; '' . ' '. " ' '
0,63Einheiten 173 + 0,4
1,25Einheiten 230 ±5 \
2,50Einheiten 347 + 13
5,00'Einheiten 474±3
10,00 Einheiten 674 + 6 NativerPGRF{1...40)
12,5Femtomol 234±17
25Femtomol 351+7 !
SOFemtomol 528±16
lOOFemtomol 720 ±32
200Femtomol 748±7 Synthetischer PGRF(I ...40)
lOFemtomol 269±20
lOOFemtomol 701±6
lOOOFemtomol ., 990 ±42 ,
Zusätzlich zu den in-witro-Tesis hinsichtlich der Sekretion von Wachstumshormon wurden in-vivo-Experimehte vorgenommen, indem das synthetische Peptid in normale männliche Ratten von etwa 200g Körpermasse injiziert wurde, nachdem die Ratten zuvor mit Pentobarbital anästhesiert worden waren. Die in Tabelle Il dargelegten Resultate zeigen, daß das synthetische PGRF-Peptid ein leistungsstarker Stimulator der Sekretion von Hypophysenhinterlappen-Wachsturtishormon ist.
Ifi-vivo-Wirkungen von synthetischem PGRF(I ...40) auf die Freisetzung von Hypophysenhinterlappen-Wachstumshormon nach einer einzelnen intravenösen Injektion in normale Ratten (4 Tiere pro Behandlungsdosis) Dosis Reaktionen hinsichtlich Serum-ir-GH in Nanograrhm/ml bei angegebenen Zeiten vor und nach der Injektion , .
| -1min | +5 min | + 10min | + 15min | +30 min | +60 min | |
| 0 | 173±47 | 251 ±81 | 339±139 | 396±121 | 749 ±440 | 316±76 |
| 0,01 | 173 + 23 | 284 ± 20 | 238 ±51 | 201 ±47 | 261 ±50 | 299 ±25 |
| 0,1 | 276 ±126 | 694 ±246 | 582 ±290 | 758 ±562 | 280 ± 70 | 424 ±129 |
| 1.0 | 142±244 | 551 + 1825" | 1 748 ± 564 | 730 ±158 | 234 ±53 | 267 ±129 |
| 10,0 | 234 ±767 | 077 ±1943 | 4676 + 585 | 2 464 ±378 | 616±112 | 223 + 26 |
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Zusätzliche Untersuchungen zeigen, daß das synthetische PGRF-Analogon von Ausführungsbeispiel IV im wesentlichen die gleiche biologische Potenz wie der native PGRF(I ...40) aufweist und daß die synthetischen Fragmente aus den Ausführungsbeispielen Vl und VIA ebenfalls eine recht beträchtliche biologische Potenz zeigen. Darüber hinaus zeigt das PGRF(I ...40)-Peptid mit dem a-Carboxamid am C-Terminal (Ausführungsbeispiel V) eine rund doppelstarke biologische Wirkung im Vergleich zu dem in Ausführungsbeispiel VII geprüften synthetischen Peptid.
Äusführungsbeispiel VIII . -
Die in Ausführungsbeispiel VII beschriebenen in-vitro-Untersuchungen werden wiederholt, wobei nativer PGRF(I ...40) und nativer PGRFd ...44) verwendet werden; die Resultate zeigen; daß nativer PGRFd ...44) etwa mehr als doppelt so stark ist. Weitere Untersuchungen ergeben, daß synthetischer PGRF(I ...44) in Form einer freien Säure, wie er in Ausführungsbeispiel I synthetisiert wurde, eine etwas geringere Potenz als nativer PGRF(I ...44) zeigt, und daß synthetisches PGRF(I ...44)-Amid im wesentlichen die gleiche biologische Potenz wie nativer PGRFd ...44) aufweist. Synthetisches PGRF(I ...44)-Amid zeigt bei Injektion in Labortiere (Ratten) den gleichen typ der wachstumshormonfreisetzenden Aktivität, wie er sich im Falle von PGRFd ...40) in Tabelle Il von Ausführungsbeispiel VII zeigt, wobei das erstgenannte Amid allerdings bei Bezug auf eine Massebasis um 2,5...3,0mal potenter als PGRF(I ...40)-freie Säure ist.
Ungefähr eines von 7000... 15000 in den USA geborenen Kindern gilt als defizitär in bezug auf das Hypophysenhinterlappen-Wachstumshormon; hierbei handelt es sich um „Hypophysenhinterlappen-Zwerge", d. h., die Betroffenen zeigen Zwergwuchs, weil ihnen die normalen Pegel an Hypophysenhinterlappen-Wachstumshormon im Blut fehlen. Klinische Gründe berechtigen zu der Annahme, daß die meisten dieser Patienten eine normale Hypophysenhinterlappen-Drüse besitzen und daß die Ursache ihres Leidens das Fehlen entweder der Synthese oder der Sekretion des hypothalamischen Freisetzungsfaktors für Wachstumshormon ist. Es wird erwartet, daß synthetischer PGRF die ideale Behandlung für derartige Fälle ist, welche bislang mit Injektionen von menschlichem Hypophysenhinterlappen-Wachstumshormon behandelt worden sind, wobei es sich um ein extrem teures Präparat handelt, das ausschließlich aus autopsierten humanen Hypophysenhinterlappen gewonnen wird. Durch DNS-rekombinante Methodologie hergestelltes humanes Wachstumshormon ist — obzwar in der Literatur annonciert — für den Routineeinsatz gegenwärtig noch nicht verfügbar. Synthetischer PGRF ist ein weitaus einfacheres Molekül und dürfte beträchtliche Vorteile für einen weltweiten Einsatz haben, zumal die Anzahl derartiger Hypophysenhinterlappen-Zwerge im Weltmaßstab auf mehrere Hunderttausend geschätzt wird.
Da es sich beim synthetischen PGRF um das erste bekannte Molekül handelt, welches sich speziell dafür eignet, die Hypophysenhinterlappen-Funktion hinsichtlich der Sekretion von Wachstumshormon abzuschätzen, so repräsentiert es gleichzeitig den ersten Routine-Test hinsichtlich der Sekretion von Wachstumshormon in all jenen Fällen, in denen der Arzt einen spezifischen Defekt der Hypophysenhinterlappen-Funktion vermutet. Synthetischer PGRF sollte künftig die gegenwärtig angewandten umständlichen Methoden (Arginin-Infusionen, Hypogiykämie, L-DOPA-Injektionen usw.) ersetzen, die als diagnostische Prozedur, der Abschätzung der Sekretionsfähigkeit von Wachstumshormon dienen. Synthetischer PGRF dürfte in all jenen Fällen der klinischen Medizin von Interesse sein, in denen ein Arzt eine positive Stickstoffbilanz sowie einen positiven Anabolismus zu fördern wünscht, so etwa bei der Wundheilung, der Behandlung von ausgedehnten Verbrennungen, in postoperativen Perioden nach ausgedehnten chirurgischen Eingriffen wie auch anderweitigen medizinischen Schwächezuständen einschließlich zahlreicher Syndrome der gerontologischen Praxis wie auch der pädiatrischen Praxis von Frühgeburten. Die Anregung der Sekretion von Wachstumshormon ist von Interesse bei Patienten während und nach ausgedehnter Bestrahlungstherapie zur Behandlung von festen Tumoren, gleichfalls zur Förderung des Anabolismus und desgleichen zur Nutzung der Wirkungen von Wachstumshormon auf die Stimulation der Stammzellen des hämatopoetischen Systems. Für die Verabreichung an Menschen sollten synthetische PGRF-Peptide eine Reinheit von mindestens etwa 93% — vorzugsweise aber mindestens etwa 98% aufweisen. Unter dieser Reinheit wird verstanden, daß das beabsichtigte Peptid mit sämtlichen peptidähnlichen Bestandteilen und vorliegenden Peptidfragmenten den festgesetzten Masseprozentsatz ausmacht.
Bei den meisten der biologisch aktiven Peptide hat sich gezeigt, daß sie auch andere biologische Aktivitäten als jene besitzen, hinsichtlich welcher sie ursprünglich anerkannt wurden. Im Hinblick auf derartige Präzedenzfälle ist es wahrscheinlich, daß es sich zeigt, daß PGRF außerhalb der Hypophysenhinterlappen-Aktivität liegende Aktivitäten besitzt, die von praktischem Interesse sein können. Wenngleich auch PGRF aus einem humanen Pankreas-Tumor extrahiert und isoliert worden ist, so ist doch auf der Grundlage allgemeiner Erfahrung und allgemeinen Experimentierens anzunehmen, daß die Aminosäure-Sequenz von PGRF(I ...44)-Amid die gleiche ist, wie die Sequenz von humanem hypothalamischem Wachstumshormon freisetzendem Faktor. ·!
Es wird erwartet, daß die chronische Verabreichung von synthetischen PGRF-Peptjden an landwirtschaftliche Nutztiere oder andere warmblütige Tiere deren Anabolismus fördert und auf diese Weise die Körpermasse in bezug auf die Muskelmasse steigert. Desgleichen ist ein Einsatz in der Aquikultur bei der Nutzhaltung von Fischen und anderen kaltblütigen Meerestieren, um deren Wachstum zu beschleunigen. Bei der Verabreichung an Tiere mag eine Reinheit bis hinunter zu etwa 5% vertretbar sein.
Synthetischer PGRF oder davon abgeleitete nichttoxische Salze können in Kombination, mit einem pharmazeutisch annehmbaren Trägerstoff zwecks Bildung einer pharmazeutischen Zusammensetzung an Sauger —einschließlich den Menschen — entweder intravenös, subkutan, intramuskulär oder oral verabreicht werden. Die Verabreichung kann vom Arzt dazu genutzt werden, die Freisetzung von Wachstumshormon in jenen Fällen zu stimulieren, in denen der zu behandelnde Wirt einer derartigen therapeutischen Behandlung bedarf. Die erforderliche Dosierung wird in Abhängigkeit von dem zu behandelnden speziellen Zustand, von der Schwere des Zustandes wie auch von der Dauer der gewünschten Behandlung variieren. ;
Derartige Peptide werden häufig in Form von pharmazeutisch annehmbaren nichttoxischen Salzen verabreicht, so etwa als Säurezusatzsalze oder Metallkomplexe beispielsweise mit Zink, Eisen oder dergleichen (wobei letztere im Rahmen der vorliegenden Anmeldung als Salze angesehen werden). Typisch für derartige Säurezusatzsalze sind Hydrochlorid, Hydröbromid, Sulfat, Phosphat, Maleat, Acetat, Zitrat, Benzoat, Sukzinat, Malat, Askorbat, Tartrat und dergleichen. Soll der Wirkstoff in Tablettenform verabreicht werden, dann kann die Tablette einen Bindestoff wie etwa Tragacanth, Maisstärke oder Gelatine
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enthalten; desgleichen kann sie eine das Zerfallen beschleunigende Substanz wie etwa Alginsäure wie auch ein Gleitmittel wie etwa Magnesiumstearat enthalten. Wird die Verabreichung in flüssiger Foim yewuiwM, fram \ώ\\η*\\ tntft ui>vi,'«ivtei Geschmacksstoffe eingesetzt werden; die intravenöse Verabreichung kann in isotonischer Kochsalzlösung, Phsophat-Puffer-Lösungen oder dergleichen erfolgen.
Die Peptide sollten unter der Aufsicht eines Arztes verabreicht werden; die pharmazeutischen Zusammensetzungen werden das Peptid gewöhnlich in Verbindung mit einem herkömmlichen, pharmazeutisch annehmbaren Trägerstoff enthalten. Die Dosierung wird gewöhnlich von etwa 20 bis zu etwa 2000 Manogramm Peptid pro Kilogramm Wirts-Körpermasse reichen. Obwohl die Erfindung im Hinblick auf ihre bevorzugten Verkörperungen beschrieben worden ist, welche nach dem derzeitigen Wissen der Erfinder den bestmöglichen Modus darstellen, sollte es sich indes von selbst verstehen, daß dem geschulten Fachmann verschiedene Abänderungen und Modifikationen möglich sind, ohne daß damit.vom Geltungsbereich der Erfindung, wie er in den anliegenden Patentansprüchen dargelegt ist, abgewichen wird. So können beispielsweise entsprechend der heute bekannten experimentellen Praktiken Modifikationen in der 44gliedrigen Kette speziell in Gestalt von Tilgungen — beginnend am 'Carboxyl-Terminal des Peptids — vorgenommen werden, um Fragmente von weniger als 40 Resten Länge wie beispielsweise PGRF(I ...27) zu erzeugen, wobei am C-Terminal entweder NH2 oder OH angebracht sind, welche die gesamte oder doch sehr beträchtliche Teile der Potenz des Peptids erhalten; derartige Peptide gelten als im Geltungsbereich der Erfindung liegend. Darüber hinaus können an einem der beiden oder auch an beiden Endstellen Zusätze angebracht werden, und/oder es können generell äquivalente Reste für natürlich auftretende Reste substituiert werden, wie dies in der allgemeinen Praxis der Peptid-Chemie wohlbekannt ist, um auf diese Weise Analoga mit mindestens einem wesentlichen Anteil der Potenz des nativen Polypeptids zu produzieren, ohne dabei vom Geltungsbereich der Erfindung abzuweichen.
Claims (9)
- -9- 252 054Erfindungsansprüche:1. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formel (I) H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-lle-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-R34-Asn-Gln-Glu-R38-Gly-R40-R4i-R oder davon hergeleitete biologisch aktive Fragmente, wobei R für OH oder NH2 steht, R34 für Ser oder AIa steht, R38 für Arg oder Ser steht, R40 für AIa oder Arg steht und R41 für Arg-Arg-Ala, Arg-Ala-Arg, Arg-Ala-Arg-Leu oder des-R41 steht, gekennzeichnet dadurch, daßa) mittels Festphasensynthese, Fragmentkondensation oder Lösungskupplung eine Verbindung mit mindestens einer Schutzgruppe und der Formel IlX^TyriX^-Ala-AsplX^-Ala-lle-Phe-ThrlX^-Asn-SerlX^-TyrlX^-ArgtX^-LyslX^-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-SertX^-Ala-ArglX6). Lys(X7)-Leu-Leu-Gln-Asp(X3)-lle-Met-Ser(XB)-Arg(X6)-Gln-Gln-Gly-Glu(X3)-R34(X5)-Asn-Gln-Glu(X3)-R38(XB oder Xe)-Gly-R4o(Xe)-R4i(Xe)-X8. 'oder ein biologisch aktives Fragment davon herstellt, wobei(X1) bis (X7) jeweils entweder Wasserstoff oder einer Schutzgruppe entsprechen und (Xs) entweder eine Amid- oder Hydroxy- oder eine Schutzgruppe darstellt, undb) die Schutzgruppen von der Verbindung der Formel Il oder dessen biologischen Fragmenten abspaltet, um zu einem Peptid der Formel I oder einem biologisch aktiven Fragment davon zu gelangen, und gewünschtenfalls,c) das erhaltene Peptid in eines seiner nichttoxischen Säureadditionssalze umwandelt.
- 2. Verfahren nach Punkt !,gekennzeichnet dadurch, daß R34 für Ser, R38RJr Arg und R40WJr AIa steht.
- 3. Verfahren nach Punkt 1 oder 2, gekennzeichnet dadurch, daß R41 für Arg-Ala-Arg-Leu steht.
- 4. Verfahren nach irgendeinem der Punkte 1 bis 3, gekennzeichnet dadurch, daß R für NH2 steht.
- 5. Verfahren nach irgendeinem der Punkte 1 bis 3, gekennzeichnet dadurch, daß R für OH steht.
- 6. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Formel der Verbindung H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-S.er-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ol lautet.
- 7. Verfahren nach irgendeinem der Punkte 1 bis 6, gekennzeichnet dadurch, daß X1 für Wasserstoff oder eine a-Aminoschutzgruppe steht; X2 ist Wasserstoff oder eine Schutzgruppe für die phenolische Hydroxy-Gruppe von Tyr; X3 ist Wasserstoff oder eine Schutzgruppe für die Carboxyl-Gruppe Asp oder GIu; X4 ist Wasserstoff oder eine Schutzgruppe für die alkoholische Hydroxy-Gruppe von Thr; Xs ist Wasserstoff oder eine Schutzgruppe für die alkoholische Hydroxy-Gruppe von Ser; X6 ist Wasserstoff oder eine Schutzgruppe für die Guanidin-Gruppe von Arg; X7 ist Wasserstoff oder eine Schutzgruppe für die Seitenketten-Aminogruppe von Lys; und X8 ist aus jener Gruppe ausgewählt, die sich aus OH, OCH3, Estern, Amiden, Hydrazinen,-O-CH2-Harzträger und -NH-Harzträger zusammensetzt. ,
- 8. Verfahren nach Punkt 7, gekennzeichnet dadurch, daß X1 für BOC steht, X2 für 2,6-Dichlorobenzyl steht, X3 für BzI steht, X4 für BzI steht, X5 für BzI steht, X6 für Tos steht, X7 für 2-Chlorobenzyloxycarbonyl steht und X8 für -Ö-CH2-Harzträger steht.
- 9. Verfahren nach Punkt 7, gekennzeichnet dadurch, daß X1 für BOC steht, X2 für 2,6-Dichlorobenzyl steht, X3 für BzI steht, X4 für BzI steht, X5 für BzI steht, X6 für Tos steht, X7 für 2-Chlorobenzyloxycarbonyl steht und X8 für -NH-Harzträger steht.,
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