DE2611779A1

DE2611779A1 - Cyclische undecapeptidanaloge von somatostatin

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Publication number: DE2611779A1
Application number: DE19762611779
Authority: DE
Inventors: Dimitrios Sarantakis
Original assignee: American Home Products Corp
Current assignee: Wyeth LLC
Priority date: 1975-03-21
Filing date: 1976-03-19
Publication date: 1976-10-07
Also published as: FR2372147A1; US4011182A; FR2304352B1; GB1530182A; CH612919A5; JPS51125395A; NL7602793A; CA1066695A; SE7603471L; FR2372147B1; SE409703B; FR2304352A1

Description

PATENTANWÄLTE

PROF.DR.DR.J.REITSTÖTTER

DR-ING. W. BONTE

DR. W KINZEBACH

n-8 MUwCHEN 43, BAUERSTB. ·

POSTFACH 780

München, den 19.März 1976 M/17 042

AMCERICAN HOME PRODUCTS CORPORATION

685 Third Avenue

New York, N.Y.10017 /USA

Cyclische Undecapeptidanaloge von Somatostatin

Die Erfindung betrifft cyclische Undecapeptidanaloge des Somatostatins und Zwischenprodukte, die bei ihrer Synthese in Form einer Kombination der Pestphasen- und klassischen Methode der Peptidsynthese, erhalten werden.

Somatostatin (auch als Somatotropin-Release-inhibierender Paktor oder SRIF bekannt) ist das Tetradecapeptid H-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH. Dieses Tetradecapeptid wurde durch Isolierung aus Extrakten von Schafshypophysengeweben identifiziert, wobei man feststellte,daß es

- 1 609841/1028

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die Sekretion des Hormons Somatotropin, das üblicherweise als "Wachstumshormon" (GH); vgl. Brazeau et al., Science, 179s Seiten 77-79 (Januar 1973)»bezeichnet wird, inhibiert. Von der linearen Form dieses Tetradecapeptids, H-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH, wurde auch von Brazeau et al., supra, berichtet, daß es durch Festphasenmethodologie synthetisiert wurde und daß festgestellt wurde, daß es dieselbe biologische Aktivität wie das aus einer natürlichen Quelle erhaltene Somatostatin aufweise. In der am 3. Januar 1974 hinterlegten Anmeldung Ser.No. 430 441, nunmehr US-PS 3 882 O98, sind das Undecapeptid Des-Ala -GIy -Asn -SRIF und seine oxidierte Form beschrieben und in der am 1. April 197¹I hinterlegten Patentanmeldung Ser.No. 457 038, sind das Dodecapeptid Des-Ala¹-Gly²-SRIF und seine oxidierte Form beschrieben.

Cyclische Analoge des Somatostatins, die kein Cystein enthalten, sind im Stand der Technik nicht offenbart. Somit besitzen die erfindungsgemäßen cyclischen Undecapeptide eine cyclische Struktur, die keinen Schwefel, jedoch Kohlenstoff als Ringglied enthält, und die auch die Aminosäuren aus den 1- und 2-Positionen des Somatostatins (d.h. AIa und GIy) ausschließt.

Die erfindungsgemäßen cyclischen Undecapeptide, die die Sekretion des Hormons Somatotropin inhibieren, sind durch die Formel I

O=C-

HN

H₂N(CH₂)₄-CH-C-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Tlir-Ser-NH-CH-C0₂H

⁸ (D

dargestellt, worin Trp entweder D- oder L-Tryptophyl darstellt und alle anderen Aminosäuren die L-Konfiguration aufweisen, sowie die nicht-toxischen Säureadditionssalze davon; in der Formel be-

- 2 - ■ 6Q9841/1026

M/17 O42 .7 .

deutet η eine ganze Zahl von 1 bis 5; wenn η = 1 handelt es sich bei der C-terminalen Aminosäure um Asparaginsäure; wenn η = 2, handelt es sich bei der C-terminalen Aminosäure um Glutaminsäure; wenn η = 3» handelt es sich bei der C-terminalen Aminosäure um a-Aminoadipinsäure; wenn η = 4, handelt es sich bei der C-terminalen Aminosäure um α-Aminopimelinsäure; und wenn η = 5» handelt es sich bei der C-terminalen Aminosäure um oc-Aminosuberinsäure. Die bevorzugte Verbindung der Formel I ist diejenige, in der η = 2 bedeutet.

Zur Erläuterung der Säureadditionssalze kann man das Hydrochlorid, Hydrobromid, Sulfat, Phosphat, Maleat, Acetat, Citrat, Benzoat, Succinat, Malat, Ascorbat und dergleichen nennen.

Die zur Bezeichnung der Peptide angewendete Nomenklatur entspricht der von Schroder & Lübke "The Peptides" I, Seiten VIII-XXIX (Academic Press 1965) · Alle in der Formel I und den nachfolgenden anderen Formeln identifizierten chiralen Aminosäurereste gehören der natürlichen oder L-Konfiguration an, mit Ausnahme des Trp, das gewünschtenfalls der L- oder D-Konfiguration angehört.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch neue Decapeptid-Zwischenprodukte der Formel II:

R-Lys(R¹)-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(R²)-Tlir(R³)-Phe-Thr(R⁴)-Ser(R⁵)-R⁶

(H)

worin:

R eine a-Aminoschutzgruppe darstellt. Die von R umfaßten a-Arainoschutzgruppen sind diejenigen, von denen man auf dem Gebiet der stufenweisen Synthese von Polypeptiden weiß, daß sie brauchbar

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if-

sind. Zu den von R umfaßten Klassen von ct-Aminoschutzgruppen gehören:

(1) Schutzgruppen des Acyltyps, die durch die folgenden erläutert werden: Formyl, Trifluoracetyl, Phthalyl, Toluolsulfonyl (Tosyl), Benzolsulfonyl, Nitrophenylsulfenyl, Tritylsulfenyl, O-Nitrophenoxyacetyl, γ-Chlorbutyryl, und dergleichen;

(2) aromatische Schutzgruppen des Urethantyps, die durch Benzyloxycarbonyl und substituiertes Benzyloxycarbonyl, wie p-Chlorbenzyloxycarbonyl, p-Nitrobenzyloxycarbonyl, p-Brombenzyloxycarbonyl, p-Methoxybenzyloxycarbonyl, l-(p-Biphenylyl)-l-methyläthoxycarbonyl, a,a-Dimethyl-3,5-dimethoxybenzyloxycarbonyl und Benzhydryloxycarbonyl erläutert sind;

(3) aliphatische Urethanschutzgruppen, die durch tert.-Butyloxycarbonyl, Diisopropylmethoxycarbonyl, Isopropyloxycarbonyl, Äthoxycarbonyl, Allyloxycarbonyl erläutert sind;

(¹O Schutzgruppen des Cycloalkylurethantyps, die durch Cyclopentyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl, Cyclohexyloxycarbonyl erläutert sind;

(5) Schutzgruppen des Thiourethantyps, wie Phenylthiocarbonyl;

(6) Schutzgruppen des Alkyltyps, die durch Triphenylmethyl (Trityl), Benzyl, erläutert sind;

(7) Trialkylsilangruppen, wie Trimethylsilan.

Die durch R definierte bevorzugte <*-Aminoschutzgruppe ist tert.-Butyloxycarbonyl;

R ist eine Schutzgruppe für den Seitenketten-Aminosubstituenten des Lysins. Zu geeigneten Seitenketten-Aminoschutzgruppen gehören Benzyloxycarbonyl und substituiertes Benzyloxycarbonyl, wo-

-H-609841/1026

-Γ'

bei der Substituent ausgewählt ist unter Halogen (beispielsweise Chlor, Brom, Fluor) und Nitro (beispielsweise 2-Chlorbenzyloxycarbonyl, p-Nitrobenzyloxycarbonyl, 3,4-Dichlorbenzyloxycarbonyl), Tosyl, tert.-Amyloxycarbonyl, tert.-Butyloxycarbonyl, Diisopropylmethoxycarbonyl, und dergleichen. Die Wahl einer derartigen Seitenketten-Aminoschutzgruppe ist nicht kritisch, mit der Ausnahme, daß es sich bei ihr um eine Gruppe handeln muß, die während der Abspaltung der Qr-Aminoschutzgruppe im Verlauf der Synthese nicht entfernt wird, bis das cyclische Undecapeptid der gewünschten Aminosäurensequenz erhalten ist. Somit können die a-aminoschützende Gruppe und die R -Seitenketten aminoschützende Gruppe am Lysin nicht gleich sein;

2 1

R. ist unter den durch R definierten Lysinschutzgruppen ausgewählt .

R , R und R^ sind Schutzgruppen für die alkoholische Hydroxylgruppe des Threonins und Serins und sind ausgewählt unter Acetyl, Benzoyl, tert.-Butyl, Trityl, Benzyl, 2,6-Dichlorbenzyl und Benzyloxycarbonyl. Die bevorzugte Schutzgruppe ist Benzyl; oder R^ und/oder R und /oder R^ stehen für Wasserstoff, was, bedeutet, daß sich an der alkoholischen HydroxyIfunktion keine Schutzgruppe befindet.

R⁶ ist ausgewählt unter OH, NHNH₂, N₃, OCH₃ und

Der Polystyrolharzträger ist vorzugsweise ein Copolymeres aus Styrol mit ungefähr 1 bis 2 % Divinylbenzol als Vernetzungsmit-

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tel, das dazu führt, daß das Polystyrolpolymere in bestimmten organischen Lösungsmitteln völlig unlöslich ist. Das Polystyrolpolymere besteht aus langen Alkylketten, die an jedem zweiten Kohlenstoffatom einen Phenylring tragen, und der terminale Aminosäurerest (Ser) ist über eine kovalente Kohlenstoff-zu-Kohlenstoff-Bindung mit diesen PhenyIringen verbunden. Die Alkylketten sind bei angenähert jedem fünfzigsten Kohlenstoffatom durch p-Diäthylphenylreste, die sich vom Divinylbenzol ableiten, vernetzt.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch neue Undecapeptide der Formel III:

R⁹O-C=O

R -Lys(R^L)-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys (R²^ThT(cft-Phe-Thr (RVser(R⁵) -NII-CH

(III)

R⁸O-C=O

worin:

R ausgewählt ist unter Wasserstoff und einer durch den Rest R definierten ß-Aminoschutzgruppe;

R , R , R , R und R^ dieselben Bedeutungen wie in Verbindung mit Formel II ausgeführt besitzen;

R ausgewählt ist unter Wasserstoff und einer Seitenketten-Carboxylschutzgruppe, die unter Bedingungen entfernt wird, wel-

ehe nicht zur Entfernung der R^ cr-Carboxyl-Schutzgruppe füh-

8 Q
ren. Somit können R und R nicht die gleiche Schutzgruppe sein.

Zur Erläuterung für R -Seitenketten-Schutzgruppen kann man tert.-Butyl, Benzhydryl und Methyl nennen;

Q Q

R eine cr-Carboxyl-Schutzgruppe darstellt. Bei der durch R^ dargestellten <7-Carboxyl-Schutzgruppe handelt es sich um eine Gruppe,

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die unter Bedingungen stabil ist, unter denen

(1) die R -Carboxy1-Schutzgruppe - falls vorhanden - entfernt wird und

(2) irgendeine ct-Amino-Schutzgruppe an der Lysylgruppe des N-terminalen Teils des Peptide entfernt wird.

ο
Zur Erläuterung der R^-Carboxyl-Schutzgruppe kann man nennen:

₁g (beispielsweise Methyl, Äthyl, Butyl, Pentyl, Isobutyl), Benzyl, substituiertes Benzyl (worin der Substituent aus mindestens einer Nitro-, Methoxy- und Methylgruppe ausgewählt ist, beispielsweise p-Methoxybenzyl, 2,4-Dimethoxybenzyl, p-Nitrobenzyl, 2,4,6-Trimethylbenzyl), Phenacyl, Phthalimidomethyl, Benzhydryl, Trichloräthyl, 4-Picolyl, ß-Methylthio-

äthyl und *l-(Methylthio)-phenyl. Die bevorzugte R -Gruppe ist. Benzyl.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch Zwischenprodukte der Formel IV:.

CH-C-Asn-Phe-Pho-Trp-Lys (R^Thr (R³)-Phe-Thr (R⁴)-Ser (R

(CH₂),
I ²

R , R und R-³ dieselben Bedeutungen wie in Formel II besitzen;

10 1 R ausgewählt ist unter Wasserstoff und R j

11 Q

R ausgewählt ist unter Wasserstoff und R^; und

12 2

R ausgewählt ist unter Wasserstoff und R ; unter der Voraussetzung, daß mindestens einer der Reste R , R , R , R , R und

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12
R von Wasserstoff verschieden ist.

Die neuen Decapeptide der Formel II werden hergestellt, indem man die Festphasensynthese anwendet. Die Synthese wird am C-terminalen Ende des Peptids unter Verwendung eines a-aminogeschützten Harzes begonnen. Ein derartiges Ausgangsmaterial kann hergestellt werden, indem man ein cc-aminogeschütztes Serin an ein chlormethyliertes Harz oder ein Hydroxymethylharz anlagert. Die Herstellung des Hydroxymethylharzes ist von Bodanszky et al., Chem.Ind. (London) 33., 1597-98 (1966) beschrieben. Ein chlormethyliertes Harz ist im Handel von BIO RAD LABORATORIES RICHMOND, CAL., erhältlich, und die Herstellung eines derartigen Harzes ist von Stewart et al., "Solid Phase Peptide Synthesis" (Freeman & Co., San Francisco 1969), Kapitel 1, Seiten 1-6, beschrieben. Das a-amino- und seitenkettengeschützte Serin wird nach der Arbeitsweise von Gisin, -HeIv. 56, Seite 1476 (1973), an das chlormethylierte Harz gekuppelt. Nach der Kupplung des ct-amino- und seitenkettengeschützten Serins an den Harzträger wird die a-Amino-Schutzgruppe entfernt, indem man beispielsweise Trifluoressigsäure in Methylenchlorid, Trifluoressigsäure allein oder HCl in Dioxan, verwendet. Das Entschützen wird bei einer Temperatur zwi sehen ungefähr 0⁰C und Raumtemperatur durchgeführt. Man kann auch andere übliche Spaltungsreagentien und -bedingungen zur Entfernung der spezifischen ö-Amino-Schutzgruppen verwenden, so wie sie in Schroder & Lubke, Supra, 1_, Seiten 72-75, beschrieben sind. Nach dem Entfernen der a-Amino-Schutzgruppe werden die verbleibenden oc-aminogeschützten Aminosäuren stufenweise in der gewünschten Reihenfolge gekuppelt, um eine Verbindung der Formel II zu erhalten, oder, als Alternative zur Zugabe jeder Aminosäure getrennt zur Synthese, können einige von ihnen vor der Zugabe zum Festphasenreaktor gekuppelt werden. Die Wahl eines geeigneten Kupplungsreagenses liegt im Können des Fachmanns. Ein besonders geeignetes Kupplungsmittel ist N,N -Diisopropylcarbo-

- 8 609841/1026

diimid. Wie zuvor gesagt, sind die bei der zuvor beschriebenen Synthese gebrauchten aktivierenden Reagentien dem Fachmann auf dem Gebiet der Peptidchemie wohlbekannt. Zur Erläuterung für
diese kann man nennen:

(1) Carbodiimide (beispielsweise N,N -Dicyclohexylcarbodiimid, N-Äthyl-N -(γ-dimethylaminopropylcarbodiimid));

(2) Cyanamide (beispielsweise N,N-Dibenzylcyanamid);

(3) Ketenimine;

(4) Isoxazoliumsalze (beispielsweise N-Äthyl-5-phenylisoxazolium-3 -sulfonat);

(5) monocyclischen Stickstoff enthaltende heterocyclische Amide mit aromatischem Charakter, die 1 bis 4 Stickstoffe im Ring enthalten, wie Imidazolide, Pyrazolide, 1,2,4-Triazolide. Zu spezifischen heterocyclischen Amiden, die brauchbar
sind, gehören: N,N -Carbonyldiimidazol, N,N -Carbonyl-di-1,2,4-triazol;

(6) alkoxyliertes Acetylen (beispielsweise Äthoxyacetylen);

(7) Reagentien, die ein gemischtes Anhydrid mit der CarboxyI-einheit der Aminosäure bilden (beispielsweise Äthylchlorformiat, Isobutylchlorformiat) und '

(8) Stickstoff enthaltende heterocyclische Verbindungen mit
einer Hydroxylgruppe an einem Ring Stickstoff (beispielsweise N-Hydroxyphthalimid, N-Hydroxysuccinimid, 1-Hydroxybenzotriazol).

Andere aktivierende Reagentien und ihre Anwendung bei der Peptidkupplung sind von Schroder und Lubke, Supra, in Kapitel III und von Kapoor, J. Pharm. Sei., jj£, Seiten 1-27, (1970), beschrieben.

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Jede geschütze Aminosäure oder Aminosäuresequenz wird in den Festphasenreaktor in einem ungefähr 4-fachen Überschuß eingeführt, und das Kuppeln wird in einem Medium aus Dimethylformamid: Methylenchlorid (1:1) oder in Dimethylformamid oder Methylenchlorid allein, durchgeführt. In Fällen, in denen eine unvollständige Kupplung auftritt, wird die Kupplungsarbeitsweise wiederholt, bevor die «.-Amino-Schutzgruppe entfernt wird, und zwar vor dem Kuppeln der nächsten Aminosäure an den Festphasenreaktor. Der Erfolg der Kupplungsreaktion bei jeder Stufe der Synthese wird durch die Ninhydrinreaktion wie von E. Kaiser et al., Analyt. Biochem, ^iL* 595 (1970), beschrieben, überwacht.

Nachdem man die gewünschte Aminosäuresequenz der Formel II erhalten hat, wird das Peptid vom Harz entfernt. Dies kann durch Methanolyse erfolgen, wobei man eine Verbindung der Formel R-Lys(R¹)-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(R²)-Thr(R³)-Phe-Thr(R⁴)-Ser(R-^)-0CH, erhält, worauf der C-terminale Methylester durch Hydrolyse in die entsprechende Säure überführt wird, gefolgt von Aktivieren der Carboxylgruppe und Bildung des Hydrazids durch klassische Methoden der Peptidsynthese, wobei man die Verbindung der Formel III erhält. Jedoch steht die bevorzugte Arbeitsweise zur Gewinnung einer Verbindung der Formel I in Übereinstimmung mit dem Reaktionsschema, das im nachfolgenden. Fließdiagramm angezeigt ist. Wie dem Fließdiagramm zu entnehmen ist, wird ein an ein Harz qebundenes Decapeptid der Formel R-Lys(R¹)-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(R²)-Thr(R³)-Phe-Thr(R^)-SeHR⁵)-O-CHp-Polystyrol-Harzträger (A) durch Reaktion mit Hydrazin in das entsprechende Hydrazid der Formel R-Lys(R¹)-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(R²)-Thr(R³)-Phe-Thr(R⁴)-Ser(R⁵)-NHNH₀ (B) überführt. Dann wird das Hydrazid der Formel B in das entsprechende Azid der Formel R-Lys(R )-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-(R²)-Thr(R³)-Phe-Thr(R^2|)-Ser(R⁵)-N₃ (C) durch Reaktion mit einem Reagens, das in situ salpetrige Säure liefert, überführt. Zu ge-

- 10 -

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eigneten Reagentien für diesen Zweck gehören ein niedriges Alkylnitrit (beispielsweise tert.-Butylnitrit, Isoamylnitrit) oder ein Alkalimetallnitritsalz (beispielsweise Natriumnitrit, Kaliumnitrit) in Gegenwart einer starken Säure, wie Chlorwasser st off säure, Phosphorsäure, Sulfonsäure und dergleichen. Diese Reaktion wird in Gegenwart entweder von Wasser und/oder eines nicht-wäßrigen Lösungsmittels, wie Dimethylformamid, Tetrahydrofuran, Dioxan, Chloroform, Methylenchlorid, und dergleichen, bei einer Temperatur zwischen ungefähr -40°C und +20⁰C, durchgeführt. Das Azid der Formel C, das vorzugsweise nicht aus dem Reaktionsmedium isoliert wird, wird dann mit einer Aminosäure der Formel D

CO₀R⁸

(CH₂)_n

worin η eine ganze Zahl von 1 bis 5 darstellt, gekuppelt, wobei man ein Undecapeptid der Formel E

9 "

(E)

E⁸O-C Il 0

erhält.

Diese Kupplung wird bei einer Temperatur zwischen ungefähr -50⁰C und +50⁰
geführt .

und +50⁰C, vorzugsweise zwischen ungefähr -25°C und +10⁰C, durch

- 11 609841/1026

-43-

Dann wird das Undecapeptid der Formel E mit einem Spaltungsmittel umgesetzt, das die ä-Amino-Schutzgruppe am Lysin, sowie

die R -Carboxy!schutzgruppe, falls vorhanden, abspaltet, wobei man eine Verbindung der Formel F

9 " RO-C I

I-NH-CH I

(F) _j 2 η

HO-C Il 0

erhält.

Es ist wesentlich, daß es sich bei dem Spaltungsreagens um ein Mittel handelt, das bei dieser Stufe der Synthese weder die

1 2
R und R -Seitenketten-Aminoschutzgruppen am Lysylaminosäurerest in den Positionen 1 und 6 des Undecapeptids, noch die

9
durch R dargestellte cr-Carboxy !schutzgruppe abspaltet. Würden diese Schutzgruppen abgespalten, so erfolgte nicht die gewünschte Cyclisierung der nächsten Stufe des Verfahrens. Ein besonders geeignetes Spaltungsmittel ist Trifluoressigsäure

dort, wo R für tert.-Butyloxycarbonyl steht, R tert.-Butyl

1 ο

bedeutet, R für 2-Chlorbenzyloxycarbonyl steht und R^ Benzyl darstellt. Die Wahl eines verträglichen Reagenses zum Entfernen verschiedener wohlbekannter a-Amino- und Seitenketten-Schutzgruppen ist von Schroder & Lubke, Supra, 1_, Seiten 72-75 beschrieben; die Offenbarung dieser Druckschrift ist in der vorliegenden Anmeldung eingeschlossen. Während es bevorzugt ist, daß irgendwelche, durch die Reste R , R , R und R^ dargestellte Seitenketten-Schutzgruppen während der Bildung einer Verbindung der Formel F nicht abgespalten werden, können jedoch gewünschtenfalls derartige Gruppen abgespalten werden, um beispielsweise eine Verbindung der Formel F-I

- 12 -

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Η-Lye (R¹)-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-NK-CHCO₂R^S

(F-I)

CO₂H

zu erhalten.

Die Verbindung der Formel F wird dann cyclisiert, wobei man eine Verbindung der Formel G

I ^%7 2'n

HN O

CH-C-Asa-Phe-Phe-Trp-Lye (R²)-Thr (R³)-?hc-Thr (R⁴)-Ser (R⁵) -NH-CiI-

HN-R¹

erhält.

Diese Cyclisierung wird vorzugsweise unter Verwendung von N,N Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) und N-Hydroxybenzotriazol in Gegenwart eines organischen Lösungsmittels in einem Temperaturbereich zwischen -²IO⁰C und +20⁰C durchgeführt. Zu geeigneten Lösungsmitteln gehören Dimethylformamid, Dichlormethan, Chloroform, Dioxan, Tetrahydrofuran und deren Mischungen. Es können· auch andere Cyclisierungsreagentien verwendet werden, so wie sie durch die oben in Verbindung mit der Herstellung des Decapeptidharzes beschriebenen Kupplungsreagentien, sowie die von Kopple, J. Pharm. Science, £1, Seiten 13^5-1356 (1972), deren Offenbarung in der vorliegenden Anmeldung eingeschlossen ist, beispielhaft belegt sind.

Eine Verbindung der Formel IV wird dann in eine Verbindung der Formel I wird dann überführt, indem man die R -Seitenketten-Amino-Schutzgruppe, sowie die R- a-Carboxyl-Schutzgruppe zusammen mit ir-

- 13 -

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M/17 042 ,_R1177

2b η / /

2 3 If tr

gendwelchen anderen durch die Reste R , R , R und R"^ dargestellten Schutzgruppen abspaltet. Ein besonders geeignetes Spaltungssystem ist Wasserstoff über einem Palladiumkatalysator. Die Spaltungsstufe kann gewünschtenfalls stufenweise ausgeführt werden, indem man ein Reagens wählt, das lediglich

ο
die R -Qr-Carboxyl-Schutzgruppe abspaltet und anschließend ein Reagens verwendet, das die R - und andere Seitenkettenschutzgruppen abspaltet. Alternativ können die R -Gruppen zuerst abgespalten werden, gefolgt von gleichzeitiger oder sequentieller Abspaltung der anderen Schutzgruppen einschließ lich der R -Gruppe. Die Wahl geeigneter Spaltungsreagentien, die mit der besonderen Seitenkette und ^-Carboxylgruppe verträglich sind, und die man gebrauchen kann, ist von Schroeder & Lubke, Supra, Seiten 72-75, beschrieben.

Ein alternativer Weg zur Herstellung der Verbindungen der Formel IV besteht darin, daß man eine Verbindung der Formel

R¹³O-C=O R-Lye (R^-Asn-Phe-Phe-Trp-Lya (R²)-Thr (R³)-Phe-Thr (R⁴)-Ser (R⁵) -NH-CH

MeO-C=O

Π Q

worin R ausgewählt ist unter Wasserstoff und R ,und Me für _; Methyl steht, durch Reaktion mit Hydrazin in das entsprechende Hydrazid überführt, wobei man die Verbindung der Formel

R¹³O-C=O

H₂NHN-C«O

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erhält und anschließend diese Verbindung durch Reaktion mit einem Reagens, das in situ salpetrige Säure liefert, wie zuvor beschrieben, in das entsprechende Azid überführt. Dann wird das Azid cyclisiert, nachdem man zuerst die a-Aminoschutzgruppe am Lysin entfernt hat.

Die durch die Formel D dargestellten Materialien sind aus dem Stand der Technik bekannt und/oder können nach üblichen Techniken leicht aus den wohlbekannten, ungeschützten Aminosäuren, nämlich Asparaginsäure, Glutaminsäure, cr-Aminoadipinsäure, flr-Aminopimelinsäure und «-Aminosuberinsäure, hergestellt werden. Die Herstellung dieser Aminosäuren ist von Farkasova et al., CoI. Czechoslov. Chem. Commun. 30_, 3117 (1965) beschrieben. Die Herstellung der ω-Carboxyl-geschützten Ester ist von Schroder et al., Annalen 673» Seiten 196, 208-(1964) und Rudinger et al., CoI. Czechoslov. Chem. Commun. 32, 1229 (1967) beschrieben.

Die nachfolgenden Beispiele sollen zur Erläuterung der durch die Formeln dargestellten erfindungsgemäßen Verbindungen dienen.

Beispiel

a-N-tert.-Butyloxycarbonyl-fi^-chlorbenzyloxycarbonyl-L-lysyl-L-asparaginyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-L-tryptophyl-e^-chlorbenzyloxycarbonyl-L-lysyl-0-benzyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-O-benzyl-L-threonyl-O-benzyl-L-seryl-hydroxymethyl-Polystyrolharz

10 g chlormethyliertes Polystyrolharz (Lab Systems, Inc.) werden mit dem Cäsiumsalz von Boc-Ser(BzI)-OH (7»5 mMol) wie von Gisin, HeIv. jj(5, 1476 (1973) beschrieben, verestert. Das Aminosäureharz wird durch quantitative Aminosäureanalyse analysiert, und man stellt fest, daß es 0,40 mMol Serin/g enthält. Dieser polymere

- 15 -

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Ester wird nach Schema A zur Einführung von Boc-Thr(BzI)-OH, Boc-Phe-OH, Boc-Thr(BzI)-OH, Boc-Lys(ClZ)-OH, Boc-Trp-OH, Boc-Phe-OH, Boc-Phe-OH, behandelt. Den Asparaginrest führt man in Form des aktivierten p-Nitrophenylesters, Boc-Asn-ONP, nach Schema B, und schließlich Boc-Lys(ClZ)-OH nach Schema A ein.

Schema A

1. Der polymere Ester Boc-Ser(Bzl)-0-Harz, 10 g äquivalent 4 mMol Serin/g wird wie folgt behandelt:

2. Man wäscht dreimal mit CH₂Cl₂.

3. Man behandelt mit Trifluoressigsäure/CH^jClp-Dithioaerythrit (1:1:0,5 %) 5 Min. lang.

4. Man behandelt mit Trifluoressigsäure/CHpClp-Dithioaerythrit (1:1:0,5 %) 25 Min. lang.

5. Man wäscht dreimal mit ₂₂

6. Man wäscht mit Dimethylformamid.

7. Man behandelt mit 12 !tigern Triäthylamin in Dimethylformamid zweimal 3 Min. lang.

8. Man wäscht mit Dimethylformamid. ^;

9. Man wäscht dreimal mit CH₂Cl₃.

10. Man behandelt mit 20 mMol des entsprechenden Derivats der in CHgCljj-Dimethylformamid gelösten Aminosäure und rührt 5 Min. lang.

11. Man gibt in zwei Portionen 25 mMol Diisopropylcarbodiimid im Verlauf von 30 Min. zu. Die Reaktionszeit beträgt 18 Std,

12. Man wäscht mit Dimethylformamid.

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13. Man wäscht dreimal mit CH₂Cl₂.

14. Man untersucht mit Hilfe der Ninhydrinreaktion nach Kaiser et al., Anal. Biochem, 3_4, 595 (1970). Im Falle einer unvollständigen Reaktion werden die Punkte 10 bis 14 wie zuvor beschrieben wiederholt.

Schema B

1. Das Peptidoharz (in diesem Beispiel Boc-Phe-Phe-Trp-Lys(ClZ)-Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-O-Harz) wird wie folgt behandelt:

2. Man wäscht dreimal mit CHpCIp.

3. Man behandelt mit Trifluoressigsäure/CH₂C1₂/Dithioaerythrit (1:1:0,5 %) 5 Min. lang.

4. Man behandelt mit Trifluoressigsäure/CH₂C1₂/Dithioaerythrit (1:1:0,5 %) 25 Min. lang.

5. Man wäscht dreimal mit ₂₂

6. Man wäscht mit Dimethylformamid.

7. Man behandelt mit 12 tigern Triäthylamin in Dimethylformamid zweimal 3 Min. lang.

8. Man wäscht mit Dimethylformamid.

9. Man wäscht dreimal mit CH₂Cl₂.

10. Man behandelt mit 40 mMol Boc-Asn-ONP in Gegenwart von 2 bis 3 Tropfen Eisessig und löst in Dimethylformamid. Die Reaktionszeit beträgt 72 Std.

11. Man wäscht dreimal mit Dimethylformamid.

12. Man wäscht dreimal mit

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Λ8

13. Man führt die Ninhydrinreaktion durch.

Das oben genannte Peptidoharz, Boc-Lys(ClZ)-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(ClZ)-Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-O-Harz, wird hydroly siert und analysiert.

Das D-Trp-'-Analoge wird nach derselben Arbeitsweise hergestellt, mit der Ausnahme, daß man Boc-L-Tryptophan durch Boc-D-tryptophan ersetzt.

Beispiel

oc-Butyloxycarbonyl-e-Z-chlorbenzyloxycarbonyl-L-lysyl-L-asparaginyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-L-tryptophyl-€-2-chlorbenzyloxycarbonyl-L-lysyl-O-benzyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-0-benzyl-L-threonyl-O-benzyl-L-seryl-Hydrazid

10 g des Peptidharzes Boc-Lys(ClCbζ)-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-(ClCbz)-Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-O-Harz von Beispiel 1 werden mit 75 ml Dimethylformamid und anschließend mit 10 ml Hydrazin (95 % Plus-Qualität) gemischt und die Mischung wird über Nacht gerührt.

Man filtriert die Mischung, wäscht den festen Teil mit etwas mehr Dimethylformamid und dampft die vereinigten Filtrate zu einem kleinen Volumen ein. Den Rückstand behandelt man mit überschüssigem Wasser, wobei man einen Feststoff erhält, der in etwas Dimethylformamid gelöst und wiederum mit Wasser ausgefällt wird. Die Ausbeute beträgt 2,8 g.

Aminosäureanalyse: Asp (1) 0,84, Thr (2) 1,62, Ser (1) 0,56, Phe (3) 3, Lys (2) 2,02, NH,, Trp, nicht bestimmt.

Das D-Trp^-Analoge wird nach derselben Arbeitsweise hergestellt

- 18 -

6098A1/1026 .

Beispiel 3

a-Butyloxycarbonyl-f-2-chlorbenzyloxycarbonyl-L-lysyl-L-

asparaginyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-L-tryptophyl-S-2-

chlorbenzyloxycarbonyl-L-lysyl-O-benzyl-L-threonyl-L-phenyl-

alanyl-O-benzyl-L-threonyl-O-benzyl-L-seryl-a-benzyl-C-tert,

butyl-1-Glutamat

Das Hydrat, Boc-Lys(ClCbz)-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(ClCbz)-Thr-(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-NHNH₂ (1,95 g, 1 mMol) von Beispiel 2 wird in Dimethylformamid (ca. 50 ml), das auf -20°C gekühlt ist, gelöst und mit HCl/EtOAc (4,7n, 0,6 ml), gefolgt von Isoamylnitrit (0,2 ml) behandelt. Man rührt die Lösung 10 Min. bei -20°C und macht dann mit NEt, (0,6 ml) alkalisch. Zu dieser Lösung gibt man H-GIu (O-tert.-Bu)-OBzI (0,3 g) und rührt 1 Std. bei -20⁰C und anschließend 4 Tage bei 0⁰C. Die Mischung wird im Vakuum zur Trockene eingedampft, und der Rückstand wird mit überschüssigem Wasser verrieben, wobei man einen weißen Peststoff erhält, der auf dem Filter mit 10 /Siger Zitronensäure und Wasser gewaschen wird. Die Ausbeute beträgt 1,9 g.

Aminosäureanalyse: Asp (1) 1,01, Thr (2) 1,73, Ser (1) 0,68, GIu (1)

stimmt.

GIu (1) 0,84, Phe (3) 3, Lys (2) 2,1, NH₃, Trp nicht bete
Das entsprechende D-Trp -enthaltende Analoge wird mit H-GIu(O-

tert.-Bu)-O-BzI nach derselben Arbeitsweise gekuppelt.

Aminosäureanalyse: Asp (1) 1,14, Thr (2) 2,10, Ser (1) 0,71, GIu (1) 1,26, Phe (3) 3, Lys (2) 1,74, NH₃ (1) 2,72, Trp nicht bestimmt.

- 19 -

609841/1026

Beispiel 4

ε-2-Chlorbenzyloxycarbonyl-L-lysyl-L-asparaginyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-L-tryptophyl^^-chlorbenzyloxycarbonyl-L-lysyl-0-benzyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-O-benzyl-L-threonyl-O-benzyl-L-seryl-a-benzyl-L-Glutamat

Das geschützte Undecapeptid, Boc-LysfClCbzi-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(ClCbz)-Thr(BzI)-Phe-Thr(BzI)-Ser(BzI)-Glu(0-tert.-Bu)-OBzI (1,8 g) von Beispiel 3 wird mit 3 ml Anisol gemischt und mit 50 ml TFA 30 Min. bei Raumtemperatur behandelt. Die Lösung wird im Vakuum zur Trockene eingedampft und der Rückstand wird zweimal mit Äther gespült. Den Rückstand verreibt man mit Äther und löst den Feststoff in etwas Dimethylformamid. Diese Lösung wird in 100 ml einer Lösung von NH^OAc in Wasser, die auf pH 6,5 eingestellt ist, gegossen. Der weiße Feststoff, der ausfällt, wird gesammelt und getrocknet, wobei man 1,35 g des oben angegebenen Materials erhält.

Aminosäureanalyse: Asp (1) 1,02, Thr (2) 1,64, Ser (1) 0,66, GIu (1) 0,80, Phe (3) 3, Lys (2) 1,99, NH₃ (1) 1,74, Trp nicht bestimmt.

Das D-Trp -Analoge wird auf dieselbe Weise teilweise entschützt.

Beispiel

L-Lysyl-L-asparaginyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-L-tryptophyl-L-lysyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-L-threonyl-L-seryl-L-glutamyl-(cyclo-«-lysyl zu r-glutamyl)-Peptid

Das Undecapeptid, H-Lys(ClCbz)-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(ClCbz)-Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OH)OBzl (1,1 g) von Beispiel 4 wird in 250 ml Dimethylformamid und 100 ml CH₂Cl₂, die

- 20 -

60 9 841/1026

M/17 0H2

mit N-Hydroxybenzotriazol (1,3 g) gemischt und in einem Eisbad gekühlt sind, gelöst und mit DCC (0,5 g) 2 Std. lang in der Kälte und anschließend 30 Std. bei Raumtemperatur behandelt.

Die Mischung wird zur Trockene eingedampft, der Rückstand wird mit Wasser verrieben, wobei man einen Niederschlag erhält, der mit wäßrigem KHCO,, Wasser, 10 £iger wäßriger Zitronensäure, Wasser, gewaschen und getrocknet wird. Das trockene feste Material wird mit absolutem EtOH auf dem Dampfbad digeriert, auf Raumtemperatur kommengel as sen und filtriert. Der Peststoff auf dem Filter (570 mg) wird in AcOH/H₂O (100 ml/l:l), das mit. 10 % Pd-C (100 mg) vermischt ist, suspendiert und 20 Std. hydriert. Der Katalysator wird entfernt und das Filtrat wird zur Trockene eingedampft und anschließend in verdünntem wäßrigem AcOH aufgenommen und lyophilisiert, wobei man 82 mg eines Pulvers erhält, bei dem es sich um das oben genannte Produkt handelt.

Rj. (n-Butanol/Wasser/Eisessig; 4:5:1): 0,60. R_f (n-Butanol/Wasser/Eisessig/Pyridin; 30:24:6:20): 0,70.

Aminosäureanalyse: Asp (1) 0,97, Thr (2) 1,84, Ser (1) 0,73, GIu (1) 0,89, Phe (3) 3, Lys (2) 1,91, NH,, Trp nicht bestimmt.

Beispiel

L-Lysyl-L-asparaginyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-D-tryptophyl-L-lysyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-L-threonyl-L-seryl-glutamyl-(cyclo-ct-lysyl zu y-glutamyl)-Peptid

Das teilweise entschützte Undecapeptid des letzten Absatzes von Beispiel 4 (3g) wird in DMF (36 ml) und CH₃Cl₂ (322 ml)

- 21 -

609841/1028

N/17 042

gelöst und anschließend gibt man Triäthylamin (0,2 ml) zu, um den pH auf 7 zu bringen. Man gibt N-Hydroxybenzotriazol (1 g) zu und kühlt die Mischung in einem Eisbad und behandelt sie dann mit DCC (0,59 g) 2 Tage unter Rühren. Die Reaktionsmi schunq wird filtriert und das Piltrat wird auf ein kleines Volumen eingedampft. Man gibt einen Überschuß Wasser zu, wobei man einen weißen Peststoff erhält, der filtriert, mit Wasser gewaschen und über P₂ ⁰R getrocknet wird. Die Ausbeute beträgt 2,5 g.

Das cyclische, teilweise geschützte Undecapeptid (2g) wird dann mit flüssigem Fluorwasserstoff (ungefähr 100 ml) in Gegenwart von Anisol (5 ml) und unter Luftausschluß 35 Min. in einem Eisbad behandelt. Die überschüssige HP wird im Vakuum so schnell wie möglich entfernt, der Rückstand wird in 2 m wäßrigem AcOH aufgenommen und die wäßrige Phase wird mit Diäthylather extrahiert, um das Anisol zu entfernen. Man lyophilisiert die wäßrige Lösung, wobei man 1,03 g Peststoff erhält. Dieses rohe Material (1 g) wird auf eine Säule mit Sephadex G-25 (2,5 x 120 cm) aufgegeben und mit 2 m wäßrigem AcOH eluiert. Die Fraktionen (4 ml jeweils), die in die Röhren 89 bis 109 gelaufen sind, werden vereinigt und lyophilisiert, wobei man 155,8 mg eines flockigen Feststoffs erhält. Diesen Feststoff gibt man auf eine Säule mit Sephadex G-10 (1,5 χ 50 cm) und eluiert. Das Eluat in den ; Röhren 13 bis 35 wird vereinigt und lyophilisiert, wobei man die Titelverbindung erhält; 111,9 mg; M^ -30° (0,5; 75 Jtige wäßrige AcOH). Dünnschichtchromatographie auf Avicel-Platten (n-Butanol/Wasser/Essigsäure;4:1:1): 0,47; (n-Butanol/Wasser/Essigsäure/Pyridin; 30:24:6:20): 0,71.

Aminosäurehydrolyse: Asp (1) 1,02, Thr (2) 1,96, Ser (1) 0,92, GIu (1) 0,99, Phe (3) 3,12, Lys (2) 2, NH₃ (1) 1,16, Trp (1) 0,77.

- 22 -

609841/1026

Die Wachstumshormon-Aktivitäten der Verbindungen gemäß Beispiel 5 werden bestimmt, indem man Ratten mit einem Gewicht von' ungefähr 200 bis 250 g zuerst Nembutal intraperitoneal in einer Dosis von 50 mg/kg injiziert und anschließend nach 5 Min. den Ratten subkutan eine Lösung der Verbindung des Beispiels 5 in Kochsalzlösung in einer Dosis von 2 mg/kg pro Ratte injiziert. 15 Minuten nach der Injektion mit der Verbindung des Beispiels 5 werden Blutproben entnommen, und der Wachstumshormonspiegel wird durch Radioimmunoassay bestimmt. Der mittlere Wachstumshormonspiegel bei den Kontrollratten (13 Tiere) wird zu 132 - 20 ng/ml festgestellt, wogegen der Wachstumshormonspiegel bei den Ratten (13 Tiere), denen die Verbindung des Beispiels 5 verabreicht wurde, zu 79 - 14 ng/ml festgestellt wird. Das vorstehende Experiment wird wiederholt, jedoch wird die Dosis an Verbindung gemäß Beispiel 5 auf 2,38 mg/kg erhöht, und das Blut wird 2 Std. nach der Injektion entnommen. Der mittlere Wachstumshormonspiegel bei den Kontrollratten (15 Tiere) wird zu 244 - 38 ng/ml festgestellt, wogegen der Wachstumshormonspiegel bei den Ratten (15 Tiere)i denen die Verbindung des Beispiels 5 verabreicht wurde, zu 89 - 23 ng/ml festgestellt wird.

Unter Befolgung derselben Arbeitsweise wird die Aktivität des Produkts gemäß Beispiel 6 2 Std. nach Verabreichung von 1500/ug/kg bestimmt, wobei man einen Wachstumshormonspiegel von 18 - 4 ng/ml bei einem Kontrollgruppenspiegel von l80 27 ng/ml und nach 4 Std. 34 - 11 ng/ml mit einem Kontrollgruppenspiegel von 182 - 49 ng/ml, erhält (ng = Nanogramm).

Der Befund einer wesentlichen Verminderung des Wachstumshormonspiegels bei dem nach 2 Std. festgestellten Spiegel zeigt an, daß die Verbindungen der Formel I überraschend eine wesentlich länger dauernde Aktivität als Somatostatin aufweisen, von dem durch Brazeau et al, Biochem. und Biophys. Res.Comm. 60, Seite

- 23 -

609841 /1026

M/17 042

7 6117 7

1202 (197¹I) berichtet wird, daß es eine biologische Halbzeit von ungefähr 4 Min. besitzt.

Mit der Verbindung gemäß Beispiel 5 wird ein weiterer Test durchgeführt, um ihre Wirkung auf die Insulin- und Glucagonspiegel zu bestimmen. Der in vivo-Test zur gleichzeitigen Bestimmung der Freisetzung von Wachstumshormon, Insulin und Glucagon wird durchgeführt, indem man drei Gruppen männlicher Ratten, die ungefähr 200 bis 250 g wiegen (9 Tiere pro Gruppe) mit Pentobarbital intraperitoneal in einer Dosis von 50 mg/kg pro Ratte, injiziert und 15 Min. später eine subkutane Injektion der Verbindung des Beispiels 5 zu einer Dosis von 2,7 mg/kg an eine Gruppe von Ratten, eine subkutane Injektion von SRIP zu einer Dosis von 0,2 mg/kg an eine weitere Gruppe von Ratten und eine subkutane Injektion von Kochsalzlösung an die dritte Gruppe von Ratten durchführt. Zehn Minuten nach einer derartigen Injektion erhalten die Ratten 150 mg Arginin in 0,5 ml Kochsalzlösung direkt ins Herz. Fünf Minuten später werden die Ratten geköpft, das Blut gesammelt und man führt verschiedene Radioimmunoassays durch. Die Ergebnisse zeigen an, daß weder die Glucagon- noch die Insulinspiegel durch die Verabreichung der Verbindung des Beispiels 5 abgesenkt werden, wogegen die Spiegel dieser beiden Hormone durch Somatostatin erniedrigt werden.

Auf analoge Weise wird das Produkt des Beispiels 6 in drei getrennten Experimenten untersucht, wobei die nachfolgenden Ergebnisse erhalten werden; hierbei besitzt die Abkürzung "nd" die Bedeutung "nicht bestimmt".

0 9 8 41/10 2

M/17 oü2 261 I 779

Verbindung Dosis GH Insulin Glucagon

/ug/kg ng/ml /uU/ml picog/ml

1. Kontrolle 247-52 19^*17 nd Beispiel 6 3 000 61*7 152*13 nd

2. Kontrolle 315*22 nd nd Beispiel 6 12 192*29 nd nd

3. Kontrolle nd 183*19 129*9 Beispiel 6 3 000 nd 93*9 107*9

Die hier beschriebene Verbindung der Formel I kann an warmblütige Säuger, einschließlich Menschen, entweder intravenös, subkutan, intramuskulär oder oral verabreicht werden, um die Freisetzung des Wachstumshormons zu inhibieren, und zwar in den Fällen, in denen der zu behandelnde Patient eine therapeutische Behandlung benötigt, die auf eine überschüssige Sekretion von Somatotropin, die mit Zuständen, wie Akromegalie, verbunden ist, ausgerichtet ist. Der in Betracht kommende Dosisbereich bei oraler Verabreichung in Form einer Tablette oder Kapsel an große Säuger beträgt ungefähr 0,015 mg bis ungefähr 7 mg/kg Körpergewicht pro Tag, während der Dosisbereich für intravenöse Injektion in wäßriger Lösung ungefähr 0,1*1 vug bis ungefähr 0,15 mg/kg Körpergewicht pro Tag beträgt. Bei subkutaner oder intramuskulärer Verabreichung wird ein Dosisbereich von ungefähr 1,5/ug bis ungefähr 7 mg/kg Körpergewicht pro Tag in Betracht gezogen. Es liegt auf der Hand, daß die erforderliche Dosierung mit dem zu behandelnden be-

- 25 -

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M/17OU2

sonderen Zustand, der Ernstheit der Bedingung und der Dauer der Behandlung, variiert.

Wenn der aktive Bestandteil in Tablettenform verabreicht wird, kann die Tablette enthalten: ein Bindemittel, wie Tragantgummi, Maisstärke, Gelatine, einen Excipienten, wie Dxkalzxumphosphat, ein Zerfallmittel, wie Maisstärke, Alginsäure und dergleichen, ein Schmiermittel, wie Magnesiumstearat und ein Süß- und/oder Geschmacksmittel, wie Sucrose, Lactose, Wintergrün und dergleichen. Zu geeigneten flüssigen Trägern zur intravenösen Verabreichung gehören isotonische Kochsalzlösung, Phosphatpufferlösungen,, und dergleichen.

- 26 -

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M/17 OH2

Fließdiagramm

R-Lys(R¹)-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(R²)-Thr(R³)-Phe-Thr(R⁴)-Ser(R⁵)-O-Harz ι

Hydrazin/Lösungsmittel ,.v R-Lys(R¹)-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(R²)-Thr(R³)-Phe-Thr(R⁴)-Ser(R⁵)-NHNH,

Reagens, das in situ
salpetrige Säure
liefert

R-LyS(R¹) -Asn-Phe-Phe-Trp-Lys (R²)-Thr (R³) -Phe-Thr (R¹*) -Ser (R⁵) -N.

CO₂R

2>n

H₂NCH-CO₂R'

(D)

RO-C=O

R-Lys (R¹) -Asn-Phe-Phe-Trp-Lys (R²) -Thr (R³) -Phe-Thr (R^A )-Sn.r (R⁵) -NH-CH

( E)
Abspaltung der „ ^e

Schutzgruppen R und R

R⁶O-C-O

R⁹O-C=O

H-Lys(R¹)-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(R²)-Thr(R³)-Phe-Thr(R^A)-Ser(R⁵)-WH-CH ,

Cyclisierung

(P)

HO-C=O

O=C-

HN

I CH

<^CV„

IJ -d-Asn-l

HNR"¹

Phe-Phe-Trp-Lye(R²)-Thr(R³)-Phe-Thr(R*)-Ser(R^-

Abspaltung der verbleibenden Schutzgruppen

R¹, R², R³, r\ R⁵ und R⁹

^POTftli/1026

- 27 -

Claims

M/17 042 PATENTANSPRÜCHE

1. !Verbindungen der Formel

O=C

I HN

<^CVn

H N(CH₂) ^CH-C-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-NH-CH-CO^I

(D

und

HN

(CIIj)₄

HN-R¹⁰

(IV)

und deren nicht-toxische Säuresalze, worin Trp ^: entweder für D- oder L-Tryptophyl steht und alle anderen

Aminosäuren die !-Konfiguration aufweisen;

12
worin R ausgewählt ist unter Wasserstoff und einer Schutzgruppe für den Seitenkettenaminosubstituenten, ausgewählt unter Benzyloxycarbonyl, Tosyl, tert,-Amyloxycarbonyl» tert.-Butyloxycarbonyl» Diisopropylmethoxycarbonyl und substituiertem Benzyloxycarbonyl, worin der Substituent ausgewählt ist un ter Halogen und Nitro;

- 28 -

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M/17 042

3 4 5
R » R und R ausgewählt sind unter Wasserstoff und einer Schutzgruppe für die alkoholische Hydroxylgruppe von Threonin und Serin, die ausgewählt ist unter Acetyl, Benzoyl, tert.-Butyl, Trityl, Benzyl, 2,6-Dichlorbenzyl und Benzyloxycarbonyl; R ausgewählt ist unter Wasserstoff und einer Schutzgruppe für die Aminofunktion, die unter den

12

durch den Rest R definierten Schutzgruppen ausgewählt ist;

R ausgewählt ist unter Wasserstoff und einer a-Carboxyl-schützenden Gruppe, die ausgewählt ist unter C,-Cg-Alkyl, Benzyl, substituiertem Benzyl, Phenacyl, Phthalimidomethyl, Benzhydryl, Trichloräthyl, 4-Picolyl, ß-Methylthioäthyl, 4-(Methylthio)-phenyl, wobei es sich beim Substituenten am Benzyl um Nitro, Methyl und Methoxy handelt und η eine ganze Zahl von 1 bis 5 darstellt; und worin

χ α ς -jo 11 mindestens einer der Reste R , R R , R , R und

12
R von Wasserstoff verschieden ist.

2. Verbindung gemäß Anspruch 1, worin η für 2 steht.

3. Verbindung gemäß Anspruch 1, worin Trp für D-Tryptophyl steht.

4. Verbindung gemäß Anspruch 1, worin Trp für L-Tryptophyl ^; steht.

5. Verbindung gemäß Anspruch 1, worin R und R für 2-Chlorbenzyloxycarbonyl stehen, R , R^" und Br Benzyl bedeuten und R die Bedeutung Benzyl besitzt.

6. Verbindung der Formel

- 29 -

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M/17 042

HN

Il

II₂N(CII₂)_/jCir-C-Asn-Phc-Phe-Trp-Lys-Thr-Plie-Thr-Ser-NII-

ZUCO_nIi

und ihre nicht-toxischen Salze» worin η eine ganze Zahl von 1 bis 5 darstellt und worin alle chiralen Aminosäuren in der Verbindung die !-Konfiguration aufweisen, mit der Ausnahme von Trp, das der D- oder !-Konfiguration angehört.

7. Verbindung gemäß Anspruch 6, L-Lysyl-L-asparaginyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-L-tryptophyl-L-lysyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-L-threonyl-L-seryl-L-glutamyl-(cyclo-ct-lysyl zu γ-glutamyl)-Peptid und deren nichttoxische Salze.

8. Verbindung gemäß Anspruch 6» L-Lysyl-L-asparaginyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-D-tryptophyl-I-lysyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-L-threonyl-L-seryl-L-glutamyl-(cyclo-a-lysyl zu γ-glutamyl)-Peptid und deren nichttoxische Salze.

9. Verbindung der Formal

R-Lys (R¹ )-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(R²)*Thr (R³)-Phe-Thr(R⁴)-Ser(R⁵)-R⁶

worin:

Trp entweder für D- oder 1-Tryptophyl steht und alle anderen chiralen Aminosäuren die L-Konfiguration aufweisen; R eine a-Aminoschutzgruppe darstellt, die unter Bedingun-

1 2 gen abspaltbar ist, welche die Schutzgruppe R und R nicht abspalten;

1 2
R und R eine Schutzgruppe für den Seitenkettenaminosubstituenten des Lysine darstellen und ausgewählt sind unter Benzyloxycarbonylt Tosyl, tert.-Amyloxycarbonyl» tert.-

- 30 -

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Butyloxycarbonyl» Diisopropylmethoxyearbonyl und substituiertem Benzyloxycarbonyl» wobei es sich beim Substituenten um Halogen und Nitro handelt und wobei die

1 2
Gruppen R und R nicht gleich der Gruppe R sind;

'TA C

R , R und R ausgewählt sind unter Wasserstoff und einer Schutzgruppe für die alkoholische Hydroxylgruppe von Threonin und Serin» die ausgewählt ist unter Acetyl, Benzoyl, tert.-Butyl, Trityl, Benzyl, 2,6-Dichlorbenzyl und Benzyloxycarbonyl; und
R⁶ ausgewählt ist unter OH, NHNH₂, N₅, OCH₃ und

-0-CH₂

10. Verbindung gemäß Anspruch 9» worin R für tert.-Butyloxy-

1 2
carbonyl steht, R und R die Bedeutung 2-ChlorbenzylQxycarbonyl besitzen und R , R^ und R^-^ Benzyl darstellen,

11. Verbindung gemäß Anspruch 10, worin R für NHNH₂ steht.

12. Verbindung gemäß Anspruch 10, worin R für

-0-CH₂

steht.

13. Verbindungen der Formeln

- 31 -

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R⁹O-C=O

<K²)-Thr (R³)-Phe-Thr (R⁴)^r (R ⁵}-NH-CH

(A)

R⁸O-C=O

und

R¹³O-C=O

R -Ly₅(R )-Asn-Phe-Phe-Tq>-Lys(li²)-Thr(R³)-Phe-Thr(R⁴)-Ser(R⁵)-NH-CH

(CHJ_n,

H₂NHN-C=O

(n)

worin:

Trp entweder für D- oder L-Tryptophyl steht und alle anderen chiralen Aminosäuren die L-Konfiguration besitzen;

1 2
R und R eine Schutzgruppe für den Seitenkettenaminosubstituenten des Lysins darstellen und ausgewählt sind unter Benzyloxycarbonyl, losyl, tert.-Amyloxycarbonyl, tert.-Butyloxycarbonyl, Diisopropylmethoxycarbonyl und substituiertem Benzyloxycarbonyl, wobei der Substituent für Halogen und Nitro steht;

R » R und R ausgewählt sind unter Wasserstoff und einer Schutzgruppe für die alkoholische Hydroxylgruppe von Threonin und Serin, die ausgewählt ist unter Acetyl, Benzoyl, tert.-Butyl, Trityl, Benzyl, 2,6-Dichlorbenzyl und Benzyloxycarbonyl;

7
R ausgewählt ist unter Wasserstoff und einer a-Aminoschutzgruppe, wobei die α-Aminoschutzgruppe von der Schutz-

- 32 -

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μ/π 042 261 Vl7 9

■13'

1 2
gruppe R und R verschieden ist und die a-Aminoschutzgruppe unter Bedingungen abspaltbar ist» die nicht zur

1 2 Abspaltung der Schutzgruppen R und R führen;

R ausgewählt ist unter Wasserstoff und einer Seitenketten-Carboxylschutzgruppe» die unter Bedingungen entfernbar ist, die nicht zur Entfernung der Carboxyl-

q
schutzgruppe R führen;

q
R^ eine a-Carboxylschutzgruppe darstellt, die unter Reaktionsbedingungen stabil ist, welche zur Abspaltung

7 8

der Schutzgruppen R und R führen, wobei die a-Carboxylschutzgruppe ausgewählt ist unter C.-Cg-Alkyl, Benzyl, Phenacyl, Phthalimidomethyl, Benzhydryl, Trichloräthyl, 4-Picolyl, ß-Methylthioäthyl, 4-(Methylthio)-phenyl und substituiertem Benzyl, wobei der Substituent Nitro, Methoxy und Methyl darstellen kann; R ausgewählt ist unter Wasserstoff und einer Schutz-

gruppe, bei der es sich um eine durch die Gruppe R definierte Schutzgruppe handelt; und η eine ganze Zahl ΛΓοη 1 bis 5 darstellt.

14. Verbindung gemäß Anspruch 13 gemäß Formel A, worin R und R für 2-Chlorbenzyloxycarbonyl stehen, R , R und

5 7

R Benzyl bedeuten, R die Bedeutung tert.-Butyloxy-

8 Q carbonyl besitzt, R für tert.-Butyl steht und R Benzyl darstellt.

15· Verbindung gemäß Anspruch 13 gemäß Formel A, worin R

und R für 2-Chlorbenzyloxycarbonyl stehen, R , R^ und

5 7 8

Ir Benzyl bedeuten, R' Wasserstoff darstellt, R Wasser-

stoff darstellt und R^y Benzyl bedeutet.

16. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel I

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D=C (CH₂)

I I

• HW D

I i ' 1

H₂N(CH₂)₄-CH-C-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-PhB-Thr-Ser-NH-CH-CD₂H

worin Trp entweder für D- oder I-Tryptophyl steht und alle anderen Aminosäuren die L-Konfiguration besitzen» dadurch gekennzeichnet» daß man von einer entsprechenden Verbindung der Formel IV

O=C ——

HN 0

i I«
CH-C-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Scr-NH-CH-CGoR

^)(te

(k)₄ ()(te () (te _(iv)

worin n, R⁵, R⁴, R⁵, R , R¹⁰, R¹¹ und R¹ die in Anspruch 1 angegebenen Definitionen besitzen» die Schutzgruppe oder -gruppen entfernt und gewünsentenfalls die erhaltene Verbindung der Formel I in ein nicht-toxisches Säureadditionssalz davon überführt.

17· Verfahren gemäß Anspruch 16» dadurch gekennzeichnet, daß man Hydrogenolyse oder Fluorwasserstoff/Anisol anwendet.

18. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel IV

HN 0
CH-C-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thx-Sax-NH-CH-CO^R¹¹

ι , , (ί«^ΐ2)ό.³) ih (R⁵)

μιι Λ

R¹⁰ (IV)

- 34 -609841/1026

worin Trp entweder für D- oder 1-Tryptophyl steht und alle anderen Aminosäuren die !-Konfiguration aufweisen und worin n, R³, E⁴, R⁵, R⁶, R¹⁰, R¹¹ und R¹² die in Anspruch. 1 angegebenen Definitionen besitzen, dadurch gekennzeichnet, daß man

(i) eine Verbindung der Formel P

R⁹O-

H-Lys-Asn-PhB-PhB-Trp-Lys-Thr-PhB-Thr-SBr-HN-CH (R¹) (R²) (R³) (R⁴XR⁵) (CH₂)_n

i;

HO (F)

in Gegenwart eines Cyclisierungsmittels, oder (ii) eine Verbindung der Formel H

R¹³O-C=Q

H-Lys-Asn-PhQ-Phe-Trp-Lys-Thr-Pho-Thr-Ser-NN-CH (R¹) (R²KR³) (R⁴) (R⁵) (CH₂)_n

(H)

cyclisiert,

wobei in den Formeln Trp entweder für D- oder L-Tryptophyl steht und alle anderen chiralen Aminosäuren die L-Konfigu-

1 2
ration besitzen, R und R gleich oder verschieden sind und Schutzgruppen für den Seitenkettenaminosubstituenten

⁰Z A C

des Lysins bedeuten, R , R^ und R unabhängig voneinander für Wasserstoff oder eine Schutzgruppe für die alkoholische

Q A"*

Hydroxylgruppe von Threonin und Serin bedeuten, R und R ot-Carboxyl-schützende Gruppen darstellen und η eine ganze

- 35 -

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Zahl von 1 Ms 5 bedeutet,

und gewünschtenfalls ein oder mehrere Schutzgruppen aus der erhaltenen Verbindung der Formel IV entfernt, um andere Verbindungen der Formel IV zu erhalten.

19. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel IV gemäß Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß man als Cyclisierungsmittel N,N -Dicyclohexylcarbodiimid und N-Hydroxybenzotriazol verwendet.

20. Verfahren gemäß Anspruch 19» dadurch gekennzeichnet, daß man die Reaktion bei einer Temperatur zwischen -40 und +2O⁰C durchführt.

21. Verfahren gemäß Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß man die Verbindung der Formel (F) gemäß Anspruch 18 herstellt, indem man

(i) eine Verbindung der Formel Ha

R-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lvs-Thr-Phe-Thr-Ser(R )0H

oder ein acylierendes funktionelles Derivat davon mit einer Verbindung der Formel D

CO₂R⁸

_2n
H₂N-CH-CO₂R⁹

kuppelt, wobei man eine Verbindung der Formel lila

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-η-

R-Lys-Asn-Phe-Pha-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Sor-NH-ljH

t*¹) .(i²) (W (i⁴) (I^s)

JL

12 3 erhält, wobei in den Formeln die Reste R , R , R ,

4-5 9

R , R und R dieselben Definitionen wie in Anspruch 18 besitzen, R für eine α-Aminoschutzgruppe steht, die unter Bedingungen abspaltbar ist, die

1 2 nicht zur Abspaltung der Schutzgruppen R und R führen, R eine Seitenkettencarboxylschutzgruppe darstellt, die unter Bedingungen entfernbar ist,

q die nicht zur Entfernung der Gruppe R führen, und

(ii) die Schutzgruppen R und R selektiv entfernt.

22. Verfahren gemäß Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß man als funktionelles Derivat der Verbindung der Formel Ha das Azid verwendet.

23. Verfahren gemäß Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet» daß man das Kuppeln bei einer Temperatur zwischen -25⁰C und +10⁰C durchführt.

24. Verfahren gemäß Anspruch 22 oder 23» dadurch gekennzeichnet, daß man das Azidderivat der Verbindung der ' Formel Ha herstellt, indem man

(i) eine entsprechende Verbindung der Formel II(b)

(R²) (R³) (R⁴) (R⁵)

3-L·

R-Lys-Asn-Phe-Pha-Txp-Lys-Thr-Phe-Thr-Sor

I
OCH

1Kb)

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mit Hydrazin umsetzt, wobei man eine entsprechende Verbindung der Formel II(c)

R-Ly3-A3n-Phe-Pho-Trp-Ly3-7hr-Pho-Thr-Ser-NHNH2 <i¹) (I²) (R³) (RL

erhält, und

(ii) das Hydrazid der Formel II(c) mit salpetriger Säure umsetzt.

25. Verfahren gemäß Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß man die dort definierte Verbindung der Formel II(a) herstellt, indem man

(i) eine entsprechende Verbindung der Formel II(b)

R-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Pho-Thr-Ser-OCH^ (t¹) (H²) (R³) (R*) (R⁵)

1Kb)

durch Methanolyse spaltet, wobei man eine Verbindung der Formel II(d)

fl-Lys-Asn-Phe-Phe-Txp-Lys-Thx-Phe-Thr-Sör-OCH_3; (R¹) (fl ) (R ) (« ) (R )

erhält und
(ii) die Verbindung der Formel II(d) hydrolysiert.

26. Verfahren gemäß Anspruch 24 oder 25, dadurch gekennzeichnet, daß man die dort definierte Verbindung der Formel II(b) herstellt, indem man die in geeigneter Weise ge-

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schützten und aktivierten Aminosäuren Ser, Thr» Phe> Thr» Lys, Trp, Phe, Phe» Asn» Lys unter Festphasensynthesebedingungen nacheinander an einen ehlormethylierten oder Hydroxymethylharzträger kuppelt.

27. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 16 bis 26» dadurch gekennzeichnet, daß Trp für D-Tryptophyl steht.

28. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel III gemäß Anspruch 13» dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der Formel II(a)

n-Lys-Asn-Phe-Phß-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser(R⁵)OH

<'r¹) (r²) (L³)

CO₉R⁸

ι c-

₂>n 0»

H₂N-CH-CO₂R⁹

kuppelt, wobei man eine Verbindung der Formel IHa

R⁹O-E=O

(R¹) (R²)(fl³) ' (R⁴)(R⁵). L

(IHa) R⁸ 0-C=O

erhält, wobei in den Formeln die Reste R¹, R², R⁵, R , R

und R die in Anspruch 13 angegebenen Definitionen besitzen, R für eine α-Aminoschutzgruppe steht, die unter Bedingungen abspaltbar ist, die nicht zur Abspaltung der

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Schutzgruppen R und R führen» R eine Seitenketten-

carboxylschutzgruppe darstellt» die unter Bedingungen

entfernbar ist, die nicht zur Entfernung der Gruppe R

führen,

und, gewünschtenfal Is, entweder eine der beiden oder

beide Schutzgruppen R und R selektiv entfernt.

29. Verfahren gemäß Anspruch 28» dadurch gekennzeichnet,
daß man als funktionelles Derivat der Verbindung der
Formel (Ha) das Azid verwendet.

30. Verfahren gemäß Anspruch 29» dadurch gekennzeichnet,
daß man das Kuppeln bei einer Temperatur zwischen
-25⁰C und +10⁰C durchführt.

31. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel II gemäß Anspruch 9» worin R für N-, steht, dadurch gekennzeichnet, daß man eine entsprechende Verbindung der IOrmel II, worin R für -NHNH2 steht, mit salpetriger Säure umsetzt.

32. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel II gemäß Anspruch 9» worin R für -NHNH₂ steht, dadurch gekennzeichnet, daß man eine entsprechende Verbindung der
Formel II, worin R⁶ für

-0-CH₂

steht, mit Hydrazin umsetzt.

33. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel II gemäß Anspruch 9» dadurch gekennzeichnet, daß man die in

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geeigneter Weise geschützten und aktivierten Aminosäuren Ser, Thr, Phe, Thr, Lys, Trp, Phe, Phe, Asn und Lys unter Festphasensynthesebedingungen stufenweise an einen chlormethylierten oder Hydroxymethylharzträger kuppelt.

34. Pharmazeutisches Mittel, bestehend aus einer Verbindung der Formel I oder einem nicht-toxischen Säuresalz davon gemäß Anspruch 1 zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger.

35. Pharmazeutisches Mittel gemäß Anspruch 34» worin Trp in der Verbindung der Formel I für L-Tryptophyl steht.

36. Pharmazeutisches Mittel gemäß Anspruch 34» worin Trp in der Verbindung der Formel I für D-Tryptophyl steht.

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