DD153684A5 - Verfahren zur herstellung von cyclischen hexapeptid-somatostatin-analogen - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von cyclischen Hexapeptid-Somatostatin-Analogen der allgemeinen Formeln I und II, in der die Reste die im Erfindungsanspruch angegeben Bedeutung haben.Diese Verbindungen sind Arzneistoffe, die zur Behandlung von Acromegalie, Diabetes, diabetischer Retinopathie und Ulcus pepticum verwendet werden koennen.
Description
"Verfahren zur Herstellung von cyclischen Hexapeptid-Somatostatin-Analogen"
Die Anwendung der vorliegenden Erfindung erfolgt im Bereich der Arzneimittel, insbesondere auf dem Gebiet der Mittel zur Behandlung von Acromegalie, Diabetes, diabetischer Retinopathie und Ulcus pepticum.
Somatostatin ist ein ein cyclisches Dodecapeptid enthaltendes Tetradecapeptid der folgenden Struktur
I 1
Ala-Gly-Cys-LyS-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH 1 2. 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Somatostatin hemmt die Freisetzung des Wachstumshormons, die Freisetzung von Insulin und Glucagon und vermindert die Magensekretion. Somatostatin selbst weist eine kurze Wirkungsdauer auf, da es unter anderem durch Aminopeptidasen und Carboxy-
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peptidasen, die in vivo vorhanden sind, inaktiviert wird.
Dieses Problem der kurzen Wirkungsdauer von Somatostatin wurde gemäss dem Stand der Technik teilweise überwunden, indem man Somatostatin-Derivate von geringer Löslichkeit herstellte und somit bei subkutaner Injektion dieser Produkte eine langsame Wirkstoffreisetzung erzielte. Sobald diese Derivate jedoch in Lösung gegangen sind, sind sie gegen eine Inaktivierung durch Aminopeptidasen und Carboxypeptidasen nicht stabiler als Somatostatin selbst.
Ziel der Erfindung ist es, neue Arzneistoffe zur Behandlung von Acromegalie, Diabetes, diabetischer Retinopathie und Ulcus pepticum bereitzustellen.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung von Somatostatin-Analogen zu eröffnen, die im Vergleich zu Somatostatin eine höhere biologische Aktivität aufweisen und langer wirksam sind als Somatostatin und die bisher bekannten Somatostatin-Derivate.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von cyclischen Hexapeptiden, bei denen es sich um Somatostatin-Derivate handelt, wobei unter anderem 7 Ringaminosäuren des Somatostatins durch eine sekundäre Aminosäure.ersetzt sind und beide exocyclischen Aminosäuren entfernt sind. Ferner kommt erfindungsgemäss auch eine Substitution und Reaktion der verbleibenden Aminosäuren in Betracht. Die erfindungsgemäss hergestellten cyclischen Hexapeptide hemmen die Freisetzung von Glucagon, Wachstumshormonen und Insulin sowie die Freisetzung von Magensäuresekreten. Insbesondere können die Verbindungen der Erfin-
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dung bevorzugt die Freisetzung von Wachstumshormonen hemmen, ohne die Menge von Magensekreten oder von Magensekreten, Insulin und Glucagon zu beeinflussen. Ferner können die Verbindungen der Erfindung die Freisetzung von Magensäuresekreten hemmen. Somit besitzen die erfindungsgemäss hergestellten Verbindungen im Vergleich zu'Somatostatin eine selektivere biologische Aktivität. Die cyclische Hexapeptidstruktur der erfindungsgemäss hergestellten Verbindungen gewährleistet im Vergleich zu Somatostatin auch eine längere Wirkungsdauer. Somit handelt es sich bei den erfindungsgemäss hergestellten cyclischen Hexapeptiden um wertvolle Arzneistoffe zur Behandlung von Acromegalie, Diabetes, diabetischer Retinopathie und Ulcus pepticum.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der allgemeinen Formeln I und II
und
R. ° 2
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in der
X (CKp) , wobei η den Wert 0, 1 oder 2 hat, oder Schwefel bedeutet,
Y (CHp) , wobei m den Wert 0, 1 oder 2 hat oder Schwefel bedeutet, wobei der Schwefel in einer beliebigen Stellung entlang der Kette stehen kann,
Rv und Rp unabhängig voneinander nieder-Alkyl, Benzyl, substituiertes Benzyl, das 1- oder 2-fach durch nieder-Alkyl, Halogen, Hydroxyl, Amino, Nitro oder nieder-Alkoxy substituiert ist, oder nieder-Alkyl, das durch einen 5- oder 6-gliedrigen heterocyclischen Ring substituiert ist, bedeuten, R-, 3-Indolylmethyl oder substituiertes 3-Indolylmethyl, das durch nieder-Alkyl, nieder-Alkoxy oder Halogen substituiert ist, bedeutet,
R1, nieder-Alkyl, Hydroxy-nieder-Alkyl, Benzyl, Carboxy-niederalkyl, Amino-nieder-alkyl oder substituiertes Benzyl, das durch nieder-Alkyl, nieder-Alkoxy, Hydroxyl, Halogen, Amino oder Nitro substituiert ist, bedeutet, und
Rj- nieder-Alkyl, Benzyl oder substituiertes Benzyl, das durch nieder-Alkyl, nieder-Alkoxy, Hydroxyl, Halogen, Amino oder Nitro substituiert ist, bedeutet, gekennzeichnet dadurch dass man
a) ein entsprechendes-, blockiertes, lineares Peptid, das an Harz in fester Phase gebunden ist, herstellt,
b) selektiv die N-endständ.ige Aminogruppe deblockiert,
c) das lineare Peptid vom. Harz entfernt,
d) das lineare Peptid mit einem Cyclisierungsmittel unter Bildung der Amidbindung des gewünschten cyclischen Hexapeptids behandelt und
e).die Seitenkettenschutzgruppen entfernt.
Der Ausdruck "nieder-Alkyl" umfasst geradkettige oder verzweigte Alkylreste mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, wie Methyl, Äthyl,
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Propyl, Isopropyl, Butyl, sek.-Butyl und Pentyl.
Der Ausdruck "nieder-Alkoxy" umfasst geradkettige oder verzweigte Alkoxyreste mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, wie Methoxy, Äthoxy, Propoxy, Isopropoxy, Butoxy, tert.-Butoxy und Pentoxy.
Der Ausdruck "Halogen" umfasst Fluor, Chlor, Brom und Jod.
Der Ausdruck "5- oder 6-gliedriger heterocyclischer Ring" umfasst 5- oder 6-gliedrige Heterocyclen mit 1 oder 2 Sauerstoff-, Stickstoff- oder Schwefelatomen als Heteroatomen. Beispiele für entsprechende Heterocyclen sind Imidazol, Furan, Thiazol, Pyrazol, Pyridin und dergleichen.
Die erfindungsgemäss hergestellten Verbindungen weisen mehrere asymmetrische Zentren auf, so dass die Verbindungen in Form von optischen Isomeren vorliegen können. Das erfindungsgemässe Verfahren betrifft für die einzelnen Asymmetriezentren der verschiedenen Aminosäuren, aus denen die cyclischen Hexapeptide bestehen, jeweils die D- und L-Konfiguration.
Für den Fachmann ist es klar, dass, wenn R1 und R? Benzyl, R-, Indolylmethyl, Y Methylen und R1, 1-Hydroxyäthyl bedeuten, die Aminosäuren in der 7-, δ-, 9- 10- und 11-Stellung von Somatostatin (-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-) vorliegen und die sekundäre Aminosäure, die in der allgemeinen Formel I N-Methylalanin ist, wenn Rf- Methyl bedeutet, und in der allgemeinen Formel II Prolin ist, wenn X Methylen bedeutet, die Stelle der übrigen Aminosäuren von Somatostatin eingenommen hat. Somit wird unter Verwendung der vorstehenden Definitionen der Substituentengruppen das folgende repräsentative cyclische Hexapeptid-Analoge von Somatostatin der allgemeinen Formel I gebildet:
N-Me-Ala-Phe-Trp ' ι
Phe-Thr~Lys
-6- 2 24
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Bevorzugt hergestellte cyclische Hexapeptide weisen die allgemeine Formel I. auf, in der Y (CH2) bedeutet und η den Wert 1 hat, R. und Rp die vorstehende Bedeutung haben, R^ 3-Indolylmethyl oder substituiertes Indolylmethyl, das durch Methoxy oder Fluor substituiert ist, bedeutet, R2, Methyl, Äthyl, Hydroxymethyl oder Hydroxyäthyl bedeutet und R1- Methyl bedeutet. Bevorzugt ist ferner die Herstellung von Verbindungen, in denen Y Methylen bedeutet, R1 und Rp die vorstehende Bedeutung haben, R-, 3-Indolylmethyl bedeutet, Rn Hydroxyäthyl bedeutet und R,- Methyl bedeutet.
Bevorzugte Reste für R1 und Rp sind nieder-Alkyl, Benzyl oder substituiertes Benzyl, das als Substituenten nieder-Alkyl, Halogen, Hydroxyl, Amino, Nitro oder Alkoxy aufweist.
Beispiele für derartige bevorzugt hergestellte Verbindungen sind Cyclo-(N-Me-Ala-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Phe) Cyclo-(N-Me-Ala-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe) Cyclo-CN-Me-Ala-Phe-L-Trp-Lys-Thr-Phe) Cyclo-CN-Me-Ala-Phe-D-Trp-Lys-Thr-p-Cl-Phe) Cyclo-(N-Me-AIa-Phe-D-5-F-Trp-Lys-Thr-Phe) Cyclo-(N-Me-Ala-Phe-L-5-F-Trp-Lys-Thr-Phe) Cyclo-(N-Me-Ala-Phe-D-Trp-Lys-Ser-Phe)
Unter Verwendung der vorstehenden Definitionen für die Substituentengruppen wird das folgende repräsentative cyclische Hexapeptid-Analoge von Somatostatin der allgemeinen Formel II gebildet:
Pro-Phe-Trp t ' ι
Phe-Thr-Lys
-7- 2 24 779
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Bevorzugt werden ferner cyclische Rexapeptide der allgemeinen
Formel II hergestellt, in der X und Y (CHp) bedeuten und η den Wert 1 hat, R.. und Rp die vorstehende Bedeutung haben,
R_ 3-Indolylmethyl oder substituiertes Indolylmethyl, das durch
Methoxy oder Fluor substituiert ist, bedeutet und
Rj, Methyl, Äthyl, Hydroxymethyl oder Hydroxyäthyl bedeutet.
Ferner werden vorzugsweise Verbindungen hergestellt, bei denen
X und Y Methylen bedeuten,
R. und Rp die vorstehende Bedeutung haben, R^ 3-Indolylmethyl bedeutet und R2, Hydroxyäthyl bedeutet.
Bevorzugte Reste für R1 und Rp sind nieder-Alkyl, Benzyl oder substituiertes Benzyl, das durch nieder-Alkyl, Halogen, Hydroxyl, Amino, Nitro oder Alkoxy substituiert ist.
Nachstehend sind entsprechende bevorzugte Verbindungen aufgeführt:
Cyclo-(Pro-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Phe) Cyclo-(Pro-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe) Cyclo-(Pro-Phe-L-Trp-Lys-Thr-Phe) Cyclo-(Pro-Phe-D-Trp-Lys-Thr-p-Cl-Phe) Cyclo-CPro-Phe-D-S-F-Trp-Lys-Thr-Phe) Cyclo-(Pro-Phe-L-5-F-Trp-Lys-Thr-Phe) Cyclo-(Pro-Phe-D-Trp-Lys-Ser-Phe)
In der vorliegenden Anmeldung werden· eine Reihe von Bezeichnungen für Aminosäurebestandteile, bestimmte bevorzugte Schutzgruppen, Reagentien und Lösungsmittel verwendet. Die Bedeutungen der einzelnen abgekürzten Bezeichnungen sind in Tabelle I zusammengestellt.
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Abkürzung
Lys Phe Trp D-Trp Thr Aha Tyr VaI Abu Ser Asn Pro Asu Cys
L-Lysin L-Phenylalanin L-Tryptophan D-Tryptophan L-Threonin 7-Aminoheptansäure L-Tyrosin L-Valin L-OC-Arainobutt er säure L-Serin L-Asparagin L-Prolin D- oder L-Aminosuberinsäure L-Cystin
Abkürzung
INOC BOC OMe Bu
CBZ BzI 2-C1-CBZ Acm Me
Isonicotinyloxycarbonyl tert.-Butyloxycarbonyl Methylester tert.-Butyl" Benzyloxycarbonyl Benzyl
2-Chlorbenzyloxycarbonyl Acetamidomethyl Methyl
Abkürzung
ONp HSE HBT aktivierende Gruppen
p-Nitrophenylester N-Hydroxysuccinimidester 1-Hydroxybenzotriazol
*" 224 77
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DCCI . Dicyclohexylcarbodiimid
TFA Tr i fluor essigsaure
TEA Triäthylamin
DIPEA . Diisopropyläthylamin
EPAW fithylacetat-Pyridin-
Essigsäure-Wasser
BAW Butanol-Essigsäure-Wasser
CMW Chloroform-Methanol-VJa s s er
DMF Dimethylformamid
THF : Tetrahydrofuran
Erfindungsgemäss werden die cyclischen Hexapeptid-Somatostatin-Analogen durch Cyclisierung der entsprechenden linearen Peptide hergestellt. Die linearen Peptide werden unter Anwendung der sequentiellen Synthesetechnik an einer festen Phase hergestellt.
Bei der Herstellung des linearen Peptids am Kunstharz ist es nicht kritisch, welche Aminosäure für die C-endständige Stellung ausgewählt wird, sofern sichergestellt ist, dass die Aminosäuresequenz im linearen Peptid der Sequenz im gewünschten Somatostatin-Analogen entspricht. Nach der Cyclisierung lässt sich nicht mehr feststellen, welche Aminosäure sich in C-endständiger Stellung des linearen Peptids befand.
Während die Wahl der ersten Aminosäure zum Starten der Kette nicht kritisch ist, da, wie vorstehend erwähnt, das lineare
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Peptid einer Cyclisierung unterzogen wird, kann es andere Faktoren geben, aufgrund derer eine bestimmte Ausgangsaminosäure gegenüber einer anderen bevorzugt ist. Beispielsweise kann D-Trp mit tert.-Butylcarboniumionen, die bei der Entfernung von BOC-Gruppen gebildet werden, reagieren. Somit ist es bei der Wahl einer Reaktionsfolge, bei der D-Trp an das N-terminale Ende des linearen Peptids gelangt, erforderlich, D-Trp als letztes zu addieren, so dass es möglichst wenig tert.-Butylcarboniumionen ausgesetzt wird. Diese Wahl ist nicht immer möglich, beispielsweise wenn im Peptid 2 indolhaltige Reste enthalten sind. Jedoch sollten derartige Reaktionsweisen bei der Planung einer Peptidreaktionssequenz berücksichtigt werden.
Die Synthese des linearen Peptids nach dem Festphasenverfahren wird stufenweise an einem chlormethylierten Harz durchgeführt. Das Harz besteht aus feinen Kügelchen (20 bis 70 ρ Durchmesser) eines synthetischen Kunstharzes, das durch Copolymerisation von Styrol mit 1 bis 2 Prozent Dinvinylbenzol hergestellt worden ist. Die Benzolringe im Kunstharz werden nach einer Friedel-Crafts-Reaktion mit Chlormethylmethyläther und Zinn(IV)-chlorid der Chlormethylierung unterzogen. Die Friedel-Crafts-Reaktion wird so lange fortgesetzt, bis das Kunstharz 0,5 bis 5 mMol Chlor pro Gramm Harz enthält.
Die als C-endständige Aminosäure des linearen Peptids ausgewählte Aminosäure v/ird mit einer Aminoschutzgruppe versehen. Die Carboxylgruppe der ausgewählten C-endständigen Aminosäure wird kovalent an den unlöslichen polymeren Harzträger gebunden, beispielsweise als Carbonsäureester des dm mit Chlormethylgruppen substituierten Polystyrol-Divinylbenzol-Harz vorhandenen, an das Harz gebundenen Benzylchlorids. Nach Entfernung der Aminoschutzgruppen wird das an der Aminogruppe'geschützte Derivat der nächsten Aminosäure in der Sequenz zusammen mit einem
-«- 2U7T
Kupplungsmittel, beispielsweise Dicyclohexylcarbodiimid, zugesetzt. Das Aminosäurereagens kann in Form einer an der Carboxylgruppe aktivierten Aminosäure vorliegen, beispielsweise als ONp-Ester, Aminosäureazid .oder dergleichen. Die Entfernung der Schutzgruppe und Addition der folgenden Aminosäuren wird durchgeführt, bis das gewünschte lineare Peptid gebildet ist.
Die Auswahl der Schutzgruppen wird teilweise durch die speziellen Kupplungsbedingungen und teilweise durch die an der Umsetzung beteiligten Aminosäure- und Peptidkomponenten festgelegt.
Es können übliche Aminoschutzgruppen verwendet werden, beispielsweise Urethanschutzgruppen, wie die Benzyloxycarbonylgruppe (Carbobenzoxygruppe), p-Methoxycarbobenzoxygruppe, p-Nitroearbobenzoxygruppe, tert.-Butyloxycarbonylgruppe und dergleichen. Vorzugsweise wird die tert.-Butyloxycarbonylgruppe (BOC) verwendet, um die C\-Aminogruppe der am Carboxylende umzusetzenden Aminosäuren zu schützen. Die BOC-Schutzgruppe lässt sich nach der Kupplungsreaktion und vor der anschliessenden Verfahrensstufe durch relativ milde Säureeinwirkung, beispielsweise Trifluoressigsäure oder Halogenwasserstoff in Essigsäureäthylester, entfernen. Die OH-Gruppe von Thr und Ser kann durch die Bzl-Gruppe geschützt werden. Die f-'Aminogruppe von Lys kann durch die INOC-Gruppe oder die 2-Chlorbenzyloxycarbonylgruppe (2-Cl-CBZ) geschützt werden. Im Fall von Lys wird vorzugsweise die f-Aminogruppe durch die 2-Cl-CBZ-Gruppe geschützt, da diese Gruppe gleichzeitig mit den Bzl-Gruppen durch Behandlung mit HF nach Cyclisierung des linearen Peptids entfernt werden kann. Die INOC-Gruppe wird nicht durch HF entfernt und macht eine weitere Behandlung mit Zn erforderlich. Keine von beiden Gruppen wird durch TFA, die zur Entfernung von BOC-Schutzgruppen verwendet wird, beeinträchtigt. Nach
-U- 2 24 77
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Cyclisierung des linearen Peptids werden die Schutzgruppen, wie 2-ClCBZ und BzI durch Behandlung mit HF entfernt. Nach Bildung des linearen Peptids am Festphasenharz kann es vom Harz nach einer Reihe von bekannten Verfahren entfernt werden. Beispielsweise kann das Peptid vom Harz mit Hydrazin abgespalten und auf diese Weise direkt in das Peptidhydrazid übergeführt werden, das anschliessend zum Azid des gewünschten cyclischen Peptids cyclisiert werden kann·. Das Hydrazid wird durch Umsetzung mit einem Reagens, das in situ salpetrige Säure bildet, in das entsprechende Azid übergeführt. Geeignete Reagentien für diesen Zweck sind niedere Alkylnitrite, wie tert.-Butylnitrit und Isoamylnitrit, oder Alkalimetallnitrite, wie Natriumnitrit und Kaliumnitrit, in Gegenwart einer starken Säure, wie Salzsäure und Phosphorsäure. Diese Reaktion wird in Gegenwart von Wasser und/oder einem nicht-wässrigen Lösungsmittel, wie Dimethylformamid, Tetrahydrofuran, Dioxan, Chloroform oder Methylenchlorid, bei Temperaturen von etwa -40 bis +20 C durchgeführt. Eine andere Möglichkeit besteht darin, das Peptid vom Harz durch Behandlung mit einem niederen Alkohol, wie Methanol, in Gegenwart einer organischen Base, wie Triäthylamin zu entfernen, wobei der entsprechende niede.re Alkoholester des linearen Peptids gebildet' wird. Der erhaltene Ester kann in das Hydrazid übergeführt werden, das dann über das Azid zum gewünschten cyclischen Peptid cyclisiert werden kann. Vorzugsweise wird zur Abspaltung des Peptids vom Harz Hydrazin verwendet.
Wie Tabelle II zeigt, erfolgt bei einem bevorzugten Gesamtverfahren zur Herstellung der gewünschten cyclischen Peptide die stufenweise Synthese eines linearen Peptids an einem Festphasenharz. Insbesondere wird bei dem Verfahren zur Herstellung von
-Κ' 224 77'
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N-Me-Ala-Phe-D-Trp Pro-Phe-D-Trp
• ' oder ' ' Phe-Thr Lys Phe-Thr Lys
das Carboxylende der N-blockierten Aminosäure Phenylalanin kbvalent an einen unlöslichen polymeren Harzträger in Form des Carbonsäureesters des an das Harz gebundenen Benzylchlorids gebunden. Die Aminogruppe Phe wird durch die BOC-Gruppe geschützt. Nach beendeter Verknüpfung von Phe mit dem Harz wird die Schutzgruppe BOC durch Behandlung mit TFA in CH?Clp entfernt. Die folgenden Aminosäuren werden in Form von BOC-Aminosäuren unter Verwendung von DCCI als Kondensationsmittel oder als aktive Ester, wie ONp,verknüpft. Nach Herstellung des gewünschten linearen Peptids v/erden die N-endständigen Aminogruppen selektiv deblockiert, und das Peptid wird durch Behandlung mit Hydrazin vom Harz entfernt. Das erhaltene lineare Peptidhydrazid mit deblockierter N-endständiger Aminogruppe weist folgende Aminosäuresequenz auf:
OBzI
D-Trp-Lys-Thr-Phe-N~Me-AlaTPhe-NHNH„
2-C1CBZ oder
OB zl
D-Trp-Lys-Thr-Phe-Pro-Phe-NHNH? 2-ClCBZ
Dieses lineare Peptid wird mit Isoamyinitrit bei einem sauren pH-Wert unter Bildung des entsprechenden Azids behandelt. Die Azidlösung wird mit einem Lösungsmittel verdünnt und mit einer organischen Phase neutralisiert. Es bildet- sich das lineare Peptid:
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OBzI
t
Cyclo-(D-Trp-Lys-Thr-Phe-N-Me-Ala-Phe) 2-C1CBZ
OBzI Cyclo-(D-Trp-Lys-Thr-Phe-Pro-Phe)
2-C1CBZ
Während der Cyclisierung wird der pH-Wert kontrolliert und durch Zugabe von organischer Base im Neutralbereich gehalten. Der pH-Wert im organischen Lösungsmittel wird bestimmt, indem man eine Aliquotmenge der Lösung auf ein angefeuchtetes pH-Papier mit engem pH-Bereich aufbringt.
Nach Cyclisierung des linearen Peptids werden die Schutzgruppen 2-Cl-CBZ und OBzI durch Behandlung mit HF in Gegenwart von Anisol entfernt. Das erhaltene rohe cyclische Peptid wird chromatographisch gereinigt, vorzugsweise durch Säulenchromatographie an Kieselgel. Als Elutionslösungsmittel wird im allgemeinen ein organisches Lösungsmittel oder ein Gemisch von Lösungsmitteln verwendet, die ausgewählt werden, indem man Aliquotmengen des Materials dünnschichtchromatographisch analysiert.
Reaktionsschema zur Herstellung von cyclischen Hexapeptiden Reaktionsschema zur Herstellung von:
N-Me-Ala-Phe-D-Trp
1 I
Phe-Thr Lys
Cl-CH2©-Harz
BOC-Phe
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-AS-
224 77
BOC-Phe-O-CH20-Harz
Festphasenverfahren
1) BOC-N-Me-AIa
2) BOC-Phe
3) BO0-(OBZl)Thr
H) B0C-(€-2-Cl-CBZ)Lys /5) BOC-D-Trp
BOC-D-Trp(6 -2-Cl-CBZ)Lys-(OBZl)Thr-Phe-N-Me-Ala-Phe-OCH20-Harz
TFA
D-Trp-(£ -2-Cl-CBZ)Lys-(OBZl)Thr-Phe-N-Me-Ala-Phe-O-CHo0-Harz
V/
D-Trp-(6 -2-Cl-CBZ)Lys-(0BZl)Thr-Phe-N-Me-Ala-Phe-NHNH,
S/
Isoamylnitrit, H , DMF
D-Trp-(£ -2-Cl-CBZ)Lys-(0BZl)Thr-Phe-N-Me-Ala-Phe-N^
DMF/Triäthylamin
Cyclo(D-Trp-(£ 2-Cl-CBZ)Lys-(0BZl)Thr-Phe-N-Me-Ala-Phe)
HF/Anisol
Cyclo-iD-Trp-Lys-Thr-Phe-N-Me-Ala-Phe)
16391Y
Reaktionsschema zur Herstellung von:
Pro-Phe-D-Trp
t I
Phe-Thr Lys
Cl-CH20-Harz
BOC-Phe
BOC-Phe-O-CH^-Harz
Festphasenverfahren 1 )· BOC-Pro
2) BOC-Phe
3) BOC-(OBZl)Thr
4) BOC-(£-2-Cl-CBZ)Lys / 5) BOC-D-Trp
B0C-D-Trp(f-2-Cl-CBZ)Lys-(OBZljThr-Phe-Pro-Phe-OCH^ß-Harz
TFA
D-Trp-(6-2-Cl-CBZ)Lys-(OBZl)Thr-Phe-Pro-Phe-O-CH20-Harz
D-Trp-(6-2-Cl-CBZ)Lys-(OBZl).Thr-Phe-Pro-Phe-NHNH2
Isoamylnitrit, H , DMF D-Trp-(6-2-Cl-CBZ)Lys-(OBZl)Thr-Phe-Pro-Phe-N
4/ DMF/Triäthylamin CycloCD-Trp-(6-2-Cl-CBZ)Lys-(OBZl)Thr-Phe-Pro-Phe)
HF/Anisol Cyclo-CD-Trp-Lys-Thr-Phe-Pro-Phe)
. 2 24 779
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Herstellung von D-Trp-(g-2-Cl-CBZ)Lys-(OBZl)Thr-Phe-Pro-Phe-OCHgfl-Harz
862,0 g (2,37 Mol) Chlormethylharz (2% vernetztes Merrifield-Harz) mit 2,25 mÄq Chlor/g und 607,0 g (2,37 Mol, 1 Äquivalent) BOC-Phe werden zu 4320 ml peroxidfreiem Tetrahydrofuran gegeben. -Das Gemisch wird 45 Minuten auf einem Ölbad bei 80°C gerührt. Sodann werden 310,0 ml Tr.iäthylamin zugegeben. Das Gemisch wird 70 Stunden bei einer Badtemperatur von 80°C gerührt, sodann auf 25°C abgekühlt und mit 2000 ml Tetrahydrofuran unter Rühren in "eine Säule für die Festphasenreaktion gebracht. Nach Entfernen des Lösungsmittels wird das Harz unter Rühren in der Säule folgendermassen gewaschen:
3 x 2000 ml Tetrahydrofuran
H χ 5170 ml Äthanol
1 χ 5170 ml Essigsäure
3 x 5170 ml Wasser
3 χ 5170 ml Methanol .
3 x 5170 ml Chloroform ,"':'.
Das BOC-Phe-O-CHp0-Harz wird 16 Stunden bei 25°C unter.vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 1203 g BOC-Phe-O-CHpß-Harz mit einem Gehalt an 1,2 mMol Phenylalanin/g Harz.
2,13 g (2,0 mMol) BOC-Phe-O-CH^-Harz werden dem in den Tabellen III und IV angegebenen Verfahren unterworfen, wobei 2 Deblockierungsstufen (2 Minuten und 25 Minuten) mit 25-prozentiger TFA in Methylenchlorid und 2,5 Äquivalente BOC-Aminosäure in der erforderlichen Sequenz verwendet werden, bis das gewünschte BOC-Hexapeptid-O-CH„0-Harz erhalten wird.
-Sl-
2 24 77
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In jeder Stufe wird DCCI als einziges Kupplungsmittel verwendet.
Die Kupplung der einzelnen Aminosäuren verläuft glatt. Die besten Ausbeuten werden erhalten, wenn die Kupplung in jeder Stufe wiederholt wird. Bei Wiederholung der Kupplung werden die anfänglichen 2 Waschvorgänge mit Chloroform, die Deblockierungsstufe und die anschliessenden 3 Waschvorgänge mit Chloroform weggelassen und durch einen einzigen Waschvorgang mit Chloroform ersetzt.
Die Kupplungsreaktionen werden in Methylenchlorid, frisch entgastem DMF oder einem Gemisch aus diesen beiden Lösungsmitteln durchgeführt. Die N-endständige Aminogruppe wird in jedem Fall mit einer BOC-Gruppe blockiert. Die Hydroxylgruppe von Thr wird mit BzI und die £-Aminogruppe von Lys mit 2-C1-C3Z blockiert, Nach Erhalt des gewünschten BOC-Hexapeptid-O-CHpß-Harzes wird die N-endständige BOC-Gruppe gemäss dem in Tabelle V angegebenen Verfahren zur Deblockierung der endständigen Gruppen entfernt.
- 1-8 -
| CHCl3 (2) | Tabelle III | CHCl3 (3) | NAt3- CH2Cl2 | CHCl3C3) | BOC AA | 0,5m DCCI | von | 10 | DMF | (1) | CTs | |
| CH2C12(3) | in CH2Cl2 | in CH2Cl2 | 5 | MeOH DMF | (D (1) | LO | ||||||
| (2) | Kupplung 30 | VO | ||||||||||
| 25% TFA | DMF oder ein | MeOH | (1) | K | ||||||||
| 40 | in | Gemisch | CHCl | ,(2) | ||||||||
| ' 5 ' | 40 | 40 | beiden | i | ||||||||
| (2) | 2 5 | und 5 | 40 | 25 | 40 | |||||||
| 2 | 5 | CvJ | ||||||||||
| * 20 | ||||||||||||
| 2 und 25 | ||||||||||||
| Lösungsmittel | ||||||||||||
| oder Reagens (Anzahl der | ||||||||||||
| Behandlungen | ||||||||||||
| oder Wasch- | ||||||||||||
| vorgange) | ||||||||||||
| Volumen in ml | ||||||||||||
| Zeit in min | ||||||||||||
geschützte Aminosäure BOC-N-Me-AIa (1 ,08 g) Kuppeln
BOC-Phe (1,32 g) Kuppeln
BOC (OBzl)Thr (1,55 g)
Kuppeln «.
B0C-(2-Cl-CBZ)Lys (2,24 g) Kuppeln
BOC-D-Trp (1,52 g).
Kuppeln
BOC-Pro (1,80 g) Kuppeln
BOC-Phe (1,32 g) Kuppeln
BOC (OBZ)Thr (1,55 g) Kuppeln
B0C-(2-Cl-CBZ)Lys (.2,24 g) Kuppeln
BOC-D-Trp (1,52 g) Kuppeln Lösungsmittel 20 ml CH2Cl2 20 ml CH2Cl2 20 ml CH2Cl2 20 ml CH2Cl2 15 ml CH2Cl2, 5 ml DMF
κ;
25 ml
25 ml
25 ml
25 ml 20 ml CH2Cl2, 5 ml DMF
| " | CHC13(1) | Tabelle V | CHCl, | MeOH(2) |
| Lösungsmittel " | 25% TFA in | (3) | CH2Cl2(D | |
| oder Reagens | 40 | CH0Cl0 + 1% | 40 · | MeOH(2) CH2C12(2) |
| (Anzahl der Behandlungen oder Wasch vorgänge) | 5 | Athandithiol (2) | 2 | 40 |
| Volumen in ml | ' · 40 | 2 | ||
| Zeit in min | 2 und 25 | |||
/i 2 24 77
1639 TY
Nach Beendigung der Verfahren der Tabellen III, IV und V wird das blockierte Hexapeptid-OCH^ß-Harz über Nacht getrocknet. Man erhält 3,7 g ,Produkt.
Herstellung von D-Trp-(£-2-Cl-CBZ)Lys-(0BZl)Thr-Phe-N-Me-Ala-Phe-NHNH
2
Das Harz von Beispiel 1 wird mit 30 ml eines 2 : 1-Gemisches aus Dimethylacetamid und Hydrazin vereinigt und 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Das unlösliche Harz wird abfiltriert. Die Lösung wird zur Entfernung des Dimethylacetamids eingedampft. Der Rückstand wird zur Entfernung sämtlicher flüchtiger Materialien über Nacht unter Hochvakuum gehalten. Nach Lösen des Rückstands in Methanol, Filtrieren und Eindampfen zur Trockne erhält man 2,19 g schaumartiges Produkt.
Herstellung von D-Trp-'(6 2-Cl-CBZ)Lys-(0BZl)Thr-Phe-N-Me-Ala-Phe-N
3
Das gemäss Beispiel 2 erhaltene schaumartige Produkt wird unter Stickstoff mit 15 ml entgastem Dimethylformamid vereinigt und auf -100C gekühlt. Sodann werden 5 Äquivalente einer 4,52 m Lösung von Chlorwasserstoff in Tetrahydrofuran (2,2 ml) zugesetzt. Die Lösung wird auf -25°C gekühlt und portionsweise mit einem 1 : 19-Gemisch von Isoamylnitrit in Dimethylformamid versetzt, bis sich eine positive Stärke/KJ-Reaktion ergibt. Die Beendigung der Reaktion wird dünnschichtchromatographisch und durch Beobachten des Verschwindens des Ausgangshydrazids festgestellt.
Beispiel 4
Herstellung von Cyclo(D-Trp-(g-2-Cl-CBZ)LyS-(O-BZl)Thr-Phe-N-Me-Ala-Phe)
Das Azid von Beispiel 3 wird zu 600 ml entgastem Dirnethylform-
-a- 2 24 77f
I639IY
amid, das auf -25 C vorgekühlt ist gegeben. Der pH-Wert wird, mit Triethylamin auf 8 eingestellt. Sodann wird das Reaktionsgemisch über Nacht in die Tiefkühltruhe gestellt. Gegebenenfalls wird nach etwa 14 Stunden der pH-Wert wieder auf 8 eingestellt. Sodann wird das Gemisch 16 Stunden bei -200C und 16 Stunden bei 5°C aufbewahrt. Die dünnschichtchromatographische Analyse zeigt, dass die Umsetzung vollständig ist. Das Gemisch wird zur Trockne eingedampft, in 150 ml eines 3 : 1-Gemisches aus Dimethylformamid und Wasser
^ gelöst und 1 Stunde mit einem Mischbett aus Anionen- und Katio-J.
nenaustauscherharz behandelt. Sodann wird das Gemisch filtriert und unter vermindertem Druck zu einem Öl eingedampft. Der Rückstand wird mit Methanol verrieben. Man erhält 1,91 g eines weissen Feststoffs.
Beispiel 5 Herstellung von CycloCD-Trp-Lys-Thr-Phe-N-Me-Ala-Phe)
1,91 g (1,8 mMol) des geschützten cyclischen Hexapeptids von Beispiel H wird in einer mit Teflon ausgekleideten Kammer mit 2 ml Anisol vereinigt. Die Kammer wird sodann evakuiert und bei der Temperatur eines Trockeneis/Aceton-Bads mit flüssigem Fluorwasserstoff gefüllt. Die Temperatur steigt auf 00C. Der Rühr Vorgang . wird 1 Stunde fortgesetzt. Sodann lässt man den Fluorwasserstoff abdampfen . Der Rückstand wird bis zur Bildung eines Breis unter vermindertem Druck behandelt. Sodann wird der Rückstand mit Essigsäureäthylester verrieben und filtriert. Man erhält 1,29 g eines feinen Pulvers. Dieses Pulver wird auf 300 g Kieselgel aufgesetzt und mit einem 10 : 5 : 1 : 3-Gemisch von EPAW unter Bildung von 9 ml-Fraktionen eluiert. ; Die Fraktionen 55 bis 66 werden vereinigt und eingedampft..
Das Gemisch wird aus einer Mischung von Chloroform, Essigsäure-· äthylester und Hexan gefällt. Man erhält 679 mg Produkt.
16391Y
Beis'pielö
Herstellung von D-Trp-(£-2-Cl-CBZ)Lys-(OBZl)Thr-Phe-Pro-Phe-NHNH 2 '
Das Harz von Beispiel 1 wird mit 30 ml eines 2 : 1-Gemisches von Dimethylacetamid und Hydrazin vereinigt und 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Das unlösliche Harz wird abfiltriert. Die Lösung wird zur Entfernung des Dimethylacetamids eingedampft. Der Rückstand wird über Nacht unter Hochvakuum behandelt, um sämtliche flüchtigen Materialien zu entfernen. Nach Lösen des Rückstands in Methanol, Filtrieren und Eindampfen zur Trockne erhält man 1,84 g Schaum.
Beispiel? Herstellung von D-Trp-te-2-Cl-CBZ)Lys-(OBZl)Thr-Phe-Pro-Phe-N^ Das schaumartige Produkt von Beispiel 2 wird unter Stickstoff mit 15 ml entgastem Dimethylformamid vereinigt und auf -100C gekühlt. Sodann werden 5 Äquivalente einer 5,8 m Chlorwasserstofflösung in Tetrahydrofuran (1,7 ml) zugesetzt. Die Lösung wird auf -25°C gekühlt und mit 5 ml eines 1 : 19-Gemisches von Isoamylnitrit in Dimethylformamid versetzt. Die Beendigung der Umsetzung wird dünnschichtchromatographisch und durch Beobachten des Verschwindens des Hydrazidausgangsmaterials verfolgt.
Herstellung von Cyclo(D-Trp-(£-2-Cl-CBZ)Lys-(0-BZl)Thr-Phe-Pro-Phe)
Das Azid von Beispiel 3 wird zu 600 ml entgastem Dimethylformamid, das auf -25 C vorgekühlt ist, gegeben. Der pH-Wert wird auf 8 eingestellt. Das Reaktionsgemisch wird über Nacht in die Tiefkühltruhe gestellt. Nach etwa 14 Stunden wird der pH-Wert gegebenenfalls auf 8 nachgestellt. Sodann wird das Gemisch 16 Stunden bei -20° und 16 Stunden bei 5°C gelagert.
- "2*1 -
16391Y
Die dünnschichtchromatographische Analyse zeigt, dass die Umsetzung beendet ist. Sodann wird das Gemisch zur Trockne eingedampft, in 150 ml eines 3 : 1-Gemisches aus Dimethylformamid und Wasser gelöst und 2 Stunden mit einem Mischbett aus Anionen- und Kationenaustauscherharz behandelt. Anschliessend wird das Gemisch filtriert und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in Methanol gelöst, filtriert und zur Trockne eingedampft. Man erhält ein schaumartiges Produkt.
Beispiel 9 Herstellung von CycloCD-Trp-Lys-Thr-Phe-Pro-Phe)
2,13 g (2 mMol) des geschützten cyclischen Hexapeptids von Beispiel 4 werden in einer mit Teflon ausgekleideten Kammer mit 2 ml Anisol vereinigt. Die Kammer wird sodann evakuiert und bei der Temperatur eines Trockeneis/Aceton-Bads mit flüssigem Fluorwasserstoff gefüllt. Nach Erhöhen der Temperatur auf 00C wird der Rührvorgang 1 Stunde fortgesetzt. Man lässt den Fluorwasserstoff abdampfen. Der Rückstand wird evakuiert, bis sich ein Brei bildet. Der Brei wird mit Essigsäureäthylester behandelt und filtriert. Man erhält 1,19 g eines feinen Pulvers. 300 mg dieses Pulvers werden auf eine präparative Dünnschichtplatte mit 1000 ^u-Kieselgel aufgesetzt. ,Als Laufmittel wird ein 70 : 30 : 5-Gemisch aus Chloroform, Methanol und konzentriertem Ammoniak verwendet. Man erhält 200 mg Produkt. Das restliche Rohprodukt wird auf eine Kieselgelsäule -aufgesetzt und mit dem gleichen Lösungsmittel eluiert. Die Anwesenheit des Produkts im Eluat wird durch dünnschichtchromatographische Analyse bestimmt. Nach Gefriertrocknung erhält man etwa 510 mg Produkt.
Gemäss dem vorstehenden Verfahren können andere cyclische Hexapeptide hergestellt werden, indem man lediglich die Art
) In —
16391Y
und Reihenfolge der in Beispiel 1 angegebenen Aminosäuren modifiziert. '
Die erfindungsgemäss hergestellten cyclischen Hexapeptid-Analogen von Somatostatin werden in einem in vitro-Test einem Vergleich mit Somatostatin in bezug auf die Hemmung des Wachstumshormonsunterzogen. Der Test wird folgendermassen durchgeführt:
Ratten-Hypophysen werden gemäss den Verfahren von VaIe und Grant, "In vitro Pituitary Hormone Secretion Assay for Hypophysiotropic Substances", Methods in Enzymology, Bd. XXXVII, Hrsg. B.W. O'Malley und J. G. Hardman, Academic Press, Inc., New York, 1975, S. 5 bis 93, isoliert.
Nach 4-tägiger Züchtung werden die Zellen 4 Stunden in gemäss Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium in Gegenwart- oder Abwesenheit von abgestuften Dosen der jeweiligen Analogen oder von Somatostatin inkubiert. Das Medium wird sodann gewonnen und für eine anschliessende Bestimmung des Wachstumshormons nach einem Doppel-Antikörper-Radioimmuntest zur Bestimmung von Ratten-Wachstumshormon verwendet. "
Nachstehend sind die Untersuchungsergebnisse für einige erfindungsgemäss hergestellte Verbindungen aufgeführt, wobei zunächst Somatostatin angegeben ist, dem der willkürliche Wert 1 zugeordnet wird. Die Ergebnisse für die erfindungsgemäss hergestellten Verbindungen sind als Mehrfache bzw. Bruchteile der Wirkung von Somatostatin angegeben. Die Zahlen in Klammern geben die jeweiligen Vertrauensgrenzen an. Die erste der aufgeführten erfindungsgemäss hergestellten Verbindungen ist die gemäss den Beispielen 1 bis 5 erhaltene Verbindung. Die Verbindung wird lediglich geringfügig anders geschrieben, um die Reihenfolge der in Somatostatin vorhandenen Aminosäuren einzuhalten«
16391Y
-a- 2 24 77
Freisetzung von Wachs-
Verbindung tumshormonen in vitro-
Hemmung
Somatostatin 1 ·
Ferner wird die Wirkung der erfindungsgemäss hergestellten Cyclohexapeptid-Analogen von Somatostatin in folgender V/eise bestimmt.
Die Verbindungen werden auf ihre Fähigkeit zur Hemmung der durch Pentagastrin hervorgerufenen Magensekretion beim Hund mit chronischer Fistel untersucht. Weibliche Beagle-Hunde mit einer chronischen Magenfistel erhalten auf intravenösem Wege im Zeitraum von -60 bis 120 min 2,5 ^g/kg/Std. Pentagastrin. Der ausgeschiedene Magensaft wird über eine Fistelkanüle gesammelt. Die Proben werden in Abständen von 30 Minuten einer Volumenbestimmung (ml) und einer Bestimmung der titrierbaren Säure (mSq/Liter) durch Titration mit 0,01 η NaOH auf den Wert 7 unterzogen. Der gesamte Säureausstoss (mÄ'q) wird aus dem ausgestossenen Gesamtvolumen und der Säurekonzentration berechnet. Die Testverbindungen werden im Zeitraum von 0 bis 60 Minuten mit konstanter Geschwindigkeit
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-it- 2 24 77
infundiert. Die Werte werden als prozentuale Veränderung des gesamten Säureausstosses im Vergleich zu einem Placeboversuch bei den gleichen Tieren angegeben. Die Ergebnisse sind nachstehend zusammengestellt, wobei zuerst für Vergleichszwecke die Wirkung von Somatostatin aufgeführt ist.
Wirkung von Cyclohexapeptid-Analogen von Somatostatin auf die Magensekretion (Dosis 0,8 ^g/ml/min - Infusion 0 bis 60 min)
Cyclo(N-Me-Ala-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe) Cyclo.( N-Me-D-Ala-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe) Cyclo(Pro-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe) · Cyclo(Pro-Phe-D-Trp-Lys-Thr-p-Cl-Phe) Cyclo(Pro-p-Cl-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe) Cyclo(Pro-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Phe)Prozentuale Hemmung der Magensekretion Volumen Säurekonzentration
| -30 | 30-60 | 60-90 | 90-1 |
| 85 | 97 | 81 | 37 |
| 91 | 92 | 90 | 84 |
| 50 | 84 | 0 | 0 |
| 88 | 98 | 95 | 86 |
| 88 | 88 | 85 | 44 |
| 79 | 94 | 51 | 25 |
| 67 ' | 87 | 87 | 64 |
| -30 | 30-60 | 60-90 | 90-120 | ι |
| 16 | 77 | 61 | 14 . | vs> I |
| 15 | 41 | 47 | 48 | |
| 12 | 34 | 9 | 0 | |
| 18 ' | 47 | 54 | 68 | |
| 52 | 82 | 94 | 38 | |
| 30 | 53 | 24 · | 12 | |
| 30 | 49 | 52 | 27 | |
Claims (5)
1. Verfahren zur Herstellung von cyclischen Hexapeptid-Somatostatin-Analogen der allgemeinen Formeln I und II
und
(II )
in denen . ·
X (CHp) , wobei η den Viert 0, 1 oder 2 hat, oder Schwefel : bedeutet,
Y (CHp) , wobei m den Viert 0, 1 oder 2 hat oder Schwefel bedeutet, wobei der Schwefel in einer beliebigen Stellung entlang der Kette stehen kann,
2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet da.durch, dass man in Stufe c) das lineare Peptidharz mit Hydrazin unter Bildung des Hydrazids behandelt.
-*" 2 24 77
16391Y
R1 und Rp unabhängig voneinander nieder-Alkyl, Benzyl, substituiertes Benzyl, das 1- oder 2-fach durch nieder-Alkyl, Haloger Hydroxyl, Amino, Nitro oder nieder-Alkoxy substituiert ist, oder nieder-Alkyl, das durch einen 5- oder 6-gliedrigen heterocyclischen Ring substituiert ist, bedeuten, R^ 3-Indolylmethyl oder substituiertes 3-Indolylmethyl, das durch nieder-Alkyl, nieder-Alkoxy oder Halogen substituiert ist bedeutet,
R1J nieder-Alkyl, Hydroxy-nieder-Alkyl, Benzyl, Carboxy-niederalkyl, Amino-nieder-alkyl oder substituiertes Benzyl, das durch nieder-Alkyl, nieder-Alkoxy, Hydroxyl, Halogen, Amino oder Nitro substituiert ist, bedeutet, und
R(- nieder-Alkyl, Benzyl oder substituiertes Benzyl,1 das durch nieder-Alkyl, nieder-Alkoxy, Hydroxyl, Halogen, Amino oder Nitro substituiert ist, bedeutet, gekennzeichnet dadurch dass ma
a) ein entsprechendes, blockiertes, lineares Peptid, das an Harz in fester Phase gebunden ist, herstellt,
b) selektiv die N-endständige Aminogruppe deblockiert,
c) das lineare Peptid vom Harz entfernt, .. ·
d) das lineare Peptid mit einem Cyclisierungsmittel unter BiI-dung der Amidbindung des gewünschten cyclischen Hexapeptids behandelt und
e) die Seitenkettenschutzgruppen entfernt.
3- Verfahren nach Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, dass man in der Cyclisierungsstufe das Hydrazid mit einem Agens, das
16319IY
in situ salpetrige Säure bildet, behandelt und das gebildete Azid in Gegenwart eines tertiären Amins zum gewünschten cyclischen Hexapeptid cyclisiert.
4. Verfahren nach Punkt 3> gekennzeichnet dadurch, dass man das Azid durch Behandlung des Hydrazids mit einem nieder-Alkylnitrit oder einem Alkalimetallnitrit in Gegenwart einer starken Säure bildet.
5. Verfahren nach Punkt 4, gekennzeichnet dadurch, dass man das Azid durch Behandlung des Hydrazids mit Isoamylnitrit in Gegenwart von Salzsäure bildet.
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