DK152505B

DK152505B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af et somatostatin-analogt cyclisk hexapeptid

Info

Publication number: DK152505B
Application number: DK460580AA
Authority: DK
Inventors: Daniel F Veber; Roger M Freidinger
Original assignee: Merck & Co Inc
Priority date: 1979-10-31
Filing date: 1980-10-30
Publication date: 1988-03-07
Also published as: NO803245L; DD153684A5; PT71966A; NO150958B; ES496424A0; NZ195303A; ES8202787A1; PL128347B1; PL227577A1; GR70725B; RO81523B; IE50364B1; FI74711C; AU6358180A; NO150958C; AU540140B2; IE802224L; DK152505C; RO81523A; DE3064499D1

Description

i

DK 152505B

Somatostatin er et tetradecapeptid indeholdende et cyc-lisk dodecapeptid med formlen: I-i

Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 5 og det kan inhibere frigørelsen af væksthormon, frigørelsen af insulin og glucagon samt nedsætte mavesyre-sekre-tionen. Somatostatin i sig selv har en kort virkningsvarighed, da det inaktiveres, bl.a. af aminopeptidaser og carboxypeptidaser, der er til stede i legemet. Dette pro-10 biem med kortvarig virkning er til dels løst i den kendte teknik ved at fremstille derivater af somatostatin, som har ringe opløselighed, hvorved de bevirker en langsom frigivelse ved subcutan injektion. Når disse derivater først er opløst, er de imidlertid ikke længere stabile 15 over for inaktivering med aminopeptidaser og carboxypep-tidaser end somatostatin i sig selv.

Den foreliggende opfindelse angår en analogifremgangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte cycliske hexapeptider, der er derivater af somatostatin, i hvilke bl.a. syv af 20 ringaminosyrerne er erstattet med en sekundær aminosyre, og begge de exocycliske aminosyrer er fjernet. Desuden kan der være foretaget substituering og omsætning af de resterende aminosyrer som beskrevet i det følgende. De cycliske hexapeptider inhiberer selektivt frigørelsen af 25 væksthormon. Nogle af forbindelserne inhiberer desuden frigørelsen af mavesyresekret, insulin og glucagon.

Forbindelserne har således en mere selektiv biologisk aktivitet end somatostatin. Den cycliske hexapeptid-struktur for de omhandlede forbindelser betyder også en 30 længere varighed af aktiviteten end varigheden af aktiviteten for somatostatin. De cycliske hexapeptider som så-

DK 152505 B

2 danne er nyttige til behandling af akromegali/ diabetes, diabetisk retinopati og mavesår.

Det tilsigtes således med den foreliggende opfindelse at tilvejebringe cycliske hexapeptider, som er analoge 5 med somatostatin. Forbindelserne er som nævnt egnede til behandling af akromegali, diabetisk retinopati og mavesår .

Dansk patentansøgning nr. 4284/78 omhandler en fremgangsmåde til fremstilling af somatostatinanaloge cyclopeptider 10 med formlen LR-phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe(w)-X—Y J 5 6 7 8 9 10 11 12 13 hvor R betyder Asn, Ala eller des-R, Trp betyder D-Trp eller L-Trp, som i benzenringen kan være substitueret med 15 et halogenatom eller en nitrogruppe, w betyder hydrogen eller i benzenringen i L-phenylalanylgruppen som substituent tilstedeværende eventuelt forethret hydroxyl eller halogen, X betyder entv-aminoalkan-(mono- eller di-)car-boxylsyrerest eller des-X, og Y betyder en(v-aminoalkan-20 (mono- eller di-)carboxylsyrerest eller des-Y. Disse forbindelser kræver mindst én sammenkædende gruppe (X eller Y), medens de ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede forbindelser udgøres af cycliske 6-leddede amino-syrekæder, hvor ringen dannes ved direkte binding af ende-25 aminosyrerne i den tilsvarende ligekædede forbindelse.

De ved den kendte fremgangsmåde fremstillede forbindelser har imidlertid, som det fremgår af det følgende, en ringere virkning.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er af den i krav l's

DK 152505B

3 indledning angivne art, og den er ejendommelig ved det i krav l's kendetegnende del anførte.

De ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede forbindelser har den i krav 1 angivne almene formel I, 5 hvori 1 2 R og R uafhængigt af hinanden betegner alkyl med 2-5 carbonatomer bortset fra sec.butyl, benzyl, substitueret benzyl, hvori substituenten kan være en eller to af grupperne alkyl med 1-5 carbonatomer, halogen, hydroxy, amino, 10 nitro eller alkoxy med 1-5 carbonatomer, eller betegner alkyl med 1-5 carbonatomer substitueret med en 5- eller 6-leddet heterocyclisk ring med 1 eller 2 heteroatomer valgt blandt oxygen, nitrogen og svovl, 3 R er 3-indolylmethyl eller 3-indolylmethyl substitueret 15 én gang med alkyl med 1-5 carbonatomer, alkoxy med 2-5 carbonatomer eller halogen, R^ er alkyl med 1-5 carbonatomer, hydroxyalkyl med 1-5 carbonatomer, benzyl, carboxyalkyl med en alkylgruppe med 1-5 carbonatomer, aminoalkyl med 1-5 carbonatomer 20 eller én gang substitueret benzyl, hvori substituenten kan være alkyl med 1-5 carbonatomer, alkoxy med 1-5 carbonatomer, hydroxy, halogen, amino eller nitro, 5 , R er alkyl med 1-5 carbonatomer, benzyl eller en gang substitueret benzyl, hvor substituenten er alkyl med 1-5 25 carbonatomer, alkoxy med 1-5 carbonatomer, hydroxy, halogen, amino eller nitro, g R er methyl, eller 5 6 R og R sammen danner gruppen -CI^-X-CH.^-, hvor

DK 152505 B

4 X er r hvor n er 0, 1 eller 2, eller svovl, Y er (CH9) , hvor m er 0 eller 2, eller svovl, Δ* lu hvor de indgående aminosyrer kan have D- eller L-konfigu-ration.

5 Den 5- eller 6-leddede heterocycliske ring kan således f.eks. være imidazol, furan, thiazol, pyrazol eller pyri-din.

I de omhandlede forbindelser er der flere asymmetriske centre, som fører til forekomsten af optiske isomere for 10 sådanne forbindelser. Den foreliggende opfindelse omfatter såvel D- som L-konfigurationerne for hvert enkelt asymmetrisk centrum i de forskellige aminosyrer, som udgør de omhandlede cycliske hexapeptider.

1 2

Det vil forstås af fagmanden, at når R og R er benzyl, 3 4 15 R er indolylmethy1, Y er methylen, og R er 1-hydroxy- ethyl, er der tale om 7,8,9,10 og 11-aminosyrer af somatostatin (-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-), og den sekundære amino- 5 syre præsenteret ved N-methylalanin, når R er methyl, . og ved prolin, når X er methylen i en forbindelse med 20 formlen I, har erstattet resten af somatostatin- aminosyrerne. Under anvendelse af de i det foregående angivne definitioner for substituenterne dannes således følgende repræsentative cycliske hexapeptid, der er analogt med somatostatin og har formlen I: 25 N-Me-Ala-Phe-Trp i i

Phe-Thr-Lys

Foretrukne cycliske hexapeptider har formlen I, hvori Y er CH2, 5

DK 1S2505B

1 2 R og R har den i det foregående angivne betydning, 3 R er 3-indolylmethyl eller substitueret indolylmethyl, hvori substituenten er methoxy eller fluor, 4 5 R er methyl, ethyl, hydroxymethyl eller hydroxyethyl, og 5 R er methyl.

Andre foretrukne forbindelser er sådanne, hvori Y er methylen, 1 2 10 R og R har den i det foregående angivne betydning, 3 R er indolylmethyl, R4 er hydroxyethyl, og 5 R er methyl.

1 „2

De foretrukne betydninger for grupperne R og R er 15 alkyl, benzyl eller substitueret benzyl, hvor substituenten er alkyl, halogén, hydroxy, amino nitro eller alkoxy.

Under anvendelse af de i det foregående angivne definitioner for substituentgrupperne dannes følgende repræ-2o sentative cycliske hexapeptid, der er analogt med somatostatin og har formlen:

Pro-Phe-Trp

I I

Phe-Thr-Lys

De foretrukne cycliske hexapeptider med denne formel er sådanne, hvori X og Y er CH^

DK 152505B

6 1 2 R og R er som defineret i det foregående, r^ er 3-indolylmethyl eller substitueret indolylmethyl, hvori substituenten er methoxy eller fluor, og 4 5 R er methyl, ethyl, hydroxymethyl eller hydroxyethyl.

Yderligere foretrukne forbindelser er sådanne, hvori X og Y er methylen, 1 2 R og R er som defineret i det foregående, 3 R er 3-indolylmethyl, og 4 10 R er hydroxyethyl.

1 2

De foretrukne betydninger for grupperne R og R er alkyl, benzyl eller substitueret benzyl, hvor substitu-enten er alkyl, halogen, hydroxy, amino, nitro eller -alkoxy.

15 Blandt disse foretrukne forbindelser kan nævnes:

Cyclo-(Pro-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Phe)

Cyclo-(Pro-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe)

Cyclo-(Pro-Phe-L-Trp-Lys-Thr-Phe)

Cyclo-(Pro-Phe-D-Trp-Lys-Thr-p-Cl-Phe) 20 Cyclo-(Pro-Phe-D-5-F-Trp-Lys-Thr-Phe)

Cyclo-(Pro-Phe-L-5-F-Trp-Lys-Thr-Phe)

Cyclo-(Pro-Phe-D-Trp-Lys-Ser-Phe) I den foreliggende opfindelse er der anvendt adskillige forkortede betegnelser for aminosyrekomponenterne, visse 25 foretrukne beskyttelsesgrupper, reagenser og opløsningsmidler. Betydningerne af sådanne forkortelser er angivet i den efterfølgende tabel.

DK 152505 B

7

TABEL I

Forkortelse Aminosyre

Lys L-lysin

Phe L-phenylalanin 5 Trp L-tryptophan D-Trp D-tryptophan

Thr L-threonin

Aha 7-aminoheptansyre

Tyr L-tyrosin 10 Val L-valin

Abu L-ct-aminosmørsyre

Ser L-serin

Asn L-asparagin

Pro L-prolin 15 Asu D- eller L-aminosuberinsyre

Cys L-cystein

Beskyttelsesgrupper INOC isonicotinyloxycarbonyl BOC tert.-butyloxycarbonyl 20 OMe methylester

Bu tert.-butyl CBZ benzyloxycarbonyl

Bzl benzyl 2-C1-CBZ 2-chlorbenzyloxycarbonyl 25 Acm acetamidomethyl

Me methyl

Aktiveringsgrupper ONp p-nitrophenylester HSE N-hydroxysuccinimidester 30 HBT 1-hydroxybenzotriazol

Kondensationsmiddel DCCI dichlorhexylcarbodiimid

Reagenser TFA trifluoreddikesyre 35 TEA triethylamin DIPEA diisopropylethylamin

Opløsningsmidler EPAW ethylacetat/pyridin/eddikesyre/vand BAW butanol/eddikesyre/vand 40 CMW chloroform/methanol/vand DMF dimethylformamid THF tetrahydrofuran

DK 152505 B

8

Udvalgte forbindelser blev undersøgt tyndtlagschromato-grafisk og udviste følgende R^-værdier i de anførte opløsningsmidler. Alle chromatogrammer blev opnået på What-man-silicagelplader til tyndtlagschromatografi.

5 Opløsnings-

Rj middel *) C-(Pro-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe) 0,65 2 C-(Pro-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Phe) 0,30 1 C-(Pro-Phe-L-Trp-Lys-Thr-Phe) 0,30 1 10 C-(Pro-Phe-D-Trp-Lys-Thr-p-Cl-Phe) 0,64 2 0,43 4 C-(Pro-Phe-D-5-F-Trp-Lys-Thr-Phe) 0,40 1 C-(Pro-Phe-L-5-F-Trp-Lys-Thr-Phe) 0,30 1 C-(Pro-Phe-D-Trp-Lys-Val-Phe) 0,50 1 15 C-(N-Me-Ala-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe) 0,44 2 C-(N-Me-Ala-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Phe) 0,50 1 C-(N-Me-Abu-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe) 0,46 3 C-(N-Me-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe) 0,50 1 C-(N-Me-Ala-Tyr-L-Trp-Lys-Val-Phe) 0,50 1 20 C-(N-Me-Ala-21-Phe-D-Trp-Lys-

Val-L-Trp) 0,45 1 C-(pro-Phe-D-Trp-Thia-Lys-Thr-phe) 0,50 1 C-(Pro-L-meta-Tyr-D-Trp-Lys-

Thr-Phe) 0,25 1 *) 25 1): 70 dele chloroform, 30 dele methanol og 3 dele kon centreret vandig ammoniak.

2) : 70 dele chlorform, 30 dele methanol og 5 déle kon centreret vandig ammoniak.

3) : 80 dele chloroform, 25 dele methanol og 5 dele kon- 30 centreret vandig ammoniak.

4) : 10 dele ethylacetat, 5 dele pyridin, 1 del eddike syre og 3 dele vand.

Alle dele er volumendele.

DK 152505B

9

Aminosyreanalyse og undersøgelse for optisk rotation for udvalgte forbindelser gav følgende resultater.

1) Cycle(Pro-Ph«-D-Trp-Ly»-Tbr-Phe)

Pro(0,97), Ph*(2,04), Trp(0,97), Ly»(0,99), Thr(l,03) j^^24-23;6· (Cl, eethenol) 2) Cyclo(Pro-Tyr-D-Trp«*Ly*-Thr-Phc)

Pro(0,97). Tyr(0,96), Ly»(l,00), Tbr(l,03), Ph*(l/01) 3) Cyclo(Pro-Ph«-l-Trp-Ly*-Thr-Ph·)

Pro(l,00), Ph* (2,02), Ly» (0 j 98) , Thr(l,00) 4) Cyclo(Pro-Phe-D-Trp-Ly*-Thr-pCl-Ph·)

Pro(0,98), Ph«(l,00), Trp(l,00, Ly»(l,01), Thr(lr00) p-Cl-Ph«(1,00) 5) Cyclo(Pro-Ph*-D-5-F-Trp-Ly*-Thr-Pbe)

Pro(0,97), Ph«(2,02)-5-F-Trp(l,01), Ly»(0,98), Thrd^Ol) 6) Cyclo(?ro-Ph«-l-5-F-Trp-Ly*-Thr-Ph·)

Pro(0,97) , Ph*(2,04),-5-F-Trp(1,01), Ly»(0,99), Thr(l,00) 7) Cyclo(Pro-Ph*-D-Trp-Ly*-V»l-Ph*)

Pro(l,02). Ph*(l,98), Trp(0,74). Ly*(0,99), Vold,02) 8) Cyclo(N-M«-Al»-Ph«-D-Trp-Ly»-Thr-Ph·)

Phe(l,98), Trp(l,04), ly»(l,01), Thr(0,98) j j‘4-65,34 (CO.4, acthanol) 9) Cyclo(N-M*-Ala-Tyr-D-Trp-Ly» - Val-Ph·)

Tyr(0,99), Trp(0,75), Ly»(l,01), Val(l,00), Ph«(l,01) 10) Cyclo(N-M«-Abu-Ph*-D-Trp-Ly»-Thr-Ph·)

Ph«(l,98), Trp(0,98), Lyid.,01), Thr(l,03) 11) Cyclo(K-M«-Ph*-Ph*-D-Trp-Ly*-Thr-Ph·)

Trp(0,89), ly* (1,00). Thr(l,00), Ph«(l,99) 12) Cyclo(N-Me-Al»-Tyr-l-Trp-Ly«-V*l-Ph«)

Tyr(0,99). Ly»(l,02), V.l(l,01), Ph«(0,99) 13) Cyclo(K-M*-Alt-2I-Ph*-D-Trp-Ly»-V»l-L-Trp)

Ph*(0,87), Trp(l,68), Ly*(l,00), V»l(0,97) 14) Cyclo(Pro-Ph«-D-Trp-Thi»-iy§-Thr-Pb·)

Prod,02), Pht(l,97), Trp(l,01), Thi»-Ly*(0,99), Tbr(l,01) j j24-112,8 (CO.5, aethanol) 15) Cyclo(Pro-L-»rta-Tyr-D-Trp-Ly*-Thr-Ph·)

Pro(0/98), L-ac«:*-Tyrd,02), Trp(0,74), Iy*(0,99), Thr(0y99). Ph«(1^01).

DK 152505 B

10

De omhandlede cycliske hexapeptider, der er analoge med somatostatin, fremstilles som sagt ved at ringslutte de tilsvarende lineære peptider. De lineære peptider fremstilles ved anvendelse af fastfase-sekvenssyntesemetoden.

5 Følgelig omfatter fremgangsmåden til fremstilling af de cycliske hexapeptider (a) fremstilling af et tilsvarende blokeret lineært peptid knyttet til en fastfaseharpiks, (b) selektiv afblokering af N-terminalamingruppen, 10 (c) fjernelse af det lineære peptid fra harpiksen, (d) behandling af de lineære peptidmed et ringslutningsmiddel til opnåelse af det cycliske hexa-peptid ved dannelse af en amidbinding, (e) fjernelse af enhver sidekæde-blokeringsgruppe.

15 Når det lineære peptid fremstilles på harpiksen, er det sædvanligvis ikke kritisk, hvilken aminosyre der vælges som C-terminalstillingsgruppe, forudsat at rækkefølgen af aminosyrer i det lineære peptid svarer til den ønskede i det cycliske peptid. Når et lineært pep-20 tid erblevet ringsluttet, kan man ikke længere bestemme, hvilken aminosyre der var afsluttende i det lineære peptid.

Skønt valget af den første aminosyre til at starte kæden er almindeligvis ikke kritisk, da det lineære 25 peptid skal ringsluttes, kan der være andre faktorer, som kan gøre det foretrukkent at starte med en aminosyre frem for en anden. For eksempel kan D-Trp reagere med t-butylcarboniumioner, som dannes, når BOC-grupper fjernes. Hvis man således vælger en reaktions-30 sekvens, hvor D-Trp placeres ved den N-terminale ende

DK 152505B

11 af det lineære peptid, vil det bevirke, at D-Trp tilsættes sidst, og det vil således i mindst mulig grad blive udsat for påvirkningen af t-butylcarboniumioner. Denne type valg er ikke altid mulig, såsom hvor der er to indolholdige 5 grupper i peptidet. Man bør imidlertid ved planlægningen af reaktionssekvensen tage hensyn til de forskellige stoffers følsomhed.

Syntesen af de lineære peptider ved fastfaseteknikken udføres trinvis i chlormethyleret harpiks. Harpiksen 10 er sammensat af fine perler (20 - 70 mikron i diameter) af en syntetisk harpiks fremstillet ved copolymerisation af styren og 1 - 2 pct. divinylbenzen. Benzenringene i harpiksen chlormethyleres ved en Friedel-Craft-reaktion med chlormethy1-methylether og stannichlorid. Friedel-15 Craft-reaktionen fortsættes, indtil harpiksen indeholder 0,5-5 mmol chlor pr. gram harpiks.

Den aminosyre, der er valgt som den C-terminale aminosyre i det lineære peptid, overføres i sit aminobeskyt-tede derivat. Carboxylgruppen i den valgte C-terminale 20 aminosyre bindes covalent til den uopløselige polymere harpiksbærer, som f.eks. som carboxylsyreesteren af det harpiksbundne benzylchlorid, der er til stede i chlormethy1-substitueret polystyren/divinylbenzen-har-piks. Efter fjernelse af aminobeskyttelsesgruppen til-25 sættes det aminobeskyttende derivat af den næste aminosyre i rækkefølgen sammen med et koblingsmiddel, såsom dichlorhexylcarbodiimid. Aminosyre-reaktanten kan anvendes i form af en carboxyl-aktiveret aminosyre, såsom ONp-esteren, et aminosyreazid eller lignende. Afbeskyt-30 telse og tilsætning af successive aminosyrer foretages, indtil det ønskede lineære peptid er dannet. Valget af beskyttelsesgrupperne er dels dikteret af de særlige koblingsbetingelser, dels af aminosyren og de indgående peptidkomponenter i reaktionen.

35 Amino-beskyttelsesgrupper, der sædvanligvis anvendes,

DK 152505B

12 omfatter de i teknikken velkendte, f.eks. urethan-be-skyttende substituenter, såsom benzyloxycarbonyl (carbo-benzoxy), p-methoxycarbobenzoxy, p-nitrocarbobenzoxy og t-butyloxycarbonyl. Det foretrækkes at anvende t-5 butyloxycarbonyl (BOC) til beskyttelse af ct-aminogrup-pen i de aminosyrer, der undergår reaktion ved carb-oxylenden af aminosyren. BOC-beskyttelsesgrupperne fjernes let efter en sådan koblingsreaktion og før det følgende trin ved den forholdsvis lille påvirkning af * 10 syrerne (dvs. trifluoreddikesyre eller hydrogenchlo-rid i ethylacetat).

OH-gruppen i Thr og Ser kan beskyttes med Bzl-gruppen, og €-aminogruppen i Lys kan beskyttes med INOC-gruppen i 2-chlorbenzyloxycarbonylgruppen (2-C1-CBZ). I til-15 fældet med Lys foretrækkes det, at 6-aminogruppen med 2-Cl-CBZ-gruppen som denne gruppe fjernes samtidig med Bzl-grupperne ved behandling med HF efter ringslutning af det lineære peptid. INOC-grupperne fjernes ikke af HF, men kræver en yderligere behandling 20 med Zn. Ingen af grupperne påvirkes af TFA, der anvendes til fjernelse af BOC-beskyttelsesgrupper. Efter ringslutning af det lineære peptid fjernes beskyttelsesgrupperne, såsom 2-C1-CBZ og Bzl,ved behandling med HF.

25 Efter dannelsen af det lineære peptid på den faste harpiks kan det fjernes fra denne på en række forskellige måder, der er kendte i teknikken. Peptidet kan for eksempel spaltes fra harpiksen med hydrazin, hvorved der direkte dannes peptid-hydrazidet, som kan ring-30 sluttes derefter via azidet til det ønskede cycliske peptid. Hydrazidet overføres til det tilsvarende azid ved påvirkning med et reagens, som giver salpetersyrling in situ. Egnede reagenser til dette formål omfatter et lavere alkylnitrit (f.eks. t-butylnitrit, isoamylnitrit) 35 eller et alkalimetalnitritsalt (f.eks. natriumnitrit,

DK 152505 B

13 kaliumnitrit) i nærværelse af en stærk syre, såsom saltsyre eller phosphorsyre. Denne reaktion udføres i nærværelse af enten vand og/eller et ikke-vandigt opløsningsmiddel, såsom dimethylformamid, tetrahydrofuran, 5 dioxan, chloroform eller methylenchlorid, ved en temperatur på mellem cirka -40°C og 20°C. Alternativt kan peptidet fjernes fra harpiksen ved behandling med en lavere alkohol, såsom methanol, i nærværelse af en organisk base, såsom triethylamin, hvilket således resul-10 terer i dannelsen af den tilsvarende lavere alkoholester af det lineære peptid. Den resulterende ester kan overføres til hydrazidet, som derpå kan ringsluttes, via azidet, til det ønskede cycliske peptid. Den foretrukne metode til spaltning af peptidet fra harpiksen er an-15 vendeisen af hydrazin.

Som det vil fremgå af den efterfølgende tabel II, involverer en foretrukken totalproces til fremstilling af de ønskede cycliske peptider trinvis syntese af det lineære peptid på en harpiks på fast fase. Ved fremstillingen 20 af N-Me-Ala-Phe-D-Trp eller Pro-Phe-D-Trp Phe-Thr---L^s påe-Thr---Lys bindes carboxylenden af den N-blokerede aminosyre phenylalanin covalent til den uopløselige polymere 25 harpiksbærer som carboxylsyreesteren af det harpiks-bundne benzylchlorid. Aminogruppen i Phe er beskyttet med BOC-gruppen. Efter fuldendt tilknytning af Phe til harpiksen fjernes BOC-beskyttelsesgruppen med TFA i CH2C12. De efterfølgende aminosyrer tilknyttes, i 30 form af BOC-aminosyre, idet man anvender DCCI som kondensationsmiddel eller en aktiv ester, såsom ONp. Efter fremstillingen af det ønskede lineære peptid afblokeres N-terminal-aminogruppen selektivt, og peptidet fjernes fra harpiksen ved behandling med hydrazin.

35 Det resulterende lineære peptid-hydrazid, hvor den N-

DK 152505 B

14 terminale aminogruppe er afblokeret, og som har amino-syresekvensen: OBzl i D-Trp-Lys-Thr-Phe-N-Me-Ala-Phe-NHN^

5 2-C1CBZ

eller OBzl D-Trp-Lys-Thr-Phe-Pro-Phe-NHNH2

2-C1CBZ

10 behandles med isoamylnitrit ved surt pH til dannelse af det tilsvarende azid. Azidopløsningen fortyndes med opløsningsmiddel og neutraliseres med en organisk base.

Det lineære peptid ringslutter til dannelse af: OBzl 15 Cyclo-(D-Trp-Lys-Thr-Phe-N-Me-Ala-Phe)

2-C1CBZ

OBzl

Cyclo-(D-Trp-Lys-Thr-Phe-Pro-Phe)

2-C1CBZ

20 Under ringslutningen kontrolleres pH, og surhedsgraden holdes neutral ved tilsætning af organisk base. pH i organisk opløsningsmiddel bestemmes ved påføring af en del af opløsningen på fugtet pH-papir med et snævert måleområde.

25 Efter ringslutning af det lineære peptid fjernes beskyttelsesgrupperne 2-C1-CBZ og OBzl ved behandling med HF i nærværelse af anisol. Det rå cycliske peptid, der opnås, renses ved chromatografi, foretrukkent søjlechro-matografi på silicagel. Elueringsmidlet er almindelig- 30 vis et organisk opløsningsmiddel eller blandinger af sådanne, som vælges ved at analysere portioner af materi-

DK 152505 B

15 alet under anvendelse af tyndtlagschroxnatografi.

TABEL II

Reaktionsskemaet til fremstilling af to af de omhandlede cycliske hexapeptider er skitseret ved hjælp af 5 følgende reaktionsrække:

Reaktionsskema for fremstilling af:

N-Me-Ala-Phe-D-Trp I I

Phe-Thr---Lys

Cl-CH20-harpiks 10 BOC-Phe

V

BOC-Phe-0-CH20-harpiks

Fastfasernetode 1) BOC-N-Me-Ala 2) BOC-Phe 15 3) BOC-(OBZl)Thr 4) BOC-(6-2-C1-CBZ)Lys * 5) BOC-D-Trp BOC-D-Trp(6-2-C1-CBZ)Lys-(OBZl)Thr-Phe-N-Me-Ala-Phe-OCH20-harpiks

20 TFA

V

D-Trp- (É-2-C1-CBZ) Lys- (OBZl)Thr-Phe-N-Me-Ala-Phe-0-CH20-harpiks J, ™2NH2

D-Trp-(e-2-Cl-CBZ)Lys-(OBZl)Thr-Phe-N-Me-Ala-Phe-NHNH2 25 isoamylnitrit, H+, DMF

16

DK 152505 B

TABEL II (forts.) D-Trp-(e-2-Cl-CBZ)Lys-(OBZ1)Thr-Phe-N-Me-Ala-Phe-N3 DMF/triethylamin v

Cyclo(D-Trp-(&-2-C1-CBZ)Lys-(OBZ1)Thr-Phe-N-Me-Ala-Phe) 5 HF/anisol

Cyclo-(D-Trp-Lys-Thr-Phe-N-Me-Ala-Phe)

Reaktionsskema for forfremstilling af:

Pro-Phe-D-Trp I \

Phe-Thr---Lys 10 Cl-CH20-harpiks BOC-Phe i B0C-Phe-0-CH20-harpiks

Fastfasemetode 1) BOC-Pro 15 2) BOC-Phe 3) BOC-(OBZl)Thr 4) BOC-(G—2-C1-CBZ)Lys Ί 5) BOC-D-Trp BOC-D-Trp(6-2-C1-CBZ)Lys-(OBZ1)Thr-Phe-Pro-Phe-OCI^Ø-harpiks

20 TFA

V

D-Trp- (6 -2-C1-CBZ) Lys-) OBZ1) Thr-Phe-Pro-Phe-O-C^Ø-harpiks NH0NH0 i / £ Δ D-Trp-(6-2-C1-CBZ)Lys-(OBZ1)Thr-Phe-Pro-Phe-NHNEL· + z

isoamylnitrit, H , DMF

\i

DK 152505B

17 D-Trp-(6 - 2-C1-CBZ)Lys-(OBZ1)Thr-Phe-Pro-Phe-N3 DMF/triethylamin

V

Cyclo(D-Trp-(6-2-C1-CBZ)Lys-(0BZ1)Thr-Phe-Pro-Phe) HF/anisol Ψ 5 Cyclo-(D-Trp-Lys-Thr-Phe-Pro-Phe)

De efterfølgende eksempler forklarer opfindelsen nærmere.

EKSEMPEL 1 D-Trp-^_-22Cl-CBZ2Lys-_(OBZl)_Thr-Phe-Pro-Phe-OCH20-harpiks

Chlormethylharpiks (2% tørbundet Merrifield resin), 862,0 10 g (2,37 mol) med 2,75 milliækvivalenter chlor pr. gram og 607,0 g (2,37 mol, 1 ækvivalent) BOC-Phe blev sat til 4320 ml peroxidfri tetrahydrofuran. Blandingen blev omrørt i et oliebad ved 80°C i 45 minutter. Triethylamin, 310,0 ml, blev tilsat, og reaktionsblandingen blev om-15 rørt ved 80°C som badtemperatur i 70 timer, afkølet til 25°C og overført til en fastfase-reaktionssøjle med 2000 ml tetrahydrofuran. Efter fjernelse af opløsningsmidlet blev harpiksen vasket under anvendelse af den omrørte søjle med: 20 3 x 2000 ml tetrahydrofuran 3 x 5170 ml ethanol 1 x 5170 ml eddikesyre 3 x 5170 ml vand 3 x 5170 ml ethanol 25 3 x 5170 ml chloroform BOC-Phe-O-Ci^Ø-harpiksen blev tørret i vakuum ved 25°C i 16 timer, hvilket gav 1293 g BOC-Phe-O-CI^Ø-harpiks indeholdende 1,2 mmol phenylalanin g harpiks.

BOC-Phe-0-CH20-harpiks (2,13 g, 2,0 mmol) blev underka-

DK 152505 B

18 kastet procedurerne i tabel III og IV under anvendelse af to afblokeringer (2 minutter og 25 minutter) med 25% TFA i methylenchlorid og 2,5 ækvivalenter BOC-aminosyre i den påkrævede rækkefølge, indtil den ønskede BOC-hexa-5 peptid-O-CI^Ø-harpiks var opnået.

DCCI blev anvendt som det eneste koblingsmiddel i hver reaktion.

Koblingen af hver aminosyre gik let. De bedste udbytter blev opnået, når koblingen blev gentaget i hvert 10 trin. Når koblingen blev gentaget, blev de initiale to chloroform-vaskevæsker, afblokeringstrinnet og de efterfølgende tre gange vask med chloroform alle udeladt og erstattet meden enkelt vask med chloroform.

Koblingsreaktionerne blev udført i methylenchlorid, 15 frisk afgasset DMF eller en blanding af disse to opløsningsmidler. Den N-terminale aminogruppe blev blokeret med en BOC-gruppe i hvert tilfælde. Hydroxylgruppen i Thr blev blokeret med Bzl og £-aminogruppen i Lys med 2-C1-CBZ.

20 Når den ønskede BOC-hexapeptid-O-CI^Ø-harpiks var opnået, blev den N-terminale BOC-gruppe fjernet ved den terminale afblokeringsprocedure, der fremgår af tabel V.

DK 152505 B

19 i—I rH rH rH CNJ^

ΓΟ O CM

8d ^

SIS SS

o H ro U cm _ U H tp Q U g

SK q m H

in u Ηi Æ

* Q

o -Η M

G

(1) •Η · B1 9> cm H S tn <ί Η Η ·Π & i< o Dfl S m m

CM g Λ CM

8 S ii h ly m Sil co co

CM

COH

HU OOI

U cm •sp æ κ H u u

H

J

ω i cm-' m S co—I cn — 5 +> O ·· m o tn

< H oH ^ "sf O

h gm- o m ro H *—> y co o a <| cm in

[il H CM

HU - O _ CM CM N bi

# M ^ O

ιηϋ cm

CM -H

ro !—I >---- U cm o in tti '-r ^

U

jgu

g ® ^ S

y ^ § h · w a) i © g

1*% t I

HH - tn

R (D Η H jp H -H

cn h cd αί > -Q. Η .u t n · _ rt® S58 S 3

O ^ Η Ό > H

DK 152505 B

20

TABEL IV

Beskyttet aminosyre Opløsningsmiddel, ml BOC-N-Me-Ala (1,08 g) 20 ml CH2C12 5 Afkobling BOC-Phe (1,32 g) 20 ml CH2C12

Afkobling BOC (OBzL)Thr (1,55 g) 20 ml CH2Cl2

Afkobling 10 BOC-(e-2-Cl-CBZ)Lys (2,24 g) 20 ml CH2C12

Afkobling

BOC-D-Trp (1,52 g) 15 ml CH2C12, 5 ml DMF

Afkobling

II

15 BOC-Pro (1,80 g) 25 ml CH2C12

Afkobling BOC-Phe (1,32 g) 25 ml CH2C12

Afkobling BOC (OBZ)Thr (1,55 g) 25 ml CH2Cl2 20 Afkobling BOC-(0-2-C1-CBZ)Lys (2,24 g) 25 ml CH2C12

Afkobling

BOC-D-Trp (1,52 g) 20 ml CH2C12, 5 ml DMF

Afkobling

25 TABEL V

Cpløsningsmiddel CHCU (1) 25% TFA i CHCL, MeOH (2) eller reagens CH2C12 + 1% CH2C12 (1) (antal behand- Ethandithiol MeOH (2) linger, herun- (2) (3) CH2C12 (2) 30 der vask)

Vol. i ml 40 40 40 40

Tid i min. 5 2 og 25 2 2

DK 152505B

21

Efter udførelse af de i tabel III, IV og V angivne procedurer tørres den blokerede hexapeptid-OCH^Ø-harpiks natten over og vejer 3,7 g.

EKSEMPEL 2 5 )_L^s-_(OBZl)_Thr-Phe-N-Me-Ala-Phe-NHNH2

Den i eksempel 1 opnåede harpiks kombineres med 30 ml af en 2:1 blanding af dimethylacetamid og hydrazin og omrøres ved stuetemperatur i 1 time. Den uopløselige harpiks fjernes ved filtrering, og opløsningen inddampes til 10 fjernelse af dimethylacetamidet. Harpiksen anbringes under højvakuum natten over til fjernelse af alle flygtige materialer. Der dannes et skum ved opløsning af resten i alkohol, filtrering og inddampning til tørhed, hvilket giver 2,19 g.

15 EKSEMPEL 3

Dl^Eli^-Cl-CBZ.JiLysMOBZlXThr-Phe-N-Me-Ala^Phe-^

Skummet fra eksempel 2 kombineres med 15 ml afgasset di-methylformamid under et tæppe af nitrogen og afkøles til -10°C, hvorpå 5 ækvivalenter 4,52 M hydrogenchlorid i 20 tetrahydrofuran (2,2 ml) tilsættes. Opløsningen afkøles til -25°C, og 5 ml af en 1:19 blanding af isoamylnitrit og dimethylformamid tilsættes portionsvis, indtil der opnås en positiv prøve for stivelse med Kl. Fuldendelse af reaktionen følges ved tyndtlagschromatografi og opbrug 25 af hydrazid-udgangsmaterialet.

EKSEMPEL 4 9Y5l2liDlSiPli^l2lCl-CBZ2LyS“_(OBZl)_Thr-Phe-N-Me-Ala-Phe

Azidforbindelsen fra eksempel 3 sættes til 600 ml afgas-set dimethylformamid, forkølet til -25°C, pH indstilles 30 på 8 med triethylamin, og reaktionsblandingen anbringes i en fryser natten over. pH genindstilles til 8, om nødvendigt, efter cirka 14 timers forløb, og blandingen op-

DK 152505 B

22 bevares i 16 timer ved -20°C og 16 timer ved 5°C. Tyndt-lagschromatografi indikerer, at reaktionen er fuldstændig. Blandingen koncentreres til tørhed, opløses i 150 ml 3:1 dimethylformamid/vand-blanding og behandles med et blan-5 det leje af anion/kation-ionbytterharpiks i 1 time.

Blandingen filtreres og koncentreres til tørhed i vakuum til en olie, og resten tritureres ved methanol, hvilket giver 1,91 g hvidt fast stof.

EKSEMPEL 5 10 Cyclo-^D-Trp-Lys-Thr-Phe-N“Me-Ala-Phe)_ 1,91 g (1,8 mmol) af det beskyttede cycliske hexapeptid fra eksempel 4 kombineres i et teflonforet kammer med 2 ml anisol. Kammeret evakueres derpå og fyldes med flydende hydrogenfluorid ved temperaturen for et bad med 15 tøris og acetone. Temperaturen forøges til 0°C, og der omrøres fortsat i 1 time. Hydrogenfluoridet får lov at afdampe, og resten anbringes i vakuum, indtil der er dannet en opslæmning. Opslæmningen tritureres med ethylace-tat og filtreres, hvilket giver 1,29 g af et fint pulver.

20 Pulveret anbringes på 300 g silicagel og elueres med en 10:5:1:3 blanding af EPAW, idet der elueres med fraktioner på 9 ml. Fraktionerne 55-66 kombineres og koncentreres. Produktet udfældes fra en blanding af chloroform, ethylacetatoghexan, hvilket giver 679 mg.

25 EKSEMPEL 6 2lT£Ellt=2-Cl-CBZXLys-^OBZlXThr-Phe-Pro-Phe-NHNH2

Harpiksen fra eksempel 1 kombineres med 30 ml af en 2:1 blanding af dimethylacetamid og hydrazin, og der omrøres ved stuetemperatur i 1 time. Den uopløselige harpiks 30 fjernes ved filtrering, og opløsningen inddampes til fjernelse af dimethylacetamid. Resten anbringes under højvakuum natten over til fjernelse af alt flygtigt materiale. Ved opløsning af resten i methanol, filtrering og inddampning til tørhed opnås et skum, der vejer 1,84 g.

DK 152505B

23 EKSEMPEL 7

Pz?rEliéz2-Cl;CBZ)_LYS-_(OBZl)_Thr-Phe-Pro-Phe-N2

Skummet fra eksempel 2 kombineres med 15 ml afgasset dimethyl formamid under et tæppe af nitrogen og afkøles til 5 -10°C, og 5 ækvivalenter 5,8 M hydrogenchlorid i tetra- hydrofuran (1,7 ml) tilsættes. Opløsningen afkøles til -25°C, og 5 ml af en 1:19 blanding af isoamylnitrit og dimethylfomamid tilsættes. Fuldendelse af reaktionen følges ved tyndtlagschromatografi og opbruget af hydra-10 zid-udgangsmaterialet.

EKSEMPEL 8 CYclo_(D-Trp-_(^-2-Cl-CBZ^Lys-_(OBZl)_Thr-Phe-Pro-Phe)_

Azidforbindelsen fra eksempel 3 sættes til 600 ml afgasset dimethylfomamid, forkølet til -25°C, pH indstilles 15 til 8, og reaktionsblandingen anbringes i en fryser natten over. pH genindstilles til 8, om nødvendigt, efter cirka 14 timers forløb, og blandingen opbevares i 16 timer ved -20°C og 16 timer ved 5°C. Tyndtlagskromatogra-fi indikerer, at reaktionen er fuldstændig. Blan-20 dingen koncentreres til tørhed, opløses i 150 ml 3:1 dimethylf ormamid/vand-blanding og behandles med en anion/ka-tion-ionbytterharpiks i blandet leje i 2 timer. Blandingen filtreres og koncentreres til tørhed i vakuum, og resten opløses i methanol, filtreres og inddampes til 25 tørhed, hvilket giver et skum.

EKSEMPEL 9 iYEiEriDzilEZi'XSzihr-Phe^Pro^Phel 2,13 g (2 mmol) af det beskyttede cycliske hexapeptid fra eksempel 4 kombineres i et teflonforet kammer med 2 30 ml anisol. Kammeret, evakueres derpå og fyldes med flydende hydrogenfluorid ved den temperatur, der opnås med et bad af tøris og acetone. Temperaturen forøges til 0°C, og der omrøres endnu 1 time. Hydrogenfluoridet får lov at afdampe, og resten anbringes i vakuum, indtil 35 der er dannet en opslæmning. Opslæmningen behandles

DK 152505 B

24 med ethylacetat og filtreres, hvilket giver 1,19 g af et fint pulver. 300 mg af dette pulver anbringes på en 1000 μ silicagelplade til præparativ tyndlagschromatogra-fi og elueres med en 70:30:5 blanding af chloroform, 5 methanol og koncentreret vandig ammoniak, hvilket giver 200 mg produkt. Resten af det rå produkt anbringes på en silicagels.øjle og elueres med samme opløsningsmiddel. Tilstedeværelsen af produktet i eluenten bestemmes ved tyndtlagschromatografisk analyse, og efter fry-10 setørring opnås cirka 500 mg produkt.

De omhandlede cycliske hexapeptider, der er analoge med somatostatin, afprøves og sammenlignes i henseende til virkninger med somatostatin ved et forsøg in vitro for inhibering af vasks thormon. Forsøget beskrives i det 15 følgende:

Rotteslimafsondringer blev isoleret efter den procedure, der er beskrevet af Vale og Grant i "In vitro Pituitary Hormone Secretion Assay for Hypophysiotropic Substances" i Methods in Enzymology, bind XXXVIIt udgivere O'Malley, 20 B.W. og Hardman, J.G. (Academic Press, Inc., New York), side 5-93 (1975).

Efter 4 dages dyrkning blev cellerne vasket og inkuberet i 4 timer i Dulbecco-modificeret Eagle's medium i nærværelse af eller uden tilstedeværelse af graderede doser 25 af hver analog eller af somatostatin. Mediet blev derpå samlet til efterfølgende væksthormonbestemmelse ved et dobbelt antistof-radioimmunoforsøg for rottevæksthormon.

Forsøgsresultaterne for nogle af de omhandlede forbindelser fremgår af det følgende sammen med resultater for 30 somatostatin, der er angivet først og tildelt den arbitrære værdi 1. Resultaterne for de omhandlede forbindelser er givet som multipla eller brøkdele af virknin-

DK 152505B

25 gen af somatostatin. Tallene i parentes er referens-grænserne for det foranstående tal. Den første af de omhandlede forbindelser som anført er den forbindelse, der blev fremstillet i eksemplerne 1-5. Forbindelsen 5 er imidlertid skrevet på en lidt anden måde for lettere at kunne sammenligne med somatostatin i henseende til aminosyrerækkefølgen.

Aktivitet af cycliske hexapeptider, der er analoge med somatostatin 10 VaEksthormonfrigivelse

Forbindelse Inhihering in vitro

Somatostatin 1

Cyclo(N-Me-Ma-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe) 4,38 (2,15 - 11,90)

Cyclo(N-Me-D-Ala-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe) 2,13 (0,83 - 6,00) 15 Cyclo(Pro-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe) 1,71 (1,31 - 2,32)

Cyclo(Pro-Phe-L-Trp-Lys-Thr-Phe) 1,59 (1,33 - 1,92)

Cyclo(Pro-Phe-D-5F-Trp-Lys-Thr-Phe) 2,4 (2,1 - 2,8)

Cyclo(Pro-Phe-L-5F-Trp-Lys-Thr-Phe) 2,5 (1,9 - 3,2)

Cyclo(Pro-Phe-D-Trp-Lys-Ser-Phe) 1,4 (1,1 - 1,7 ) 20 Cyclo(Pro-Phe-D-Trp-Lys-a-ABU-Phe) 0,82 (0,57 - 1,18)

Cycio(Pro-Phe-D-Trp-Lys-Thr-p-Cl-Phe) 0,86 (0,75 - 1,0 )

Cyclo(Pro-p-Cl-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe) 1,14 (0,98 - 1,34)

Cyclo(Pro-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Phe) 14,3 (8,3 - 33,0 )

Virkningerne af de omhandlede cycliske hexapeptider be-25 stemmes ved følgende procedure.

Forbindelserne afprøves for deres evne til at inhibere pentagastrin—fremkaldt mavesyre-sekretion i den kronisk fistuløse hund. Hun-beagle-hunde med kronisk mavefistula blev indgivet pentagastrin (2,5 pg/kg/time, i.v.

30 fra -20 til 120 minutter), og maveudskillelsesprodukter blev samlet via fistula cannula. Prøver blev analyseret med mellemrum på 30 minutter for volumen (ml) og triter-bar syre (mækv./liter) (titrering til pH 7 med 0,01 N NaOH)? total syreudskillelse (mækv.) blev beregnet som produktet 35 af udskillelsesvolumenet og syrekoncentrationen. Prøveforbindelserne blev indgivet ved infusion med en konstant

DK 152505B

26 hastighed i O - 60 minutter. Data er udtrykt som procentvis ændring af totalsyreudskillelse i forhold til placebo-forsøg i samme dyr.

«. f

DK 152505 B

27

O

<N

. H’^’OOOOOOOCNt''

ij! β ri I H V£>r)H(N

ri o O O

Η -Η -η σι ri -ri +J „ tn φ fo o Η ri |u|OI ΗΓ'31'ί'ί^Ν ^ -Plvo^r in οι n in ød) ri o di to t n (D x>

gi ri O

g Q) -rH ΰ o 3 > MO'xit^H'^r^cNncn w φ ¢) Mi h^n'iiBin'i g Λ (Do ,π -H ri m H »ri X! >1

4J Q| C tn] O

•Η ΟΊ V£> LQ CN CO <N O O

_p - itHHHHinnro

tø ri o\o O

ri -H

øl -p —· r· n-i td ri o -p ri o <n tø -μ -H Hr^'^OWJ'^LD'^ β Og -P i ro oo co ^ m in -H -P <D o 4J (ti o ri σι

(ti g VD X

P O I (DO

tø ω o mriorHooLninHi·" 0 <D (Dl ω οι σι oo in co P Ό ri ri g o (ti (DO. >i ri vo g g -H tø Ή 0 tø <D 0 o Μ (Dri > >io hN^ooco^r· (ti i cn o oo σ> co σι co ri O ri go O H -H o 4-t (ti ri i o S. (3 rOLDt-tOCOOOOr·'· (1) ^ I (O dl Kl CO (O h li -P ri · o (ti (D ri

P -H

H rig ri (D \ ~ tø Ό H 2 d) g tøm^

μ v \ (D Pri (U (D

ri iji Λ i Λ X!

jj (D ri- (ii ri CU CU

(ϋ ’ϋ I -ri I I

> -h oo riE-i'-r-fri'-'

-H -p * X! I <U U Χί (U

(ri QjO EHW-rilE^Xl β (D I >i CM Ot I (¾

(ti O) tø tø iri I I W I

td -h triiriri>.ri

Li tø h-1 Q-ι r^3 Æ M Æ (D (DO I ri Β Β I Eh

rj p ft f( I I P< I

(tf ^ ri i m w ri cn

0) B Q >1 >i Eh N

(tf I I iri Μ I iri

rrt tø Q (ϋ I I P I

H i XJ ft ft I ft O H (D ft ri ri i) ri

ro O X! I En Β Λ B

c; >, PM (ti I i Cri I

3 O I H Q Q I Q

(ti (ti <1 I I 1—I I

i m h i φ 0) U ri

(ti ril-iQXrrrili^T

u_i (D τ| I I ft ft ft B

L, β tø -P <D (D 1 I I I

φ 0) H (tiggOOOO

+j (ri <D -P i i ri ri ri ri Ιμ β Ό tø g g ril 1¾ rit 1¾

ω β ·Η -P 0 O O O O O

Λ\ JJ rH rH i—I rH i—li—1 rS u u goooooo •H O O !>i !>i h > fø cnuuoouu

DK 152505B

28

Den biologiske aktivitet for et fra dansk patentansøgning nr. 4284/78 kendt cyclisk decapeptid blev sammenlignet med det dermed nærmest beslægtede decapeptid fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen. Data er angivet i forhold til somatostatin, der er givet værdien 1.

Cyclo (Pro-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe)

Inhibering af insulin 5,2

Inhibering af glucagon 8,0

Inhibering af væksthormoner 1,71

Cyclo (Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe)

Inhibering af insulin 0,32

Inhibering af glucagon inaktiv

Inhibering af væksthormoner 0,27

Den kendte forbindelse ses således at have meget ringere aktivitet end den ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede forbindelse.

Claims

1. Analogifremgangsmåde til fremstilling af et somato- statin-analogt cyclisk hexapeptid med formlen R5 o ^ H -.VAV N H O q-J n B Λ n~ O i 2J-H H é O hvor 1 2 R og R uafhængigt af hinanden betegner alkyl med 2-5 5 carbonatomer bortset fra sec.butyl, benzyl, sub stitueret benzyl, hvori substituenten kan være en eller to af grupperne alkyl med 1-5 carbonatomer, halogen, hydroxy, amino, nitro eller alkoxy med 1-5 carbonatomer, eller betegner alkyl med 1-5 carbonatom-10 er substitueret med en 5- eller 6-leddet heterocyclisk ring med 1 eller 2 heteroatomer valgt blandt oxygen, nitrogen og svovl, O R er 3-indolylmethyl eller 3-indolylmethyl substitueret én gang med alkyl med 1-5 carbonatomer, alkoxy med 15 2-5 carbonatomer eller halogen, R^ er alkyl med 1-5 carbonatomer, hydroxyalkyl med 1-5 carbonatomer, benzyl, carboxyalkyl med en alkyl-gruppe med 1-5 carbonatomer, aminoalkyl med 1-5 carbonatomer eller én gang substitueret benzyl, 20 hvori substituenten kan være alkyl med 1-5 carbon atomer, alkoxy med 1-5 carbonatomer, hydroxy, halogen, amino eller nitro, DK 152505B R5 er alkyl med 1-5 carbonatomer, benzyl eller én gang substitueret benzyl, hvor substituenten er alkyl med 1-5 carbonatomer, alkoxy med 1-5 carbonatomer, hydroxy, halogen, amino eller nitro, g 5. er methyl, eller C g R og R sammen danner gruppen -CH2-X-CH2-, hvor X er (CHn) , hvor n er 0, 1 eller 2, eller svovl, 2 n Y er (CH2)m, hvor m er 0 eller 2, eller svovl, hvor de indgående aminosyrer kan have D- eller L-konfigu-10 ration, kendetegnet ved, at man (a) fremstiller et til formel I svarende beskyttet lineært peptid knyttet til en harpiks på fast fase, (b) selektivt afblokerer den N-terminale aminogruppe, (c) fjerner det lineære peptid fra harpiksen, 15 (d) behandler det lineære peptid med et ringslutnings middel, og (e) fjerner eventuelle sidekædebeskyttelsesgrupper.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at trin (c) omfatter behandling af den lineære pep- 20 tidharpiks med hydrazin til dannelse af hydrazidet.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at ringslutningstrinnet omfatter behandling af hydrazidet med et middel, der in situ danner salpetersyrling, til fremstilling af azidet, som ringsluttes i nær- DK 152505B værelse af en tertiær amin.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at azidet dannes ved behandling af hydrazidet med et alkylnitrit med 1-5 carbonatomer eller et alkalimetal-5 nitrit i nærværelse af en stærk syre.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at azidet dannes ved behandling af hydrazidet med isoamylnitrit i nærværelse af saltsyre.