FI74711B - Foerfarande foer framstaellning av terapeutiskt anvaendbara cykliska hexapeptidfoereningar. - Google Patents

Description

1 74711

Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten syklisten heksapeptidiyhdisteiden valmistamiseksi Förfarande för framställning av terapeutiskt användbara cykliska hexapeptidföreningar 5

Somatostatiini on tetradekapeptidi, jonka muodostaa syklinen dodekapeptidi, jonka rakenne on: I - |

Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 ja jonka ominaisuuksia ovat kyky ehkäistä kasvuhormonin vapautumista, kyky ehkäistä insuliinin ja glukagonin vapautumista, ja kyky vähentää mahahapon erityksiä. Soma-15 tostatiinin vaikutusaika on lyhyt, koska sitä inaktivoi-vat mm. in vivo läsnäolevat aminopeptidaasit ja karboksi-peptidaasit. Lyhyen vaikutusajan tuoma ongelma on aikaisemmin ratkaistu osittain valmistamalla somatostatiinin johdannaisia, joiden liukoisuus on vähäinen mahdollis-20 taen täten hitaan vapautumisen ihonalaisena ruiskeena annettuna. Kerran liuottuaan johdannaiset eivät kuitenkaan ole enää sen kestävämpiä aminopeptidaasien ja karb-oksipeptidaasien inaktivoivaa vaikutusta vastaan kuin so-matostatiinikaan.

25 Esillä oleva keksintö koskee syklisten heksapep- tidien valmistamista, jotka ovat somatostatiinin johdannaisia, joissa mm. 7 renkaan aminohapoista on korvattu sekundäärisellä aminohapolla, ja molemmat renkaan ulkopuoliset aminohapot on poistettu. Keksintö koskee myös 30 jäljellä olevien aminohappojen lisäsubstituointia ja reaktioita. Nämä sykliset heksapeptidit ehkäisevät glukagonin, kasvuhormonien ja insuliinin vapautumista ja ehkäisevät mahahapon erittymistä.

Yhdisteet voivat ensisijaisesti ehkäistä spesi-35 fisesti kasvuhormonien vapautumista vaikuttamatta maha-happoeritysten tasoon tai insuliinin ja glukagonin tasoon, tai yhdisteet voivat ehkäistä mahahappoeritysten vapautumista. Täten yhdisteillä on selektiivisempi biolo- 2 74711 ginen vaikutus kuin somatostatiinilla. Tämän keksinnön mukaisesti valmistettujen yhdisteiden syklisen heksapep-tidirakenteen vaikutuksen kesto on pitempi kuin somatostatiinilla. Sen vuoksi nämä sykliset heksapeptidit ovat 5 käyttökelpoisia hoidettaessa jättikärkisyyttä, sokeri tautia, sokeritautiperäistä verkkokalvosairautta ja itse-sulatushaavaumia.

Keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetaan yhdisteitä, joilla on kaava 10

O R H

Vk-V^·· 15 CH3^/ I I / J H /

0=4 I

0 H N-H

hr,0 4 tai 25

0 R H

-e/' YY’ 30 0=/ 35 1 H R 0 4 7471 1 joissa X on (CH2^n' 1ossa n on 0» 1 tai 2, Y on (CI^) , jossa m on 0, 1 tai 2, tai rikki, siten että rikki voi olla missä tahansa ketjun kohdassa, 5 ja R2 ovat toisistaan riippumatta bentsyyli tai subs- tituoitu bentsyyli, jossa substituenttina voi olla 1 tai 2 halogeenia tai hydroksiryhmää, R^ on 3-indolyylimetyyli tai substituoitu 3-indolyylimetyy-li, jossa substituenttina voi olla pienalkoksi tai halo-10 geeni, R4 on pienalkyyli tai hydroksipienalkyyli, ja R^ on pienalkyyli tai bentsyyli.

Tässä käytettynä termi "pienalkyyli" edustaa sellaisia joko suora- tai sivuketjuisia alkyyliryhmiä, 15 joissa on 1 - 5 hiiliatomia. Esimerkkejä sellaisista al- kyyliryhmistä ovat metyyli, etyyli, propyyli, iso-propyy-li, butyyli, sek-butyyli, pentyyli ja näiden kaltaiset.

Termin "pienalkoksi " piiriin sisällytetään sellaiset joko suora- tai sivuketjuiset alkoksiryhmät, jois-20 sa on 1 - 5 hiiliatomia. Esimerkkejä sellaisista alkoksi-ryhmistä ovat metoksi, etoksi, propoksi, isopropoksi, butoksi, tert.-butoksi, pentoksi ja näiden kaltaiset.

Termi "halogeeni" käsittää fluorin, kloorin, bromin ja jodin.

25 Tämän keksinnön mukaisesti valmistetuissa yhdis teissä on useita asymmetriakeskuksia, mistä johtuen yhdisteet voivat esiintyä optisina isomeereinä. Tämän keksinnön piiriin on tarkoitus sisällyttää erilaisten aminohappojen, jotka muodostavat tämän keksinnön mukaisia 30 syklisiä heksapeptidejä, jokaista asymmetriakeskusta vas taavat sekä D- että L-konfiguraatiot.

Alan asiantuntijoille on täysin selvää, että kun R^ ja R2 ovat bentsyylejä, R3 on indolimetyyli, Y on me-tyleeni, ja R^ on 1-hydroksietyyli, edustettuina ovat so-35 matostatiinin 7, 8, 9, 10 ja 11-aminohapot (-Phe-Trp-Lys-

Thr-Phe-), ja sekundäärinen aminohappo, jota edustaa N-metyyli-alaniini, kun R5 on metyyli rakennekaavassa I, ja proliini, kun X on metyleeni rakennekaavassa II, on otta- 4 74711 nut paikan jäljellä olevilta somatostatiinin aminohapoilta. Täten edellä olevia substituenttiryhmien määritelmiä käyttäen muodostuu seuraavaa somatostatiinin vastaavaa syklistä heksapeptidi-analogia, jonka rakennekaava I on 5 N-Me-Ala-Phe-Trp

I I

Phe-Thr-Lys 10 Edullisia tämän keksinnön mukaisesti valmistetta via syklisiä heksapeptidejä ovat kaavan I mukaiset yhdisteet, joissa Y on metyleeni.

Rl ja R2 ovat edellä määriteltyjä, 15 Rj on 3-indolyylimetyyli tai substituoitu indolyylimetyy-li, jossa substituenttina on metoksi tai fluori, R^ on metyyli, etyyli, hydroksimetyyli tai hydroksietyyli, ja R^ on metyyli.

20 Muita edullisia keksinnön mukaisesti valmistetta via yhdisteitä ovat kaavan I mukaiset yhdisteet, joissa Y on metyleeni, R^ ja R2 ovat edellä määriteltyjä, R^ on 3-indolyylimetyyli, 25 R^ on hydroksietyyli, ja

Rt- on metyyli.

Näiden edullisten yhdisteiden piiriin sisältyvät seuraavat yhdisteet:

Syklo-(N-Me-Ala-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Phe) 30 Syklo-(N-Me-Ala-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe)

Syklo-(N-Me-Ala-Phe-L-Trp-Lys-Thr-Phe)

Syklo-(N-Me-Ala-Phe-D-Trp-Lys-Thr-p-Cl-Phe)

Syklo-(N-Me-Ala-Phe-D-5-F-Trp-Lys-Thr-Phe)

Syklo-(N-Me-Ala-Phe-L-5-F-Trp-Lys-Thr-Phe) 35 Syklo-(N-Me-Ala-Phe-D-Trp-Lys-Ser-Phe) 5 74711 Käyttäen edellä olevia substituenttiryhmien määritelmiä muodostuu somatostatiinin vastaavaa syklistä hek-sapeptidianalogia, jonka rakennekaava II on 5 Pro-Phe-Trp

I I

Phe-Thr-Lys

Edelleen tämän keksinnön mukaisesti valmistettavia 10 edullisia syklisiä heksapeptidejä ovat kaavan II mukaiset yhdisteet, joissa X ja Y ovat kumpikin metyleeni,

Rj ja R2 ovat edellä määriteltyjä, on 3-indolyylimetyyli tai substituoitu indolyylimetyy-15 li, jossa substituenttina on metoksi tai fluori, ja R4 on metyyli, etyyli, hydroksiinetyyli tai hydroksietyyli.

Edullisia ovat edelleen kaavan II mukaiset yhdisteet, joissa X ja Y ovat metyleenejä, 20 R^ ja R2 ovat edellä määriteltyjä, R3 on 3-indolyylimetyyli, ja R4 on hydroksietyyli.

Näiden ensisijaisten yhdisteiden piiriin sisältyvät seuraavat yhdisteet: 25 Syklo-(Pro-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Phe)

Syklo-(Pro-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe)

Syklo-(Pro-Phe-L-Trp-Lys-Thr-Phe)

Syklo-(Pro-Phe-D-Trp-Lys-Thr-p-Cl-Phe)

Syklo-(Pro-Phe-D-5-F-Trp-Lys-Thr-Phe) 30 Syklo-(Pro-Phe-L-5-F-Trp-Lys-Thr-Phe)

Syklo-(Pro-Phe-D-trp-Lys-Ser-Phe)

Aminohappokomponenteista, eräistä ensisijaisista suojaryhmistä, reagensseista ja liuottimista käytetään tässä hakemustekstissä tiettyjä lyhenteitä. Näiden ly- 35 henteiden merkitykset on esitetty taulukossa I.

7471 1

Taulukko I

Lyhenne Aminohappo Lya L-lysiini

Phe L-fenyylialaniini

Trp L-tryptofaani D-Trp D-tryptofaani

Thr L-treoniini

Aha 7-aminoenantyylihappo

Tyr L-tyrosiini

Vai L-valiini

Abu L- Ct-aminovoihappo

Ser L-seriini

Asn L-asparagiini

Pro L-proliini

Asu D- tai L-aminokorkkihappo

Cys L-systeiini

Suojaryhmät INOC isonikotinyylioksikarbonyyli BOC tert.-butyylioksikarbonyyli OMe metyyliesteri

Bu tert.-butyyli CBZ bentsyylioksikarbonyyli

Bzl bentsyyli 2-C1-C8Z 2-klooribentsyylioksikarbonyyli

Acm asetamidometyyli

Me metyyli

Aktivoivat ryhmät ONp p-nitrofenyyliesteri HSE N-hydroksisukkiini-imidiesteri HBT 1-hydroksibentsotriatsoli

Kondensointiaineet DCCI disykloheksyylikarbodi-imidi

Reaqenssit TFA trifluorietikkahappo TEA trietyyliamiini DIPEA di-isopropyylietyyliamiini

Liuottimet EPAH etyyliasetaatti-pyridiini-etikkahappo-vesi BAW butanoli-etikkahappo-vesi CMW kloroformi-metanoli-vesi DMF dimetyyliformamidi THF tetrahydrofuraani 7 74711 Tämän keksinnön mukaisesti valmistetaan somato-statiinin uusia syklisiä heksapeptidianalogeja syklisoi-malla vastaavia lineaarisia peptidejä. Lineaarisia peptidejä valmistetaan käyttämällä sarjana tapahtuvaa syn-5 teesitekniikkaa. Siten tämän keksinnön mukaisesti kaa van I tai kaavan II mukaisia somatostatiinin syklisiä heksapeptidianalogeja valmistetaan siten, että a) valmistetaan vastaavasti suojattu lineaarinen peptidi liitettynä kiinteäfaasiseen hartsiin, 10 b) lohkaistaan selektiivisesti N-pääteaminoryhmän suoja- ryhmä, c) irrotetaan lineaarinen peptidi hartsista, d) käsitellään lineaarista peptidiä syklisointiaineella halutun syklisen heksapeptidin amidisidoksen muodostami- 15 seksi, ja e) poistetaan sivuketjujen suojaryhmät.

Kun hartsilla valmistetaan lineaarista peptidiä, ei yleensä ole ratkaisevaa merkitystä sillä, mikä aminohappo valitaan C-pääteasemaan, edellytetään vain, että 20 lineaarisen peptidin aminohappojen järjestys vastaa ha lutussa somatostatiini-analogissa olevaa järjestystä.

Sen jälkeen, kun lineaarinen peptidi on syklisoitu, ei enää voida määrittää mikä aminohappo oli lineaarisen peptidin C-päätteessä.

25 Vaikkakaan ketjun ensimmäisen lähtö-aminohapon valinnalla ei yleensä ole ratkaisevaa merkitystä, koska lineaarinen peptidi syklisoidaan, voi olla muita tekijöitä, jotka asettavat jonkin lähtö-aminohapon etusijalle toiseen nähden. Esimerkiksi D-Trp voi reagoida tert.-30 butyylikarboniumionien kanssa, joita muodostuu poistetta essa BOC-ryhmät. Täten valittaessa reaktiosarja siten, että D-Trp sijoittuu lineaarisen peptidin N-pääteosaan, D-Trp on lisättävä viimeiseksi, jolloin se joutuu vähiten alttiiksi tert.-butyylikarboniumionien vaikutukselle.

35 Tämän tyyppinen valinta ei aina ole mahdollista, kuten tapauksessa, jolloin peptidissä on 2 indolin sisältävää osaa. Sellainen reaktioalttius on kuitenkin huomioitava peptidi-reaktiosarjaa suunniteltaessa.

8 74711

Lineaaristen peptidien syntetisointi kiinteäfaa-si-tekniikalla suoritetaan vaiheittain kloorimetyloidul-la hartsilla. Hartsi koostuu hienojakoisista (20 -70 jumin läpimittaisista) synteettisistä hartsihelmistä, 5 jotka on valmistettu sekapolymeroimalla styreeni ja 1 - 2 % divinyylibentseeniä. Hartsin bentseenirenkaat kloorimetyloidaan Friedel-Crafts-reaktion avulla käyttämällä kloorimetyyli-metyylieetteriä ja stannikloridia. Friedel-Crafts-reaktiota jatketaan kunnes hartsi sisäl-10 tää 0,5 - 5 mmol klooria grammaa kohden hartsia.

Aminohappo, joka on valittu lineaarisen peptidin C-pääteaminohapoksi, muutetaan johdannaisekseen, jonka aminoryhmä on suojattu. Valitun C-pääteaminohapon karbok-syyliryhmä liitetään kovalenttisesti liukenemattomaan 15 polymeerihartsikantajaan, esimerkiksi samalla tavalla kuin kloorimetyyli-substituoidussa polystyreeni-divinyy-libentseeni-hartsissa oleva hartsiin sidotun bentsyyli-kloridin karboksyyliesteri. Aminosuojaryhmän poistamisen jälkeen lisätään sarjassa seuraavana olevan aminohapon 20 aminoryhmästään suojattu johdannainen kytkentäaineen, kuten disykloheksyylikarbodi-imidin kanssa. Aminohapporea-genssia voidaan käyttää karboksyyliaktivoidun aminohapon muodossa, kuten ONp-esterinä, aminohappoatsidina, ja näiden kaltaisessa muodossa. Suojauksen poistamista ja pe-25 rättäisten aminohappojen lisäämistä suoritetaan, kunnes haluttu lineaarinen peptidi on muodostunut.

Suojaryhmien valinnan määräävät osittain erityiset kytkentäolosuhteet, osittain reaktioon osallistuvat aminohappo- ja peptidikomponentit.

30 Tavallisesti käytettäviä aminon suojaryhmiä ovat alalla hyvin tunnetut suojaryhmät, esimerkiksi uretaani-suojasubstituentit, kuten bentsyylioksikarbonyyli (kar-bobentoksi), p-metoksikarbobentoksi, p-nitrokarbobentok-si, tetr.-butyylioksikarbonyyli ja näiden kaltaiset.

35 CK-aminoryhmän suojaamiseksi aminohapoissa, jois sa mainitun aminohapon pääte-karboksyyli osallistuu reaktioon, suositellaan käytettäväksi tert.-butyylioksikar-bonyyliä (BOC). BOC-suojaryhmä on helposti poistettavissa 7471 1 sellaisen kytkentäreaktion jälkeen ja ennen seuraavaa vaihetta käsittelemällä suhteellisen miedoilla hapoilla (so. trifluorietikkahapolla tai kloorivedyllä etyyliasetaatissa) .

5 Thr:n ja Ser:n OH-ryhmä voidaan suojata Bzl-ryh- mällä ja Lys:n £-aminoryhmä voidaan suojata INOC-ryh-mällä tai 2-klooribentsyylioksikarbonyyli-(2-C1-CBZ)-ryhmällä. Kun kyseessä on Lys, £-aminoryhmä suojataan lähinnä 2-Cl-CBZ-ryhmällä, koska tämä ryhmä poistuu salo man aikaisesti Bzl-ryhmien kanssa suoritettaessa käsittely HF:n kanssa lineaarisen peptidin syklisoinnin jälkeen. INOC-ryhmä ei lohkea HF:n vaikutuksesta ja vaatii lisä-käsittelyn Zn:llä. TFA, jota käytetään BOC-suojaryhmien poistoon, ei vaikuta kumpaankaan ryhmään. Lineaarisen 15 peptidin syklisoinnin jälkeen suojaryhmät, kuten 2-C1-CBZ ja Bzl, poistetaan käsittelemällä HF:n kanssa.

Sen jälkeen, kun lineaarinen peptidi on muodostunut kiinteäfaasisella hartsilla, se voidaan irrottaa hartsista erilaisin menetelmin, jotka ovat alalla hyvin 20 tunnettuja. Esimerkiksi peptidi voidaan irrottaa hartsista hydratsiinilla ja näin muodostuu suoraan peptidihydr-atsidia, joka voidaan sen jälkeen syklisoida atsidin kautta halutuksi sykliseksi peptidiksi. Hydratsidi muutetaan vastaavaksi atsidiksi antamalla sen reagoida reagens-25 sin kanssa, joka muodostaa typpihapoketta in situ. Sopivia reagensseja tähän tarkoitukseen ovat pienalkyylinit-riitti (esim. tert.-butyylinitriitti ja isoamyylinitriit-ti) tai alkalimetallinitriittisuola (esim. natriumnitriit-ti ja kaliumnitriitti) vahvan hapon, kuten kloorivetyha-30 pon, fosforihapon jne. läsnäollessa. Tämä reaktio suoritetaan joko veden ja/tai vedettömän liuottimen, kuten di-metyyliformamidin, tetrahydrofuraanin, dioksaanin, kloroformin, metyleenikloridin jne. läsnäollessa lämpötilassa noin -40 - +20°C. Vaihtoehtoisesti peptidi voidaan irrot-35 taa hartsista käsittelemällä pienimolekyylisen alkoholin, kuten metanolin kanssa orgaanisen emäksen, kuten trietyy-liamiinin läsnäollessa, jolloin näin saadaan muodostumaan vastaavaa lineaarisen peptidin ja pienimolekyylisen alko- 7471 1 10 holin esteriä. Saatu esteri voidaan muuttaa hydratsidik-si, joka voidaan sitten syklisoida atsidin kautta halutuksi sykliseksi peptidiksi. Ensisijaisena menetelmänä peptidin irrottamiseksi hartsista tämän keksinnön yhtey-5 dessä on hydratsiinin käyttö.

Kuten taulukko II esittää, yksi edullinen tämän keksinnön mukainen kokonaissynteesi haluttujen syklisten peptidien valmistamiseksi käsittää lineaarisen peptidin asteittaisen synteesin kiinteäfaasisella hartsilla. Täs-10 mällisemmin sanoen menetelmässä, jolla valmistetaan yhdistettä N-Me-Ala-Phe-D-Trp Pro-Phe-D-Trp \ | tai I |

Phe-Thr Lys Phe-Thr-Lys 15 N-suojatun aminohapon fenyylialaniinin karboksyylipää liitetään kovalenttisesti liukenemattomaan polymeerihart-sikantajaan, kuten hartsiin sidotun bentsyylikloridin 20 karboksyylihappoesteri. Phe:n aminoryhmä suojataan BOC- ryhmällä. Kun Phe:n liittäminen hartsiin on saatu päätökseen, suojaava ryhmä BOC poistetaan käsittelemällä TFA: 11a C^C^xssa. Seuraavat aminohapot liitetään, BOC-aminohapon muodossa, käyttämällä kondensointiaineena 25 DCCI:tä tai aktiivista esteriä, kuten ONprtä. Sen jälkeen kun haluttu lineaarinen peptidi on valmistettu, lohkaistaan N-pääteaminon suojaryhmä selektiivisesti ja peptidi irrotetaan hartsista käsittelemällä hydratsiinin kanssa. Saatua lineaarista peptidihydratsidia, jonka N-pääteamino-30 ryhmästä on lohkaistu suojaryhmä ja jossa aminohappojärjestys on seuraava: OBzl D-Trp-Lys-Thr-Phe-N-Me-Ala-Phe-NHNI^

2-C1CBZ

35 tai OBzl l D-Trp-Lys-Thr-Phe-Pro-Phe-NHNH»

2-C1CBZ

n 74711 käsitellään isoamyylinitriitin kanssa pH:n ollessa hap-pamella puolella, vastaavan atsidin muodostamiseksi. At-sidi-liuos laimennetaan liuottimena ja neutraloidaan orgaanisella emäksellä. Lineaarinen peptidi syklisoituu, 5 jolloin muodostuu yhdistettä: OBzl syklo-(C-Trp-Lys-Thr-Phe-N-Me-Ala-Phe)

2-C1CBZ

10 tai OBzl syklo-(D-Trp-Lys-Thr-Phe-Pro-Phe)

15 I

2-C1CBZ

pH:ta tarkkaillaan syklisoinnin aikana ja se pidetään neutraalina lisäämällä orgaanista emästä. Orgaanisen 20 liuottimen pH määritetään panemalla liuosnäyte kostutetulle kapea-alueiselle pH-paperille.

Sen jälkeen kun lineaarinen peptidi on syklisoi-tu, suojaryhmät 2-C1CBZ ja OBzl poistetaan käsittelemällä HF:n kanssa anisolin läsnäollessa. Saatu raaka syklinen 25 peptidi puhdistetaan kromatografisesti, edullisesti pyl-väskromatografialla silikageelillä. Eluointiliuotin on tavallisesti orgaaninen liuotin tai orgaanisten liuosten seos, joka valitaan analysoimalla materiaalista ohutker-roskromatografiällä.

Taulukko II

12 7471 1

Reaktiokaavio kahden keksinnön mukaisesti valmistettavan syklisen heksapeptidin valmistamiseksi 1. Reaktiokaavio, jota noudattaen valmistetaan yhdistettä N-Me-Ala-Phe-D-Trp I f

Phe-Thr — Ly s

Cl-CH20-hartsi J BOC-Phe BOC-Phe-O-CH20-hartsi

Kiinteäfaasi-menetelmä 1) BOC-N-Me-Ala 2) BOC-Phe 3) BOC-(OBzl)Thr 4) BOC-(fc-2-Cl-CBZ)Lys v 5) BOC-D-Trp BOC-D-Trp(S-2-C1-CBZ)Lys-(OBzl)Thr-Phe-N-Me-Ala-Phe-OCH20-hartsi .

TFA

Ψ D-Trp-(fc-2-Cl-CBZ)Lys-(OBzl)Thr-Phe-N-Me-Ala-Phe-O-CH20-hartsi nh2nh2

V

D-Trp-(ζ-2-Cl-CBZ)Lys-(OBzl)Thr-Phe-N-Me-Ala-Phe-NHNH2 isoamyylinitriitti, H+, DMF v D-Trp-(£-2-Cl-CBZ)Lys-(OBzl)Thr-Phe-N-Me-Ala-Phe-N3 DMF/trietyyliamiini

V

syklo-/D-Trp-(6-2-C1-CBZ)Lys-(OBzl)Thr-Phe-N-Me-Ala-Phe/ HF/anisoli ' f syklo-(D-Trp-Lys-Thr-Phe-N-Me-Ala-Phe). (jatkuu) 7471 1 13

Taulukko II (jatkuu) 2. Reaktiokaavio, jota noudattaen valmistetaan yhdistettä

Pro-Phe-D-Trp

I I

Phe-Trh-Ly s

Cl-CH20-hartsi BOC-Phe v BOC-Phe-O-CH20-hartsi

Kiinteäfaasi-menetelmä 1) BOC-Pro 2) BOC-Phe 3) BOC-(OBzl)Thr 4) BOC-(£-2-Cl-CBZ)Lys 5) BOC-D-Trp v BOC-D-Trp(S.-2-C1-CBZ) Lys-(OBzl)Thr-Phe-Pro-Phe-OCH20-hartsi

TFA

v D-Trp-(g-2-cl-CBZ)Lys-(OBzl)Thr-Phe-Pro-Phe-O-CH20-hartsi nh2nh2 v D-Trp-(t-2-Cl-CBZ)Lys-(OBzl)Thr-Phe-Pro-Phe-NHNH2 isoamyylinitriitti, H+, DMF v/ D-Trp-(£-2-Dl-CBZ)Lys-(OBzl)Thr-Phe-Pro-Phe-N^ DMF/trietyyliamiini

V

syklo-^D-Trp-(£-2-Cl-CBZ)Lys-(OBzl)Thr-Phe-Pro-Ph§7 HF/anisoli v syklo-(D-Trp-Lys-Thr-Phe-Pro-Phe) 7471 1 14 Näitä somatostatiinin syklisiä heksaheptidi-ana-logeja on koestettu ja niiden vaikutuksia on verrattu in vitro-kokeessa somatostatiinin kykyyn ehkäistä kasvuhormonia. Koetta selostetaan seuraavasti: 5 Rotan aivolisäkkeitä eristettiin menetelmin, joi ta ovat kuvanneet Vale ja Grant artikkelissa "In vitro Pituitary Hormone Secretion Assay for Hypophysiotropic Substances", teoksessa Methods in Enzymology, vol.

XXXVII, toim. B. W, O'Malley ja J. G. Hardman (Academic 10 Press, Inc., New York) (1975), ss. 5 - 93.

4 vuorokauden viljelyn jälkeen solut pestiin ja niitä idätettiin 4 tuntia Dulbecco-modifioidussa Eagle'n elatusaineessa siten, että läsnä oli, tai ei ollut, kalibroituja annoksia kutakin analogia tai somatostatiinia. 15 Elatusaine koottiin sitten talteen seuraavaa kasvuhormoni-määritystä varten menetelmällä "double antibody radioimmunoassay for rat growth hormone".

Koetulokset eräiden tämän keksinnön mukaisesti valmistettujen yhdisteiden osalta on luetteloitu seuraavas-20 sa; tällöin somatostatiinilla saadut tulokset ovat luettelossa ensimmäisenä ja niille on annettu mielivaltainen arvo 1. Tulokset tämän keksinnön mukaisesti valmistetuille yhdisteille on esitetty somatostatiinin vaikutuksen kerrannaisina tai murto-osina. Sulkeissa olevat luvut 25 ovat edeltävän luvun perus-raja-arvoja. Luettelossa en simmäisenä oleva keksinnön mukaisesti valmistettu yhdiste on esimerkissä 1 valmistettu yhdiste. Se on kuitenkin esitetty hieman eri tavalla kirjoitettuna, jotta se olisi yhdenmukainen somatostatiinissa todetun aminohappo-30 järjestyksen kanssa.

15 7471 1

Somatostatiinin syklisten heksapeptidi-analogien vaikutus:

Kasvuhormonin vapautu- 5 Yhdiste misen estyminen in vitro

Somatostatiini 1

Syklo(N-Me-Ala-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe) 4,38 (2,15 - 11,90)

Syklo(N-Me-D-Ala-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe) 2,13 (0,83 - 6,00) 10 Syklo(Pro-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe) 1,71 (1,31 - 2,32)

Syklo (Pro-Phe-L-Trp-Lys-Thr-Phe) 1,59 (1,33 - 1,92)

Syklo(Pro-Phe-D-5F-Trp-Lys-Thr-Phe) 2,4 (2,1 - 2,8)

Syklo(Pro-Phe-Ii-5F-Trp-Lys-Thr-Phe) 2,5 (1,9 - 3,2)

Syklo (Pro-Phe-L-5-OCH3-Trp-Lys-Thr-Phe) 0,17 (0,12 - 0,25) 15 Syklo(Pro-Phe-D-Trp-Orn-Thr-Phe) 0,16 (0,15 - 0,17)

Syklo(Pro-Phe-D-Trp-Lys-Ser-Phe) 1,4 (1,1 - 1,7)

Syklo(Pro-Phe-D-Trp-Lys-a-ABU-Phe) 0,82 (0,57 - 1,18)

Syklo(Pro-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Leu) 0,16 (0,07 - 0,33)

Syklo(Pro-Phe-D-Trp-Lys-Thr-p-Cl-Phe) 0,86 (0,75 - 1,0) 20 Syklo(Pro-p-Cl-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe) 1,14 (0,98-1,34)

Syklo(Pro-Leu-D-Trp-Lys-Thr-Phe) 0,29 (0,13 - 0,57)

Syklo(Pro-Ala-D-Trp-Lys-Thr-Phe) 0,19 (0,1 - 0,38)

Syklo(Pro-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Phe) 14,3 (8,3 - 33,0) 25 Tämän keksinnön mukaisesti valmistettujen somato statiinin sykloheksapeptidi-analogien vaikutukset on määritetty seuraavalla menetelmällä.

Kokeiltiin yhdisteiden kykyä estää pentagastrii-nin aiheuttamaa mahahapon erittymistä kroonisen avanteen 20 omaavilla koirilla. Beagle-naaraille, joilla oli krooninen maha-avanne, annettiin pentagastriinia (2,5 jug/kg/h, i.v. välillä -60 - 120 minuuttia) ja mahaeritteet koottiin talteen avannekanyylin kautta. Näytteistä analysoitiin 30 minuutin välein tilavuus (ml) ja titrattavissa 35 oleva happo (mekv/1) (titraus pH-arvoon 7, 0,01-n nat- riumhydroksidilla); kokonaishappoeritys (mekv) laskettiin eritystuotto-tilavuutena ja happokonsentraationa. Koeyh-disteitä annettiin letkuruiskeina vakionopeudella aikavälillä 0-60 minuuttia. Arvot on ilmoitettu kokonaiseri-40 tyksen muuttumisprosentteina samoilla eläimillä suorite tun plasebo-kokeen antaman arvon suhteen.

16 7471 1 o

CM

rH^coooooocMt-'

O I rH •»M VO CO f-H CM

C -HO

0) -p σι „ 0) <0

C W <#> ltj O

•M X I ^mHhm'f'idCM

<n > tn 4-i i vo ^ movcMm

C -P -H C O

CU -H E (1) VO

^ m >i tn

>1 CU 4-1 C O

P tnOvor^i-M^r^cMcoov 4-> C J) >| | r^-^nrJ-OOLnrr

0) O O O

+j a c a ci -*Η (tf Q) 0, tn & ^ n n) o

tl) <0 C tHECcOVDI/ICNOOCMOO

x!-h E li-irHrHrHmnn tö (0 E >i o

tn E +J

tn o 4->______

tl) 4-1 VO -H

tn a) u o ,¾ tn i tl) cm 3 X Hr^^fovo^Ln^ P 30 C l ro oo co M* cm to

•H 4-1 O O

O 3 :<0 04 cr\ X X iH (0 to

(4 -H rH 4U 3 O

fO cO -H t0 3<JVrHoominrHr- -P >H £ > I oo o\ n oo in oo 3 :<0 td td o

-f 3 > S ι-l VO

•h · a) -h

to 4J -H 3 EH O

4-><D O ^ VOr-CMTrOOOO*)·!''

Min o tn i σι oi oo tn oo ai co

<U X rH -H O

> O (0 3 co

rH CM

C 3 (0 3 O

O 4J I X fOLnr-foooaoavf-'-

•H4J i oo oi ι/i co oo Is VO

MS 4-» Ό 0) o

tn c -H rH

tn Ό 4->--*:- a) to 0 i a) Ό <0 a) — Λ — —.

Ntnac tuettua) ai to -H Λ I Λ Λ

-P <0 en E A M A A

£ -M X I £ Il >Ί rH 0) rH M EH — rH (H — «j .c e jcid)uj:<i)

Ctn ΕπιηχίΙΕΗΛ

0)0 C I >i A 04 I A

c-> 0) 3_ tn h£ i i tn i oc+j >-h tn oo Ι-40Χ1ΛΟΛ MC ·Η ·» I M Eh Eh I Eh

(0 -H rH O 04 frn I I 04 I

•h x M i tn tn M tn C4-I > tn Eh Q >i >i Eh >i Q) to tn o i i cj 4-3 I pj

•H 4-» C Q 0) I I a I

> tn CC I «C 04 04 l 04

tOO-HtO φ A M M 0) M

<04-1 C — ÄIEhEhxJEh

M (0 -H A (0 I I A I

3 E H I rH Q Q | Q

0) O 4J -H (0 < I I rH I

to tn (0 CrSItUtUUM

4-1 -H m: Q £ J3 I >1 tn -H I I A A 04 Eh

O 4-1 0) 0) I I I I

-P (OSSOOOO

<0 4-1 I I M M M M

E 0) MSSAAAA

O 4-1 O w _ w w ^ co tn -p o o o o o o

*rl fO rH Ι-H r-1 rH r—I rH

Ό E Ai £ £ £ M £ XS O >1 >1 >1 >1 >M >1 1 pH__CO CO CO CO to to to I? 7471 1

Seuraavat vertailukoetulokset osoittavat keksinnön mukaisesti valmistettujen sykloheksapeptidien yllättävän edullisuuden verrattuna julkaisusta EP-A 0001295 tunnettuihin somatostatiini-analogeihin: 5

Syklo-(Pro-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe)

Insuliinin inhiboituminen 5,2

Glukagonin inhiboituminen 8,0

Kasvuhormonin inhiboituminen 1,71 10

Syklo-(Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe) (EP-A 0001295) Insuliinin inhiboituminen 0,32

Glukagonin inhiboituminen tehoton

Kasvuhormonin inhiboituminen 0,27 15

Tulokset on suhteutettu somatostatiinin tehoon antamalla tälle arvo 1.

Seuraavat esimerkit on esitetty menetelmien kuvaamiseksi, joita on käytetty tämän keksinnön toteutuksissa. 20 Esimerkki 1

Syklo-(D-Trp-Lys-Thr-Phe-N-Me-Ala-Phe) a) D-Trp-(£-2-C1-CBZ)Lys-(OBzl)Thr-Phe-Pro-Phe-OCH^0-hartsin valmistus

Kloorimetyylihartsia (2 % ristikytkettyä Merrifield-25 hartsia) 862,0 g (2,37 mol), jossa oli 2,75 mekv kloo-ria/g, ja 607,0 g (2,37 mol, 1 ekvivalentti) BOC-Phe:tä lisättiin 4320 ml:aan peroksiditonta tetrahydrofuraania. Seosta sekoitettiin Ö1jyhauteessa 80°C:n haudelämpötilas-sa 45 minuuttia. Lisättiin 310,0 ml trietyyliamiinia ja 30 reaktioseosta sekoitettiin 80°C:n haudelämpötilassa 70 tuntia, jäähdytettiin 25°C;seen ja siirrettiin sekoitettuun kiinteäfaasiseen reaktiokolonniin käyttämällä 2000 ml tetrahydrofuraania. Liuottimen poistamisen jälkeen hartsi pestiin käyttäen sekoitettavaa kolonnia 35 3 x 2000 ml:11a tetrahydrofuraania, 4 x 5170 ml:lla etanolia, 1 x 5170 ml:11a etikkahappoa, 3 x 5170 ml:lla vettä, 3 x 5170 ml:11a metanolia ja 40 3 x 5170 ml:lla kloroformia.

7471 1 18 BOC-Phe-O-CH20-hartsia kuivattiin tyhjössä 25°C:ssa 16 tuntia, jolloin saatiin 1203 g BOC-Phe-O-Ci^#-hartsia, jossa oli 1,2 mmoolia fenyylialaniinia grammassa hartsia.

5 BOC-Phe-O-CI^fl-hartsia (2,13 g, 2,0 mmol) käsitel tiin taulukkojen III ja IV mukaisin menetelmin käyttäen 2 suojauksen poistoa (2 min ja 25 min) 25-%:isella TFA:n metyleenikloridiliuoksella ja 2,5 ekvivalentilla BOC-ami-nohappoa tarvittavassa järjestyksessä, kunnes saatiin ha-10 luttua BOC-heksapeptidi-O-CH20-hartsia.

Ainoana kytkentäaineena käytettiin kaikissa vaiheissa DCCIstä.

Jokaisen aminohapon kytkentä tapahtui moitteettomasti. Parhaat saannot saatiin toistettaessa kytkentä jo-15 kaisessa vaiheessa. Toistettaessa kytkentä, alkuvaiheen 2 kloroformipesua, suojauksen poistovaihe ja perättäiset 3 kloroformipesua jätettiin pois ja korvattiin yhdellä kloroformipesulla.

Kytkentäreaktiot suoritettiin metyleenikloridissa, 20 DMF:ssä, josta oli juuri poistettu kaasut, tai näiden liuottimien seoksessa. N-pääte-aminoryhmä suojattiin kussakin tapauksessa BOC-ryhmällä, Thr:n hydroksiryhmä suojattiin Bzl:llä ja Lys:n 8-aminoryhmä 2-C1-CBZ:llä.

Kun oli saatu haluttu BOC-heksapeptidi-O-CH20-25 hartsi, N-pääte-BOC-ryhmä poistettiin käyttämällä taulu kossa V esitettyä termistä suojaksenpoistomenetelmää.

19 7471 1 * -te * * "’cn fN rH rH rH \ n

Κ «Ή O

h O K O U H· <N

a o) a o k q a q a u n) o UI ro tn i—l :id ·» :id

0 -P <N -P

E ·· H C

1 H u O <D

mu in <-h m M

'UK -P

o q u >1

Ai ' Ή

fG IG

to -p 3 m ui cd oi ·· Ufl -rl ui <C. <n tn Ch cu m (¾ rH U) g ui (Nm U · 0) 4! U Nfci H 0 o k a o <u m u q g oi (N | ro rH g (0

rH u CD rH x O

U fN rH rH -q· (N

KK o -H ro 0 U g g

1 fN

rH Ä m ro u σι o 4J (N ·· IN H1 Id H W K rH ·(->

M Z U 'T

h ____m_ o M ro A! rH o

3 U ro N" (N

H K

3 U

(0____ E-< id -P (d oi <C oi m

h ·· (N

E-ι fN

rH O (G

dP U (N (N -n

fN

m K (N

CN u ro

rH

u o K CN N* m U __

rH

•rl I I I Γ· g id >1 CD 3 * -P H rH Q, Ai ^ ' 3

CO CD 3 01 -H

3 01 -P -H rH 3 g rl C -P Id 3 -P CD -h HJ 3 Md > O Cn oi cd P (d id

3 id :<d 3 -ro :id M

•H CD 5^ CU 3 od -H -H

i3 M -n 01 g Eh < 7471 1 20

Pm

§ S

6 E

m m ·* (N (N <N (N <N OS CM CS CS rs

»H <H r-l ι—I r-l i-O H r-l ι—I ι—1 rH

E UUUOO O O O O U

rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs > * κ cc κ te as κ cc cc s cc m cuuuuo υυαυυ

•H

O -P t—I H iH H H ·—1 «-j '-j '-j *-j ^oeeeee eeege λ; 3 3 .ri o o o o m m ir> m in o >h j rs rs (N rs H rs rs rs rs rs 3 (Ö

Eh__________

Cn tn 'j1

—»rs (N

Cp rs tn rs O in —· w

Di oo m m

Ct, o -oitji m tn tn 1¾ ^ -—. i—1 c*1 —. '— jg r-itn^iHcs en tn -n j rs O ^ in w <—> u"> fi :nj rs :nJ M afl N :ctJ - :nj o aö rs afl :nj n :ta :nj

•H (O+Jro+JiJ-PCQ-P-H-P oo+Jro+JJs+Jffj-PH+J

e hc - cehcoc^c “C -gjcöoc^c 5 < <D r-l Q) ^ 0) I <D <u H » H J) h oi I il <u I ^ - ϋ H J,! H ϋ Cu M ΟιΛ|

p <D 4J -P N -P U -P P -P -P -P N -P O P P P

P S>i<U>iffl>il >1 H >1 P Ι^χίΛΟΟΛΟηΐΛίΙΛί ΙιΧΧίίιΐΟ^Ν^ΙΛΙ

m Z (X, — Q Oift — '-'Q

•n 1*1· *1*1* 1*1* *1*1* O UOUOUOUOUtJ O'dUOU'Oy'OO'd 3 0303030303 HO 30 30 30303

ro HmD0QOfflO«OffiD MöPiODajocoofflO

7471 1 21

(O

e

rH

0) •n Ä 0

O

-p CO * * * *

-H (N r-t CN (N

O ^ \ ''s.

dl

β CN CM

(1) rH rH O

CO SJ o K U H" CN

M O CN o CN 0 d) X <U S3

id g U S U

•n O

0 ---—__ co

C

d) a) ^

Jj en

Tj H O

:id y ro «a· cn > ____ o

M

M <#> 0

rH rH

0 id + id E-ι id -h -P id rH m

• t CO o CN

< CO -H O

tl ·· Ό CN -Ν' Id

En (N -H TO

-H C

<#> o Id CN

cn id m k -μ CN cj 0) »L. . i ..... Il > ....

n

rH

O o

DC rl a· CN

u C * Ή -H ® C - g

id t-ι CD

-P ·Η >o to :id "G

CO rH 0 u CO -H

C co <u co :id 0 g H C -p 0) :cd 0 -P 0) -P Dj § > O 0> h 0 id id 0 Id CO -H ΛΙ rH Λί

•H <v ad id 0 -H -H

jD P K -P rH fr < 7471 1 22

Taulukkojen III, IV ja V toimenpiteiden päätyttyä suojattua heksapeptidi-O-CH20-hartsia kuivattiin yön ajan ja sen paino oli 3,7 g.

b) D-Trp-(β -2-C1-CBZ)Lys-(OBzl)Thr-Phe-N-Me-Ala-5 Phe-NHNH^in valmistus

Esimerkissä 1 a) saatu hartsi yhdistettiin 30 ml:n kanssa dimetyyliasetamidin ja hydratsiinin seosta (2:1) ja sekoitettiin tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Liukenematon hartsi poistettiin suodattamalla ja liuos haih-10 dutettiin kuiviin dimetyyliasetamidin poistamiseksi.

Jäännös pantiin yön ajaksi suurtyhjöön kaiken haihtuvan aineksen poistamiseksi. Liuottamalla jäännös metanoliin, suodattamalla ja haihduttamalla kuiviin saatiin vaahto-maista ainetta, joka painoi 2,19 g.

15 c) D-Trp-(& -2-C1-CBZ)Lys-(OBzl)Thr-Phe-N-Me-Ala-

Phe-Nj:n valmistus

Esimerkissä 1 b) saatu vaahto yhdistettiin 15 ml:n kanssa dimetyyliformamidia, josta oli poistettu kaasut, typen suojaamana, jäähdytettiin -10°C:seen ja lisättiin 20 5 ekvivalenttia 4,52-m kloorivedyn tetrahydrofuraaniliuos- ta (2,2 ml). Liuos jäähdytettiin -25°C:seen ja lisättiin annoksittain 5 ml isoamyylinitriitin ja dimetyyliformami-din seosta (1:19) kunnes saatiin positiivinen tärkkelys/ KJ-koetulos. Reaktion päättymistä seurattiin ohutkerros-25 kromatografiän ja hydratsidi-lähtöaineen häviämisen avul la .

d) Syklo-/D-Trp-(S -2-C1-CBZ)Lys-(O-Bzl)Thr-Phe-N-Me-Ala-Phe7 in valmistus

Esimerkissä 1 c) saatu atsidi-yhdiste lisättiin 30 600 ml:aan dimetyyliformamidia, josta kaasut oli poistet tu ja joka oli esijäähdytetty -25°C:seen, pH säädettiin arvoon 8 trietyyliamiinilla ja reaktioseos pantiin yöksi jäähdytyslaitteeseen. pH säädettiin tarvittaessa uudelleen arvoon 8 noin 14 tunnin kuluttua ja seosta pidettiin 35 16 tuntia -20°C:ssa ja 16 tuntia 5°C:ssa. Ohutkerroskro- matografinen analyysi osoitti reaktion päättyneen. Seos haihdutettiin kuiviin, liuotettiin 150 ml:aan dimetyyli-formamidi/vesi-seosta (3:1) ja käsiteltiin sekatäyte- 23 7 4 71 1 anioninvaihtohartsilla tunnin ajan. Seos suodatettiin ja haihdutettiin kuiviin tyhjössä öljyksi, ja jäännös trituroitiin metanolin kanssa, jolloin saatiin 1,91 g valkeaa kiinteää ainetta.

5 e) Syklo-(D-Trp-Lys-Thr-Phe-N-Me-Ala-Phe);n valmis tus 1,91 g (1,8 mmol) esimerkissä 1 d) saatua suojattua syklistä heksapeptidiä yhdistettiin teflon-pinnoit-teisessa kammiossa 2 ml:n kanssa anisolia. Sitten kammio 10 evakuoitiin ja täytettiin nestemäisellä fluorivedyllä kuivajää/asetoni-hauteen lämpötilassa. Lämpötila nostettiin 0°C:seen ja sekoittamista jatkettiin tunnin ajan. Fluorivedyn annettiin haihtua pois ja jäännöstä pidettiin tyhjössä, kunnes oli muodostunut liete. Lietettä tri-15 turoitiin etyyliasetaatilla ja suodatettiin, jolloin saatiin 1,29 g hienoa jauhetta. Jauhe pantiin 300 g:lle si-likageeliä ja eluoitiin EPAW-seoksella 10:5:1:3, eluoi-malla 9 ml:n fraktioin. Fraktiot 55 - 56 yhdistettiin ja haihdutettiin kuiviin. Tuote saostettiin kloroformin, 20 etyyliasetaatin ja heksaanin seoksesta, jolloin sitä saatiin 679 mg.

Esimerkki 2

Syklo-(D-Trp-Lys-Thr-Phe-Pro-Phe) a) D-Trp-(S-2-C1-CBZ)Lys-(OBzl)Thr-Phe-Pro-Phe-25 NHNH^;n valmistus

Esimerkissä 1 a) saatu hartsi yhdistettiin 30 ml:n kanssa dimetyyliasetamidin ja hydratsiinin seosta (2:1) ja sekoitettiin huoneen lämpötilassa tunnin ajan. Liukenematon hartsi poistettiin suodattamalla ja liuos haih-30 dutettiin kuiviin dimetyyliasetamidin poistamiseksi. Jäännöstä käsiteltiin suurtyhjössä yön ajan kaiken haihtuvan aineksen poistamiseksi. Kun jäännös oli liuotettu metano-liin, liuos suodatettu ja haihdutettu kuiviin, muodostui vaahtoa, joka painoi 1,84 g.

24 7471 1 b) D-Trp- ( £-2-Cl-CBZ) Lys- (OBzl)Thr-Phe-Pro-Phe-N^ ; n valmistus

Esimerkissä 2 a) saatu vaahto yhdistettiin 15 ml:n kanssa dimetyyliformamidia, josta oli poistettu kaasut, 5 typen suojaamana ja jäähdytettiin -10°C:seen ja lisättiin 5 ekvivalenttia 5,8-m kloorivedyn tetrahydrofuraaniliuos-ta (1,7 ml). Liuos jäähdytettiin -25°C:seen ja lisättiin 5 ml isoamyylinitriitin dimetyyliformamidi-seosta (1:19). Reaktion päättymistä seurattiin ohutkerroskromatografisen 10 analyysin ja hydratsidi-lähtöaineen häviämisen avulla.

c) Syklo-ZD-Trp-(£-2-Cl-CBZ)Lys-(OBzl)Thr-Phe-Pro-Phe?:n valmistus

Esimerkissä 2 b) saatu atsidiyhdiste lisättiin 600 ml:aan dimetyyliformamidia, josta kaasut oli poistet-15 tu ja joka oli esijäähdytetty -25°C:seen, pH säädettiin arvoon 8 ja reaktioseos pantiin jäähdyttimeen yön ajaksi. Tarvittaessa pH säädettiin uudelleen arvoon 8 noin 14 tunnin kuluttua ja seosta pidettiin 16 tuntia -20°C:ssa ja 16 tuntia 5°C:ssa. Ohutkerroskromatografinen analyysi 20 osoitti reaktion päättyneen. Seos haihdutettiin kuiviin, liuotettiin 150 ml:aan dimetyyliformamidi/vesi-seosta (3:1) ja liuosta käsiteltiin sekatäyte-anionikationivaih-tajahartsilla 2 tuntia. Seos suodatettiin ja haihdutettiin kuiviin tyhjössä, ja jäännös liuotettiin metanoliin, 25 suodatettiin ja haihdutettiin kuiviin, jolloin saatiin vaahto.

d) Syklo-(D-Trp-Lys-Thr-Phe-Pro-Phe):n valmistus 2,13 g (2 mmol) esimerkissä 2 c) saatua suojattua syklistä heksapeptidiä yhdistettiin teflon-pinnoitteises-30 sa kammiossa 2 ml:n kanssa anisolia. Sitten kammio evaku oitiin ja täytettiin nestemäisellä fluorivedylläkuivajää/ asetoni-hauteen lämpötilassa. Lämpötila nostettiin 0°C:seen ja sekoittamista jatkettiin tunnin ajan. Fluori-vedyn annettiin haihtua pois ja jäännöstä pidettiin tyh-35 jössä, kunnes oli muodostunut liete. Lietettä käsiteltiin etyyliasetaatin kanssa ja suodatettiin, jolloin saatiin 1,19 g hienoa jauhetta. 300 mg tätä jauhetta pantiin 1000 |im:n preparatiiviselle silikageeli-ohutkerroskroma- 25 7471 1 tografialevylle ja eluoitiin kloroformin, metanolin ja ammoniakin väkevän vesiliuoksen seoksella (70:30:5), jolloin saatiin 200 mg tuotetta. Jäljellä oleva raakatuote pantiin silikageeli-kolonniin, ja eluoitiin samalla liuot- 5 timella. Tuotteen esiintyminen eluaatissa määritettiin ohutkerroskromatografisen analyysin avulla ja jäähdytys-kuivauksen jälkeen saatiin noin 510 mg tuotetta.

Noudattamalla edellä esitettyä menetelmää ja modifioimalla ainoastaan esimerkin 1 menetelmässä käytettä- 10 vien aminohappojen valintaa ja järjestystä valmistettiin keksinnön mukaisesti muita kaavan I tai II mukaisia syklisiä heksapeptidejä. Näiden yhdisteiden fysiokemialliset ominaisuudet on esitetty seuraavassa.

15 Ohutkerroskromatoqrafialla määritettyjä Rf-arvoja keksin nön mukaisesti valmistetuille syklisille heksapeptideille;

Liuotin-Rf systeemi 20 Syklo-(Pro-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe) 0,65 5

Syklo-(Pro-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Phe) 0,30 1

Syklo-(Pro-Phe-L-Trp-Lys-Thr-Phe) 0,30 1

Syklo-(Pro-Phe-D-Trp-Lys-Thr-p-Cl-Phe) 0,64 2 0,43 4 25 Syklo-(Pro-Phe-D-5-F-Trp-Lys-Thr-Phe) 0,40 1

Syklo-(Pro-Phe-L-5-F-Trp-Lys-Thr-Phe) 0,30 1

Syklo-(Pro-Phe-D-Trp-Lys-Val-Phe) 0,50 1

Syklo-(N-Me-Ala-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe) 0,44 2

Syklo-(N-Me-Ala-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Phe) 0,50 1 30 Syklo-(N-Me-Abu-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe) 0,46 3

Syklo-(N-Me-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe) 0,50 1

Syklo-(N-Me-Ala-Tyr-L-Trp-Lys-Val-Phe) 0,50 1

Syklo-(N-Me-Ala-2-T-Phe-D-Trp-Lys-Val- L-Trp) 0,45 1 35 Syklo-(Pro-Phe-D-Trp-Thia-Lys-Thr-Phe) 0,50 1

Syklo-(Pro-L-meta-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Phe) 0,25 1 7471 1 26

Kaikki kromatogrammit ajettiin ohutkerroskroma-tografialevyillä Whatman silica gel G(ΚΙ).

Liuotinsysteemit: 1) 70 osaa kloroformia, 30 osaa metanolia, 3 osaa väkevää 5 ammoniakin vesiliuosta, 2) 70 osaa kloroformia, 30 osaa metanolia, 5 osaa väkevää ammoniakin vesiliuosta, 3) 80 osaa kloroformia, 25 osaa metanolia, 5 osaa väkevää ammoniakin vesiliuosta, 10 4) 10 osaa etyyliasetaattia, 5 osaa pyridiiniä, 1 osa etikkahappoa, 3 osaa vettä.

Kaikki osat ovat tilavuusosia.

Aminohappoanalyysit ja optiset kiertokyvyt: 1) Syklo (Pro-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe)

Pro(0,97), Phe(2,04), Trp(0,97), Lys(0,99), Thr(1,03) [dj24-23,6° (Cl, metanoli)

D

2) Syklo(Pro-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Phe)

Pro(0,97), Tyr(0,96), Lys(1,00), Thr(1,03), Phe(1,01) 20 3) Syklo(Pro-Phe-L-Trp-Lys-Thr-Phe)

Pro(1,00), Phe(2,02), Lys(0,98), Thr(1,00) 4) Syklo(Pro-Phe-D-Trp-Lys-Thr-pCl-Phe)

Pro(0,98), Phe(1,00), Trp(1,00), Lys(1,01), Thr(1,00) p-Cl-Phe(1,00) 25 5) Syklo(Pro-Phe-D-5-F-Trp-Lys-Thr-Phe)

Pro(0,97), Phe(2,02)-5-F-Trp(1,01), Lys(0,98), Thr(1,01) 6) Syklo(Pro-Phe-L-5-F-Trp-Lys-Thr-Phe)

Pro(0,97), Phe(2,04),-5-F-Trp(1,01), Lys(0,99), Thr(1,00) 7) Syklo(Pro-Phe-D-Trp-Lys-Val-Phe) 30 Pro(1,02), Phe(1,98), Trp(0,74), Lys(0,99), Val(1,02) 8) Syklo(N-Me-Ala-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe)

Phe(1,98), Trp(1,04), Lys(1,01), Thr(0,98) /-^24-65,34 (CO. 4, metanoli) L™ d 35 9) Syklo(N-Me-Ala-Tyr-D-Trp-Lys, Val-Phe)

Tyr(0,99), Trp(0,75), Lys(1,Q1), Val(1,00), Phe(1,01) 10) Syklo(N-Me-Abu-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe)

Phe(1,98), Trp(0,98), Lys(1,01), Thr(1,03) 27 7471 1 11) Syklo(N-Me-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe)

Trp(0,89), Lys(1,00), Thr(1,00), Phe(1,99) 12) Syklo(N-Me-Ala-Tyr-L-Trp-Lys-Val-Phe)

Tyr(0/99), Lys(1,02), Val(1,01), Phe(0,99) 5 13) Syklo(N-Me-Ala-2I-Phe-D-Trp-Lys-Val-L-Trp)

Phe(0,87), Trp(1,68), Lys(1,00), Val{0,97) 14) Syklo(Pro-Phe-D-Trp-Thia-Lys-Thr-Phe)

Pro(1,02), Phe(1,97), Trp(1,01), Thia-Lys(0,99), 10 Thr (1,01) , ^k/24-112,8 (CQ> 5> metanoli 15) Syklo(Pro-L-meta-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Phe)

Pro(0,98), L-meta-Tyr(1,02), Trp(0,74), Lys(0,99),

Thr(0,99), Phe(1,01) .

Claims (7)

28 . „ 7471 1

1. Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen syklisen heksapeptidiyhdisteen valmistamiseksi, jolla on 5 kaava

0 R- H ..^rVr' 1° N H 0=(

0. N-H °7iArjYx^Is^··. 15 1 1 0 H R4 tai

20. R2 H CX * °T

25 H “K

0 H ' ° N Αγ/Ν· < i T ]

30 H “* joissa X on (CH2)n, jossa n on 0, 1 tai 2, Y on (CH2) , jossa m on 0, 1 tai 2, tai rikki, siten et- 35 tä rikki voi olla missä tahansa ketjun kohdassa, R^ ja R2 ovat toisistaan riippumatta bentsyyli tai substi-tuoitu bentsyyli, jossa substituenttina voi olla 1 tai 2 halogeenia tai hydroksiryhmää. 29 7471 1 R^ on 3-indolyylimetyyli tai substituoitu 3-indolyylime-tyyli, jossa substituenttina voi olla pienalkoksi tai halogeeni, R^ on pienalkyyli tai hydroksipienalkyyli, ja 5 R^ on pienalkyyli tai bentsyyli, tunnettu siitä, että a) valmistetaan kiinteäfaasiseen hartsiin liitetty vastaava suojattu lineaarinen peptidi, b) lohkaistaan selektiivisesti N-pääteaminoryhmän 10 suojaryhmä, c) lineaarinen peptidi irrotetaan hartsista, d) lineaarista peptidiä käsitellään syklisointi-aineella halutun syklisen heksapeptidin amidisidoksen muodostamiseksi, 15 e) poistetaan sivuketjujen suojaryhmät.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaiheessa c) lineaarisen peptidin ja hartsin yhdistelmää käsitellään hydratsiinin kanssa hydratsidin muodostamiseksi.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että syklisointivaiheessa hydrat-sidia käsitellään aineella, joka muodostaa typpihapoketta in situ, atsidin valmistamiseksi, joka syklisoidaan ter-tiäärisen amiinin läsnäollessa halutuksi sykliseksi hek-25 sapeptidiksi.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että atsidi muodostetaan käsittelemällä hydratsidia pienalkyylinitriitin kanssa vahvan hapon läsnäollessa.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että atsidi muodostetaan käsittelemällä hydratsidia isoamyylinitriitin kanssa kloori-vetyhapon läsnäollessa. 30 Patentkrav 74 71 1