NO150958B - Analogifremgangsmaate ved fremstilling av terapeutisk aktive cycliske hexapeptid-somatostatinanaloger - Google Patents

Description

Somatostatin er et tetradecapeptid som omfatter et cyclisk dodecapeptid med strukturen:

og har egenskapene å inhibere frigjørelsen av veksthormon, å inhibere frigjørelsen av insulin og glucagon og å redusere gastriske sekresjoner. Somatostatin selv har en kort virk-ningsvarighet på grunn av at det inaktiveres, bl.a. av aminopeptidaser og carboxypeptidaser som er tilstede in vivo. Dette problem med den korte varighet av virkningen er delvis blitt løst tidligere ved fremstilling av derivater av somatostatin som har lav oppløselighet, og således oppnå en langsom frigjørelse ved subcutan injeksjon. Når de først er oppløst,

er imidlertid derivatene ikke mere stabile overfor inaktiver-ing av aminopeptidaser og carboxypeptidaser enn somatostatin selv.

Foreliggende oppfinnelse angår en analogi fremgangsmåte for fremstilling av cycliske hexapeptider som er derivater av somatostatin i hvilke bl.a. syv av ringens aminosyrer er erstattet med en annen aminosyre, og begge de exocycliske aminosyrer er fjernet. Videre substitusjon og reaksjon av de gjenværende aminosyrer er også beskrevet. De cycliske hexapeptider inhiberer frigjørelsen av glucagon, veksthormoner og insulin, og inhiberer frigjørelsen av mavesyresekresjoner. Spesielt kan forbindelsene preferensielt inhibere frigjørelsen av veksthormoner uten å påvirke nivået av gastriske sekresjoner eller insulin og glucagon, og forbindelsene kan inhibere frigjørelsen av gastriske syresekresjoner. Forbindelsene har således en mere selektiv biologisk aktivitet enn somatostatin. Den cycliske hexapeptidstruktur av foreliggende forbindelser har også en lengre aktivitetsvarighet enn somatostatin. Som sådanne er de foreliggende cycliske hexapeptider nyttige for behandling av acromegali, diabetes, diabetisk retinopati og peptisk ulcus.

Oppfinnelsen angår en analogifremgangsmåte ved fremstilling av terapeutisk aktive cycliske hexapeptidforbindelser med formelen:

hvor

Y er (CH-) hvor m er 0, 1 eller 2 eller svovel idet svovelet

z m

kan være i en hvilken som helst stilling langs kjeden;

R^ og R_ er uavhengig av hverandre laverealkyl, benzyl, substituert benzyl hvor substituenten kan være én eller to av gruppene laverealkyl, halogen, hydroxy, amino, nitro eller laverealkoxy; og laverealkyl substituert med en 5- eller 6-leddet heterocyclisk ring;

R^ er 3-indolylmethyl eller substituert 3-indolylmethyl hvor substituenten kan være laverealkyl, laverealkoxy eller halogen;

R^ er laverealkyl, hydroxylaverealkyl, benzyl, carboxylaverealkyl, aminolaverealkyl eller substituert benzyl hvor substituenten kan være laverealkyl, laverealkoxy, hydroxy, halogen, amino eller nitro; og

R,, er laverealkyl, benzyl eller substituert benzyl hvor substituenten er laverealkyl, laverealkoxy, hydroxy, halogen, amino eller nitro;

Rg er methyl, eller

Rc og R, danner sammen en -CH_-X-CH_-kjede hvor X er (CH-)

do z z zn hvor n er 0, 1 eller 2, eller svovel.

Forbindelsene som fremstilles ifølge oppfinnelsen, anskueliggjøres best ved følgende strukturformler:

hvori symbolene har de ovenfor angitte betydninger.

Uttrykket "laverealkyl" er her anvendt for å betegne

de alkylgrupper, enten rettkjedede eller forgrenede, som har 1-5 carbonatomer. Eksempler på slike alkylgrupper er methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, sek-butyl, pentyl og lignende .

Uttrykket "laverealkoxy" er her brukt for å omfatte de alkoxygrupper som har 1-5 carbonatomer, enten i rett eller forgrenet kjede. Eksempler på slike alkoxygrupper er methoxy, ethoxy, propoxy, isopropoxy, butoxy, t-butoxy, pentoxy og lignende.

Uttrykket "halogen" er anvendt for å omfatte fluor, klor, brom og jod.

Uttrykket "5- eller 6-leddet heterocyclisk ring" er anvendt for å betegne de 5- og 6-leddede heterocycliske grupper med 1 eller 2 heteroatomer valgt fra oxygen, nitrogen og svovel. Eksempler på slike heterocycliske forbindelser er imidazol, furan, thiazol, pyrazol, pyridin og lignende.

I fremgangsmåteforbindelsene er der flere asymmetriske sentra som vil føre til forekomsten av optiske isomerer for slike forbindelser. I fremgangsmåteforbindelsene som har slike asymmetriske sentra, omfatter oppfinnelsen både D- og L-konfigurasjonene.

Det vil innsees av fagfolk at når R, og er benzyl,

R^ er indolylmethyl, Y er methylen og R^ er 1-hydroxyethy1,

er 7, 8, 9, 10 og 11 aminosyrene av somatostatin (-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-) representert, og den annen aminosyre representert ved N-methylalanin hvor R,, er methyl, i formel I, og ved prolin når X er methylen i formel II, har tatt plassen til resten av somatostatin-aminosyrene. Under anvendelse av ovenstående definisjoner av substituentgruppene dannes således den følgende representative, cycliske hexapeptid-

analog av somatostatin i formel I:

De foretrukne utførelsesformer av de cycliske hexapeptider som fremstilles ifølge oppfinnelsen, fremgår av den foregående strukturformel I hvor Y er (CI^) » og n er 1;

R^ og R^ er som ovenfor angitt;

R^ er 3-indolylmethyl eller substituert indolylmethyl hvor substituenten er methoxy eller fluor;

R^ er methyl, ethyl, hydroxymethyl eller hydroxyethyl; og

Rj. er methyl.

Videre utførelsesformer fåes når Y er methylen;

R^ og R2 er som ovenfor angitt;

R3 er 3-indolylmethyl;

R^ er hydroxyethyl; og

Rj. er methyl.

De foretrukne R^- og R2~grupper er laverealkyl, benzyl eller substituert benzyl hvor substituenten er laverealkyl, halogen, hydroxy, amino, nitro og alkoxy.

. Innbefattet i disse foretrukne forbindelser er:

Under anvendelse av ovenstående definisjoner av substituentgruppene dannes den følgende representative cycliske hexapeptidanalog av somatostatin med formel II:

De foretrukne utførelsesformer av de cycliske hexapeptider ifølge oppfinnelsen dekkes av foregående strukturformel II hvor X og Y er (CH-,) riog n er 1;

R^ og R2 er som ovenfor angitt;

R^ er 3-indolylmethyl eller substituert indolylmethyl hvor substituenten er methoxy eller fluor; og

R^ er methyl, ethyl, hydroxymethyl eller hydroxyethyl.

Andre foretrukne utførelsesformer er de hvor X og Y er methylen;

R^ og R2 er som ovenfor angitt;

R^ er 3-indolylmethyl; og

R^ er hydroxyethyl.

R^ og R2 er som ovenfor angitt.

De foretrukne R^- og R2~grupper er lavere alkyl, benzyl eller substituert benzyl hvor substituenten er laverealkyl, halogen, hydroxy, amino, nitro eller alkoxy.

Innbefattet i disse foretrukne forbindelser er:

I foreliggende beskrivelse og krav er flere forkortede betegnelser anvendt for aminosyrekomponentene, særlig foretrukne beskyttende grupper, reagenser og oppløsningsmidler. Betydningen av slike forkortede betegnelser er gitt i tabell I.

I henhold til foreliggende oppfinnelse fremstilles de nye cycliske hexapeptid-somatostatinanaloger ved ringslut-ning av tilsvarende lineære peptider. De lineære peptider fremstilles ved anvendelse av fastfase-rekkefølge-syntese-metoden.

Analogifremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er kjenne-tegnet ved at

a) et tilsvarende blokkert, lineært peptid bundet til en fastfaseharpiks fremstilles; b) den N-terminale amingruppe deblokkeres selektivt; c) det lineære peptid fjernes fra harpiksen; d) det lineære peptid behandles med et cycliserings-middel for å danne amidbindingen av det ønskede cycliske

hexapeptid;

e) de sidekjedebeskyttende grupper fjernes.

Når det lineære peptid fremstilles på harpiksen, er

det i alminnelighet ikke kritisk hvilken aminosyre som velges til å være i C-endestillingen forutsatt bare at rekkefølgen av aminosyrer i det lineære peptid svarer til den i den ønskede somatostatinanalog. Når et lineært peptid er blitt cyclisert, kan man ikke lenger bestemme hvilken aminosyre var i C-enden av det lineære peptid.

Skjønt i alminnelighet valget av den første aminosyre for å begynne kjeden ikke er kritisk når det lineære peptid

cycliseres, kan der være andre faktorer som gjør at en utgangs-aminosyre foretrekkes fremfor en annen. Eksempelvis kan D-Trp reagere med t-butylcarboniumioner som dannes når BOC-grupper fjernes. Valget av reaksjonsrekkefølgen som anbringer D-Trp ved N-sluttenden av det lineære peptid, vil således bevirke at D-Trp tilsettes sist, og således vil det være minst utsatt for t-butylcarboniumioner. Denne type av valg er kanskje ikke alltid mulig, som når der er to indol-holdige grupper i peptidet. Slike reaksjonssensibiliteter bør imidlertid taes i betraktning ved planlegging av en peptid-reaksjonsrekkefølge.

Syntesen av de lineære peptider ved fastfasemetoden utføres på en trinnvis måte på klormethylert harpiks. Harpiksen består av fine perler (20-70yUm i diameter) av en syn-tetisk harpiks fremstilt ved copolymerisering av styren med 1- 2% divinylbenzen. Benzenringene i harpiksen er klormethylert i en Friedel-Crafts-reaksjon med klormethyl-methylether og tinn(IV)-klorid. Friedel-Crafts-reaksjonen fortsettes inntil harpiksen inneholder 0,5 til 5 mmol klor pr. g harpiks.

Aminosyren valgt til å være den C-terminale aminosyre

av det lineære peptid, overføres til sitt aminobeskyttede derivat. Carboxylgruppen av den valgte C-terminale aminosyre bindes covalent til den uoppløselige polymere harpiksbærer,

f.eks. som carboxylesteren av det harpiksbundne benzylklorid som er tilstede i klormethyl-substituert polystyren-divinylbenzenharpiks. Efter at den aminobeskyttende gruppe er fjernet, tilsettes det aminobeskyttede derivat av den neste aminosyre i rekken sammen med et koblingsmiddel, som dicyclohexylcarbodiimid. Aminosyrereaktanten kan være i form av en carboxylaktivert aminosyre som ONp-esteren, et aminosyreazid eller lignende. Avbeskyttelsen og tilsetningen av de påfølgende aminosyrer utføres inntil det ønskede lineære peptid er dannet.

Valget av beskyttende grupper er, delvis, diktert av spesielle koblingsbetingelser, delvis av aminosyre- og peptid-komponentene involvert i reaksjonen.

Amino-beskyttende grupper som vanligvis anvendes, innbefatter dem som er vel kjent i faget, f.eks. urethan-beskyttende substituenter som benzyloxycarbonyl (carbo-benzoxy), p-methoxycarbobenzoxy, p-nitrocarbobenz<p>xy, t-butyloxycarbonyl og lignende. Det foretrekkes å anvende t-butyloxycarbonyl (BOC) for å beskytte a-aminogruppen i aminosyrene som undergår reaksjon ved carboxylenden av aminosyren. Den BOC-beskyttende gruppe fjernes lett efter en slik kob-lingsreaksjon og før det påfølgende trinn ved den relativt milde virkning av syrer (dvs. trifluoreddiksyre, eller hydrogenklorid i ethylacetat).

OH-gruppen av THr og Ser kan beskyttes med Bzl-gruppen, og £-aminogruppen av Lys kan beskyttes med INOC-gruppen eller 2- klorbenzyloxycarbonyl-gruppen (2-C1-CBZ). I tilfelle av Lys foretrekkes det å beskytte £-aminogruppen med 2-C1-CBZ-gruppen da denne gruppe fjernes samtidig med Bzl-gruppene ved behandling med HF efter at det lineære peptid er ring-sluttet. INOC-gruppen fjernes ikke av HF og krever en til-leggsbehandling med Zn. Ingen av gruppene påvirkes av TFA, som anvendes for å fjerne BOC-beskyttende grupper. Efter at det lineære peptid er cyclisert, fjernes de beskyttende grupper, som 2-C1-CBZ og Bzl, ved behandling med HF.

Efter at det lineære peptid er dannet på fastfase-harpiksen, kan det fjernes fra harpiksen ved en rekke for-skjellige metoder som er vel kjent. Eksempelvis kan peptidet spaltes fra harpiksen med hydrazin og således direkte danne peptid-hydrazidet som derefter kan cycliseres via azidet til det ønskede cycliske peptid. Hydrazidet overføres til det tilsvarende azid ved omsetning med et reagens som danner salpetersyrling in situ.. Passende reagenser til dette formål innbefatter et lavere alkylnitrit (f.eks. t-butylnitrit, isoamylnitrit) eller et alkalimetall-nitritsalt (f.eks. natriumnitrit, kaliumnitrit) i nærvær av en sterk syre som saltsyre, fosforsyre, etc. Denne reaksjon utføres i nærvær av enten vann og/eller et ikke-vandig oppløsningsmiddel som dimethylformamid, tetrahydrofuran, dioxan, kloroform, methylenklorid, etc, ved en temperatur mellom ca. -40°C og +20°C. Alternativt kan peptidet fjernes fra harpiksen ved behandling med en lavere alkohol som methanol i nærvær av en organisk base som triethylamin, hvilket fører til dannelsen av den tilsvarende lavere alkoholester av det lineære peptid. Den dannede ester kan overføres til hydrazidet som så kan cycliseres, via azidet, til det ønskede cycliske peptid.

Den foretrukne fremgangsmåte for spaltning av peptidet fra harpiksen ved foreliggende oppfinnelse er anvendelsen av hydrazin.

Som vist i tabell II, består en foretrukken totalfrem-gangsmåte for fremstilling av de ønskede cycliske peptider

av den trinnvise syntese av det lineære peptid på en fastfaseharpiks. Mere spesifikt ved fremgangs-måten for fremstilling av:

er carboxylenden av det N-blokkerte aminosyre-fenylalanin

bundet covalent til en uoppløselig polymer harpiksbærer som carboxylsyreesteren av det harpiksbundne benzylklorid. Aminogruppen av Phe er beskyttet med BOC-gruppen. Efter at bindingen av Phe er avsluttet på harpiksen, fjernes den beskyttende gruppe BOC ved behandling med TFA i CH^C^. De efterfølgende aminosyrer påbindes i form av BOC-aminosyre, under anvendelse av DCCI som kondenseringsmiddelieller en aktiv ester som ONp. Efter at det ønskede lineære peptid er dannet, deblokkeres den N-terminale aminogruppe selektivt, og peptidet fjernes fra harpiksen ved behandling med hydrazin. Det resulterende lineære peptid-hydrazid med den N-terminale aminogruppe deblokkert, og med aminosyrerekkefølgen:

behandles med isoamylnitrit ved sur pH for å danne det tilsvarende azid. Azidoppløsningen fortynnes med oppløsnings-middel og nøytraliseres med en organisk syre. Det lineære peptid cycliseres under dannelse av:

i

Under cycliseringen kontrolleres pH og holdes på nøytral ved tilsetning av organisk base. pH i det organiske oppløs-ningsmiddel bestemmes ved påføring av en prøve av oppløs-ningen på fuktet smalområdét pH-papir.

Efter at det lineære peptid er cyclisert, fjernes de beskyttende grupper, 2-C1-CBZ og OBzl, ved behandling med HF i nærvær av anisol. Det erholdte rå cycliske peptid renses kromatografisk, fortrinnsvis ved kolonnekromatografi på silicagel. Oppløsningsmidlet er stort sett et organisk oppløsningsmiddel eller blandinger derav, som er valgt ved å analysere prøver av materialet under anvendelse av tynnskiktskromatografi.

TABELL II

Reaksjonsskjemaet for fremstilling av to av de cycliske hexapeptider illustreres i den følgende rekke av reaksjoner:

Reaksjonsskjerna for fremstilling:

De følgende eksempler er gitt for å illustrere metodene anvendt for utførelse av foreliggende oppfinnelse.

Eksempel 1

Fremstilling av D- Trp- ( E.- 2- C1- CBZ) Lys-( OBzl) Thr- Phe- Pro-Phe-OCH20-harpiks

862,0 g (2,37 mol) klormethylharpiks (2% tverrbundet "Merrifield resin"), med 2,75 mekv. klor/g, og 607,0 g (2,37 mol, 1 ekvivalent) BOC-Phe ble tilsatt til 4320 ml peroxydfri tetrahydrofuran. Blandingen ble omrørt i et olje-bad ved 80°C badtemperatur i 45 minutter. 310,0 ml triethylamin ble tilsatt og reaksjonsblandingen omrørt ved 80°C badtemperatur i 70 timer, avkjølt til 25°C og overført til en omrørt fastfase-reaksjonskolonne med 2000 ml tetrahydrofuran. Efter fjernelse av oppløsningsmidlet ble harpiksen vasket under anvendelse av en omrørt kolonne med:

3 x 2000 ml tetrahydrofuran

4 x 5170 ml ethanol

1 x 5170 ml eddiksyre

3 x 5170 ml vann

3 x 5170 ml methanol

3 x 5170 ml kloroform BOC-Phe-0-CH20-harpiksen ble tørret i vakuum ved 25°C i 16 timer, hvorved man fikk 1203 g BOC-Phe-0-CH20-harpiks inneholdende 1,2 mmol fenylalanin pr. g harpiks. 213 g (2,0 mmol) BOC-Phe-0-CH20-harpiks ble ført gjennom metoden i tabell III og IV under anvendelse av 2 deblokkeringer (2 minutter og 25 minutter) med 25%-ig TFA i methylenklorid og 2,5 ekvivalenter av BOC-aminosyre i den nødvendige rekke-følge inntil den ønskede BOC-hexapeptid-O-Cr^Ø-harpiks var erholdt.

DCCI ble anvendt som det eneste koblingsmiddel i hvert trinn.

Koblingen av hver aminosyre forløp glatt. Beste ut-bytter ble erholdt når koblingen ble gjentatt i hvert trinn. Når koblingen ble gjentatt, ble de første to kloroformvasker deblokkeringstrinnet og de påfølgende tre kloroformvasker eller sløyfet og erstattet med en enkelt kloroformvask.

Koblingsreaksjonene ble utført i methylenklorid, friskt avgasset DMF eller i en blanding av disse to oppløs-ningsmidler. Den N-terminale aminogruppe var blokkert med en BOC-gruppe i hvert tilfelle; hydroxygruppen av Thr var blokkert med Bzl og E-aminogruppen av Lys med 2-C1-CBZ.

Når den ønskede BOC-hexapeptid-0-CH20-harpiks var erholdt, ble den N-terminale BOC-gruppe fjernet ved den terminale deblokkeringsmetode angitt i tabell V.

Efter at prosessene i tabell III, IV og V var avsluttet, ble den blokkerte hexapeptid-OCH20-harpiks tørret over natten og veiet 3,7 g.

Eksempel 2

Fremstilling av D- Trp-( 8- 2- C1- CBZ) Lys-( OBzl) Thr- Phe- N- Me-Ala-Phe-NHNH2

Harpiksen fra eksempel 1 ble forenet med 30 ml av en 2:1 blanding av dimethylacetamid og hydrazin og omrørt ved værelsetemperatur i 1 time. Den uoppløselige harpiks ble fjernet ved filtrering, og oppløsningen ble inndampet for å fjerne dimethylacetamidet. Residuet ble anbrakt under høy-vakuum over natten for å fjerne alle flyktige stoffer. Et skum ble erholdt fra å oppløse residuet i methanol, og ble filtrert og inndampet til tørrhet, og veiet 2,19 g.

Eksempel 3

Fremstilling av D- Trp-( £- 2- Cl- CBZ) Lys-( OBzl) Thr- Phe- N- Me-Ala-Phe-N3

Skummet fra eksempel 2 ble forenet med 15 ml avgasset dimethylformamid under et nitrogenteppe og avkjølt til -10°C, og 5 ekvivalenter 4,52 M hydrogenklorid i 2,2 ml tetrahydrofuran ble tilsatt. Oppløsningen ble avkjølt til -25°C, og 5 ml av en 1:19 blanding av isoamylnitrit i dimethylformamid ble tilsatt i porsjoner inntil en positiv stivelse/KI-test ble erholdt. Avslutningen av reaksjonen ble fulgt ved tynnskiktskromatografi og forsvinningen av hydrazid-utgangsmaterialet.

Eksempel 4

Fremstilling av cyclo-( D- Trp-(&- 2- C1- CBZ) Lys-( 0- BZ1) Thr- Phe-N- Me- Ala- Phe)

Azidforbindelsen fra eksempel 3 tilsettes til 600 ml avgasset dimethylformamid, foravkjøles til -25°C, pH inn-stilles på 8 med triethylamin, og reaksjonsblandingen anbringes i en fryser over natten. pH gjeninnstilles på 8 om nødvendig efter ca. 14, og blandingen lagres i 16 timer ved

-20°C og i 16 timer ved 5°C. Tynnskiktskromatografi indikerer

at reaksjonen er fullstendig. Blandingen inndampes til tørr-het, oppløses i 150 ml av en 3:1 dimethylformamid/vann-blanding og behandles med et blandet lag av anion-kation-bytteharpiks i 1 time. Blandingen filtreres og inndampes til tørrhet i vakuum til en olje, og residuet tritureres med methanol, hvilket gir 1,91 g hvitt, fast stoff.

Eksempel 5

Fremstilling av cyclo-( D- Trp- Lys- Thr- Phe- N- Me- Ala- Phe)

1,91 g (1,8 mmol) av det beskyttede cycliske hexapeptid fra- eksempel 4 forenes i et teflonforet kammer med 2 ml anisol. Kammeret evakueres så og fylles med flytende hydro-genfluorid ved temperaturen av tørris/acetonbadet. Temperaturen heves til 0°C, og omrøringen fortsettes i 1 time. Hydrogenfluoridet tillates å fordampe, og residuet settes under vakuum inntil en oppslemning er dannet. Oppslemningen tritureres med ethylacetat og filtreres, hvilket gir 1,29 g av et fint pulver. Pulveret anbringes på 300 g silicagel og elueres med en 10:5:1:3 blanding av EPAW, under eluering med 9 ml fraksjoner. Fraksjonene 55-66 forenes og inndampes. Produktet helles fra en blanding av kloroform, ethylacetat og hexan, hvilket gir 679 mg.

Eksempel 6

Fremstilling av D- Trp-(€- 2- Cl- CBZ) Lys-( OBzl) Thr- Phe- Pro-Phe-NHNH2

Harpiksen fra eksempel 1 forenes med 30 ml av en

2:1 blanding av dimethylacetamid og hydrazin og omrøres ved værelsetemperatur i 1 time. Den uoppløselige harpiks fjernes ved filtrering, og oppløsningen inndampes for å fjerne dimethylacetamid. Residuet anbringes under høyvakuum over natten for å fjerne alle flyktige stoffer. Et skum fåes fra oppløsning av residuet i methanol, filtrering og inndampning til tørrhet, som veier 1,84 g.

Eksempel 7

Fremstilling av D-Trp-( -2-C1-CBZ)Lys-(OBzl)Thr-Phe-Pro-Phe-N3

Skummet fra eksempel 2 forenes med 15 ml avgasset dimethylformamid under et teppe av nitrogen og avkjøles til -10°C, og 5 ekvivalenter 5,8 M hydrogenklorid i 1,7 ml tetrahydrofuran tilsettes. Oppløsningen avkjøles til -25°C, og 5 ml av en 1:19 blanding av isoamylnitrit i dimethylformamid tilsettes. Avslutningen av reaksjonen følges ved tynnskiktskromatografi og forsvinningen av hydrazid-utgangsmaterialet.

Eksempel 8

Fremstilling av cyclo-( D- Trp-( - 2- Cl- CBZ) Lys-( O- Bzl) Thr- Phe-Pro- Phe)

Azidforbindelsen fra eksempel 3 tilsettes til 600 ml avgasset dimethylformamid, foravkjøles til -25°C, pH inn-stilles på 8, og reaksjonsblandingen anbringes i en fryser over natten. pH gjeninnstilles på 8 om nødvendig efter ca.

14 timer, og blandingen lagres i 16 timer ved -20°C og i

16 timer ved 5°C. Tynnskiktskromatografi viser at reaksjonen er fullstendig. Blandingen inndampes til tørrhet, oppløses i 150 ml av en 3:1 dimethylformamid/vannblanding og behandles med et blandet lag av anion-kation-bytteharpiks i 2 timer. Blandingen filtreres og inndampet til tørrhet i vakuum, og residuet oppløst i methanol, filtreres og inndampes til tørr-het, hvilket gir et skum.

Eksempel 9

Fremstilling av cyclo-( D- Trp- Lys- Thr- Phe- Pro- Phe)

2,13 g (2 mmol) av det beskyttede cycliske hexapeptid fra eksempel 4 forenes i et teflon-foret kammer med 2 ml anisol. Kammeret evakueres så og fylles med flytende hydrogen-fluorid ved temepraturen for tørris/acetonbadet. Temperaturen heves til 0°C, og omrøringen fortsettes i 1 time. Hydrogenfluoridet får lov til å fordampe, og residuet settes under vakuum inntil en oppslemning er dannet. Oppslemningen behandles med ethylacetat og filtreres, hvilket gir 1,19 g av et fint pulver. 300 mg av dette pulver anbringes på en lOOO^um silicagel-preparativt lag kromatografiplate og

elueres med en 70:30:5 blanding av kloroform, methanol og konsentrert vandig ammoniakk, hvilket gir 200 mg produkt.

Det gjenværende rå produkt anbringes på en silicagelkolonne og elueres med det samme oppløsningsmiddel. Nærværet av produktet i elueringsmidlet bestemmes ved tynnskiktskromato-grafisk analyse, og, efter frysetørring, får man ca. 510 mg produkt.

Ved å følge ovenstående fremgangsmåte, og ved å modi-fisere bare valget og ordenen av aminosyrer i fremgangs-måten i eksempel 1, fremstilles andre cycliske hexapeptider.

Foreliggende cycliske hexapeptidanaloger av somatostatin prøves og sammenlignes med virkningene av somatostatin i en in vitro prøve for å inhibere veksthormon. Prøven kan beskrives som følger: Rottehypofyser ble isolert i henhold til metodene til Vale og Grant "In vitro Pituitary Hormone Secretion Assay for Hypophysiotropic Substances" i Methods in Enzymology.

Vol. XXXVII, utgaver 0'Malley, B.W. og Hardman, J.G. (Aca-demic Press, Inc., New York) s. 5-93 (1975).

Efter 4 dager i kultur ble cellene vasket og inkubert

i 4 timer i Dulbecco-modifisert Eagle<1>s medium i nærvær eller fravær av graderte doser av hver analog eller somatostatin. Mediet ble så oppsamlet for efterfølgende veksthormonbestemm-else ved en dobbel-antilegeme-radioimmunobestemmelse for rotteveksthormon.

Forsøksresultatene for noen av fremgangsmåteforbindelsene er angitt nedenfor med resultatene for somatostatin angitt først og gitt den vilkårlige verdi av 1. Resultatene for foreliggende forbindelser er gitt som multipler eller fraksjoner av effekten av somatostatin. Tallene i parentes er pålitelighetsgrensene for det forutgående tall. Den første av de angitte fremgangsmåteforbindelser er forbindelsen fremstilt i eksempel 1-5. Forbindelsen er skrevet litt for-skjellig, men for å stemme med rekkefølgen av aminosyrer funnet i somatostatin.

Virkningene av foreliggende cycliske hexapeptidanaloger av somatostatin ble bestemt ved følgende metode.

Forbindelser ble prøvet på deres evne til å inhibere pentagastrin-bevirket gastrisk sekresjon i hunder med kronisk fistula. Beagle hunhunder med en kronisk gastrisk fistula ble gitt 2,5^ug/kg.time pentagastrin intravenøst fra -60 til 120 minutter, og gastriske utsondringer ble oppsamlet ved fistula-kanylen. Prøver ble analysert med 30 minutters mellomrom på volum (ml) og titrerbar syre (mekv/1) (titrering til pH 7 med 0,01N NaOH); total syreutsondring (mekv) ble beregnet som produksjonen av utsondringsvolum og syrekonsen-trasjon. Forsøksforbindelsene ble infusert med en konstant hastighet fra 0 til 60 minutter. Data er uttrykt som prosent forandring av totalsyreutsondring i forhold til et placebo-forsøk på de samme dyr.

Claims (1)

1. Analogifremgangsmåte ved fremstilling av terapeutisk aktive cycliske hexapeptidforbindelser med formelen:

   hvor

   Y er (CH_) hvor m er 0, 1 eller 2 eller svovel idet svovelet

   z m

   kan være i en hvilken som helst stilling langs kjeden; R^ og R2 er uavhengig av hverandre laverealkyl, benzyl, substituert benzyl hvor substituenten kan være én eller to av gruppene laverealkyl, halogen, hydroxy, amino, nitro eller laverealkoxy; og laverealkyl substituert med en 5- eller 6-leddet heterocyclisk ring; R^ er 3-indolylmethyl eller substituert 3-indolylmethyl hvor substituenten kan være laverealkyl, laverealkoxy eller halogen; R^ er laverealkyl, hydroxylaverealkyl, benzyl, carboxylaverealkyl, aminolaverealkyl eller substituert benzyl hvor substituenten kan være laverealkyl, laverealkoxy, hydroxy, halogen, amino eller nitro; og

   R,, er laverealkyl, benzyl eller substituert benzyl hvor substituenten er laverealkyl, laverealkoxy, hydroxy, halogen, amino eller nitro;

   Rg er methyl, eller

   Rc og R, danner sammen en -CH_-X-CH0-kjede hvor X er (CH~) 5 6 22 2 n hvor n er 0, 1 eller 2, eller svovel;

   karakterisert ved at: a) et tilsvarende blokkert, lineært peptid bundet til en fastfaseharpiks fremstilles; b) den N-terminale amingruppe deblokkeres selektivt; c) det lineære peptid fjernes fra harpiksen; d) det lineære peptid behandles med et cycliserings-middel for å danne amidbindingen av det ønskede cycliske hexapeptid; e) de sidekjedebeskyttende grupper fjernes.