KR860001961B1 - 싸이클 헥사펩티드 소마토스테틴 유사체의 제조방법 - Google Patents

싸이클 헥사펩티드 소마토스테틴 유사체의 제조방법 Download PDF

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Abstract

내용 없음.

Description

싸이클 헥사펩티드 소마토스테틴 유사체의 제조방법
본 발명은 다음 일반식(1) 및 (2)의 화합물로 표시되는 싸이클 헥사펩티드 소마토스테틴 유사체를 제조하는 방법에 관한 것이다.
Figure kpo00001
식중,
Figure kpo00002
소마토스테틴은 싸이클 도데카펩티드를 함유하는 테트라데카펩티드인 바 다음 일반식의 구조를 가지며, 성장호르몬 방출의 억제, 인슐린 및 글루카곤 방출의 억제 및 위액분비 감소의 특성을 갖는다.
Figure kpo00003
소마토테틴 자체는 생체내에 존재하는 아미노펩티다제 및 카복시펩티다제에 의해 불활성화 되기 때문에 작용 지속 시간이 짧다. 이러한 작용 지속시간이 짧다는 문제는, 당업계 주지의 방법(저용해성의 소마토스테틴 유도체를 제조하고 즉시 피하주사 함으로서 완만한 방출을 담성한다)에 의해 부분적으로 해결될 수 있었다. 그러나, 한번 용해되면 이 유도체는 소마토스테틴 자체보다도 아미노 펩티다제 및 카복시펩티다제에 의해 불활성화 되므로 안정화되지 않는다.
본 발명에 따라 소마토스테틴 유도체인 싸이클헥사펩티드, 그중에서도 환 아미노산 7개가 2급 아미노산으로 대치되어 측쇄 아미노산의 양쪽이 제거된 것이 제공된다.
기타 아미노산의 치환 및 반응에 대한 것도 기술되어 있다.
싸이클헥사펩티드는 글루카곤, 성장호르몬 및 인슐린 방출을 억제하고 위산분비를 억제한다. 특히 화합물은, 위액분비의 레벨(Level)에 영향을 끼치는 일이 없이 또는 위산 분비, 인슐린 및 글루카보의 레벨에 영향을 끼치는 일없이 성장 호르몬의 방출을 특이적으로 억제하며, 또 화합물은 위산분비를 억제한다. 따라서 이 화합물은 소마토스테틴보다 더 선택적인 생물활성을 갖는다.
상술한 싸이클헥사펩티드는 소마토스테틴 보다 긴 활성 지속기간을 갖는다.
이와 같은 싸이클헥사펩티드는 선단거대증 당뇨병, 당뇨병성 망박증 및 소화성궤양 치료에 유용하다.
따라서, 본 발명의 목적은 싸이클헥사펩티드 소마토스테틴 유사체의 제조 방법을 제공함에 있다. 본 발명의 다른 목적은 선단거대중, 당뇨병성 망막증 및 소화성궤양 치료시에 상기 화합물을 사용하는 것에 대해 설명하고자 함에 있다.
본 명세서에서 "저급알킬"이라 함은 1-5개의 탄소원자가 있는 직쇄 또는 분지쇄의 알킬기를 나타낸다. 이러한 알킬기의 예를들면, 메틸, 에틸, 프로필, 이소-프로필, 부틸, 2급-부틸, 펜틸 등이 있다.
"저급알콕시"라 함은 1-5개의 탄소원자가 있는 직쇄 또는 분지쇄의 알콕시를 나타낸다. 이러한 알콕시기의 예를들면 메톡시, 에톡시, 프로톡시, 이소프로폭시, 부톡시, 3급-부톡시, 펜톡시 등이 있다.
"할로겐" 또는 "할로"라 함은 불소, 염소, 브롬 및 요오드 등이다.
"5 또는 6원 헤테로싸이클 환"이라 함은 산소, 질소 및 황으로부터 선택된 1 또는 2개의 헤테로원자가 있는 5- 및 6- 원 헤테로싸이클을 포함한다. 이러한 헤테로 싸이클의 예로는 이미다졸, 푸란, 티아졸, 피라졸, 피리딘 등이 있다.
본 발명의 화합물중 각종 비대칭 중심은 이러한 화합물에 대한 광학 이성체를 존재케한다. 본 발명은, 본 싸이클 헥사펩티드를 구성하는 아미노산의 비대칭 중심에 대해 D 및 L배치를 포함한다.
당 업계에서는, 소마토스테틴의 7,8,9,10,11번의 아미노산(-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-)이 존재하고(즉 R1,R2가 벤질이고 R3가 인돌릴, Y가 메틸렌, R4가 1-하이드록시에틸인 경우)2급 아미노산이 기타 소마토스테틴의 아미노산에 치환되어 있는(구조식 (1)에서 R5가 메탈인 경우 N-메틸알라닌으로서 존재하고, 구조식(2)에서 X가 메틸렌인 경우 프롤린으로서 존재한다) 화합물이 평가될 수 있다.
따라서, 상술한 치환기 정의를 사용하는 다음의 전형적인 소마토스 테틴의 싸이클 헥사펩티드 유사체가 구조식(1)로 형성된다.
Figure kpo00004
본 발명의 싸이클 헥사펩티드의 바람직한 형태는 Y가 (CH2)n이고 n이 1이며, R1및 R2가 상술한 바와 같고, R3가 3-인돌릴 메틸 또는 치환기가 메톡시 또는 불소인 치환 인돌릴 메틸이며, R4가 메틸, 에틸, 하이드록시 메틸 또는 하이드록시 에틸이고, R5가 메틸인 경우의 상술한 일반식(1)을 들 수 있다.
또한 바람직한 형태로는 Y가 메틸렌이고, R1및 R2가 상술한 바와 같으며, R3가 3-인돌릴 메틸, R4는 하이드록시 에틸, R5가 메탈인 일반식(1) 화합물을 들 수 있다.
바람직한 R1및 R2는 저급알킬, 벤질 또는 치환기가 저급알킬, 할로겐, 하이드록시, 아미노, 니트로 또는 알콕시인 치환 벤질이다.
이것의 바람직한 화합물에는 다음과 같은 것이 포함된다.
싸이클로-(N-Me-Ala-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Phe)
싸이클로-(N-Me-Ala-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe)
싸이클로-(N-Me-Ala-Phe-L-Trp-Lys-Thr-Phe)
싸이클로-(N-Me-Ala-Phe-D-Trp-Lys-Thr-P-Cl-Phe)
싸이클로-(N-Me-Ala-Phe-D-5-F-Trp-Lys-Thr-Phe)
싸이클로-(N-Me-Ala-Phe-L-5-F-Trp-Lys-Thr-Phe)
싸이클로-(N-Me-Ala-Phe-D. Trp-Lys-Ser-Phe)
상술한 치환기 정의를 사용하면, 소마토스테틴의 싸이클 헥사펩티드 유사체는 다음 구조식(2)로 형성된다.
Figure kpo00005
본 발명의 싸이클 헥사펩티드의 바람직한 형태는 X 및 Y가 (CH2)n이고 n이 1이며, R1및 R2가 상술한 바와 같고, R3는 3-인돌릴 메틸 또는 치환기가 메톡시 또는 불소 치환 인돌릴 메틸, R4는 메틸, 에틸, 하이드록시 메틸 또는 하이드록시 에틸인 경우의 일반식(2) 화합물을 들 수 있다.
또한 바람직한 형태는 X 및 Y 가 에틸렌이고, R1및 R2는 상술한 바와 같으며, R3는 3-인돌릴 메틸, R4는 하이드록시 에틸인 일반식(2) 화합물을 들 수 있다.
바람직한 R1및 R2기는 저급 알킬, 벤질, 치환기가 저급알킬, 할로겐, 수산기, 아미노, 니트로 또는 알콕시인 치환 벤질이다.
이것의 바람직한 화합물에는 다음과 같은 것이 포함된다.
싸이클로-(Pro-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Phe)
싸이클로-(Pro-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe)
싸이클로-(Pro-Phe-L-Trp-Lys-Thr-Phe)
싸이클로-(Pro-Phe-D-Trp-Lys-Thr-P-Cl-Phe)
싸이클로-(Pro-Phe-D-5-F-Trp-Lys-Thr-Phe)
싸이클로-(Pro-Phe-L-5-F-Trp-Lys-Thr-Phe)
싸이클로-(Pro-Phe-D-Trp-Lys-Ser-Phe)
본 발명에서는 아미노산 성분, 혹종의 바람직한 보호기, 시약 및 용매에 대한 여러가지 약자를 사용하였다.
이러한 약자의 의를 표1에 기재하였다.
[표 1]
Figure kpo00006
본 발명에 따라서, 소마토스테틴 유사체인 신규 싸이클헥사 펩티드는 대응하는 직쇄 펩티드르 환화시켜 제조된다.
직쇄펩티드는 고체상 합성법을 사용하여 제조하였다.
따라서, 본 발명의 싸이클 헥사펩티드 소마토스테틴 유사체를 제조하는 방법은, 1) 고체상 수지에 결합된 보호 직쇄 펩티드를 제조하고 2) N-말단 아미노기를 선택적으로 탈보호하고 3) 수지로부터 직쇄 펩티드를 제거하고 4) 직쇄 펩티드를 환화제로 처리하여 아미드 결합을 형성시켜 싸이클 헥사펩티드를 얻고 5) 측쇄 보호기를 제거하는 것으로 구성된다.
직쇄 펩티드를 수지상에 서제조할 때, 어느 아미노산을 C-말단에 놓을 것인가는 일반적으로 중요하지 않으며 소망하는 소마토스테틴 유사체에 대응하는 직쇄 펩티드의 아미노산을 배열하는 것이 중요하다. 일단 직쇄 펩티드가 환화되면 어느 아미노산이 직쇄 펩티드의 C-말단에 있었는가는 이미 결정할 수 없다.
직쇄 펩티드는 환화되므로, 일반적으로 최초의 아미노산 선택은 중요하지 않으나 어떤 경우에 있어서는 혹종의 아미노산이 다른 것보다 바람직할 때가 있다. 예컨대 BOC기를 제거할 때 생기는 t-부틸 카보늄 이온은 D-Trp와 반응할 수 있다. 따라서, D-Trp를 직쇄 펩티드의 N-말단에 위치시키는 반응을 선택하게 되면 D-Trp가 최후에 결합됨으로 해서 t-부틸 카보늄 이온과 부딪히는 일이 최소한으로 억제된다. 이 형태를 선택하는 것은 어느 경우에나 가능한 것은 아니다(펩티드 중에 2개의 인돌을 함유하는 잔기가 있는 경우). 그러나, 이러한 반응의 감수성은 펩티드 합성 계획시에 고려되어야만 한다.
고체상(固體相)법에 따른 직쇄 펩티드의 합성은 클로로메틸화 수지상에서 계단식(stepwise) 방법으로 처리된다.
수지는 1-2% 디비닐벤젠과 스티렌을 공중합시켜 제조된 합성수지의 미립자(직경이 20-70미크론)로 조성되어 있다. 수지중의 벤젠환은 클로로메틸 메틸에테르 및 염화 제2주석을 사용하여 프리델-크라프트(Friedel-Crafts) 반응으로 클로로 메틸화하였다. 프리델-크라프트 반응은 수지가 수지 1그램당 0.5-5밀리몰의 염소를 함유할 때까지 지속하였다.
직쇄펩티드의 C-말단 아미노산으로 선택된 아미노산은 그의 아미노기보호 유도체로 전환된다. C-말단 아미노산의 카복실기는 불용성 중합수지에 공유결합으로 결합된다(예컨대 클로로메틸 치환 폴리스티렌 디비닐 벤젠수지에 존재하는 수지 결합된 염화 벤질의 카복실산 에스테르와 같이). 아미노 보호기가 제거된 후, 연속적으로 다음 아미노산의 아미노 보호 유도체를 디싸이클로 헥실카보디이미드와 같은 축합제로 결합시켰다.
아미노산 반응물질은 ONp 에스테르, 아미노산아지드 등과 같은 카복실 활성 아미노산의 형태로 사용될 수 있다.
탈보호 및 아미노산의 부가는 소기의 직쇄펩티드가 형성될 때까지 계속된다.
보호기의 선택은, 어떤 경우에는 축합조건에 의해 결정되고 어떤 경우에는 반응중에 함유되는 아미노산 및 펩티드에 따라 결정된다.
보통 사용되는 아미노-보호기에는 당업계에 공지된 것이 포함되는바, 예컨대 벤질옥시-카보닐(카보벤족시), p-메톡시 카보벤족시, p-니트로카보벤족시, t-부틸옥시카보닐 등과 같은 우레탄계 보호기가 있다. 후술하는 카복시 말단 반응 아미노산의 아미노기를 보호하는 데는 t-부틸옥시카보닐(BOC)를 사용하는 것이 바람직하다. BOC 보호기는 축합반응 후 또는 다음 반응전에 비교적 온화한 산의 작용(에컨대 트리플루오로 초산, 초산에틸 중의 염산)에 의해 간단히 제거된다.
Thr 및 Ser 의 OH기는 BZ1 기에 의해 보호될 수 있으며 Lys의 E-아미노기는 INOC 또는 2-클로로벤질옥시카보닐(2-C1-CBZ)기에 의해 보호될 수 있다.
Lys의 경우에, 직쇄펩티드가 환화된 후 HF 처리에 의해 BZ1기와 동시에 2-C1-CBZ가 제거될 수 있으므로 E-아미노기를 보호하는데 이 기를 사용하는 것이 바람직하다.
INOC기는 HF에 의해 제거되지 않고 Zn과의 부가적인 처리가 필요하다. BOC 보호기를 제거하기 위해 사용되는 TFA에 의해 다른 기는 영향받지 않는다. 직쇄펩티드가 환화된 후, 2-C1-CBZ 및 BZ1과 같은 보호기는 HF로 처리하여 제거된다.
직쇄 펩티드가 고체상 수지상에 형성된 후, 당업계에 공지된 여러 방법에 의해 수지로 부터 제거될 수 있다. 예컨대 펩티드는 하이드라진에 의해 수지로 부터 분리되어 직접 펩티드하이드라지를 형성하여 이것은 계속하여 아지드를 경유하며 소망하는 싸이클 펩티드로 환화된다. 하이드라지드는 원위치에서 아질산을 공급하는 시약과의 반응에 의해 상응하는 아지드로 변환된다.
이러한 목적에 적합한 시약에는 염산, 인산 등과 같은 강산의 존재하의 저급 알킬 니트리트(에컨대, t-부틸 니트리트, 이소아밀 니트리트) 또는 알카리금속 니트리트염(에컨대, 아질산나트륨, 아질산칼륨)등이 포함된다.
이 반응은 약 -40℃~20℃의 온도에서 물 및 /또는 디에틸 포름아미드, 테트라하이드로푸란, 디옥산, 클로로포름, 염화메틸렌 등과 같은 비수성 용매의 존재하에 수행된다. 다른 방법으로, 펩티드는 트리에틸 아민과 같은 유기염기의 존재하에 메탄올과 같은 저급 알코올로 처리하여 수지로 부터 제거되어 직쇄 펩티드의 상응하는 저급알코올 에스테르를 형성한다. 얻어진 에스테르는 하이드라지드로 변환된 후 아지드를 경유하여 소망하는 싸이클펩티드로 환화된다. 본 발명에서 수지로 부터 펩티드를 분리하기 위한 바람직한 방법은 하이드라진을 사용하는 것이다.
표 2에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 소망하는 싸이클 펩라이드를 제조하기 위한 한개의 바람직한 공정은 고체상 수지상에서 직쇄 펩티드를 단계식 합성하는 것이다.
특히,
Figure kpo00007
또는
Figure kpo00008
의 제조과정에 있어서, N-보호 아미노산 페닐알라닌의 카복실말단은 수지에 결합되는 벤젤 클로라이드의 카복실산 에스테르로서 불용성 중합수지에 공유결합한다. Phe의 아미노기는 BOC기에 의해 보호된다.
수지상에 Phe의 결합이 완결된 후, 보호기 BOC는 CH2Cl2중의 TFA로 처리하여 제거된다. 차후의 아미노산은 ONP와 같은 활성 에스테르 또는 축합제로서 DCCI를 사용하여 BOC-아미노산 형태로 부착된다. 소기의 직쇄 펩티드를 제조한 후, N-말단 아미노기를 선택적으로 탈보호하고 펩티드는 하이드라진과 처리하여 수지로 부터 제거한다. 탈 보호된 N-말단 아미노기를 가질 수 있는 직쇄 펩티드 하이드라지드는 다음 식과 같은 아미노산 배열을 갖는다.
Figure kpo00009
또는
Figure kpo00010
산성 pH 중에서 아질산 이소아밀로 처리하여 상응하는 아지드를 형성한다. 아지드 용액을 용매로 희석하고 유기염기로 중화한다. 직쇄 펩티드는 환화하여 다음식의 화합물을 형성한다.
Figure kpo00011
환화반응중에 pH를 측정하고 유기염기를 첨가하여 중성을 유지하였다. 유기용매의 pH는 용약소량을 좁은 범위의 pH 시험지 0,1 침투시켜 결정하였다.
직쇄 펩티드를 환화한 후, 보호기인 2-Cl-CBZ 및 OBZ1을 아니솔의 존재하에 HF로 처리하여 제거하였다. 얻어진 싸이클 로펩티드를 바람직하기는 실리카겔 상에서 컬럼 크로마토그래피 함으로서 정제하였다. 용출 용매는 일반적으로 박층 크로마토그래피를 사용하여 선택된 유기용매 또는 그의 혼합물이다.
[표 2]
본 발명의 싸이클 헥사펩티드를 제조하는 2개의 반응도식은 다음 일련의 반응에 의해 요약된다.
Figure kpo00012
Figure kpo00013
다음의 실시예에 의해 본 발명을 실해하는데 필요한 방법을 보여준다. 이 실시예는 발명을 설명하기 위한 것으로 발명을 한정하는 것은 아니다.
[실시예 1]
D-Trp-(ε-2-Cl-CBZ)Lys-(OBZ1)Thr-Phe-Pro-Phe-OCH2
Figure kpo00014
-수지에 제조
2.75meg·염소/g 의 클로로메틸 수지(2% 교차 결합된 메리필드(Merrifield) 수지) 및 607.0g(2.37몰, 1당량)의 BOC-Phe를 4320ml의 과산화물에 제거된 테트라하이드로 푸란에 가하였다. 혼합물을 80℃의 오일욕중에서 45분간 교반하였다. 310.0ml의 트라에틸아민 3몰을 가하고 반응혼합물을 80℃ 욕에서 70시간 동안 교반한 후 25℃로 냉각시켜서, 2000ml의 테트라하이드로푸란에 의해 고체상 반응 컬럼에 이동하였다. 용매제거 후, 3×2000ml의 테트라하이드로푸란, 4×5170ml 의 에탄올 1×5170ml의 아세트산, 3×5170ml의 물, 3×5170ml의 메탄올, 3×5170ml의 클로로포름으로 된 용매를 사용하여 컬럼을 사용한 수지를 세척하였다. BOC-Phe-O-CH2
Figure kpo00015
-수지를 25℃에서 16시간 동안 진공 건조하여 1.2밀리몰의 페닐알라닌/수지 1g을 함유하는 1203g의 BOC-Phe-O-CH2
Figure kpo00016
-수지를 얻었다.
BOC-Phe-O-CH2
Figure kpo00017
-수지(2.13g, 2.0밀리몰)을 요망하는 BOC-헥사펩티드-O-CH2
Figure kpo00018
-수지가 얻어질 때까지 표3 및 표4의 방법에 따라, 염화메틸렌 중 25% TFA 에 의한 2회 탈보호(2분 및 25분)하고 2.5당량씩 배열된 BOC-아미노산을 사용하여 반응을 하였다.
DCCI를 모든 단계에서 유일한 축합제로서 사용하였다.
각 아미노산의 축합은 간단하게 진행되었다. 축합을 각 단계에서 반복하였을 때 최고의 수율이 얻어졌다. 축합을 반복하는 경우 초기의 2회의 클로로포름 세척; 탈보호 및 3회의 클로로포름 세척을 모두 생략하고 1회의 클로로포름 세척으로 대신하였다.
축합반응은 메틸렌클로라이드, 신선한 탈공기된 DMF 또는 이들 두 용매의 혼합물중에서 실시하였다. N-말단 아미노기는 전체 경우에, BOC기로 보호되며, Thr의 수산기는 BZ1기로 보호되고 Lys의 ε-아미노기는 2-Cl-CBZ로 보호된다. 소망하는 BOC-헥사펩티트-O-CH2
Figure kpo00019
-수지가 얻어지는 경우 N-말단 BOC기는 표5에 기재된 탈호보 공정에 의해 제거된다.
표 3,4, 및 5의 방법을 행한 후, 보호된 헥사펩티드-O-CH2
Figure kpo00020
-수지를 철야건조시켜 3.7g의 물질을 얻었다.
[표 3]
Figure kpo00021
[표 4]
Figure kpo00022
[표 5]
Figure kpo00023
[실시예 2]
D-Trp-(ε-2-Cl-CBZ)Lys-(OBZl) Thr-Phe-N-Me-Ala-Phe-NHNH2의 제조
실시예 1로 부터의 수지를 실온에서 1시간 동안 30ml의 디메틸아세트아미드 및 하이드라진의 2:1 혼합물과 혼합하였다. 불용성 수지를 여과하여 제거하고 용액을 증발시켜 디메틸아세트아미드를 제거하였다. 잔사를 고도의 진공하에 철야 방치하여 모든 휘발성물질을 제거하였다. 메탄올에 잔사를 용해시켜서 얻은 기포를 여과하고 증발건조시켰더니 2.19g의 물질이 얻어졌다.
[실시예 3]
D-Trp-(ε-2-Cl-CBZ)Lys-(OBZl) Thr-Phe-N-Me-Ala-Phe-N3의 제조
실시예 2로 부터의 기포를 질소 블랭킷(blanket) 하에서 15ml의 탈가스된 디메틸포름아미드와 혼합하고 -10℃까지 냉각시켜서 테트라하이드로푸란(2.21ml) 중의 5당량의 4.52M 염화수소를 첨가하였다. 용액을 -25℃까지 냉각시키고 전분/KI 시험이 양성으로 될 때까지 5ml의 아질산 이소아민 및 디메틸포름아미드 1:19 혼합물을 소량씩 가하였다. 반응 수량은 박층 크로마토그래피에 의해하 이드라지드 출발물질이 소멸되는 것에 의해 검출된다.
[실시예 4]
싸이클로 (D-Trp-(ε-2-Cl-CBZ)Lys-(O-BZl) Thr-Phe-N-Me-Ala-Phe)의 제조
실시예 3의 아지드 화합물을 600ml의 탈가스된 디메틸포름아미드에 가하고, -25℃까지 예냉각시켜서 트리에틸아민으로 pH를 8로 조절하고 반응 혼합물을 냉동기에 철야 방치하였다.
필요에 따라 약 14시간 후에 pH를 8까지 재조절하고 혼합물을 -20℃에서 16시간 동안 보존하고 다시 5℃에서 16시간 동안 보존하였다. 박층 크로마토그래피는 반응이 완결되었음을 나타낸다. 혼합물을 농축 건조시켜서 150ml의 3:1 디메틸포름아미드/물 혼합물에 용해시키고 1시간 동안 혼합상 음이온-양이온 교환수지로 처리하였다. 혼합물을 여과하고 오일이 되도록 진공 건조시켜 농축시키고, 잔사를 메탄올로 분쇄하여 1.91g%의 백색고체를 얻었다.
[실시예 5]
싸이클로 (D-Trp-Lys-Thr-Phe-N-Me-Ala-Phe)의 제조
실시예 4의 1.91g(1.8밀리몰)의 보호된 싸이클로헥사펩티드를 테프론(teflon) 배열시킨 실에서 2ml의 아니솔과 혼합하였다. 실을 비우고 실온에서 드라이아이스/아세톤 욕의 액체 불화수소를 충전시켰다. 온도를 0℃까지 상승시키고 1시간동안 교반을 지속하였다. 불화수소를 증발시키고 슬러리가 형성될때 까지 진공하에 잔사를 방치하였다. 슬러리를 에틸아세테이트로 분쇄하고 여과하여 1.29g의 미세분말을 얻었다. 분말을 300g의 실리카겔 상에 두고 10:5:1:3의 EPAW혼합물로 용출시키고 9ml씩의 유분으로 용출시켰다. 유분 55-66을 혼합하고 농축시켰다. 생성물을 클로로포름, 에틸아세테이트 및 헥산 혼합물로 부터 침전시켜 679ml을 얻었다.
[실시예 6]
D-Trp(2-Cl-CBZ)Lys-(OBZl) Thr-Phe-Pro-Phe-NHNH2의 제조
실시예 1로 부터의 수지를 30ml의 디메틸아세트아미드 및 하이드라진의 2:1 혼합물과 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 불용성수지를 여과하여 제거하고 용액을 증발시켜 디메틸아세트아미드를 제거하였다. 잔사를 고도의 진공하에 철야 방치하여 모든 휘발성 물질을 제거하였다. 잔사를 메탄올에 용해시켜 얻어진 기포를 여과하여 증발 건조시켜 1.84g의 물질을 얻었다.
[실시예 7]
D-Trp-(2-Cl-CBZ)Lys-(OBZl) Thr-Phe-Pro-Phe-N3의 제조
실시예 2의 기포를 질소 블랭킷하에 15ml의 탈가스된 디메틸포름아미드와 혼합하고 -10℃까지 냉각시켜서 테트라하이드로푸란(1.7ml)중의 5당량의 5.8M 염화수소를 가하였다. 용액을 -25℃까지 냉각시키고 디메틸포름아미드중의 이소아밀니트릴의 1:19 혼합물 5ml를 가하였다. 박층 크로마토그래피에 의해 하이드라지드 출발물질의 소멸에 의해 반응의 완결을 검출하였다.
[실시예 8]
싸이클로 (D-Trp-(2-Cl-CBZ)Lys-(O-Bzl)Thr-Phe-Pro-Phe)의 제조
실시예 3의 아지드 화합물에 600ml의 탈가스된 디메틸포름 아미드를 가하고 -25℃까지 냉각시켜서 pH를 8로 조절하고 반응 혼합물을 냉동기에 철야 방치하였다. 필요에 따라 약 14시간 후에 pH를 8로 재조절하고 혼합물을 -20℃에서 16시간, 5℃에서 16시간동안 방치하였다. 박층 크로마토그래피는 반응이 완료되었음을 보여주었다. 혼합물을 농축 건조시켜서 150ml의 3:1 디메틸포름아미드/물 혼합물에 용해시키고 혼합상 음이온-양이온 교환수지로 2시간동안 처리하였다. 혼합물을 여과하고 진공에서 농축 건조시켜서 잔사를 메탄올에 용해시키고 여과하여 증발 건조시켜서 기포를 형성하였다.
[실시예 9]
싸이클로 (D-Trp-Lys-Thr-Phe-Pro-Phe)의 제조
실시예 4의 2.13g(2밀리몰)의 보호된 사이클로헥사펩티드를 테프론 배선된 실에서 2ml의 아니솔과 혼합하였다. 실을 비우고 실온에서 드라이아이스/아세톤 욕의 액체 불화수소를 충전시켰다. 온도를 0℃까지 상승시키고 1시간동안 교반을 지속하였다. 불화수소를 농축시키고 슬러리가 형성될때까지 잔사를 진공에 방치하였다. 슬러리를 에틸아세테이트로 처리하고 여과하여 1.19g의 미세한 분말을 얻었다. 이 분말 300mg을 1000μ 실리카겔 조제용 박층 크로마토그래피판에 놓고 클로로포름, 메탄올 및 농축 수성암모니아의 70:30:5 혼합물로 용출시켜 200mg의 생성물을 얻었다. 잔류하는 조잡한 생성물을 실리카겔 컬럼에 방치하고 동일 용매로 용출시켰다. 용출액중의 생성물의 존재는 박층 크로마토그래피에 의해 결정하고 동결 건조시킨 후 약 510mg의 생성물이 얻어졌다.
상기 공정에 따라, 실시예 1의 방법의 아미노산의 선택 및 순서를 변화시켜서 본 발명의 기타 싸이클헥사펩티드를 제조하였다.
이 소마토스테틴의 싸이클헥사펩티드 유사체를 성장호르몬의 억제의 생체 시험에 있어서 소마토스테린의 효과에 대해 비교하였다. 시험은 다음과 같이 기술된다.
O' Malley, B.W. 및 Hardman,J.G.(Academic Press,Inc., New York)Vol.XXXVII, eds. PP. 5-93(1975)편의 Methods in Enzymology의 Vale and Grant의 "In Vitro Pituitary Hormone Secretion As-say for Hypophysiotropic Substances" 따라 쥐 뇌하수체를 분리하였다.
배양한지 4일후, 세포를 세척하고, 소마토스테틴 또는 유사체 적당량의 존재하 또는 부재하에서 Dulbe-cco modified Eagle 배치중에서 4시간동안 배양하였다. 쥐의 성장호르몬에 대한 2항체 라디오이뮤노어세이(radioimmunoassay)에 의해 차후의 성장호르몬을 측정하기 위하여 배지를 수집하였다.
본 발명 화합물에 대한 시험결과를 소마토스테틴에 대한 결과와 함께 아래에 기록한 바, 기준치를 1로 정했다. 본 발명 화합물에 대한 결과를 소마토스테틴의 효과에 대해 배수 또는 분수 기재하였다. 괄호안의 숫자는 앞의 숫자에 대한 기준한계이다. 열거된 본 발명 화합물의 첫째는 실시예 1-5에서 제조된 화합물이다. 화합물은 약간 상이하게 기술되었지만, 소마토스테틴 중에서 보여지는 아미노산 순서에 적합한 것이다.
소마토스테틴 싸이클헥사펩티드 유사체의 활성
Figure kpo00024
Figure kpo00025
본 소마토스테틴 싸이클헥사펩티드 유사체의 효과를 다음 공정에 의해 결정하였다.
만성 위에 구멍이 있는 개에서 펜타가스트린에 의해 유발시킨 위산분비를 억제하기 위한 능력에 대해 화합물을 시험하였다. 만성 위궤양이 숫컷 사냥개에 펜타가스트린(2.5μg/kg/시간으로 -60~120분동안 정맥내 주사)을 주입하고 카놀레를 통하여 위의 배출물을 수집하였다. 시료는 매 30분당의 용량(ml) 및 적정가능한 산(mEq/L)(0.01N NaOH로 pH7까지 적정)이다.
배출된 총산은 배출된 용량과 산의 농도로서 계산되었다. 시험 화합물을 0-60분의 일정한 속도로 주입하였다. 데이타는 동일한 동물에서 위약 투여에 관련하여 총산 배출물의 변화율 %로 표현되었다.
다음 데이타에서, 소마토스테틴에 대한 결과를 비교하기 위하여 첫번째로 기재하였다.
위액분비에 대한 소마토스테틴 유사체 사이클헥사펩티드의 효과
(투여량 0.8μg/ml/분 0~60분 주입)
Figure kpo00026

Claims (1)

  1. 클로로메틸화 수지상에 BOC-Phe,BOC-N-Me-Ala 또는 BOC-Pro, BOC-Phe, BOC-(OBZl)Thr, BOC-(ε-2-Cl-CBZ)Lys 및 BOC-D-Trp를 단계적으로 합성하여 다음 일반식(1)' 및 (2)'의 직쇄 펩티드를 제조하고,
    Figure kpo00027
    환화제로 처리하여 싸이클 헥사펩티드를 얻고, 보호기를 제거하는 것으로 구성된 다음 일반식(1) 및 (2)의 싸이클 헥사펩티드 소마토스테린 유사체의 제조방법.
    Figure kpo00028
    Figure kpo00029
    식중,
    Figure kpo00030
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