DK151034B

DK151034B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af somatostatinanaloge cyclopeptider eller fysiologisk taalelige syreadditionssalte eller komplekser deraf

Info

Publication number: DK151034B
Application number: DK428478AA
Authority: DK
Inventors: Hans Rink; Bruno Kamber; Peter Sieber
Original assignee: Ciba Geigy Ag
Priority date: 1977-09-28
Filing date: 1978-09-27
Publication date: 1987-10-12
Also published as: NO148957C; JPS6218560B2; IE47380B1; NO783268L; DK428478A; NO148957B; JPS5459293A; AT370090B; AU4022978A; LU78191A1; US4238481A; IL55643A; IE781931L; HU184612B; AU523050B2; EP0001295A3; CA1111841A; EP0001295A2; FI68246C; IL55643A0

Description

151034

Den foreliggende opfindelse angår en analogifremgangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte somatostatinanaloge cyclopeptider med den almene formel

Lr - Phe - Phe - trp - Lys - Thr - Phe(W) - X - Y-J (I) 5 6 7 8 9 10 11 12 13 5 hvori R betyder Asn eller des-R, trp betyder D-Trp eller L-Trp, som i benzenringen kan være substitueret med et halogenatom eller en nitrogruppe, W betyder hydrogen eller i benzenringen i L-phenylalanylgruppen som substituent tilstedeværende eventuelt med C^_^-alkyl forethret hydroxyl eller 10 halogen, X betyder en u)-amino-C^_y-alkan- (mono eller di)-carb-oxylsyrerest eller des-X, og Y betyder en m-amino-C-L_^-alkan-(mono eller di)-carboxylsyrerest eller des-Y, med den undtagelse, at i en forbindelse, hvori R betyder des-R, trp betyder D-Trp eller L-Trp, W betyder hydrogen, og et af symboler-15 ne X og Y betyder des-X eller des-Y og det andet en ω-amino-alkancarboxylsyrerest, er denne forskellig fra en 7-amino-heptansyrerest, eller fysiologisk tålelige syreadditionssalte eller komplekser deraf.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at 20 man fra en forbindelse med formlen ^R-phe-Phe-trp-Lys(A)-Thr(B)-Phe(W)-X'-Y'J (II) hvori R, W og trp har de ovennævnte betydninger, X' har den ovenfor for X anførte betydning eller betyder en i den exo-cycliske carboxylgruppe ved forestring beskyttet ω-amino-25 C-^_^-alkandicarboxylsyrerest, Y" har den ovenfor for Y anførte betydning eller betyder en i den exocycliske carboxylgruppe ved forestring beskyttet u)-amino-C^_7-alkandicarboxylsyre-rest, A betyder en ε-aminobeskyttelsesgruppe eller hydrogen, og B betyder en hydroxylbeskyttelsesgruppe eller hydrogen, 30 idet kun et af symbolerne A og B kan betyde hydrogen, fraspalter beskyttelsesgruppen eller -grupperne og, om ønsket, fra et opnået syreadditionssalt frigør den tilsvarende base 2 151034 og/eller omdanner en opnået base til et syreadditionssalt eller et kompleks deraf.

Cyclopeptiderne med formlen I har somatostatins væsentligste kendetegn, såsom delsekvensen af aminosyrerne 5-11, eller en 5 ækvivalent sekvens, men er svovlfri.

g

De i benzenringen i tryptophan -resten eventuelt tilstedeværende halogenatomer befinder sig fortrinsvis i 5-stillingen og nitrogruppen fortrinsvis i 6-stillingen. Især skal nævnes de af 5-brom-L-tryptophan, 5-fluor-D-tryptophan og 10 6-nitro-D-tryptophan afledte rester. En eventuelt substitu ent W i L-phenylalanin^-resten befinder sig fortrinsvis i p-stilling i benzenringen. Særligt foretrukket foruden den usubstituerede L-phenylalaninrest er også p-iod-L-phenyl-alanin- og p-hydroxy-L-phenylalaninresten. Hydroxylgruppen 15 i den sidstnævnte rest (dvs. L-tyrosinresten) kan også foreligge i en med C-,_7-alkyl forethret form. Især foretrækkes 1 11 tert-butylgruppen, og den foretrukne aminosyre -rest er afledt af p-tert-butoxyphenylalanin (dvs. tyrosin-tert-butyl-ether).

20 Ved en særlig udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstiller man en forbindelse med formlen I, eller et syreadditionssalt eller et kompleks deraf, hvori R betyder Asn eller des-R, trp betyder D-Trp eller L-Trp, W betyder hydrogen, X betyder en ω-amino-C-j^-alkanmonocarb-25 oxylsyrerest eller des-X, og Y betyder en ω-amino-C^_y-alkan-monocarboxylsyrerest eller des-Y, med den undtagelse, at i en forbindelse, hvori R betyder des-R, og en af grupperne X og Y betyder des-X eller des-Y, er ω-aminoalkanmonocarb-oxylsyren forskellig fra 7-aminoheptansyre.

30 En æ-amino-C^_^-alkanmonocarboxylsyrerest er fortrinsvis en rest med formlen -NH-(CHJ -CO-2 n 3 151034 hvori n betyder et helt tal fra 1 til 7, især 2 til 4.

Særlig foretrukket er en γ-aminosmørsyrerest, som betegnes med symbolet Gaba (n = 3).

En a)-amino-C^_7-alkandicarboxylsyrerest afledes fortrinsvis 5 af en rest med formlen -NH-CH-(CH2)n_1-CO-

COOH

hvori n har den ovenstående betydning. Særlig foretrukket er en L- eller især Sr-glutaminsyrerest med formlen

-NH-CH-(CH0)~-CO-| 2 Z

COOH

5 Svarende til den almindelige nomenklatur betyder præfixet "des", at et dermed betegnet symbol mangler; således betyder f.eks. udtrykket "des-X", at symbolet X bar betydningen [X]m, hvori m = O og skal udelades i den tilsvarende formel.

De foretrukne omhandlede somatostatinanaloge er sådanne,

O

10 hvori R fortrinsvis står for Asn eller des-R, tryptophan -resten har D-konfiguration,og -X-T- sammen betyder -[Gaba] hvori p er 0, 1 eller 2. Som særligt foretrukket skal fremhæves forbindelser med formlen L Asn-Phe-Phe-[ D-trp] -Lys-Thr-Ehe-[ Gaba]^ (IA) 5 6 7 8 9 10 11 15 hvori p = 2 eller især p = 1. Alle disse foretrukne somatostatinanaloge kan også foreligge i form af syreadditionssalte eller komplekser.

Syreadditionssalte er salte med almindelige fysiologisk tålelige syrer. Blandt de uorganiske syrer skal nævnes hydrogen-20 halogenider, såsom saltsyre/ men også svovlsyre og phosphor- eller pyrophosphorsyre. Blandt de organiske syrer skal i første række nævnes sulfonsyrer, såsom benzen- eller 4 151034 p-toluensulfonsyre, eller lavalkansulfonsyrer, såsom methan-sulfonsyre, endvidere også carboxylsyrer, såsom eddikesyre, mælkesyre, palmitin- og stearinsyre, æblesyre, vinsyre, ascor-binsyre og citronsyre.

5 Yed komplekser skal forstås forbindelser, som har en endnu ikke fuldstændig afklaret struktur og opstår yed tilsætning af visse uorganiske eller organiske stoffer til peptider, og som giver disse en forlænget virkning. Sådanne stoffer er eksempelvis beskrevet for ACTH og andre adrenocorticotropt 10 virksomme peptider. Hævnes skal f.eks. uorganiske forbindelser, som afledes af metaller, såsom calcium, magnesium, aluminium, cobalt og især zink, fremfor alt tungt opløselige salte, såsom phosphater, pyrophosphater og polyphosphater, samt hydroxider af disse metaller, endvidere alkalinetal-15 polyphosphater, f.eks. "Calgon SF"^ "Oalgon 322"f, "Calgon 188”® eller "Polyron B 12". Organiske stoffer, som fremkalder en forlængelse af virkningen, er eksempelvis ikke-anti-gene gelatinearter, f.eks. polyoxygelatine, polyvinylpyrro-lidon og carboxymethylcellulose, endvidere sulfonsyre- eller 20 phosphorsyreestere af alginsyre, dextran, polyphenoler og polyalkoholer, fremfor alt polyphioretinphosphat og phytin-syre, samt polymerisater og copolymerisater af basiske eller fremfor alt sure aminosyrer, f.eks. protamin eller polyglut-aminsyre.

25 De omhandlede cyclopeptider har en fysiologisk virkning, som i karakter og intensitet er ækvivalent med somatostatins virkning. De kan derfor med fordel anvendes ved lignende terapeutiske indikationer som somatostatin, f.eks. til behandling af funktionsforstyrrelser, hvorved sekretionen af væksthormon el-30 ler af insulin og glucagon er unormal høj, såsom ved acromegali eller juvenil diabetes.

Somatostatin er et cyclisk tetradecapeptid med formlen

I-- I

H-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 W

5 151034 (Science 179? 77 (1973))/ der som bekendt hæmmer den hypofysestyrede sekretion af væksthormonet (Somatotropin). Desuden hæmmer det den sekretoriske aktivitet af den endokrine pancreas, såsom sekretionen af insulin og glucagon.

5 Disse værdifulde egenskaber kan hos somatostatin selv ikke nå til fuld praktisk anvendelse, da den komplicerede kemiske struktur står i vejen for en teknisk syntese af denne forbindelse. Ved siden af det store antal aminosyrer er også tilstedeværelsen af cystin en særlig ulempe: på grund af 10 sit svovlindhold forhindrer denne aminosyre anvendelse af de yderst fordelagtige hydrogenolytisk fraspaltelige beskyttelsesgrupper. Det er senere lykkedes at afhjælpe sidstnævnte ulempe, jfr. DE-offentliggørelsesskrift nr. 2.656.849, SE-fremlæggelsesskrift nr. 409.703 og J.Am.Chem.Soc. 98, 15 2367-2369 (1976), idet man uden nævneværdig forringelse af den gunstige fysiologiske virkning ikke blot kan udelade de to første aminosyrerester, som sidder udenfor peptidringen, men også kan ombytte den i peptidringen tilstedeværende svovlholdige cystinrest med en analog opbygget (isoster), men 20 svovlfri lineær α-amino-(C^_g)-alkan(mono- eller di)carboxyl-syrerest. Halvdelen (7 af 14) af aminosyrerne i somatostatin indeholder yderligere funktionelle grupper i sidekæden, og i de fra de nævnte trykskrifter kendte forbindelser findes stadig 5 af disse aminosyrer. Disse grupper kræver på den ene 25 side en særlig midlertidig beskyttelse, på den anden side forhø jer de risikoen for racemisering betragteligt og komplicerer følgelig syntesebetingelserne yderligere.

Det har nu overraskende vist sig, at man i somatostatinmole-kylet kan udelade flere af disse substituerede aminosyrer, 30 især også cystin, eller erstatte dem med simple, optisk inaktive aminosyrer under bibeholdelse af den fysiologiske aktivitet, hvilket illustreres nærmere i det følgende.

De omhandlede forbindelsers inhiberende virkning på insulinsekretionen er bestemt in vivo på mus. Nedenfor anføres re-35 sultaterne udtrykt som ED^rvcø/ hvilket er den mængde aktivt 6 151034 stof i mg/kg, son ved en enkelt parenteral indgift til forsøgsdyret fonnindsker udskillelsen af endokrint insulin ned gennemsnitligt 50% (ved enkelte dyr mindst 20%). Somatostatin giver en ED på 0,03 mg/kg.

Aktivt stof Eks.nr. ED20-50 5 Cyclo-[D-Trp®, Gaba'^Gaba'*'®]-somatostatin- (mg/kg) (5-13)-nonapeptid (2) 0,1 8 12 cyclo-[D-Trp ,Gaba ]-somatostatin-(5-12)- octapeptid (1) 0,01 8 12 cyclo-[D-Trp ,Dava ]-somatostatin-(5-12)- 10 octapeptid ( 4) 0,01-0,03 8 12 cyclo-[D-Trp ,Bala ]-somatostatin-(5-12) - octapeptid ( 5) 0,1-0,3 o το cyclo-[D-Trp , D-i-Glu ]-somatostatin- (5-12)-octapeptid (6) 0,03 15 cyclo- [D-Trp® ,Gly^] -somatostatin- (5-12) - octapeptid (10) 1 cyclo- [D-Trp (5-E)®,Gaba^^] -somatostatin- (5-12) - octapeptid (11) 0,1 8 12 cyclo- [D-Trp (β-ΝΟ^) r Gaba ] -somatostatin- 20 (5-12)-octapeptid (12) 0,3 8 11 12 cyclo-[D-Trp ,Phe(3-J) jGaba^ ]-somatostatin- (5-12)-octapeptid (14) 0,3 8 11 12 cyclo-[D-Trp ,Tyr(But) ,Gaba ]-somatostatin.- (5-12)-octapeptid (15) 1

O

25 cyclo-[D-Trp ]-somatostatin-(6-11)-hexapeptid ( 7) 3

Gaba = γ-aminosmørsyre, Dava = δ-aminovalerianesyre,

Bala = β-alanin, D-i-Glu = D-Y-amino-Y-carboxysmørsyre.

De omhandlede forbindelsers inhibering af insulin- og gluca-gon-sekretionen er desuden bestemt in vivo på rotter. Resul-30 taterne er anført nedenfor i form af ED20-50f som er ^en mængde aktivt stof i mg/kg, scm ved en enkelt parenteral indgift til forsøgsdyret inhiberer sekretionen af endokrint insulin (INS) og glucagon (GLG) med gennemsnitligt 50% (ved enkelte dyr med mindst 20%). Somatostatin giver Ιϋ^Ο-δΟ på 0,1 (INS)/0,3 (GIG) mg/kg.

7 151034

Aktivt stof Eks.nr. ED20-50

INS/GLG

mg/kg 8 12

Cyclo-[D-Trp ,Gaba Δ]-somatostatin-(5-12) - octapeptid ( 1) 0,001- 0,01/0,03 8 12 cyclo-[D-Trp ,Dava]-somatostatin-(5-12)- 5 octapeptid ( 4) 0,003- 0,01/0,1 8 12 cyclo-[D-Trp ,D-i-Glu ]-somatostatin-(5-12) octapeptid ( 6) 0,003/0,1

Den tekniske fordel ved syntese af somatostatinaktive stoffer kan allerede ses klart af, at 13 optisk aktive aminosyrer 10 (deraf 7 med endnu en beskyttet funktionel gruppe) er nødvendige som byggesten til syntese af somatostatin, hvorimod man ved de omhandlede forbindelser klarer sig med højst 7 optisk aktive aminosyrer (deraf kun 2 med endnu en beskyttet funktionel gruppe).

15 Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan der som ε-amino-beskyttelsesgrupper anvendes alle i peptidkemien almindelige aminobeskyttelsesgrupper, f.eks. de, der beskrives sammenfattende i tilsvarende opslagsværker, f.eks. i Houben-Weyl: Methoden der organischen Chemie, 4.oplag, bind 15/1.

20 E.Wunsch (udgiver): Synthese von Peptiden. (Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1974). Foretrukne er acidolytisk fraspaltelige grupper, såsom i første række tert.butoxycarbo-nylgruppen og analoge grupper, f.eks. tert.amyloxycarbonyl-, isopropoxycarbonyl-, diisopropylmethoxycarbonyl-, allyloxy-25 carbonyl-, cyclopentyloxycarbonyl-, cyclohexyloxycarbonyl-, d-isobornyloxycarbonyl- og adamantyloxycarbonyl-gruppen, samt grupper af aralkyltype, såsom benzhydryl og triphenyl-methyl (trityl), eller bestemte aralkoxycarbonylgrupper af 2-(p-biphenylyl)-2-propoxycarbonyltype, som er beskrevet 30 i schweizisk patentskrift nr. 509.266.

8 151034

Endvidere kan man dog også anvende reduktivt eller "basisk fraspaltelige aminobeskyttelsesgrupper, f.eks. især benzyl-oxycarbonylgruppen og benzyloxycarbonylgrupper, der i den aromatiske del er substitueret med halogenatomer, nitro-5 grupper, lavalkoxygrupper og/eller lavalkylgrupper, såsom p-chlor- og p-brombenzyloxycarbonyl-, p-nitrobenzyloxy-carbonyl-, p-methoixybenzyloxycarbonyl- og p-tolyloxycarbo-nylgruppen, eller også isonicotinyloxycarbonylgruppen, endvidere også acylgrupper, såsom p-toluensulfonyl, benzen-10 sulfenyl, o-nitrobenzensulfenyl eller også formyl, trifluor-acetyl eller pbtbaloyl.

En. særlig fordelagtig e-aminobeskyttelsesgruppe er en ethoxy-carbonylgruppe, som i β-stilling bærer en med tre carbon-bydridgrupper substitueret silylgruppe, såsom en triphenyl-15 silyl-, dimethyl-butyl-silyl- eller fremfor alt trimethyl-silylgruppe. -En sådan β-(tribydrocarbylsilyl)-ethoxycarbonyl-gruppe, såsom en p-(trilavalkylsilyl)-etlioxycarbonyl-, f.eks. især en β - (trime thylsilyl) -ethoxycarbonylgruppe, danner med ε-aminogruppen, der skal beskyttes en tilsvarende 20 β-trilydrocarbylsilyl-etliosycarbonylaminogruppe (f.eks. en β-trime tbylsilylethoxycarbonylaminogruppe), som er bestandig mod betingelserne ved sur hydrolyse og ved hydro geno lyse, men som under ganske specifikke, meget milde betingelser kan fraspaltes ved indvirkning af fluoridioner. I denne henseen-25 de forholder den sig analogt med den nedenfor som carboxyl-beskyttelsesgruppe beskrevne β-silylethylestergruppe. (Denne lighed må tages særligt i betragtning ved syntesen; bortset fra enkelte tilfælde udelukker anvendelse af den ene af disse beskyttelsesgrupper den samtidige anvendelse 30 af den anden beskyttelsesgruppe). Andre enkeltheder er angivet nedenfor ved beskyttelse af earboxylgruppen med β-silylethylestere.

Som hydroxybeskyttelsesgruppe kan anvendes alle til dette formål i peptidkemien almindelige grupper, jfr. det ovenfor 35 citerede -værk (Houben-Weyl). Foretrukne er acidolytisk fra- / 9 151034 spaltelige grupper, såsom 2-tetrahydropyranyl og ganske særligt tert.butyl, samt tert.butoxycarbonyl. Endvidere kan man dog også anvende reduktivt eller basisk fraspaltelige hydroxylbeskyttelsesgrupper, f.eks. benzyl- og benzyloxy-5 carbonylgrupper, som i den aromatiske del kan være substitueret med halogen, nitro og/eller lavalkoxy, eller lavalk-anoylgrupper, såsom acetyl eller aroylgrupper, såsom benzoyl.

Fortrinsvis vælges beskyttelsesgrupperne i og B således, at 10 de er fraspaltelige under lignende betingelser; særligt foretrukne er derved de allerede fremhævede acidolytisk fraspaltelige grupper. Eraspaltningen af begge beskyttelsesgrupper sker derefter med fordel i en enkelt operation; der kan dog også anvendes grupper af forskellig art, som I5 fraspaltes enkeltvis.

Fraspaltningen af beskyttelsesgrupperne sker på almindelig kendt måde; sur hydrolyse (acidolyse) gennemføres f.eks. ved hjælp af trifluoreddikesyre, saltsyre eller hydrogenfluorid, ved syrefølsomme beskyttelsesgrupper også ved hjælp af en 20 lavaliphatisk carboxylsyre, såsom myresyre og/eller eddikesyre, under tilstedeværelse af vand og eventuelt af en polyhalogeneret lavalkanol eller lavalkanon, såsom 1,1,1,3S3»3-hexafluorpropan-2-ol eller hexafluoracetone. De reduktivt fraspaltelige grupper, især sådanne, der indeholder benzyl-25 grupper, fjernes fortrinsvis hydrogenolytisk, f.eks. ved hydrogenering under palladium-katalyse. Isonicotinyloxy-carbonylgruppen fraspaltes fortrinsvis ved zink-reduktion.

De omhandlede slutprodukter opnås, alt efter isoleringsmåden, som baser eller som syreadditionssalte; disse kan sene-30 re på i og for sig kendt måde omdannes til hinanden.

Også dannelsen af de ovenfor omtalte komplekser sker ved kendte eller med disse ækvivalente metoder.

ίο 151034

Komplekser med uorganiske stoffer, såsom tungtopløselige metal-, f.eks. aluminium- eller zinkforbindelser,fremstilles fortrinsvis på analog måde som kendt for ACTH, f.eks. ved omsætning med et opløseligt salt af det pågældende metal, 5 f.eks. zinkchlorid eller zinksulfat, og udfældning med et alkalimetalphosphat og/eiler -hydroxid. Komplekser med organiske forbindelser, såsom polyoxygelatine, carboxymetbyl-cellulose, polyvinylpyrrolidon, polyphloretinphosphat, poly-glutaminsyre og lign., opnås ved blanding af disse stoffer 10 med peptidet i vandig opløsning. På samme måde kan også fremstilles uopløselige forbindelser med alkalimetalpoly-phosphater.

Forbindelserne med den ovenfor karakteriserede formel II er nye. De opnås ved, at man cycliserer et tilsvarende lineært 15 peptid med formlen H-CII'l-C (III) hvori II' er en til formlen II svarende gruppe, hvori den amidiske binding mellem to vilkårlige nabostillede aminosyrer estere i peptidringen er afbrudt, og C står for en fri 20 hydroxylgruppe, en med en aktiveringsgruppe omdannet hydroxylgruppe eller en hydrazinogruppe

Blandt de lineære peptider med formlen III foretrækkes dem, hvori mindst én af grupperne X og Y i gruppen [II1] danner en endestillet aminosyre. Disse foretrukne udgangsstoffer 25 karakteriseres af formlerne H-X-Y -R-Phe -Phe - trp-Ly s (A)-Thr(B)-Phe-C (Illa) H-Y-R-Phe -Phe - trp-Lys (A)-Thr(B)-Phe-X-C (Illb) og især H-R-Phe-Phe-trp-Lys(A)-Thr(B)-Phe-X-Y-C (IIIc) 11 151034 hvori A, B, C, trp, E, X og Y har de ovenfor angivne Betydninger. Ganske særligt foretrukne er forbindelserne med formlerne IIIa-c, hvori A står for en aminobeskyttelsesgrup-pe, fremfor alt en acidolytisk fraspaltelig aminobeskyttel-5 sesgruppe, B for en hydroinylbeskyttelsesgruppe, fremfor alt en acidolytisk fraspaltelig hydroxylbeskyttelsesgruppe og C for en fri hydroxylgruppe.

En med symbolet C betegnet funktionel gruppe supplerer carbonylgruppen i den C-terminale aminosyrerest og danner 10 sammen med denne en fri carboxylgruppe, en aktiveret estergruppe eller en carbazoylgruppe.

Aktiveringsgruppen, hvormed hydroxylgruppen er omdannet, er især en sådan, som danner aktiverede estere af N-hydroxysuc-cinimid, 1-hydroxybenzotriazol, N,E'-dicyclohexylisourin-15 stof, 2,4,5-trichlorphenol, 2-nitrophenol, 4-nitrophenol, pentachlorphenol eller pentafluorphenol, men også en anden fra peptidkemien kendt aktiverings gruppe af denne art, jfr. Houben-Weyl, bind 15/11-

Den omhandlede cyclisering af de lineære peptider med form-20 len III sker på i og for sig kendt måde ved hjælp af sædvanlige, til dannelse af amidbindingen almindelige koblingsmetoder, hvorved de peptidiske udgangsstoffer dog anvendes i en meget lav koncentration for at forskyde koblingsforløbet til fordel for den intramolekylære cyclisering på 25 bekostning af den intermolekylære p o lykondens at i on.

De lineære peptider anvendes med fordel i en ca. 1.10 ^ til _Zl ca. 1.10 J molær, fortrinsvis en ca. 1.10 molær koncentration, som svarer til en vægt-volumen-koncentration på ca.

0,01 til 1,0%, fortrinsvis 0,1%. En tilsvarende fortynding 30 kan i reaktionsblandingen indstilles fra begyndelsen af, eller også fremstilles fortløbende ved langsom tildrypning af udgangsstoffet og eventuelt de øvrige reagenser til' reaktionsblandingen.

12 151034

Fortrinsvis sker cycliseringen ved, at man ved en ovenfor angivet begyndelseskoncentration a) behandler et udgangsstof med formlen III, hvori C betyder en fri hydroxylgruppe, og hvori såvel ε-aminogruppen i lysinresten som hydroxylgrup-5 pen i threoninresten er beskyttet, med et carbodiimid, eventuelt under tilstedeværelse af en komponent, der danner en aktiv ester, eller b) omsætter et udgangsstof med formlen III, hvori C er en til en aktiveret ester omdannet bydroxylgruppe, og den endestillede aminogruppe foreligger 10 i protoneret form, hvorved i det mindste e -aminogruppen i lysinresten er beskyttet, med en organisk base, eller c) først behandler et udgangsstof med formlen III, hvori C betyder gruppen og i det mindste e -aminogruppen i lysinresten er beskyttet, under sure betingelser med salpe-15 tersyrling eller en lavalkylester deraf og derefter cycli-serer ved en ovenfor omtalt lav koncentration med overskydende organisk base.

Cycliseringen gennemfører man i egnede opløsningsmidler, eksempelvis skal nævnes dioxan, tetrahydrofuran, aceto-20 nitril, pyridin, dimethylformamid, dimethylacetamid, dimethylsulfoxid, h-methylpyrrolidon, hexamethylphosphor-triamid samt chloroform og metbylenchlorid og blandinger deraf.

Yed fremgangsmådevariant a) fremkaldes cycliseringen med et 25 carbodiimid, fortrinsvis E,]T -dicyclohexylcarbodiimid, som man med fordel anvender i overskud; det må antages, at udgangsstoffet med formlen III med fri carboxylgruppe derved primært omdannes til en aktiveret ester af dicyclohexyliso-urinstof (eller et analogt isourinstof), og at denne in 30 situ dannede aktive ester straks reagerer videre. Tilsætningen af en komponent, der danner aktive estere som hjælpereagens er uden tvivl skyld i en intermediær dannelse af en aktiv ester; til dette formål kan tjene i peptidkemien almindelige komponenter, der danner aktive estere, såsom 13 151034 især 2,4,5-trichlorphenol, 2- eller 4-nitrophenol, penta-clilor- og pentaf luorphenol, men fremfor alt N-hydr oxyforbin-delser, hvoraf E-hy dr oxysuccinimid, E-hydroxypiperidin og fremfor alt l-hydroxybenzotriazol skal omtales som særligt 5 fordelagtige. Arb e j ds t emp e r a tur en ved denne variant er i almindelighed 0-70°C, fortrinsvis 35-55°0·

Ved variant b), hvorved der arbejdes med færdige, aktive estere, især de allerede fremhævede, sker cycliseringen spontant, idet den endestillede aminogruppe deprotoniseres 10 af den organiske base. De anvendte baser er fortrinsvis kvaternære eller fremfor alt tertiære aminer, f.eks. tri-ethylamin eller E-ethylmorpho1in. Fortrinsvis arbejder man ved 10-30°G, især ved stuetemperatur.

Ved variant c) kan den første fase, d.v.s. dannelsen af syre-azidet ved behandling med salpetersyrling eller en ester deraf, med fordel ske ved en væsentlig højere koncentration af udgangsstofferne end den efterfølgende cyclisering. Man arbejder hensigtsmæssigt med ca. 1 ækvivalent af et lav-alkylnitrit, såsom ethyl-, isoamyl- og især tert.butyl-20 nitrit, i saltsurt miljø ved temperaturer fra ca. -30 til ca. -5°0, fortrinsvis ca. -20°C; et ringe overskud af nitrit er tilladeligt. Derefter gøres opløsningen af det dannede azid basisk efter den nødvendige fortynding ved en temperatur på ca. 0 til ca. 35°0 ved hjælp af et overskud af en organisk 25 base, f.eks. en af de ovennævnte, og bringes derved som ved fremgangsmåde-variant b) til spontan cyclisering.

De lineære peptider med formlen III samt de til deres syntese tjenende mellemprodukter er nye og med fordel anvendelige til syntese også af andre somatostatin-analoge, f.eks.

30 sådanne med længere aminosyre-sekvenser. De opnås, ved i og for sig kendte metoder, idet man kondenserer de til deres opbygning nødvendige aminosyrer eller mindre peptidenheder med hinanden 14 151034 i vilkårlig tidsmæssig rækkefølge under dannelse af COHH-bin-dinger, hvorved i reaktionen ikke deltagende funktionelle grupper kan beskyttes intermediært.

Yed fremstilling af disse udgangsstoffer, såvel som alle nød-5 vendige mellemprodukter kommer især de ved syntese af langkædede peptider almindelige beskyttelsesgrupper i betragtning som beskyttelsesgrupper for de endestillede g-amino- og carboxylgrupper, hvilke beskyttelsesgrupper kan fraspaltes let og selektivt, f.eks. ved solvolyse eller reduktion.

10 Som α-aminobeskyttelsesgrupper skal eksempelvis nævnes eventuelt, f.eks. med halogen, nitro, lavalkyl eller lavalkoxy substituerede di- eller triaryllavalkylgrupper, såsom di-phenylmethyl- eller triphenylmetbylgrupper, f.eks. benz-hydryl, trityl, di- (p-me thoxy ) -benzhydryl, eller fremfor alt 15 af kulsyre afledte hydrogenolytisk fraspaltelige grupper, såsom eventuelt i den aromatiske gruppe med halogenatomer, nitrogrupper, lavalkyl- eller lavalkoxygrupper substituerede benzyloxycarbonylgrupper, f.eks. benzyloxycarbonyl (d.v.s. carbobenzoxy), p-brom- eller p-chlorbenzyloxycarbonyl, p-20 nitrobenzyloxycarbonyl og p-methoxybenzyloxycarbonyl, endvidere også 2-(p-biphenylyl)-2-propoxycarbonyl og lignende i schweizisk patentskrift nr. 509.266 beskrevne aryloxycarbonyl-grupper. -Derved skal det tages i betragtning, at a-amino-beskyttelsesgruppen må være selektivt fraspaltelig under bi-25 beholdelse af den eventuelt tilstede^værende ε-aminobeskyt-telsesgruppe i lysinresten. Det er i øvrigt også en fordel, hvis en eventuelt tilstedeværende carboxyl- eller hydroxyl-beskyttelsesgruppe forbliver upåvirket ved dens fraspaltning.

Carboxylgrupper beskyttes eksempelvis ved hydraziddannelse 30 eller ved forestering. Egnede til forestering er f.eks. lavere, eventuelt substituerede alkanoler, såsom methanol, ethanol, cyanmethylalkohol, 2,2,2-trichlorethanol, benzoyl- 15 151034 methylalkohol eller især tert.butylalkohol, men også en eventuelt substitueret benzylalkohol. En særlig fordelagtig kategori af substituerede alkanoler er ethylalkoholer, som i β-stilling bærer en trisubstitueret silylgruppe, såsom en 5 triphenylsilyl-, dimet hy 1-butyl- s i ly 1 - eller fremfor alt trimethylsilylgruppe. Som beskrevet f.eks. i belgisk patentskrift nr. 851-576 egner disse alkoholer sig særligt godt til beskyttelse af carboxylgrupperne, fordi de tilsvarende β-silylethylestere, f.eks. β-(ΐΓ^βΐΐ37ΐ8ίΐ7ΐ)-βΐ1]7·1β8ΐβΓ, 10 ganske vist har almindelige alkylesteres stabilitet, men kan fraspaltes selektivt under milde betingelser ved indvirkning af fluoridioner under bevarelse af alle andre beskyttelsesgrupper.

Til dannelse af aktiverede estere, såsom i forbindelserne 15 med formlen III, egner sig f.eks. eventuelt med elektrontiltrækkende substituenter substituerede phenoler og thio-phenoler, såsom phenol, thiophenol, thiocresol, p-nitrothio-phenol, 2,4,5- og 2,4,6-trichlorphenol, pentachlorphenol, 0-og p-nitrophenol, 2,4-dinitrophenol og p-cyanophenol, endvi-20 dere f.eks. H'-hydroxysuccinimid, F-hydroxyphthalimid og N-hydroxypiperidin.

Hydroxy 1 gruppen i threoninresten kan beskyttes ved forestering eller forethering, som allerede ovenfor angivet, den kan dog også forblive fri.

25 hisse beskyttelsesgrupper kan fraspaltes på kendt måde. Således kan man fraspalte benzyloxycarbonylgruppen ved hydrogeno lyse, ΪΓ-tri tylgruppen med mineralsyrer, såsom hydrogen-halogenider, f.eks. hydrogenfluorid eller fortrinsvis hydrogenchlorid, eller en organisk syre, såsom myresyre, 30 eddikesyre, chloreddikesyre eller trifluoreddikesyre, i vandigt eller absolut trifluorethanol som opløsningsmiddel (jfr. tysk offentliggørelseskrift DT 2.546.147) eller med vandig eddikesyre, t e rt.butoxy carbonylgruppen med trifluor- 16 151034 eddikesyre eller saltsyre, 2-(p-biphenylyl)-isopropoxy-carbonylgruppen med vandig eddikesyre eller f.eks. med en Handing af iseddike, myresyre (82,8%' s) og vand (7:1:2) eller ved fremgangsmåden ifølge DI 2.34-6.14-7· 5 β-Silylethylestergrupperne fraspaltes fortrinsvis med fluoridionafgivende reagenser, f.eks.fluorider af kvaternæ-re organiske baser, såsom tetraethylammoniumfluorid. De kan dog også, ligesom de sædvanlige alkylestergrupper, fraspaltes ved alkalisk hydrolyse, f.eks. ved hjælp af alkalimetal-1° hydroxider, -carbonater eller -hydrogencarbonater, eller omdannes ved hydrazino lyse, f.eks. ved hjælp af hydrazinhydrat, til de tilsvarende carbazoylgrupper. Til fraspalt-ning af tert.butylestere anvender man fortrinsvis acidolyse, til benzylestere hydrogenolyse.

15 Den til fremstilling af lineære peptider med formlen III

gennemførte kondensation af aminosyre- og/eller peptidenhederne sker på i og for sig kendt måde, idet man fortrinsvis knytter en aminosyre eller et peptid med beskyttet a-amino-gruppe og eventuelt aktiveret terminal carboxylgruppe (= ak-20 tive komponenter) til en aminosyre eller et peptid med fri α-aminogruppe og fri eller beskyttet, f.eks. foresteret terminal carboxylgruppe (= passive komponenter), i det dannede produkt frigør den terminale aminogruppe og igen omsætter dette peptid, som indeholder en fri α-aminogruppe og 25 en eventuelt beskyttet terminal carboxylgruppe,med endnu en aktiv komponent, d.v.s. en aminosyre eller et peptid med aktiveret terminal carboxylgruppe og fri α-aminogruppe o.s.v. Carboxylgruppen kan eksempelvis aktiveres ved overføring til et syreazid, -anhydrid, -imidazolid, -isoxazolid eller en 30 aktiveret ester, såsom en af de ovennævnte, eller ved reaktion med et carbodiimid, såsom 1ST,N'-dicyclohexylcarbodiimid, eventuelt under tilsætning af ΪΓ-hydr oxy sue c inimid eller en usubstitueret eller f.eks. med halogen, methyl eller methoxy 17 151034 substitueret 1-hydroxybenzotriazol eller 4-hydro:Ky-benzo-l,2,5-triazin-3-oxid (jfr. bl.a. DT 1.917.690, DT 1.937.656, DT 2.202.615) eller med l,]F-carbonyldiimidazol. Som den almindelige koblingsmetode skal nævnes carbodiimidmetoden, endvidere også azidmetoden, metoden med aktiverede estere og 5 anb.ydridm.etoden samt Merrifield-metoden og metoden med ΓΓ-carboxyanhydrider eller N-thiocarboxyanhydrider.

Yed en særlig foretrukket fremstilling af de lineære peptider med formlen III anvender man som koblingsmetode carbodi-imid-metoden med N,N' -dicyclohexylcarbodiimid under tilste-10 deværelse af 1-hydroxybenzotriazol. Den terminale carboxyl-gruppe beskyttes derved i form af p-(trimethyl-silyl)-etbylesteren, α-aminogruppen i den aktive komponent beskyttes med en benzyloxycarbonylgruppe, som efter koblingstrinet fraspaltes ved hydrogeno lyse. Til beskyttelse af e-amino-15 gruppen i lysinresten anvendes acylering med en tert .butoxy-carbonylgruppe og til hydroxylgruppen i tbreoninresten for-etbering med en tert.butylgruppe. Disse to beskyttelsesgrupper kan om ønskes fraspaltes til sidst i et trin ved sur hydrolyse, f.eks. ved hjælp af trifluoreddikesyre, saltsyre 20 eller hydrogenfluorid.

Alt efter arbejdsmåden opnår man forbindelserne i form af baser eller deres salte. Baserne kan udvindes af saltene på i og for sig kendt måde. Af sidstnævnte kan der atter ved omsætning med syrer, f.eks. med sådanne, der danner de oven-25 nævnte salte, udvindes terapeutisk anvendelige syreadditionssalte.

Som følge af den snævre forbindelse mellem de nye forbindelser i fri form og i form af deres salte skal der i det foregående og efterfølgende ved de frie forbindelser eller de-30 res salte eventuelt også forstås de tilsvarende salte eller frie forbindelser.

18 151034

De nye forbindelser med formlen I og terapeutisk anvendelige syreadditionssalte deraf kan anvendes som farmakologisk aktive forbindelser, især i de for somatostatin sædvanlige indikationer, fortrinsvis i form af farmaceutiske præparater.

Den daglige dosis, der administreres til et varmblodet dyr 5 eller menneske på ca. 70 kg, udgør fra ca. 0,1 til ca. 120 mg.

De følgende eksempler belyser opfindelsen nærmere. Som forkortelser f.eks. til betegnelse af aminosyrer, peptider, beskyttelsesgrupper og lign. anvendes de sædvanlige, f.eks. i "Synthese von Peptiden" (udgiver: E. Wtinsch), Bd. XV af 10 "Methoden der org. Chemie" (Houben-Weyl) (1974·; O* Thieme, Stuttgart), sammenfattede korte benævnelser. Især anvendes følgende forkortelser:

Boc - tert.butoxycarbonyl

Bpoc - 2- (p-bipbenylyl)-2-propoxycarbonyl 15 But - tert.butyl (som ether dannende gruppe) DCCI - ΪΓ,Η’ -dicyclohexylcarbodiimid

Gaba - 4-aminosmørsyrerest, -HH-(CB^) ^-CO- OBzl - benzyloxy (som esterdannende gruppe) OEP - p-nitrophenoxy (som esterdannende gruppe) 20 OHSu - succinimido-H-oxy 0Tm.se - 2- (trime thyls ilyl) - ethoxy (som esterdannende gruppe) SEOC - 2- (trimethylsilyl)-e thoxycarbonyl Trt - trityl Z - benzyl oxycarbonyl ( carbobenzoxy ) 25 DC - tyndtlagskromatografi I DC anvender man, hvis. ikke andet er angivet, kiselgel som adsorbens og følgende systemer som elueringsmidler:

System 45 : sek.butanol-3%' s vandig ammoniak (7:3)

System 52 : n-butanol-eddikesyre-vand (71,5:7j5:21) 30 System 101 : n-butanol-pyridin-eddikesyre-vand (38:24:8:30)

System 101B : n-butanol-pyridin-25%' s vandig ammoniak-vand (40:24:6:30)

System 112A. : n-butanol-pyridin-myresyre-vand (42:24:4:20) 19 151034

System 157 : chloroform-methanol-eddikesyre-vand (70:42:0,5:10)

System 157-4 : chi or of orm-me t hano 1 - e ddike syre - vand (90:10:0,5:1) 5 System 157B : chloroform-methanol-eddikesyre-vand (85:13:0,5:1,5)

System 1570 : chloroform-methanol-eddikesyre-vand (75·'26:0,5:5)

Eksempel 1.

kksn-Pfa.e-Ph.e- ( D-trp ) -Lys-Thr-Phe-Gaba-^ 10 195 mg beskyttet octapeptid med formlen ^ Asn-Pfae-Pfae- ( D-trp ) -Lys ( Boc ) -Tfar ( But) -Phe-Gaba-l opløses ved 5°C under I2 i 1,5 ml af en blanding af 89 volumenprocent trifluoreddikesyre, 10 volumenprocent vand og 1 volumenprocent tfaioglycolsyre; opløsningen opvarmes straks 15 til 25°C og udfældes efter 90 minutter ved stuetemperatur under ^ med 15 ml ether. Det resulterende rå trifluoracetat af slutproduktet tørres i vakuum, opløses i 5 ml 1 U eddike- (Tf) syre og filtreres gennem 15 ml AG^ 1-X8 (Rio-Rad), acetat-form. Eluatet inddampes i vakuum, og remanensen underkastes 20 modstrømsfordeling i systemet n-butanol-eddikesyre-vand (2400:600:5000) over 200 trin. De i elementerne 168 til 183 indeholdte faser (K = 5,9) samles, inddampes i vakuum og lyo-filiseres fra tert.butanol-vand (1:1).

Den opnåede titelforbindelse er i tre systemer tyndtlagskro-25 matografisk ensartet.

DC (cellulose, Merck): system 101 Rf = 0,9, system 111B Rf = 0,9, system 112A Rf = 0,8.

Det peptidiske udgangsstof er opnået på følgende måde: 20 151034

Trin 1.1 H-Phe-OTmse-hydrochlorid

En opløsning af 2,50 g Z-Phe-OTmse i 25 ml methanol hydroge-neres efter tilsætning af 0,25 g palladium-kul (10%) ved 5 stuetemperatur og normaltryk i 3 timer,hvorved reaktions-blandingens pH ved tilsætning af 1 I methanolisk hydrogen-chloridopløsning holdes på 5,5· Til oparbejdning frafiltre-res katalysatoren, og filtratet inddampes i vakuum. Råproduktet kan uden yderligere rensning anvendes i det næste 10 trin.

Trin 1.2 Z-Thr(But)-Phe-OTms e

Til en opløsning af 10,30 g Z-Thr(But)0H i 120 ml vandfrit tetrahydrofuran og 4,20 ml H-ethylmorpho 1 in sættes i løbet 15 af 3 minutter ved -15°C en opløsning af 4,4-3 ml chlormyre-syreisobutylester i 20 ml tetrahydrofuran. Efter 10 minutter ved -10 til -15°C tilsættes ved -15°0 en opløsning af 10,05 g H-Phe-OTmse-hydrochlorid (se trin 1.1) i 40 ml tetrahydrofuran, og en yderligere portion på 4,20 ml ΪΓ-20 ethylmorpholin, og reaktionsblandingen holdes i en time ved hver af temperaturerne -15°C, 0°C og stuetemperatur. Til oparbejdning frafiltreres det udfældede F- e thylmo rpho 1 in-hydrochlorid, filtratet inddampes i vakuum, og remanensen opløses i ethylacetat og vaskes tre gange med 1 H citronsy-25 re, tre gange med 1 H natriumhydrogencarbonat og tre gange med vand. Den organiske fase tørres over natriumsulfat, inddampes i vakuum og befries i høj vakuum for de sidste spor af opløsningsmidlet. Produktet opnås som en tyktflydende, gullig olie, der ifølge DO er ensartet.

30 DC: (chloroform-methanol (9:1)) Ef = 0,83 (ethylaeetat-petroleumsether (7:3)) Ef = 0,77 21 151034

Trin 1.3 H-Thr(Bat)-Phe-OTmse

En opløsning af 8,84· g Z-Thr(But)-Phe-OTmse (trin 1.2) i 325 ml methanol hydrogeneres efter tilsætning af 880 mg 5 palladium-kul (10%) i 5 timer ved normaltryk og stuetemperatur. Til oparbejdning frafiltreres katalysatoren, og filtratet inddampes i vakuum. Den olieagtige remanens er ifølge DC et ensartet produkt og anvendes uden rensning i trin 1.4.

10 DC: (chloroform-methanol (9:1)) Rf = 0,62.

Trin I.3A-

Z-CD-taTO-lysCBo^-QH

Til en opløsning af 33»84 g Z-(D-trp)-0H og 17,42 g 8-hydroxy-quinolin i 30 ml acetonitril tildryppes ved 0-5°C 15 en opløsning af 21,87 g DCCI i 100 ml acetonitril i løbet af 45 minutter. Efter yderligere 30 minutter ved 5°0 fjernes det udfældede dicyc1ohexy lurinstof ved filtrering og udvaskes med 50 ml acetonitril. Til filtratet sættes en opløsning af 27,09 g H-Lys(Boc)-0H i 25,9 ml 4,25 N kaliumhydroxidopløs-20 ning og 80 ml acetonitril, og blandingen henstilles i 15 timer ved stuetemperatur. Til oparbejdning inddampes reaktionsblandingen i vakuum, remanensen optages i 1 liter ethylacetat og vaskes tre gange, hver gang med 200 ml 1 R saltsyre ved 0°C og tre gange, hver gang med 200 ml vand,og 25 den organiske fase tørres over natriumsulfat og inddampes i vakuum. Den opnåede brune olie opløses i 150 ml chloroform og dryppes under stærk omrøring i 1,5 liter hexan. Det fnuggede, klæbrige bundfald frafiltreres, vaskes med 500 ml hexan og tørres i vakuum. Til yderligere rensning opløses 30 materialet i 150 ml tetrachlormethan-ethylacetat (6:4 volumendele) og kromatograferes på en kiselgelsøjle med denne opløsningsmiddelblanding. Egnede tyndtlagskromatografisk ensartede fraktioner inddampes i vakuum, hvorved det rene produkt opnås i form af en skumagtig masse.

*5 ^ "ΠΠ « f γ\~πγ\·Ρ Γ\Ύ-τΓη_m In οηηΊ _ττοτί 1D-f* _ Γ\ £J\ 22 151034

Trin 1.4 Z- ( D-trp ) -Lys (Boc) -Tin? (But) -Phe-Olms e

Til en opløsning af 7524 g råt (87%' s ifølge titrering) H-Thr(But)-Phe-OTmse (trin 1.3) og 8,45 g Z-(D-trp)-Lys 5 (Boc)-OH (trin 1.3A) i 100 ml dimethylf ormamid sættes ved 5°C 2,28 g E-hydroxy-benzotriazol og 3,38 g DCOI, og reaktionsblandingen holdes i en time ved 5U0 og i yderligere 15 timer ved stuetemperatur. Til oparbejdning fjernes det udfældede dicyclohexylurinstof ved frafiltrering, og filtra-10 tet inddampes i høj vakuum. Remanensen omkrystalliseres to gange fra ethylacetat-petroleumsether og tørres i vakuum, smp. 114-120°C.

DC: (chloroform-ethylacetat (1:1)) Rf = 0,23 (toluen-acetone (1:1)) Rf = 0,70.

-*-5 Trin 1.5 Ξ-(D-trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-Olms e

En opløsning af 5*00 g Z-(D-trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-OTmse (trin 1.4) i 300 ml methanol bydrogeneres efter tilsætning af 0,50 g palladium-kul (10%) ved stuetemperatur og normal-20 tryk i 5 timer. Til oparbejdning frafiltreres katalysatoren, og den efter inddampning af filtratet tilbageblivende remanens videreomsættes straks i trin 1.6.

Trin 1.5A Z-Asn-Phe-Phe-OH

25 Til en suspension af 2,95 g H-Ehe-Phe-OH i 30 ml dimethylf ormamid og 6 ml vand sættes 2,36 ml 4 ΪΓ natriumhydroxidopløs-ning og derefter 5?29 g Z-Asn-OEP, og blandingen omrøres grundigt i 20 timer ved 35°0. Til oparbejdning sættes der til reaktionsopløsningen ved 5°0 2,36 ml 4 I saltsyre, den 30 svagt uklare opløsning filtreres, og filtratet koncentreres i højvakuum til ca. 15 ml. Ved tilsætning af 150 ml vand fældes råproduktet i geleagtig form, og det frafiltreres og tørres i vakuum over phosphorpentoxid. Dette materiale omfæl- 23 151034 des endnu to gange, Irver gang fra 20 ml methanol og 50 ml ether, frafiltreres og tørres i vakuum. Ifølge racemiserings-testen (totalhydrolyse, derivatisering af aminosyrerne og opdeling ved gaskromatografi) foreligger mindre end 2% af ^ aminosyrerne i D-konfiguration i dette produkt.

DC: (chloroform-methanol-eddikesyre-vand (70:40:0,5:10))

Kf = 0,50.

Trin 1.6 Z-Asn-Phe-Phe- ( D-trp ) -Lys ( Boc ) -Thr (But) -Phe-QTmse 10 Til en opløsning af 632 mg Z-Asn-Phe -Phe - OH (trin 1.5A) og 862 mg H-(D-trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Ehe-OTmse (trin 1.5) i 5 ml dimethylformamid sættes 210 mg E-hydroxy-benzotriazol og 276 mg DCCI, og "blandingen henstilles i 15 timer ved stuetemperatur. Til oparbejdning fjernes det udfældede di-15 cyclohexylurinstof ved frafiltrering, og filtratet inddampes i højvakuum. Den olieagtige remanens rives med 5 ml methanol og suges fra. Det uopløste materiale rives til rensning endnu en gang med 5 ml methanol ved 50°0, suges fra, vaskes med methanol og tørres i vakuum. Produktet er ensartet ifølge 20 DC.

DC: (chloroform-methanol (85:15)) Hi = 0,85 (chloroform-methanol-vand (14:6:1) Hf = 0,90

Trin 1.7

Z-Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-OH

25 940 mg Z-Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-OTmse (trin 1.6) opløses i 23 ml af en friskfremstillet vandfri 0,15 M tetraethylammoniumfluoridopløsning i dimethylformamid og holdes i 30 minutter ved 25°C. Efter afkøling til 5°C sættes under god omrøring 0,68 ml 1 I vandig saltsyre 30 til reaktionsblandingen, og produktet fældes ved tilsætning af 70 ml vand. Det frafiltrerede materiale vaskes med 5 ml vand, tørres i vakuum over phosphorpentoxid og anvendes direkte i trin 1.8.

24 151034

Trin 1.7A

Ξ-Gaba-OBzl-p-toluensulfonat

En blanding af 30,94· g 4—aminosmørsjre og 68,4-8 g p-toluen-sulfonsyre-monohydrat i 311 ml benzylalkohol og 300 ml 5 benzen destilleres langsomt ved normaltryk, indtil der i løbet af 5 timer er opfanget 200 ml af en fraktion med kp. 70-90°C. Den klare reaktionsopløsning koncentreres i vand-strålevaknum og derefter i højvakuum ved ca. 6& til 150 ml.

Den udfældede krystalgrød omrøres med 250 ml ether, og kry-10 s tallerne frafiltreres og vaskes med 200 ml ether. Til yderligere rensning omrøres dette materiale med 500 ml ether ved stuetemperatur i en time, frafiltreres, vaskes med ether og tørres i vakuum, smp. 106-107,5°C.

DC: (chloroform-methanol-17%’ s vandig ammoniak-vand 15 (50:40:6:4)) Bf = 0,39.

Trin 1.8 Z-Åsn-Phe-Phe-(D-trp)-Dys(Bo c)-Thr(But)-Phe-Gaba-OBzl

Til en blanding af 430 mg Z-Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Bo c)-Thr(But)-Phe-OH (trin 1.7) og 82 mg Gaba-benzylester (fri-20 gjort ved tilsætning af 0,046 ml K-methyImorpho 1 in til 152 mg tilsvarende p-toluensulfonat, se trin I.7A) i 2 ml dimethylformamid sættes 61 mg E-hydroxybenzotriazol og 93 mg DCCI, og blandingen henstilles i 20 timer ved stuetemperatur. Til oparbejdning sættes 10 ml iskold methanol 25 til blandingen, og denne filtreres. Det udvundne faste stof omrøres til yderligere rensning med 5 ml varmt methanol i 10 minutter, suspensionen afkøles til 0°C, og det rene produkt frafiltreres og tørres i vakuum.

DC: (chloroform-methanol (85:15)) Bf = 0,85- 30 Trin 1.9 Ξ-Asn-Phe -Phe- ( D-trp ) -Dys ( Bo c ) -Thr ( But) -Ehe-Gaba-OH En opløsning af 380 mg Z-Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boc)- 25 151034 hydrogeneres efter tilsætning af 50 mg palladium-kul (10%) i 6 timer ved stuetemperatur og normaltryk. Til oparbejdning koncentreres opløsningen til 2 ml i høj vakuum efter frafiltrering af katalysatoren, og produktet udfældes med 5 25 ml peroxidfri ether, frafiltreres og tørres i vakuum. Rå produktet underkastes uden yderligere rensning det næste trin 1.10 (cyclisering).

Trin 1,10

t-Asn-Phe-Phe- ( D-trp ) -Lys ( Boc ) -Thr ( But) -Phe - G-ab sP

10 En opløsning af 297 mg råt H-Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-Gaba-0H (trin 1.9), 324 mg N-hydroxybenzotri-azol og 495 mg DCCI i 240 ml dtmethylformamid holdes i 20 timer ved 50°C. Til oparbejdning afdampes opløsningsmidlet i høj vakuum ved ca. 30°C, og remanensen rives med 10 ml ethyl-15 acetat. Det udfældede dicyc1ohexylurinstof fjernes ved frafiltrering, og filtratet fortyndes med ethylacetat til 50 ml, vaskes tre gange, hver gang med 20 ml 1 N vandig oxalsyre, og derefter med vand til neutralitet, tørres over natriumsulfat og inddampes i vakuum. Råproduktet underkastes til 20 rensning modstrømsfordeling i systemet methanol-vand-chloro-form-tetrachlormethan (2700:675:900:1575 volumendele) over 460 trin. De i elementerne 198 til 240 indeholdte faser (K = 0,88) samles og inddampes i vakuum. Remanensen opløses i 20 ml tert.butanol og lyofiliseres, hvorved der resulterer 25 et tyndtlagskromatografisk ensartet materiale med den ovenstående formel.

DC: (chloroform-methanol (85:15)) Rf = 0,18 (chloroform-methanol-vand (14:6:1)) Rf = 0,77·

Pksempel 2.

30 Asn-Phe-Phe-(D-trp)-lys-Thr-Phe-Gaba-Gaba- På analog måde som beskrevet i eksempel 1 behandler man et 26 151034 "beskyttet nonapeptid med formlen U/lsn-Phe-Phe- (D-trp ) -Lys (Boc)-Thr( But) -Phe - Gab a - Gab a-^ med trifluoreddikesyre og oparbejder det.

Yed modstrømsfordeling (K = 5*45) på 200 elementer opnås 5 det ønskede produkt som tyndtlagskromatografisk ensartet amorft stof.

DO: cellulose, Merck; system 101 : Rf = 0,90, system 111B Rf = 0,75? system 112 A Rf = 0,93·

Det som udgangsstof anvendte beskyttede nonapeptid kan op-10 nås på følgende måde:

Trin 2.1 Boc-Gaba-OH

En opløsning af 41,25 g Ξ-Gaba-OH i 520 ml dioxan-vand (1:1 volumendele) indstilles med 20,5 ml 4 M natrium-15 hydcoxidopløsning til pH 10,0, og der tilsættes 65,0 g

Boc-azid. Yed langsom tilsætning af 4 I natriumhydroxidop-løsning (i alt 185 ml) i løbet af 24 timer ved stuetemperatur boldes pH på 10,0. Til oparbejdning vaskes reaktionsopløsningen tre gange, hver gang med 250 ml etber, og den 20 vandige fase indstilles ved 5°0 ved tilsætning af 192 g citronsyre til pH 5j0* Det udfældede materiale optages i tre portioner 400 ml etber, og de samlede organiske faser vaskes neutrale, tørres over natriumsulfat og inddampes i vakuum. Remanensen opløses i 50 ml etber og krystalliseres 25 ved tilsætning af 100 ml petroleums etber, smp. 60-62°C.

DO: (chloroform-metbanol-vand (14:6:1)) Rf = 0,85 (benzen-acetone (7:3)) Hf = 0,21.

27 151034 [Erin 2.2

Boc-Gaba-Gaba-OBzl

Til en opløsning af 2,03 g Boc-Gaba-OH (trin 2.1) i 20 ml vandfrit tetrahydrofuran sættes ved -15°C først 1,39 ml 5 triethylamin og derefter i løbet af 1 minut 1,31 ml chlor-myresyre-isobutylester. Efter 10 minutter ved -10 til -15°C tilsættes ved -15°C en opløsning af 3565 g H-Gaba-0Bzl-p-toluensulfonat (eksempel 1.7A) og 1,39 ml triethylamin i 10 ml dimetbylformamid, og reaktionsblandingen holdes i en 10 time ved hver af temperaturerne -10°C, 0°C og stuetemperatur. Til oparbejdning sættes 150 ml ethylacetat til blandingen, og den vaskes tre gange med 1 F citronsyre, tre gange med 1 F FaHCO^ og tre gange med vand. Den organiske fase inddampes efter tørring over natriumsulfat i vakuum, 15 og den tilbageblivende svagt gulligfarvede olie befries i højvakuum for opløsningsmiddelrester. Produktet er ensartet ifølge DC.

DC: (chloroform-methanol (83:13)) Rf = 0,60 (toluen-acetone (7:3))Rf = 0,17.

20 Erin 2-5 H-Gaba-Gaba-OBzl-Sydrochlorid.

2,00 g Boc-Gaba-Gaba-OBzl (trin 2.2) opløses i 15 ml af en 2 F opløsning af hydrogenchlorid i ethylacetat og henstilles i en time ved stuetemperatur. Efter afkøling af reak-25 tionsblandingen til 0°C frafiltreres det udfældede produkt, og det vaskes med 20 ml ether og tørres i vakuum, smp. 80-83°C.

DO: (chloroform-methanol-vand (14:6:1)) Bf = 0,29· 28 151034

Trin 2.4 Z-Asn-Phe-Phe- ( D-trp) -Lys ( Bo c ) -Thr C But) -Phe-Gaba-Gaba-OBzl

Til en opløsning af 430 mg Z-Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-OH (eksempel 1.7) og 142 mg H-Gaba-Gaba-OBzl-5 hydro chl or i d (trin 2.3) i 3 ml dime thylf ormamid sættes 43 mg triethylamin, 61 mg 1-hydroxy-benzotriazol samt 93 mg ΙίΓ,ΪΙ* — di eye 1 ohexy 1 carlo diimi d, og Blandingen henstilles i 24 timer ved stuetemperatur. Til reaktionsbiandingen sættes 15 ml vand, og det udfældede materiale frafiltreres og tørres i 10 vakuum over phosphorpentoxid. Til rensning rives råproduktet med 5 ml varmt methanol, og det suges fra og fældes efter tørring i vakuum fra en opløsning i 2 ml dimethylformamid med 10 ml methanol. Bundfaldet frafiltreres, vaskes med lidt methanol og tørres i vakuum, hvorved der resulterer et 15 tyndtlagskromatografisk ensartet produkt.

DO: (chloroform-methanol (85:15)) Rf = 0,80.

Trin 2.5

H-Asn-Phe -Phe - ( D-trp ) -Bys (Boc ) -Thr ( But) -Phe-Gaba-Gaba-OH

Deme forbindelse opnås på analog måde som i eksempel 1.9 20 Ved hydrogenering af Z-Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boe)-Thr(But)-Phe-Gaba-Gaba-OBzl (trin 2.4) og vide r e f or arb e j de s uden rensning i trin 2.6.

Trin 2.6 ______

L-Asn-Phe -Phe- ( D-trp ) -lys (Boc) -Thr ( But) -Phe - Gab a-Gab a-J

25 Denne forbindelse opnås på analog måde som i eksempel 1.10 ved cyclisering af H-Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-Gaba-Gaba-OH (trin 2.5) ved hjælp af DCCI og 1-hydroxy-benzotriazol. Råproduktet renses ved modstrømsfordeling (K = 1,1).

29 151034 DC: (chloroform-methanol (85:15)) Rf = 0,06 (chloroform-methanol-vand (14-:6:1)) Rf = 0,69.

Eksempel 3» ^Asn-Phe-Phe- (D-Trp) j-Lys-Thr-Phe-l 5 På analog måde som "beskrevet i eksempel 1 behandles det beskyttede peptid med formlen

-Asn-Phe-Phe- ( D-Trp ) -Lys (Bo c ) -Thr ( But) -Phe -I

med trifluoreddikesyre og videreforarbejdes. Yed modstrømsfordeling (E = 5?4-) over 220 trin opnås det ønskede produkt 10 som et amorft stof.

DC: System 101 Rf = 0,60, system 111B Rf = 0,37» system 112A Rf = 0,50.

Det som udgangsstof anvendte beskyttede peptid med den ovenfor angivne formel kan opnås på følgende måde: 15 1,10 g Z-Asn-Phe-(D-Trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Fhe-OH (eksempel 1.7) hydrogeneres i 30 ml dimethylformamid under tilsætning af 100 mg Pd-kul (10%), indtil Z-gruppen er fuldstændig fraspaltet (ca. 4- h, DC-kontrol). Efter frafiltrering af katalysatoren koncentreres filtratet i højvakuum til 15 ml, og 20 den opnåede opløsning af peptidet med formlen

Η-Asn-Phe-Phe- ( D-Trp ) -Lys (Boc ) -Thr ( But) -Phe-OH

cycliceres direkte på analog måde som i eksempel 1.10 ved hjælp af DCCI og R-hydroxybenzotriazol. Råproduktet renses ved modstrømsfordeling (K = 0,71), hvorved det ønskede be-25 skyttede cyclopeptid med formlen.

^ Asn-Phe -Phe - ( D-Trp ) -Lys (Boc) -Thr ( But) -Phe-^ resulterer.

DC: (chloroform-methanol-vand (14-:6:1)) Rf = 0,83· 30 151034

Eksempel 4.

I— Asn-Phe-Phe-( D-Trp ) -Lys-Thr-Phe-ΗΞ ( CH2) ^-GO-^ På analog måde som "beskrevet i eksempel 1 "behandler man det beskyttede peptid med formlen 5 ^“Asn-Phe -Phe- ( D-Trp ) -Lys ( Bo c ) -Thr ( But) -Phe-HH- ( CHg )^-GO~^ med trifluoreddikesyre og oparbejder det. Ved modstrømsfordeling (K = 5i31) over 220 trin opnås det ønskede produkt som et amorft stof.

DC: System 101 Rf = 0,29, system 111B Rf = 0,34-, system 112A 10 Ef = 0,47.

Det som udgangsstof anvendte beskyttede peptid opnås på følgende måde:

Trin 4.1 H-Asn-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-OTmse 15 94-2 11¾ Z-Asn-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-OTmse (eksempel 1.6) hydrogeneres i 50 ml dimethylf ormamid under tilsætning af 100 mg Pd-kul (10%), indtil Z-gruppen er fuldstændig fraspaltet (ca. 2 timer, DC-kontrol). Efter frafil-trering af katalysatoren inddampes filtratet i højvakuum til 20 4 ml og anvendes direkte i det næste trin.

Trin 4.2 Z-HE- ( CH2 ) ^-CO-Asn-Phe-Phe- ( D-Trp ) -Lys (Boc)-Thr (But) -Phe-OTmse

Til en opløsning af 188 mg 5-b en zy 1 oxy c arbony 1 aminopentansyre, 847 mg råt heptapeptid fra det foregående trin 4.1 og 101 mg 25 hydroxybenzotriazol i 4 ml dimetbylformamid sættes ved 0-5°C en opløsning af 182 mg DCCI i 1 ml dimetbylf ormamid. Efter 31 151034 15 minutter ved 0-5°C holdes blandingen i endnu 18 timer ved stuetemperatur og filtreres derefter fra det udfældede dicyclohexylurinstof. Filtratet koncentreres i højvakuum til 3 ml, og råproduktet udfældes ved tilsætning af 60 ml vand.

5 Efter filtrering og tørring omrøres bundfaldet til rensning to gange, hver gang med 20 ml methanol ved 40°C og frafiltrere s.

DC: (chloroform-methanol (85:15)) Hf = 0,61 (chloroform-methanol-vand (14:6:1)) Rf = 0,89.

10 Trin 4.5

Ζ-ΗΞ- (CH2)^CO-Asn-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(Bo c)-Thr(But)-Phe- OH

760 mg Z-Μ- ( CH2 ) ^CO-Asn-Phe-Phe-( D-Trp) -Lys ( Bo c ) -Thr ( But) -Phe-OTmse (trin 4.2) opløses i 17,1 ml af en friskfremstillet vandfri 0,15 M tetraethylammoniumfluoridopløsning i 15 dimethylformamid og holdes i 40 minutter ved stuetemperatur. Efter afkøling til 0-5°C sættes under god omrøring 0,51 ml 1 N vandig saltsyre til reaktionsblandingen, og produktet fældes ved tilsætning af 80 ml vand.

DC: (chloroform-methanol (85:15)) Hi = O?15 20 (chloroform-methanol-vand (14:6:1)) Hf = 0,65·

Trin 4.4

NH2- ( CH2 )/)CO-Asn-Phe-Phe - ( D-Trp ) -Lys ( Bo c ) -Thr ( But) -Phe-OH

696 mg Z-HH- ( CH2 ) ^CO-Asn-Phe-Phe - ( D-Trp ) -Lys ( Bo c ) -Thr ( But) -Phe-OH (trin 4.3) hydrogeneres i 70 ml dime thyl f ormami d un-25 der tilsætning af 80 mg Pd-kul (10%), indtil fuldstændig fraspaltning af Z-gruppen (ca. 2 timer, DC-kontrol). Efter frafiltrering af katalysatoren koncentreres filtratet i højvakuum til ca. 3 ml, og produktet fældes med 50 ml per-oxidfri ether.

30 DC: (chlorofoim-methanol-vand (14:6:1)) Hf = 0,46.

32 151034

Trin 4.5 ^•Asn-Phe-Phe - ( D-Trp ) -Lys (Bog) -Thr ( But) -Phe-EH- ( CEL) )^00-^

Ved cyclisering af det lineære octapeptid med formlen

ML, ( GEL, ^CO-Asn-Phe-Phe- ( D-Trp ) -Lys (Boc) -Thr(But) -Phe-OH

5 (trin 4.4) analogt med den i eksempel 1.10 Beskrevne fremgangsmåde opnår man ved hjælp af LCCI og E-hydroxybenzotri-azol det ønskede cycliske peptid. Råproduktet renses ved modstrømsfordeling (E = 0,66).

DC: (chloroform-methanol (85:15)) hf = 0,50 10 (chloroform-methanol-vand (14:6:1)) Rf = 0,77·

Eksempel 5· •^Asn-Phe-Phe- ( D-Trp ) -Lys-Thr-Phe- ( β -Ala )~^ På analog måde som Beskrevet i eksempel 1 Behandles det Beskyttede peptid med formlen 15 ^-Asn-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-(p-Ala) med trifluoreddikesyre og oparbejdes. Ved modstrømsfordeling (E = 5}0) over 170 trin opnås det ønskede produkt som et amorft stof.

DC: System 101 Rf = 0,555 system 111B Rf = 0,32, system 20 112A Rf = 0,39.

Det som udgangsstof anvendte Beskyttede cyclopeptid opnås på følgende måde:

Trin 5·! Η- ( β -Ala ) -OBzl-p-to luensulf onat 25 På analog måde som i eksempel 1.7A Beskrevet opnås ved for- 33 151034 estering af β-alanin med benzylalkohol under tilstede-værelse af p-toluensulfonsyre den ønskede ester som p-toluen-snlfonat, smp. 94,5-101°C.

DG: (clil or of orm-me thanol-vand (14:6:1)) Ef = 0,58.

5 Trin 5«2 Z-Asn-Phe-Phe- ( D-Trp ) -Lys (Boc ) -TIir(But) -Hie-( β-Ala ) -QBzl På analog måde som i eksempel 1.8 beskrevet omsættes 1,09 g Z-Asn-Fhe-Phe-(D-Trp )-Lys (Boc)-Thr(But)-Phe-OH (eksempel 1.7) med 0,53 g H-(p-Ala)-OBzl .p-toluensulfonat ved hjælp 10 af DCCI under tilstedeværelse af E-methylmorpholin og N-hydroxybenzotriazol og oparbejdes.

DC: (chloroform-methanol (85:15)) Ef = 0,69 (chloroform-methanol-vand (14:6:1)) Ef = 0,89.

Trin 5·3

15 H-Asn-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-(β-Ala)-OH

På analog måde som i eksempel 1.9 beskrevet omdannes benzyl-ester en H-Asn-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe- ( β -Ala)-0Bzl (trin 5·2) ved hydrogenering til den tilsvarende frie syre.

20 DC: (chloroform-methanol-vand (14:6:1)) Ef = 0,52.

Trin 5*4 _________ L-Asn-Phe-Ehe-( D-Trp ) -Lys (Boc ) -Thr ( But) -Phe- ( β-Ala )~^

Analogt med den i eksempel 1.10 beskrevne fremgangsmåde cycliseres den frie syre H-Asn-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(Boc)-25 Thr (But) -Phe- ( β -Ala)-OH ved hjælp af DCCI og N-hydroxy-benzotriazol. Råproduktet renses ved modstrømsfordeling (K=0,71).

34 151034 DC: (chloroform-methanol (85:15)) Ef = 0,65 (chloroform-methanol-vand (14-:6:1)) Ef = 0,80.

Eksempel 6.

—Asn-Phe-Phe- ( D-lrp ) -Iys -Thr-Phe - ( D-G-lu) -OH

5 På analog måde som "beskrevet i eksempel 1 behandler man det beskyttede peptid med formlen ^-Asn-Phe -Phe - ( D-Trp ) -Lys (Bo c ) -Thr ( But) -Phe- ( D-G-ln) -OBut med trifluoreddikesyre og oparbejder det. Ted modstrømsfordeling (K = 4-,26) over 300 trin opnås det ønskede produkt 10 som et amorft stof.

DC: System 101 Ef = 0,53? system 111B Ef = 0,4-0, system 112A Ef = 0,31.

Symbolet -iålu-QH står for en rest med formlen -EH-CH- (CH0 ) o-C0— f 2 2

CO-OH

15 Det som udgangsstof anvendte beskyttede peptid opnås på følgende måde:

Trin 6.1 H-ΓD-Glu(OBzl)]-OBut-hydrochlorid

En blanding af 5? 00 g H-[ D-Glu(0Bzl)]-0H og 4-0 ml flydende 20 isobuten omrøres med 4- ml koncentreret svovlsyre i 4-0 ml dioxan i en lukket beholder ved stuetemperatur, indtil en klar opløsning er dannet, og henstilles i yderligere 4- timer ved stuetemperatur. Til oparbejdning hældes den til -20°C afkølede reaktionsblanding i en iskold blanding af 25 300 ml ether og 203 ml 1 E natriumhydroxid. Etherfasen vaskes tre gange, hver gang med 50 ml vand. Efter efter- 35 151034 ekstraktion af den vandige fase med yderligere 300 ml ether tørres de samlede organiske faser over natriumsulfat og inddampes i vakuum til 10 ml, og ved 0°C tilsættes under god omrøring 30 ml 0,7 N hydrogenchloridopløsning i methanol. Den 5 opnåede opløsning inddampes i vakuum, og remanensen rives med 20 ml petroleumsether, indtil krystallisation indtræder.

Det frafiltrerede produkt med formlen C0-0But HC1 .M2-CH(CH2)2-C0-0Bzl renses ved kromatografi på en kiselgelsøjle (170 g) med 10 chloroform-methanol (85:15)? smp. 107-108°C (dekomposition), [a]^p = -15° -1° (ethanol, 2%).

DC: (chloroform-methanol (85:15)) lif = 0,60.

Trin 6.2 Z-Asn-Phe-Phe- ( D-Trp ) -Lys ( Boc)-Thr(But) -Phe-D-Glu( OBzl) -OBut 15 Til en opløsning af 1,09 g Z-Asn-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Ehe-OH (eksempel 1.7), 0,31 g HC1*[ D-Glu(OBzl)]-OBut (trin 6.1), 0,13 g E-hydroxybenzotriazol og 95 mg lime thylmorpho 1 in i 8 ml dimethylformamid sættes ved 0-5°C en opløsning af 0,21 g DCCI i 2 ml dimetbylf ormamid, og blan-20 dingen holdes efter 30 minutter ved 0-5°C i yderligere 15 timer ved stuetemperatur. Det udfældede dicyclohexylurinstof frafiltreres, og filtratet inddampes i højvakuum. Remanensen rives med 30 ml vand, filtreres, tørres og omrøres til rensning endnu to gange, hver gang med 10 ml methanol og 25 frafiltreres.

DC: (chloroform-methanol (85:15)) Rf = 0,85 (chloroform-methanol-vand (14:6:1)) Rf = 0,91.

36 151034

Trin 6.3 H-Asn-Phe -Phe - ( D-lrp ) -Lys ( Bo c ) -Thr ( But) -Bie- Γ D- Glu] - OBut På analog måde som i eksempel 1.9 beskrevet ly dr ogener es forbindelsen med formlen 5 H-Asn-Phe-Phe- ( D-Trp ) -Lys ( Bo c ) -Thr ( But) -Phe- [ D-Glu- (0Bzl)]-0But (trin 6.2) til det ønskede produkt.

DC: (chloroform-methanol (85:15)) Rf = 0,13 (chloroform-methanol-vand (14:6:1)) Rf = 0,65.

lp Trin^6u4_________j ^-Asn-Phe-Phe-( D-Trp) -Lys (Boc)-Thr(But)-Phe-[ D-Glu] -OBut På analog måde som beskrevet i eksempel 1.10 cycliseres syren med formlen H-Asn-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-[D-Glu]-OBut 15 ved hjælp af DCCI og E-hydroxybenzotriazol. Råproduktet renses ved modstrømsfordeling (K = 0,52).

DC: (chloroform-methanol (85:15)) Rf = 0,54 (chloroform-methanol-vand (14:6:1)) Rf = 0,83-

Eksempel 7.

20 Phe-Phe-(D-Trp)-Lys-Thr-Phe 235 mg beskyttet hexapeptid med formlen

Phe-Phe- ( D-Trp ) -Lys (Boc ) -Thr (But) -Phe befries analogt med eksempel 1 med trifluoreddikesyre for beskyttelsesgrupperne og renses som acetat ved modstrømsf or-25 deling i det samme system som i eksempel 1. Det rene stof isoleres ved K = 5» 4.

37 151034 DO: (kiselgel, Merck): system 4-5 Rf = 0,2, system 52 Rf = 0,35, system 157 Rf = 0,5·

Udgangsmaterialet opnås som følger:

Trin 7·1 5 Z-Phe -Hie- ( D-Trp ) -Lys ( Bo c )-Thr ( But) -Phe-OTms e

Til en opløsning af 2,84- g Η- ( D-Trp ) -Lys ( Bo c ) -Thr ( But) -Phe -OTmse (eksempel· 1.5) og 1,52 g Z-Phe-Phe-OH i 12 ml dime-thylf ormamid sættes ved 0°C 0,62 g U-hydrosybenzotriazol og 0,98 g DOCI, og "blandingen henstilles i 16 timer ved 0°C.

10 Efter frafiltrering af dicyclohexylurinstoffet fældes produktet ved tildrypning til fortyndet natriumhydrogencarbonat-opløsning. Produktet omkrystalliseres fra vandigt methanol.

DC: (kiselgel, Merck): system 157&-, Rf = 0,6.

Trin 7»2

15 Z-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-OH

Til en opløsning af 2,86 g Z-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys( Bo c ) -Thr(But)-Phe~OTmse i 13,5 ml dimethylformamid sættes ved 30°C 6,1 ml af en 1,2 M opløsning af tetrabutylammonium-fluorid i dimethylsulfoxid, og blandingen henstilles i 5 20 minutter ved denne temperatur. Produktet fældes ved tildrypning til iskold fortyndet saltsyre og renses ved omfældning fra acetonitrilopløsning med fortyndet saltsyre.

DC: system 157A Rf = 0,35-

Trin 7·5

2 5 i-Phe -Phe - ( D-Trp ) -Lys ( Bo c ) -Thr ( But) -Phe -I

En opløsning af 870 mg Z-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-OH i 20 ml di.me thylf ormamid hydrogeneres under tilstedeværelse af 90 mg palladium-kul (10%) i 2 timer ved stue- 38 151034 temperatur. Efter frafiltrering af katalysatoren koncentreres filtratet i højvakuum til få ml, der tilsættes 790 ml dime thylf ormamid, 1,2 g U-hydroxybenzotriazol og 1,6 g DCCI, og "blandingen henstilles i 15 timer ved 50°C. Efter tilsæt-5 ning af 2 ml 5 M oxalsyreopløsning i dime thylf ormamid inddampes "blandingen i høj vakuum til ca. 10 ml, dicyc 1 ohexylur in-stoffet suges fra, og produktet fældes ved tildrypning til fortyndet natriumhydrogencarhonatopløsning♦ Ved kromatografi på kiselgel elueres det rene produkt med chloroform under 10 tilsætning af 5-5% methanol.

DO: system 157k Bf = 0,5·

Eksempel 8.

^-phe-Phe-C D-Trp ) -Lys-Thr-Phe-Gly^ 450 mgWhe-Phe- (D-Trp )-Lys ( Bo c ) -Thr ( But) -Phe-Gly-^ behandles 15 som beskrevet i eksempel 1 med trifluoreddikesyre. Det rå produkt overføres med en ionbytter til acetatet,og dette renses ved modstrømsfordeling i systemet n-butanol-eddike-syre-vand-toluen (4:1:5:4) over 420 trin. Det rene stof (K = 1,5) isoleres på sædvanlig måde.

20 DC: (kiselgel, Merck): system 1570 Bf = 0,25·

Udgangsmaterialet kan opnås på følgende måde:

Trin 8.1 Z-Phe-Phe- ( D-Trp ) -Lys ( Bo c ) -Thr ( But) -Phe-Giy-OBzl

Til en opløsning af 800 mg Z-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(Boc)-25 Thr(But)-Phe-0H (eksempel 7*2), 290 mg H-Gly-OBzl-p-toluen-sulfonat og 130 mg U-hydrosybenzotriazol i 4 ml dimethyl-formamid sættes ved 0°C 0,095 ml B-methylmorpho 1 in og 200 mg DCCI, og blandingen henstilles i 16 timer ved 0°0. Efter frafiltrering af di cy c 1 ohexylur ins t of f e t fældes produktet 39 151034 ved tildrypning til fortyndet natriumfaydrogencarbonatopløs-ning. Råproduktet renses ved omkrystallisation fra methanol-vand (9:1) og acetonitril-vand (1:1).

DC: (chloroform-methanol (95:5))Hf = 0,55, system 157-4 Rf = 5 0,75.

Trin 8.2 _ kPfa.e-Eh.e- ( D-Trp ) -lys ( Bo c) -Thr ( But) -Phe-Gly-^

En opløsning af 780 mg Z-Eh.e-Ehe-(D-Trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-Gly-OBzl (trin 8.1) i 15 ml dimethylformamid hydrogeneres 10 -under tilstedeværelse af 80 mg palladium-kul (10%) i 6 timer. Efter frafiltrering af katalysatoren inddampes filtratet stærkt, der tilsættes 115 ml dime thylf ormamid, 910 mg U-hydroxybenzotriazol og 1,22 DCCI, og blandingen henstilles i 20 timer ved 50°C. Oparbejdningen sker som beskrevet i eksem-15 pel 7.5. Til rensning af råproduktet gennemføres en modstrømsfordeling over 460 trin i det samme system, som beskrevet i eksempel 1.10. (E = 0,4).

DC: System 1574 Rf = 0,4.

Eksempel 9.

20 ^ Ehe-Ehe- ( D-Trp) -Lys-Thr-Phe - Gab a-1 260 mgkphe-Phe-( D-Trp ) -Lys ( Bo c) -Thr ( But) -Ebe - Gab a-^ behandl e s analogt med eksempel 1 med tr if luor eddike syre. Yed hjælp af en ionbytter overføres produktet til acetatet, som renses ved modstrømsfordeling over 300 trin i systemet sek.butanol-25 vand-eddikesyre (100:100:1). Det rene stof (K = 1,5) isoleres som sædvanligt.

DC: (kiselgel, Merck) system 157 Rf = 0,5.

Udgangsmaterialet opnås på følgende måde: 40 151034

Trin 9.1 Z-Hie-Phe- CB-Trp)-Lys (Bog) -Thr (But) -Phe-Gaba-OBzl

Til en opløsning af 4-20 mg Z-Phe-Phe-(B-Trp)-Lys(Boc)-. Thr(But)-Phe-OH (eksempel 7.2), 165 mg H-Gaba-OBzl.p-toluen-5 sulfonat og 70 mg E-hydroxybenzotriazol i 2 ml dimethylform-amid sættes ved 0°C 0,05 ml E-methylmorpho lin og 100 mg DCCI,og "blandingen henstilles i 20 timer ved 0°C. Efter fra-filtrering af dicyclohexylnrinstoffet udfældes produktet ved tildrypning til natrinmhydrogencarbonatopløsning.

10 BO: system 157A Ef = 0,65.

Trin 9.2 ^-Phe-Phe- ( B-Trp ) -lys (Boc ) -Thr ( But) -Phe-Gaba-^

En opløsning af 500 mg Z-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-Gaba-OBzl i 20 ml dimethylformamid hydrogeneres under 15 tilstedeværelse af 50 mg palladium-kul (10i 2 timer. Efter frafiltrering af katalysatoren inddampes filtratet stærkt i hø jvakuum, til remanensen sættes 370 ml dimethylformamid, 560 mg E-hydroxybenzotriazol og 760 mg BCOI, og blandingen henstilles i 18 timer ved 50°C. Oparbejdningen og rensningen 20 af produktet sker analogt med eksempel 8.2, K = 0,3.

BC: system 157-A- Ef = 0,45·

Eksempel 10.

^åsn-Phe-Phe- ( B-Trp ) -hys-Thr-Phe-Gly-^ 600 mgkåsn-Phe-Phe- (B-Trp)-Lys (Boc )-Thr(But)-Phe-Gly-lbe-25 handles med trifluoreddikesyre som beskrevet i eksempel 1, oparbejdes og renses, K = 3,5- BC : system 1570 Ef = 0,15.

..41 151034

Udgangsmaterialet opnås som følger:

Trin 10.1 Z-Asn-Phe-Phe-( D-Trp )-Lys (Boc ) -Thr( Bat) -Phe-Gly-OBzl

Til en opløsning af 230 mg Z-Asn-Phe-Phe- (D-Trp) -Lys (Boc) -5 Thr(But)-Phe-OH (eksempel 1.7)? 77 mg H-Gly-OBzl.p-toluen-sulfonat og 35 mg U-hydroxybenzotriazol i 1 ml dimethylform-amid sættes ved 0°C 0,025 ml U-methylmorpholin og 53 mg DOGI. Efter 16 timer oparbejdes blandingen analogt med eksempel 7-1 og omkrystalliseres fra acetonitril-vand (4-:1).

10 DC: system 157 A Ef = 0,65-

Trin 10,2

Asn-Phe-Phe- ( D-Trp ) -lys (Boc) -Thr ( But) -Phe-Gly —^

En opløsning af 200 mg Z-Asn-Ph.e-Phe-(D-Trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-Gly-OBzl (trin 10.1) i 15 ml dimethylformamid 15 hydrogeneres "under tilstedeværelse af 50 mg palladium-kul (10%). Efter frafiltrering af katalysatoren inddampes filtratet i høj vakuum·, der sættes 14-0 ml dime thylf ormamid, 215 mg U-hydroxybenzotriazol og 290 mg DCCI til remanensen, og blandingen henstilles i 20 timer ved 50°C. Oparbejdning 20 og rensning sker som i eksempel 8.2. K = 0,8.

DC: system 157B Ef = 0,4-5-

Eksempel 11.

L-Asn-Phe-Phe-Γ D-Trp (E ) ] -Lys -Thr—Phe—Gaba-I

340 mg Asn-Phe-Phe-[ D-Trp (1)3 -Lys (Boc )-Thr(But) -Fhe-Gaba 25 behandles som beskrevet i eksempel 1 med trif luor eddike syre, overføres ved hjælp af en ionbytter til acetatet og renses ved modstrømsfordeling i systemet tert.butanol-toluen-methanol-puffer (0,05 M ammoniumacetat + 0,05 M eddikesyre) 42 151034 (7:7:3:1°) over 500 trin (K = 0,14). (Symbolet [D-Trp(E)] betyder 5-flnor-D-tryp tophan).

DC: system 157: Rf = 0,36.

Udgangsmaterialet opnås på følgende måde: 5 Trin 11.1

Z-Γ D-Trp(E)]-OH

Til en opløsning af 2 g 5-fluor-DL-tryptophan i 9 .ml 1 I natriumhydroxidopløsning sættes under isafkøling og stærk omrøring samtidig 1,4 ml chlormyresyrebenzylester og 1° 10,5 ml 1 I natriumhydroxidopløsning. Efter yderligere 2 ti mer tilsættes 5° ml ethylacetat, den tofasede blandings pH indstilles til 1 med saltsyre, og den organiske fase skilles fra, vaskes med vand, tørres over natriumsulfat og inddampes. Remanensen opløses i 9i5 ml vand og 5 il 2 N natrium-15 bydroxidopløsning, efter tilsætning af 1,5 ml anilin, 100 mg L-cystein-bydrocblorid og 54 ml 0,2 M citratpuffer (pH 5) udfælder udgangsmaterialet til dels igen; suspensionen bringes med 2 Έ saltsyre til pH 6,3- 260 mg papain opslæm-mes i 2 ml vand på 40°C, det uopløselige fracentrifugeres, 20 1,9 ml af supernatanten sættes til den ovennævnte suspen sion og denne omrøres i 20 timer ved 40°C. Under isafkøling bringes blandingens pH til 8 med 2 U natriumhydroxidopløsning, det uopløselige Z-[L-Trp(E ) ]-anilid frafiltreres, filtratet indstilles med 5 U saltsyre til pH 5,3, og der 25 tilsættes som ovenfor cystein-hydrochlorid og papain. Efter yderligere 20 timer f raf iltreres det dannede anilid igen, og filtratet behandles endnu en gang i løbet af 3 dage som ovenfor, hvorved der kun dannes spor af anilidet. Filtratet overhældes med ethylacetat og indstilles til pH 1-2; det 30 organiske lag vaskes med vand, tørres over natriumsulfat og inddampes. Remanensen omkrystalliseres fra diis opr opylether-hexan.

DC: system 157B Rf = 0,3· 43 151034

Trin 11.2 Ζ-ΓΡ-Τγρ(3?)]-Ττ8(Βοο)-ΟΗ 1,15 g Z-[D-Trp(B)]-OH overføres ifølge den i eksempel 1.3A "beskrevne fremgangsmåde til det i titlen nævnte dipeptid.

5 DO: system 157B Hf = 0,33·

Trin 11.3 Z-[D-Trp(ff ) ]-lys CBoc)-Tbr(But)-Pbe-OTmse

Til en opløsning af 380 mg Z-[D-Trp(B)]-Lys(Boc)-OH, 300.mg H-Thr(But)-Pbe-OTmse (eksempel 1.3) og HO mg H-bydroxy-10 benzotriazol i 2,5 ml dime thylf ormamid sættes ved 0°C 170 mg DCCI. Efter 15 timer oparbejdes "blandingen analogt med eksempel 7.1, og produktet renses ved omkrystallisation fra ethylacetat-petroleumsether.

DC: system 157A Hf = 0,76.

15 Trin 11.4 Z-Asn-Pbe-Pbe-[ D-Trp (3?)] -Lys(Boc)-Tbr(But)-Pbe-OTmse

En opløsning af 490 mg Z-[D-Trp(ff)]-Lys(Boc)-Thr(But)-Pbe-OTmse i 15 ml methanol-vand (9:1) bydrogeneres -under tilstedeværelse af 50 mg palladium-kul (10%), idet der ved en 20 samtidig tilsætning af 0,2 U saltsyre i det ovennævnte opløsningsmiddel gennemgående boldes et pH på 5· Reaktions-blandingen filtreres, filtratet inddampesjog vandet fjernes tre gange ved afdampning med dimetbylformamid. Til den tilbageblivende opløsning (1,2 g) sættes 305 mg Z-Asn-Phe-Pbe-25 OH, 83 mg N-bydroxybenzotriazol, 0,06 ml H-methylmorpholin og 1,2 ml dimetbylf ormamid. Ved -5°C tilsætter man 130 mg DCCI og benstiller blandingen i 16 timer ved denne temperatur. Efter oparbejdning analogt med eksempel 7.1 omkrystalliseres produktet fra acetonitril-vand.

30 DC: system 157A Bf = 0,6.

44 151034

Trin 11.5

Z-Asn-Phe -Phe-Γ D-Trp (P ) ] -Lys (Boc ) -Thr ( But) -Rie-OH

Til en opløsning af 600 mg Z-Asn-Phe-Phe-[ D-Trp(P ) ]-lys(Boc)-Thr(But)-Phe-OTmse i 4,2 ml dimetlaylformamid sættes ved 30°C

3,8 ml 0,34 M tetraethylammoniumfluoridopløsning i dimethyl-5 snif oxid, og "blandingen lienstilles i 30 minutter ved 30°C. Opløsningen dryppes under isafkøling til 50 ml vand og 0,65 ml 2 1ST saltsyre, og "bundfaldet frafiltreres. Produktet renses ved omkrystallisation fra acetonitril-vand.

DC: system 1574 Ef = 0,35- 10 Trin 11.6 Z-Asn-Pb.e-Ph.e-C D-Trp (P ) ] -lys ( Boc ) -Thr ( But) -Phe-Gaba-OBzl

Til en opløsning af 470 mg Z-4sn-Phe-Phe-[ D-Trp(P)]-Lys(Boc)-Tbr(But)-Phe-OH, 165 mg H-Gaba-OBzl*p-toluensulfonat (eksempel I.74) og 66 mg ΪΓ-hydroxybenzotriazol i 2 ml dimethylform-15 amid sættes ved -5°C 0,05 ml N-methylmorpholin og 100 mg DCCI. Efter 16 timer ved denne temperatur oparbejdes blandingen analogt med eksempel 7*1· Produktet opnås rent, bortset fra spor af cyclohexylurinstof.

DC: system 157-4 Ef = 0,55· 20 Trin 11.7 ^-Asn-Plie-Pbe-Γ D-Trp (P)] -Dys (Boc)-Thr (But)-Phe-Gaba-^

En opløsning af 520 mg Z-4sn-Phe-Phe-[D-Trp(P)]-Lys(Boc)-Tbr(But)-Phe-Gaba-OBzl i 20 ml dimetbylformamid hydrogene-res under tilstedeværelse af 50 mg palladium-kul (10%) i 25 2 timer. Efter f raf il trering af katalysatoren inddampes filtratet i høj vakuum, og der tilsættes 350 ml dimethyl-formamid, 540 mg E-hydroxybenzotriazol og 720 mg DCCI. Efter 20 timer ved 50°C oparbejdes og renses blandingen analogt med eksempel 8.2; K = 1,1.

45 151034 DC: system 157-4 Bf = 0,35·

Eksempel 12.

Asn-Phe-Phe-[ D-Trp (ITC^ ) ] -Lys-Thr-Phe-Gaba·^ På analog måde som beskrevet i eksempel 1 behandler man det 5 beskyttede peptid med formlen ^-Asn-Phe-Phe-[ D-Trp (ΪΓ02) ] -Lys (Bog ) -Thr ( But) -Phe-Gaba-^ med triflnoreddikesyre og oparbejder blandingen. Ved modstrømsfordeling over 220 trin (K = 4,5) opnås det ønskede produkt som et tyndtlagskromatografisk ensartet amorft stof.

10 DC: system 101 Bf = 0,58, system 111B Bf = 0,40, system 112A Bf = 0,45.

(Symbolet [D-TrpCM^)] betyder 6-nitro-D-tryptophan). Udgangsmaterialet opnås på følgende måde:

Trin 12.1 15 Z-Gaba-QTmse

En opløsning af 5,93 g Z-Gaba-OH og 3,84 g trimethylsilyl-ethanol i 10 ml acetonitril og 6 ml pyridin afkøles til 5°C, og der tilsættes under omrøring 5,70 g DCCI. Efter en time ved 5°C holdes reaktionsblandingen i endnu 15 timer 20 ved stuetemperatur. Det udfældede dicyc 1 ohexylurinstof fra-filtreres og vaskes med etbylacetat, og filtratet inddampes. Bemanensen kromatograferes på en kiselgelsøjle (350 g), hvorved en blanding af tetrachlormethan og etbylacetat (6:4) tjener som elueringsmiddel. Praktionerne, der indehol-25 der produktet, samles og inddampes. Den opnåede farveløse olie tørres i højvakuum.

46 151034 DC: (chloroform-methanol (85:15)) Bf = 0,69 (toluen-acetone (7:3)) Bf = 0,59-

Trin 12.2 H-Gaha-Olmse 5 Gennem en opløsning af 4,70 g Z-Gaba-OTmse (trin 12.1) i 50 ml 2-propanol ledes efter tilsætning af 0,5 g palladium-kul (10%) hydrogen, indtil der tyndt lagskromat ografisk (chloroform-methanol (85:15)) ikke længere kan påvises udgangsstof. Katalysatoren frafiltreres, og filtratet inddam-10 pes i vakuum. Det opnåede olieagtige råprodukt anvendes direkte til det næste trin.

Trin 12.5 Z-Phe-Gata-OTmse

Til en opløsning af 4,60 g Z-Phe-ΟΞ og 2,83 g H-Gaba-OTmse 15 (trin 12.2) i 15 ml methylenchlorid sættes ved 0-5°C en opløsning af 3»75 g dicycloheixylcarbodiimid i 5 ml methylenchlorid. Be akt ionstl andingen holdes i endnu 15 minutter ved 5°0 og derefter i 2 timer ved stuetemperatur; det udfældede DCH f raf iltreres, og filtratet inddampes. Remanensen omkry-20 stalliseres til rensning tre gange fra 12 ml ethylacetat og 60 ml petroleumsether, smp. 88-93,5°C (dekomposition).

(DCH = dicyclohexylurinstof).

DC: (chloroform-methanol (85:15)) Bf = 0,72 (toluen-acetone (7:3)) Bf = 0,44.

25 Trin 12.4 Z-Thr ( But) -Phe-Gaha-QTms e

En opløsning af 3,93 g H-Phe-Gaha-OTmse (opnået ud fra 5,42 g Z-Phe-Gaha-OTmse (trin 12.3) ved hydrogenering ana- -logt med trin 12.2) og 5^45 g Z-Thr(But)-0HSu i 25 ml di-30 methylformamid koldes i 15 timer ved stuetemperatur, der 47 151034 tilsættes 0,34- ml dime thylaminopropylamin, og 'blandingen henstilles i yderligere en time ved stuetemperatur. Reaktionsblandingen inddampes i høj vakuum., remanensen opløses i ca. 200 ml ethylacetat og vaskes tre gange, hver gang med 5 30 ml af en 5%'s vandig vinsyre opløsning og tre gange, hver gang med 30 ml vand. Den over natriumsulfat tørrede organiske fase inddampes i vakuum, og remanensen omkrystalliseres to gange fra 10 ml ethylacetat-80 ml petroleumse ther, smp. U4~117°C (dekomposition).

10 DC: (chloroform-methanol (85:15)) Rf = 0,75 (tetraehlormethan-ethylacetat (6:4·)) Rf = 0,39·

Trin 12.5 Z-Lys (Boc )-Thr (But)-Phe-Gaba-OTmse

Til en opløsning af 2,37 g H-Thr(But)-Phe-Gaba-0Tmse (op-15 nået ud fra 3j00 g Z-Thr (But) -Phe - Gab a- OTms e ved hydrogenering analogt med trin 12.2), 1,96 g Z-Lys(Boc)-OH og 0,70 g H-hydroxybenzotriazol i 10 ml methylenchlorid sættes ved 0-5°C en opløsning af 1,25 g DCCI i 5 ml methylenchlorid.

Efter 15 minutter ved 0-5°C holdes "blandingen i 15 timer ved 20 stuetemperatur. Det udfældede dicyc 1 ohexylurinstof frafil-treres, filtratet inddampes i vakuum, og remanensen omfældes tre gange fra 20 ml ethylacetat-100 ml petroleumsether.

DC: (chloroform-methanol (85:15)) Rf = 0,73 (chloroform-methanol-vand (14-:6:1)) Rf = 0,87.

25 Trin 12.5-å

Bpoc-Phe-[D-Trp(Mb,)]-OH

En suspension af 0,50 g 6-nitro-D-tryptophan og 1,10 g Bpoc-Phe-OHSu i 10 ml af en Blanding af dimethylformamid-vand (8:2) behandles ved stuetemperatur med 0,1 H natrium-30 hydroxidopløsning således, at pH forbliver på en værdi på 7,5. Efter 2 1/2 time udgør det samlede natriumhydroxidop- 48 151034 løsningsforbrug 31?5 ml. Reaktionsblandingen afkøles til 0-5°C, og der tilsættes langsomt 3?5 ml 1 IT saltsyre. Det udfældede råprodukt frafiltreres, tørres og kromatograferes to gange på en kiselgelsøgle (hver gang 60 g adsorbens) med en 5 "blanding af chloroform og methanol (85:15) og tetrachlorme.than og ethylacetat (6:4) som elueringsmiddel.

DC: (chloroform-methanol (85:15)) Hf = 0,12 (chloroform-methanol-vand (14:6:1)) Rf = 0,50.

Trin 12.6 1° Bpoc-Phe-Γ D-Trp (HO^ ) 1 -Dys ( Bo c ) -Thr ( But) -Ihe - Gaba-OTms e fil en opløsning af 1,08 g Η-Ly s ( Bo c ) -Thr ( But) -Phe-G-aba-OTmse (opnået ud fra 1,30 g Z-Lys (Bo c ) -Thr (But) -Phe-Gaba-OTmse (trin 12.5) ved hydrogenering analogt med trin 12.2)), 0,93 S Bpoc-Phe-[ D-Trp (M^)]-OH (trin 12.%) og 0,22 g H-15 hydroxybenzotriazol i 8 ml methylenchlorid sættes ved 0-5°C en opløsning af 0,36 g DCCI i 2 ml methylenchlorid. Efter 15 minutter ved 0-5°C holdes "blandingen i 4 timer ved stuetemperatur. Til oparbejdning frafiltreres det udfældede di-. cyclohexylurinstof, filtratet inddampes i vakuum, og remanen-20 sen omfældes fra en blanding af 10 ml ethylacetat og 70 ml petroleumsether og rives derefter med 10 ml methanol.

DC: (toluen-acetone (7:3)) Rf = 0,20 (chloroform-methanol-vand (14:6:1)) Rf = 0,90.

Trin 12.7 25 HCl*H-Phe-[ D-Trp (M^ ) ] -Lys ( Bo c ) -Thr ( But) -Phe-Gaba-OTms e

En opløsning af 1,27 S Bpoc-Phe-[D-Trp (N02)] -Lys (Boc) -Thr(But)-Phe-Gaba-OTmse (trin 12.6) i en blanding af 27 ml trifluorethanol og 3 ml vand holdes ved gradvis tilsætning af en blanding af trifluorethanol og koncentreret saltsyre 30 (9:1) på et tilsyneladende pH på 1,5 (glaselektrode, automatisk titrerapparat). Indtil reaktionens afslutning for- 49 151034 "bruges i løbet af 1 1/2 time ved stuetemperatur ca. 0,76 ml af reagenset. Det efter inddampning i vakuum opnåede råprodukt omrøres i løbet af en time med 30 ml ether og frafil-treres derefter.

5 DC: (chloroform-methanol (85:15)) Rf = 0,55·

Trin 12.7-Å- 2-Trimethylsilyletbyl-IT-hydro3y-succinimidocarbonat (SEOC-OHsu)_

Til en opløsning af 100 g chlormyresyre-H-hydroxysuccinimid-10 ester og 73 ,2 g 2-trimetbylsilylethanol i 160 ml metbylen-chlorid dryppes ved 0-5°C 62,6 g H-methylmorpho 1 in i løbet af 15 minutter. Blandingen omrøres i 2 timer ved 0-5°C, oparbejdes ved tilsætning af 1 liter ether og vaskes to gange med 200 ml 1 I HC1, to gange med 200 ml vand, to gange med 15 200 ml 5%'s natriumhydrogencarbonatopløsning og tre gange med 200 ml vand. De vandige faser efterekstraheres med 0,5 liter ether, og de samlede organiske faser tørres over natriumsulfat og inddampes. Remanensen omkrystalliseres fra 360 ml diisopropyl-ether,og de opståede krystaller frafiltreres og vaskes med 20 150 ml hexan, smp. 101-102°0.

Trin 12.7B SE0C-Asn-0H

I en opløsning af 2,64 g L-asparagin i 80 ml af en blanding af dimethylformamid og vand (6:2) indstilles pH til 7,5 ved 25 tilsætning af 0,21 ml 1 H natriumhydroxidopløsning, og der tildryppes derefter stadig under opretholdelse af et pH på 7,5 ved tilsætning af yderligere mængder 1 H natriumhydroxidopløsning ved hjælp af et automatisk titreringsapparat, en opløsning af 5?19 S SEOC-OHSu (trin 12.7A) i 10 ml dimethyl-30 formamid i løbet af en time. Efter 2 1/2 time frafiltreres en lille mængde uopløst materiale, og til filtratet sættes en mængde fortyndet saltsyre, som er ækvivalent med den for- 50 151034 "brugte mængde 1 H natriumhydroxidopløsning (ca. 20 ml). Opløsningen inddampes i hø g vakuum, og remanensen rives med 30 ml koldt vand og filtreres, smp. 144,5-14-6, 5°0 (dekomposition) .

5 DC: (chloroform-methanol-vand (14-:6:1)) Bf = 0,15·

Trin 12.7C SEOC-Asn-ONSu

Til en opløsning af 1,72 g SE0C-Asn-0H (trin 12.7B) i en "blanding af 20 ml ethylacetat og 10 ml dimethylformamid 10 sættes 0,79 g H-hydroxy-succinimid, og til den til 0-5°C afkølede opløsning sættes 1,54- g DCCI. Efter 2 timer ved 0-5°C frafiltreres det udfældede dicyclohexylurinstof, filtratet fortyndes med 150 ml ethylacetat og vaskes tre gange, hver gang med 50 ml 1%' s oxalsyre opløsning og fire gange, 15 hver gang med 50 ml vand. Den organiske fase tørres over natriumsulfat og inddampes i vakuum; det opnåede skum anvendes direkte uden yderligere rensning i det næste trin.

. DC: (chloroform-methanol-vand (14-:6:1)) Bf = 0,75·

Trin 12.7D 20 SEQC-Asn-Bhe-OH

Til en suspension af 0,64- g phenylalanin og 1,44 g SEOC-Asn-OEBu (trin 12.70) i en "blanding af 5 ml dimetliylformamid og 5 ml vand dryppes i løbet af en halv time ved stuetemperatur en 1 I natriumhydroxidopløsning ved hjælp af et . 25 automatisk titrerapparat med en sådan hastighed, at der holdes et pH på 7j5· Til oparbejdning frafiltreres en lille mængde uopløst materiale, og til filtratet sættes ved 0-5°C en mængde fortyndet saltsyre (ca. 4-,2 ml af en 1 I opløsning), der er ækvivalent med den forbrugte mængde 30 natriumhydroxidopløsning. Det udfældede råprodukt tørres over phosphorpentoxid og omkrystalliseres fra 4-0 ml ethyl- 51 151034 acetat, smp. 156-158°C (dekomposition).

DG: (ehlorofo:m-methanol-vand (14:6:1)) Rf = 0,33*

Trin 12.8 SEOC-Asn-Phe-Phe-[ D-Trp (M^ ) ] -Lys (Bo c ) -Thr ( But) -Phe-Gaba-5 OTmse_

En opløsning af 500 mg HCl*H-Phe-[D-Trp(E02)]-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-Gaba-OTmse (trin 12-7) , 202 mg SEOC-Asn-Phe-OH (trin 12.7D), 65 mg E-hydroxybenzotriazol og 44 mg E-methyl-morpholin i 5 ml dimetliylformamid afkøles til 0°0, og der 10 tilsættes 116 mg DCCI, hvorefter blandingen holdes i 15 minutter ved 0-5°G og i 6 timer ved stuetemperatur. Det udfældede dicyclohexylurinstof frafiltreres, filtratet inddampes i højvakuum, og remanensen rives med 20 ml vand og suges fra. Råproduktet rives endnu to gange, hver gang med I5 4 ml methanol og frafiltreres.

DC: (chloroform-methanol (85:15)) Rf = 0,80 (chloroform-methanol-vand (14:6:1), Rf = 0,90.

Trin 12.9

H-Asn-Phe -Phe-[ D-Trp (E02) ] -Lys ( Bo c ) -Thr ( But) -Phe-Gaba-OH

20 530 mg SE0C-Asn-Phe-Phe-[D-TrpQ$T02)]-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-Gaba-OTmse (trin 12.8) opløses i 46,7 ml af en friskfremstille t vandfri 0,15 M tetraethylammoniumfluoridopløsning i dimethylformamid og holdes i en time ved stuetemperatur. Opløsningen afkøles til 0-5°C,under god omrøring tilsættes 25 0,70 ml vandig 1 E saltsyre, og blandingen koncentreres til 3 ml i højvakuum. Produktet fældes ved tilsætning af 30 ml vand.

DC: (chloroform-methanol-vand (14:6:1)) Rf = 0,45.

52 151034

Trin 12.10

kåsn-Phe-Phe-[ D-TrpQSK^)] -Lys ( Bo c ) -Thr ( But) -Plie - Gaha -I

På en analog måde, som "beskrevet i eksempel 1 opnås H-Asn-Phe-Phe-[ D-Trp (ΡΓΟ^)! -Lys ( Bo c ) -Tin? ( But) -Phe-Gaha-OH (trin 5 12.9) ved cyclisering ved hjælp af DCCI og E-hydroxybenzo-triazol. Råproduktet renses ved modstrømsfordeling (K = 1,08).

DC: (chloroform-methanol (85:15)) Rf = 0,45 (chlorof orm-methanol-vand (14:6:1)) Rf = 0,60.

1° Eksempel 15.

^Asn-Phe -Phe - f Trp(Br)] -Lys-Thr-Phe-G-aha-^ (Synholet [ Trp(Br)] "betyder 5-hrom-L-tryptophan). Syntesen af den nævnte forbindelse sker under de samme "betingelser som syntesen i det foregående eksempel 12, men under anven-15 delse af 5-Urom-L-tryptophan i stedet for 6-nitro-D-trypto-phan i tilsvarende udgangsstoffer og mellemprodukter. Modstrømsfordeling 520 trin, K = 9»0.

DC: system 101 Rf = 0,60, system 111B Rf = 0,40, system 112A Rf = 0,52.

20 Udgangsstoffet med formlen l-Asn-Phe-Phe-[ Trp(Br) ] -Dys ( Bo c ) -Thr ( But) -Phe-Gaha-^ opnås på følgende måde:

Trin 15.1

Bpoc-Phe-C Trp(Br)]-OH

25 På analog måde som "beskrevet i eksempel 12.5A omsættes 0,57 g 5-brom-L-tryptophan med 1,00 g Bpoc-Phe-ORSu.

53 151034 DC: (chloroform-methanol (85:15)) Rf = 0,15 (chloroform-methanol-vand (14:6:1)) Rf = 0,55·

Drin I5.2

Bpoc-Phe-Γ Trp ( Br)]-Lys (Eoc )-Thr(But) -Phe-Gaba-QTin.se 5 En blanding af 0,57 g Bpoc-Phe-[Trp(Br)]-OH (trin 13.1), 0,63 g Η-Lys (Boc)-Thr (But)-Phe-Gaba-OTmse (eksempel 12.5), 0,13 g H-hydroxybenzotriazol og 0,21 g DCCI omsættes på analog måde som i eksempel 12.6. Til rensning opløses råproduktet i 10 ml varmt methanol og udfældes ved afkøling.

1° DC: (chloroform-methanol (85:15)) Rf = 0,80 (chloroform-methanol-vand (14:6:1)) Rf = 0,90.

Trin I5.5 HCl»H-Phe-Γ Trp(Br ) ]-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-Gaba-OTmse 0,84 g Bpoc-Phe-[Trp(Br)]-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-Gaba-OTmse 15 behandles analogt med eksempel 12.7.

DC: (chloroform-methanol (85:15)) Rf = 0,65 (chloroform-methanol-vand (14:6:1)) Rf = 0,90.

Trin 13.4 SEOC-Asn-Phe-Phe-[Trp(Br)]-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-Gaba-OTms e 20 Analogt med eksempel 12*8 kobles 700 mg HCl*H-Phe-[Trp(Br)]-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-Gaba-OTmse (trin 13-3) og 250 mg SEOC-Asn-Phe-OH (eksempel 12.7D) ved hjælp af 146 mg DCCI under tilstedeværelse af 88 mg H-hydroxybenzotriazol og 60 mg N-methylmorpholin.

25 DC: (chloroform-methanol (85:15)) Rf = 0,77 (chloroform-methanol-vand (14:6:1)) Rf = 0,85.

54 151034

Trin 15«5

H-Asn-Phe -Pile - Γ grp (Br ) ] -Lys (Bog) -gire (But) -Phe-Gaha-OH

I 500 mg SEOO-Asn-Phe-Phe-[Trp(Br)]-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-GaBa-OTmse (trin 13.4) fraspaltes samtidig SEOC- og Tmse-5 gruppen analogt med eksempel 12.9.

DC: (chlorof orm-methanol-vand (14:6:1)) Ef = 0,50.

Trin 15.6 4 Asn-Phe -Bie-Γ Trp(Br)] -Iys^pcVThrCButO-Phe-GaBa-^

Ved cyclisering af H-Asn-Phe-Phe-[Trp(Br)]-Lys(Boc)-10 Thr (But) -Phe-GaBa-OH ved hjælp af DCCI og E-hydroxyBenzo-triazol ifølge den i eksempel 1.10 Beskrevne fremgangsmåde opnås et råprodukt, som renses ved modstrømsfordeling (E = 0,86).

DG: (chloroform-methanol (85:15)) Hf = 0,06 15 (chloroform-methanol-vand (14:6:1)) Ef = 0,85.

Eksempel 14.

^Asn-Phe-Phe- ( D-Trp ) -Lys-lhr-Γ Phe ( J) ] -GaBa-^ 130 mg LAsn-Phe -Ehe - ( D-Trp ) -Lys ( Bo c ) -Thr-[ Phe (j)] -Gaha ^ Behandles analogt med eksempel 1 med trifluoreddikesyre og 20 overføres ved hjælp af en ionBytter til acetatet. Eensnin-gen sker ved modstrømsfordeling i det i eksempel 1 angivne system; E = 9* DG: (kiselgel, Merck) system 1570 Ef = 0,25-Symbolet Ph(J) Betyder p-iod-L-phenylalanin.

25 Udgangsmaterialet opnås på følgende måde: 55 151034

Trin 14-.1 Z-(D-Trp)-Lys(Boc)-Thr-OMe

Til en opløsning af 2,78 S Z-(D-Trp)-Lys(Boc)~OH (eksempel 1.3A), 0,85 g H-Thr-OMe-hydrochlorid og 0,77 g H-hydroxy-5 henzotriazol i 16 ml acetonitril sættes ved -5°C 0,56 ml H-methylmorpholin og 1,03 g DCCI. Efter 15 timer ved -5°C oparbejdes blandingen analogt med trin 14.3B. Produktet omkrystalliseres fra ethylacetat-hexan; smp. 120-122°C.

DC: system 157-Å- Bf = 0,47·

10 Trin 14.1A

SEOC-Asn-Phe-Phe-OH

En opløsning af 2,24 g Z-Asn-Phe -Pbe - OH i 40 ml dimethyl-formamid hydrogeneres under tilsætning af 0,23 g Pd-kul 15 (10%) i 4 timer ved stuetemperatur. Efter frafiltrering af katalysatoren inddampes opløsningen til ca. 5 ml i højvakuum og videreforarbejdes direkte i denne form. Til en opløsning af 1,71 g opnået H-Asn-Phe-Phe-OH i 15 ml dimethylformamid sættes 10 ml vand, og den opnåede suspension holdes efter 20 tilsætning af 1,04 g SEOC-OHSu ved gradvis tilsætning af 2 ΪΓ natriumhydroxidopløsning ved hjælp af et automatisk ti-trerapparat i løbet af 2 timer (stuetemperatur) ved et pH på 755· Efter en yderligere tilsætning af 1,04 g SEOC-OHSu henstilles blandingen i endnu 4 timer ved pH 7>5* Til opar-25 bejdningen filtreres lidt uopløst materiale fra blandingen, til filtratet sættes ved 0-5°C en mængde saltsyre, der er ækvivalent med det forbrugte natriumhydroxid (ca. 8,0 ml 2 H saltsyreopløsning), det udfældede produkt frafiltreres og tørres. Råproduktet omfældes en gang fra 10 ml methanol med 30 100 ml ether og en gang fra 10 ml methanol med 80 ml vand, smp. 176-182°C (dekomposition).

DC: (chloroform-methanol-vand (14:6:1)) Rf = 0,30.

56 151034

Trin 14.2 SEOC-Asn-Phe-Phe-( D-Trp ) -Lys (Bo c ) -Thr-OMe

En opløsning af 340 mg Z-(D-Trp)-Lys(Boc)-Thr-OMe (trin 14.1) i en blanding af 15 ml methanol og vand (9:1) hydrogeneres 5 -under tilstedeværelse af 50 mg palladium-kul (10$), og under tilsætning af 0,2 I saltsyre i det samme opløsningsmiddel ved pH 4,5· Efter frafiltrering af katalysatoren inddampes filtratet i vakuum og inddampes endnu to gange med dimethyl-formamid. Til den tilbageblivende opløsning (total 1,5 g) 10 sættes 285 mg SE00-Asn-Phe-Phe-0H (trin 14.1A) og 90 mg H-hydroxybenzotriazol. Yed -5°C tilsættes 0,056 ml H-methyl-morpholin og 123 mg DCCI, og blandingen henstilles i 18 timer ved -5°0. Oparbejdningen sker analogt med eksempel 7-1; råproduktet omkrystalliseres fra vandigt trifluorethanol.

15 DC: System 157A Ef = 0,45.

Trin 14.3 SEOC-Asn-Phe-Phe- ( D-Trp ) -Dys (Boc ) -Thr-hydrazid

Til en opløsning af 355 mg SEOC-Asn-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(Boc)-Thr-OMe (trin 14.2) i 1,1 ml dimethylformamid sættes ved 20 stuetemperatur 0,16 ml hydrazinhydrat. Efter 2 1/2 time rives den faste masse med 5 ml vand, og bundfaldet suges fra og vaskes med vand til fuldstændig fjernelse af hydrazin.

Det efter rivning med methanol opnåede produkt er ensartet.

DC: system 157B Ef = 0,25-

25 Trin 14.3A

Boc-Γ Phe ( J) ] -OH

Til en opløsning af 2,9 g p-iod-L-phenylalanin i 10 il 1 I natriumhydroxidopløsning og 25 ml tert.butanol sættes 2,4 ml di-tert.butyl-dicarbonat, og blandingen omrøres ved stue-30 temperatur i yderligere 3 timer og henstilles i endnu 20 timer. Eeaktionsopløsningen fordeles mellem vand og hexan; den 151034 -57 organiske fase bortkastes, og den vandige fase gøres sur under isafkøling. Produktet optages i ethylaeetat, og opløsningsmidlet afdampes i vakuum. Produktet renses ved krystallisation fra tetrachl ormethan, smp. 118-120°C.

5 PC: system 157B Bf = 0,35·

Urin 14.3B

Boc-rPhe(J)]-Gaba-OTmse

Til en opløsning af 406 mg H-G-aba-OTmse (eksempel 12.2), 782 mg Boc-[Phe(J)] -OH (trin 14.3A) og 306 mg E-bydroxy-10 benzotriazol i 5 ml acetonitril og 3 ml dimetbylformamid sættes ved +5°C en opløsning af 412 mg DCCI i 1 ml dimethyl-formamid. Efter 20 timer ved 5°C frafiltreres det udfældede dicyclohexylurinstof, filtratet fortyndes med ethylacetat og udrystes med fortyndet saltsyre og natriumhydrogencarbonat-15 opløsning. Efter tørring over natriumsulfat inddampes opløsningsmidlet, og produktet omkrystalliseres fra hexan, smp. 98-100°C.

PC: (cyclohexan-acetone (7:3)) Bl = 0,35? system 157-4 Bf = 0,68.

20 Trin 14.30 Ξ-Γ Phe( J)] -Gaba-OTmse-hydrochlorid

Til en opløsning af 345 mg Boc-[Phe(J)]-Gaba-OTmse (trin 14.3B) i 0,7 ml af en blanding af trifluoretbanol-vand (9:1) sættes ved stuetemperatur 1,5 ml 1,2 N saltsyre i det sam-25 me opløsningsmiddel. Efter 30 minutter sættes 10 ml tert. butanol til blandingen, og den inddampes i vakuum til ca. halvdelen. Penne fremgangsmåde gentages endnu tre gange, hvorefter det resterende tert.butanol fjernes ved lyofili-sering. Remanensen omkrystalliseres fra 2-propanol-ether.

30 PC: system 1570 Bf = 0,68.

58 151034 grin 14.4 SEOC-Asn-Phe-Phe- (D-Trp ) -Lys ( Bo c ) -Thr-Γ Hie ( J ) ] -Gaba-OTmse

Til en opløsning af 320 mg SEOC-Asn-Phe-Phe- (D-Trp)-Lys(Boc)-Thr-hydrazid (trin 14-.3) i 2 ml dimethylformamid sættes ved 5 -15 til -20°0 0,14- ml 5,3 ^ saltsyre i dioxan og 0,04- ml tert. butylnitrit, og blandingen omrøres i 15 minutter ved denne temperatur. Derefter tilsættes ved -25°0 en opløsning af 193 mg H- [ Plie ( J ) ] - Gab a- OTms e-bydr o chlori d (trin 14.30) i 0,5 ml dimetbylformamid og 0,18 ml E-me thylmorpholin, og 10 blandingen opvarmes langsomt til 0°C og henstilles i 16 timer ved denne temperatur. Produktet fældes ved tildrypning til vand og renses ved rivning med methanol og acetonitril.

DC: (chloroform-trifluorethanol-methanol (80:15:5)) Kf = 0,43.

15 Trin 14.5

H-Asn-Phe-Phe-(D-Trp)-Dys(Boc )-Thr-f Phe(J)]-Gaba-QH

Til en opløsning af 324 mg SEOC-Asn-Phe-Phe-(D-Trp)-Iys(Boc)-Thr-[ Phe (<J)]-Gaba-OTmse (trin 14.4) i 2 ml dimethylformamid sættes 12,3 ml 0,34 M tetraetbylammoniumfluorid i dimethyl-20 sulf oxid, og blandingen henstilles i 1 1/2 time ved 30°0. Produktet udfældes ved tildrypning til 40 ml iskoldt vand, som indeholder 0,41 ml 1 E saltsyre, og anvendes efter tørring i det næste trin.

DC: system 157 PI = 0,5.

25 Trin 14.6 t-Asn-Phe-Phe-( D-Trp )-Lys (Boc ) -Thr-Γ Phe ( J ) 1 -Gaba?

En opløsning af 258 mg H-Asn-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(Boc)-Thr-[ Phe (1) ] -Gaba-0H, 300 mg E-hydroxybenzotriazol og 410 mg DC0I i 200 ml dimetbylformamid henstilles i 20 timer ved 30 50°0. Oparbejdning og rensning sker analogt med eksempel ' 59 151034 8.2; K = 1,1.

DG: system 1574 Rf = 0,22.

Eksempel 15.

LAsn-Eb.e-Eb.e- ( D-Trp ) -Lys-Thr-Tyr ( But) -Gaba-1 5 Til en opløsning af 350 mg ^-Asn-Ehe-Ehe- ( D-Trp ) -Lys (SEOC ) -Thr-Tyr( Bat)-Gaba- i 1,2 ml dimetbylformamid sættes 0,7 ml 2,1 M tetrabutyl-ammoniumfluorid i dimethylsnlfoxid, og blandingen henstilles i 20 timer ved 30°0. Efter tilsætning af 20 ml 1 R 10 eddikesyre og 50 ml ethylacetat skilles den -vandige fase fra, den organiske fase ekstraheres endnu to gange med lidt vand, og de samlede vandige opløsninger inddampes i vakuum og lyofiliseres. Remanensen, som består af en blanding af produkt og tetrabutylammoniumfluorid, adskilles ved præpara-tiv DC på kiselgel i system 1570. Det fra kiselgelen isolerede endnu ikke helt rene produkt renses ved modstrømsfordeling i systemet chloroform-tetrachlormethan-methanol-0,05 M ammoniumacetat (9:1:7:3) over 460 trin. Det rene produkt (K = 0,9) isoleres som sædvanlig.

20 DC: (kiselgel, Merck) system 1570 Rf = 0,25.

Udgangsmaterialet opnås som følger:

Trin 15-1 Z- ( D-Trp )-Lys-OH-trifluoracetat 3,4 g Z-(D-Trp)-Lys(Boc)-OH (eksempel 1.34) kommes under 25 isafkøling i 34- ml af en blanding af trifluoreddikesyre-vand (9:1), som indeholder 0,5 ml 2-mercaptoethanol, og henstilles,så snart det er opløst,i endnu 40 minutter ved 23°C. Yed tildrypning til 400 ml ether og 150 ml hexan fæl- 60 151034 des råproduktet, og det opløses i 30 ml vand. Efter henstand ved stuetemperatur i 18 timer lyofiliseres opløsningen, og remanensen anvendes direkte i det næste trin.

DC: system 157 Hf = 0,35- 5 Urin 15»2

Z-(D-Trp)-Lys CSEOC)-OH

Til en opløsning af 3»0 g Z-(D-Trp)-Lys-OH-trifluoraeetat (trin 15.I) og 1,47 g (2-trimethylsilylethyl)-(H-hydroxy)-succinimidocarbonat (eksempel 12.7-4) i 5,2 ml dime thylform-10 amid sættes ved stuetemperatur 0,87 ml triethylamin, og "blandingen henstilles i 15 timer. Efter fortynding med ethylacetat indstilles blandingen til pH 1-2 med saltsyre, ethylacetat-opløsningen vaskes med vand, tørres over natriumsulfat og inddampes. Råproduktet renses ved modstrømsfordeling over 15 140 trin i det i eksempel 1.10 beskrevne system. K = 0,75· DC: system 157C Hf = 0,55·

Trin 15·5 Z-(D-Trp)-Dys(SEOC)-Thr-OMe

Til en opløsning af 3>16 g Z-(D-Trp)-Lys(SEOC)-OH (trin 15.2), 20 1,32 g H-Thr-OHe-hydrochlorid og 0,95 S H-hydroxybenzotri-azol i 25 ml acetonitril sættes ved -5°C 0,86 ml H-methyl-morpholin og 1,34 DCOI, og blandingen henstilles i 16 timer ved denne temperatur. Det efter frafiltrering af dicyclo-hexylurinstoffet opnåede filtrat fortyndes med ethylacetat, 25 vaskes med fortyndet saltsyre og en natriumhydrogencarbonat-opløsning og tørres over natriumsulfat. Den efter afdampning af opløsningsmidlet opnåede remanens kromatograferes med blandinger af ethylacetat og hexan (7:3) til (9:1) over en kiselgelsøjle. De tyndtlagskromatografisk rene fraktioner 30 inddampes til tørhed.

DC: system 157-4 Rf = 0,38.

61 151034

Trin 15« 4 Z-Asn-Phe -Phe - ( D-Trp ) -Lys (SEOC ) -Thr-QMe

En opløsning af 1,31 S Z-(D-Trp)-Lys(SEOC)-Thr-OMe i 30 ml methanol-vand (95:5) bydrogeneres over 130 mg palladium-kul 5 (1Cf/o) i 2 timer. Efter filtrering af katalysatoren inddampes filtratet og inddampes to gange med dimethylf ormamid i hø j-vakuum. Til den opnåede opløsning, som indeholder 3?5 ml dimethylformamid, sættes 1,01 g Z-Asn-Phe-Phe-OH (eksempel 1.5A) og 330 mg B-hydroxybenzotriazol, og blandingen afkøles 10 til -5°C, behandles med en opløsning af 440 -mg DCCI i 0,5 il dimetbylformamid, henstilles i 15 timer ved 0°C og oparbejdes analogt med eksempel 7-1· DC: system 157-4 Bf = 0,45.

Trin 15«5 15 Z-Asn-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(SEOC)-Thr-hydrazid

Til en opløsning af 2,0 g Z-Asn-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(SEOC)-Thr-OMe i 6 ml dimethylformamid sættes ved stuetemperatur 0,85 ml bydraziohydrat. Efter 2 1/4 time oparbejdes blandingen som i eksempel 14.3· Produktet kan på grund af dets fuld-20 stasndige tungt opløselighed ikke kontrolleres ved hjælp af DC.

Trin 15.5-Å.

lrt-Tyr(But)-OH-diethylammoniumsalt

Til en opløsning af 4,0 g H-Tyr(But)-OH i 50 ml chloroform 25 sarttes 6,7 ml vand, 6,7 ml diethylamin og under isafkøling i løbet af 30 minutter 7,05 g triphenylchlormethan. Efter yderligere 1 1/2 time skilles den vandige fase fra, og chloroformopløsningen udrystes to gange med en 4%'s vandig diethylaminopløsning og to gange med en mættet natrium-3° chloridopløsning, tørres over natriumsulfat og befries for opløsningsmiddel i vakuum. Remanensen krystalliseres fra 62 151034 ether-petroleumsether, smp. 14-1-145°C.

DC: (toluen-acetone (1:1)) Rf = 0,4-8.

Trin 15«5B Trt-Tyr(But)-ORSu 5 4-,7 g Trt-Tyr(But)-OH-diethylammoniumsalt (trin 15-5-A-) om-, rystes under isafkøling med 100 ml etliylacetat og 10 ml 0,5 H kaliumsulfat- og 10 ml 0,5 M kaliumhydrogensulfatop-løsning. Ethylacetatopløsningen vaskes efter fraskillelse af den nederste fase med vand og tørres med natriumsulfat, og 10 opløsningsmidlet afdestilleres skånsomt i vakuum. Remanensen opløses i 50 ml dimethylformamid*, der tilsættes 1,1 gl-hydrosqysuccinimid og ved 0°G 1,94 g DOCI, og 11 andingen henstilles i 15 timer ved +5°0. Efter frafiltrering af dicyclo-hexylurinstoffet fældes med vand et råprodukt fra filtratet, 15 og dette råprodukt kromatograferes på en kiselgelsøgle med chloroform. De fraktioner, der ifølge DC indeholder produktet, samles og omkrystalliseres fra methanol, smp. 163-164°C.

DC: (chloroform-ethylacetat (1:1)) Rf = 0,53·

20 Trin 15.5C

Trt-Tyr(But)-Gaba-OBzl

Til en suspension af 580 mg Trt-Tyr(But)-OESu (trin 15·5B) og 73Ο mg H-Gaha-OBzl-p-toluensulfonat (eksempel 1.7A) i 1 ml rent chloroform sættes 0,77 ml H-methylmorpholin, og 25 "blandingen henstilles i 4 dage ved stuetemperatur. Efter fortynding med ethylacetat udrystes opløsningen under isafkøling med 0,2 M kaliumhydrogensulfatopløsning og vand, den organiske fase tørres over natriumsulfat, og opløsningsmidlet afdestilleres. Råproduktet kromatograferes på kiselgel. Det 30 rene produkt elueres med en "blanding af ethylacetat og hexan (1:1) og isoleres som sædvanlig.

63 151034

DC: (toluen-acetone (8:2)) Rf = 0,5-Trin 15« 3D

H-Tyr (But)-Gaba-OBzl-hydrochlorid

Til en opløsning af 620 mg Trt-Tyr(But)-Gaba-OBzl (trin 5 15.50) i 20 ml af en blanding af trifluorethanol og vand (9:1) sættes ved hjælp af et automatisk titrerapparat ved pH 3,5 1,2 H saltsyre i det samme opløsningsmiddel, indtil der ikke længere finder et forbrug sted. Efter tilsætning af 20 ml tert."butanol inddampes "blandingen i vakuum. Dette gen-10 tages endnu to gange, og det resterende tert."butanol fjernes ved lyofilisering. Til fjernelse af triphenylcarhinol fordeles lyofilisatet mellem vand og ether, og den vandige opløsning lyofiliseres derefter.

DC: system 157B Bf = 0,5.

15 Trin 15.6 Z-Asn-Phe-Phe-(D-lrp)-Dys(SEOC)-Thr-Tyr(But)-Gaba-OBzl Til en opløsning af 975 mg Z-Asn-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(SEOC)-

Thr-hydrazid (trin 15.5) i 7 ml dimethylformamid sættes ved -15 til -20°C 0,47 ml 4,6 ΤΓ saltsyre i dioxan og 0,11 ml 20 tert.hutylnitrit. Efter 15 minutter sættes til denne reaktionsblanding ved -25°C en opløsning af 385 mg H-Tyr(But)-Gaba-OBzl-hydrochlorid (trin 15-5D) i 0,5 ml dimethylform- . amid og 0,44 ml H-methylmorpho 1 in, og blandingen henstilles i 15 timer ved 0°C. Produktet fældes med vand og renses ved 25 rivning med acetonitril og methanol. På grund af produktets uopløselighed kan en DC-kontrol ikke finde sted.

Trin 15.7

Ξ-Asn-Phe-Phe- ( D-Trp ) -Lys (SEOC) -Thr-Tyr (But) -Gaba-OH

En opløsning af 1,1 g Z-Asn-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(SEOC)-Thr-30 Tyr(But)-Gaba-0Bzl i 30 ml dimethylformamid hydrogeneres un-

Claims

151034 der tilstedeværelse af 100 mg palladium-kul (10%) i 3 timer. Katalysatoren suges fra, filtratet inddampes, og produktet fældes med vand. Det renses ved opløsning i 5 ml (Umetnylform-amid og fældning med 15 ml methanol.

1. Analogifremgangsmåde til fremstilling af somatostatin-analoge cyclopeptider med den almene formel ^-R - Phe - Phe - trp - Lys - Thr - PheTw) - X - (I) 5 6 7 8 9 10 11 12 13 20 hvori R betyder Asn eller des-R, trp betyder D-Trp eller L-Trp, som i benzenringen kan være substitueret med et halogenatom eller en nitrogruppe, W betyder hydrogen eller i benzenringen i L-phenylalanylgruppen som substituent tilstedeværende eventuelt med C^__7~alkyl forethret hydroxyl eller halogen, X bety-25 der en io-amino-C-^-alkan- (mono eller di) -carboxylsyrerest eller des-X, og Y betyder en oj-amino-C^-y-alkan- (mono eller di)-carboxylsyrerest eller des-Y, med den undtagelse, at i en forbindelse, hvori R betyder des-R, trp betyder D-Trp eller 151034 L-Trp, W betyder hydrogen, og et af symbolerne X og Y betyder des-X eller des-Y og det andet en ω-aminoalkancarboxylsyrerest, er denne forskellig fra en 7-aminoheptansyrerest, eller fysiologisk tålelige syreadditionssalte eller komplekser deraf, 5 kendetegnet ved, at man fra en forbindelse med formlen l-R-Phe-Phe-trp-Lys (A) -Thr (B) -Phe(W) -X'-Y'J (II) hvori R, W og trp har de ovennævnte betydninger, X' har den ovenfor for X anførte betydning eller betyder en i den exocyc-10 liske carboxylgruppe ved forestring beskyttet ω-amino-C^ - alkandicarboxylsyrerest, Y' har den ovenfor for Y anførte betydning eller betyder en i den exocycliske carboxylgruppe ved forestring beskyttet m-amino-C^_^-alkandicarboxylsyrerest, A betyder en ε-aminobeskyttelsesgruppe eller hydrogen, og B bety-15 en hydroxylbeskyttelsesgruppe eller hydrogen, idet kun et af symbolerne A og B kan betyde hydrogen, fraspalter beskyttelsesgruppen eller -grupperne og, om ønsket, fra et opnået syreadditionssalt frigør den tilsvarende base og/eller omdanner en opnået base til et syreadditionssalt eller et kompleks deraf.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man fremstiller en forbindelse med formlen I, eller et syreadditionssalt eller et kompleks deraf, hvori R betyder Asn eller des-R, trp betyder D-Trp eller L-Trp, W betyder hydrogen, X betyder en (jj-amino-C^^-alkanmonocarboxylsyrerest eller 25 des-X, og Y betyder en æ-amino-C^_y-alkanmonocarboxylsyrerest eller des-Y, med den undtagelse, at i en forbindelse, hvori R betyder des-R, og en af grupperne X og Y betyder des-X eller des-Y, er- ω-aminoalkanmonocarboxylsyren forskellig fra 7-amino-heptansyre.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at man underkaster en udgangsforbindelse med formlen II, hvori mindst ét af symbolerne A og B betyder en acidolytisk fraspaltelig gruppe, acidolyse, især behandler en udgangsforbindelse med formlen II, hvori A betyder en tert-butoxycarbo- 151034 nylgruppe og B en tert-butylgruppe, med trifluoreddikesyre.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man i en forbindelse med formlen II, hvori A betyder en 2-(trihydrocarbylsilyl)-ethoxycarbonylgruppe, især 2-(tri- 5 methylsilyl)-ethoxycarbonyl, B betyder hydrogen, og R, W, X', Y1 og trp har de i krav 1 angivne betydninger, fraspalter aminobeskyttelsesgruppen ved hjælp af fluoridioner.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1-4, kendetegnet ved, at man fremstiller en forbindelse ifølge, krav 2, hvori 10 ω-aminoalkanmonocarboxylsyreresten er karakteriseret ved formlen -NH-(CH0) -C0-Δ n hvori n betyder et helt tal fra 1 til 7, især et helt tal på 2-4, eller en forbindelse ifølge krav 1, hvor uj-amino-C^^-15 alkandicarboxylsyreresten er karakteriseret ved formlen -NH-CH-(CH9) _ί -CO-i u n x COOH hvori n betyder et helt tal på 1-7.

5 DO: system 157 Hf = 0,55. Trin 15.8 kåsn-Phe-Phe- ( D-Trp ) -Lys ( SEOC ) -Thr-Tyr ( But)-Gaba—^ En. opløsning af 700 mg H-Asn-Phe-Ehe- (D-Trp)-Lys (SEOC)-Thr-Tyr (But) -Gaba-ΟΞ (trin 15-7) j E-hydroxybenzotriazol og 10 1,11 g DCOI i 54-0 ml dimethylformamid cycliseres i løhet af 21 timer ved 50°0. Oparbejdningen sker analogt med eksempel 7.3· Produktet renses ved søjlekromatografi på kiselgel, det rene stof elueres med en blanding af chloroform, trifluor-ethanol og methanol (87:5:8).

15 DC: system 157B Ef = 0,38.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at man fremstiller en forbindelse med formlen

20 LAsn-phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-NH- (CH2) 3-CO-l eller et fysiologisk tåleligt syreadditionssalt eller kompleks deraf.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at man fremstiller en forbindelse med formlen 25 ^-Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe- [NH-(CH2) 3-CO] 2J eller et fysiologisk tåleligt syreadditionssalt eller kompleks deraf.