SU1435157A3

SU1435157A3 - Способ получени пептидов

Info

Publication number: SU1435157A3
Application number: SU843791983A
Authority: SU
Inventors: Эдвард Фредерик Ривье Жан; Уолкер Вейл Вили
Original assignee: Дзе Салк Институт Фор Биолоджикал Стадиз (Фирма)
Priority date: 1983-09-13
Filing date: 1984-09-12
Publication date: 1988-10-30
Also published as: IE842324L; NO166944B; NZ209515A; NO166944C; FI88402C; US4518586A; FI843579L; DK433684D0; JPH0689035B2; IN160247B; EP0146210A1; DK165749B; JPS60100596A; PH22310A; DK433684A; IL72799A; FI843579A0; PT79189B; HUT35696A; IE57774B1

Abstract

Изобретение касаетс пептидов, в 1ас1 ности соединений общей ф-лы I R,-Ala-Asp Ala-Ile Phe-Thr-Rg-Ser- Tyr-Arg-R -R ,-Leu-Gly-Gln-R .-R |g - Ala-Arg-Lys-Leu-R2j-R24-R2S-Tle-Nle- R g-Arg-NHj, где R - N- Me-Tyr или His; Rg- Ser или Asn; Rf - Arg или Lys; R fi - He или Valj R,- - Leu или D-Leu-; R yg - Tyr или Ser; - Leu или D-Leu; R - His или Glu; R 25- - Glu или D-Glu или Asp; - A.sn или Ser, которые обладают способностью прокотировать вьщеление гормона роста, что может быть использовано в сельском хоз йстве; Цель изобретени - создание новых более активных и менее токсичных пептидов. Их синтез ведут из з ащищенного группой вое или ТОС аргинина, который св зывают с метилбензгидриламиновой смолой (МБГАС) с последующим отщеплением группы БОС. Затем провод т последовательное наращивание пептидной цепи в указанной в ф-ле I последовательности с использованием 1-2 ммоль защищенной аминокислоты на 1 г смолы МБГАС. Процесс ведут в среде диметил- формамида и/или метиленхлорида1 Получают пептидную смолу общей ф-лы II. ,(Х)или Xi-Ala-Asp(X -Ala-Ile- Phe-Thr(X4)-RJ(X4Или Xj)-Ser(X - Tyr (X,2)-Arg(X)-R ,(Х или X7)-Ri3-Leu-Gly- Gln(Xj)-R п-R (8 (Xj)-Ala-Arg(Xg)- Lys(Xp-Leu-R23-Ri4(X6 или X)- R(Xj)-Ile-Nle-R28 (X или Xj)-Arg- NH-Z, где R, -Rg, R (г-т;, , R fT-re указаны; или БОС; или 2,6-дих.порбензоил; X или OBZ1; или бензил; или ксантил; или тозил; Х-,Н или 2-хлорбензил- оксикарбонил; или МВНА. В этой смоле отщепл ют защитные группы и полимерную подложку обработкой или HF при (-20)-0 С в присутствии анизола и/или метиленсульфида,- Целевой продукт выдел ют с помощью жидкостной хроматографии высокого давлени . Новые пептиды в сравнении с ичвестным hpGRF(1-40)OH обеспечивают лучшую активность при более длитель-. ном времени действи (до 9,3 ч против 2,2 ч)и невысокую токсичность. 1 табл. g О) С 4k СП Ч см

Description

И:зобретение относитс к способу получени пептидов - цовых биологически активных соединениГ), которые могут найти применение в медицине.

Цель изобретени - синтез новых производных пептидов - малотоксичных, обладающих более высоког способностью промотировать выделение гормона роста.

Пример 1. Синтез пептида tD-Glu ,Nle- -rhGRF(1-29)-NH2, H-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser- Ser-Tyr Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr- Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-DGlu-Ile-Nla- Asn-Arg-NH провод т моностадийно на пептидном синтезаторе Бекман 990 с использованием 2 г смолы МВНА, имеющей диапазон замещени 0,1 - 0,5 ммоль/г- смолы. Присоединение ВОС- Atg(TOS) к смоле осуществл ют использу KF в смеси 50% в метиленхло- рнде при 60 С в течение 24 ч при пе- эемешивании, при этом происходит замещение 0,35 ммоль Arg на 1 г смолы,-После деблокировани и нейтрализации на смоле стади за стадией стро т пептидную цепь. Все используемые растворители тщательно дегазируют барботированием И1гертного газа, например гели или азота, чтобы гаран- гировать отсутствие кислорода, который мог бы привести к нежелательному окислению серы Met-остатка.

Деблокирование предпочтительно провод т в соответствии с графиком эпераций А:

Реактив

1

2

60% TFA/2% этандитиол 60%-. TFA/2% этандитиол

3.1РА/1% этандитиол

4.ЕЬзН(10%) в

5.МеОН

6.Et3N(10%) в

Врем смешивани , мин

10

15

0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

ЫеОП (дважды) 8. (дважды) Присоединени предпочтительно гфо- од т в соотве- ствии с графиком опе- аций В:

Реактив Врем смешивани , мин

9. DCG1

10, ВОС-амино- кислота

50-90

0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

11.МсОН (дважды)0,5

12. (дважды) 0,5

13. (ЗМ) в

,15,0

14.СГ-ЦСЦ0,5

15.МеОИ0,5

16. (дважды) 0,5

В кратком изложении, 1-2 ммол). ВОС-защи ценной аминокислоты в мет ленхлориде используют на 1 г смолы, добавл ют один эквивалент 1,0 М DGG1 в метиленхлориде в течение 2 ч дл большинства аминокислот, за исключением BOG-Arg(TOS). BrL-зфир использован в качестве защищающей гид- роксил боковой цепи группы дл Ser и Thr. Амидогруппы Asn и Gin защищены с помощью Хап, когда используетс DGC-присоединение, что и предпочтено. Р-нитрофенильиьй эфир (ONP) также может использоватьс цл активации кар- боксиль гого конца Asn или Gin, например BOC-Asn-(OHP) может быть при- соеди 1ен в течение ночи с использованием одного эквивалента HOBt в 50% смеси ДМФА и метиленхлорида, в этом случае DCC не присоедин етс , 2-Хлор- бензилоксикарбонил-(2С1-2) использован в качестве защитной группы дл боковой цени LgS. TOS использован дл гуанидиногруппЕ. Arg и ими- дазольного азота liis, а карбоксильна группа боковой цепи Gin или Агр защищена с .помощью OBZ1. Фенольна гидроксильна группа TYr защищена с помощью 2,6-дихлорбензила (DCB). В конце синтеза получают полимерную смолу следующего состава: BOG- N t-leHis (X)-Ala-Asp (Х,)-А1а-11 e-Phe- Thr(X) -Ser(X)-Ser(x 4)-Tyr(X2)- Arg(X)-Arg(Xp-Ile-Leu-Gly -Gln(X,r) Leu-Tyr,(X) -Ala-Arg (X g) -Lys (X 7) -Leu- Leu-Hi s (X)-Glu(Xj)-II e-Met-A3h(X 5-) Arg(X)-X3,

где X-TOS,X2-DGB,X3-OBZ1,, Xg-Xan, ,-X-,-2Gl-Z и X представл ет собой - NH-переметилбенз- гидриламин, Хап может быть частично или полностью удален с помов;ью TFA- обработ ки, используемой дл деблокировани с -ам1-1нозащитной группы.

Дл расщеплени и удалени защиты 5,4 г защищенной пептидосмолы обрабатывают с помощью 1,5 мл анизола, 0,5 мл метилэтилсульфида и 15 мл фтористого водорода (HF) на 1 г пептиДо- смолы при -20 С в течение получаса и при О С в течение получаса. После

3

удалени фтористого кодорода в вакууме остающийс смолопептид промывают чередованием сухого диэтилового эфира и .хлороформа, затем пептид экстрагируют. 2N дегазированной уксусной кислотой получают 2,84 г (путем фильтровани ).

Расщепленный и лишенный защиты пептид после этого раствор ют в 0-5% уксусной кислоты и. подвергают очистке , котора может включать ультрагель-фильтрацию на Сефадекс-50, получают 204,4 мг.

Затем пептид очищают препаратив- ный ЖХВД, Кассеты, устанавливаемые- на препаративном жидкостном хроматографе LC-500 производства фирмы Уотерс ассошиэйтс набивают двуокисью кремни типа С/ -Silica 15- 20 мкм (фирма Вайдэк) (ЗООА). Градиент CHjCN в ТЕАР создают с помощью градиентного аппарата Элдекс низкого давлени , хроматографические фракции тщательно контролируют с по- мощью ЖХВД и собирают лишь те, дл которых характерна существенна чистота . Высаливание очищенных фракций, независимо проверенных на чистоту, осуществл ют с использованием кассет 15-20-мкм С-18 и 15-20 мкм фенил и градиента в 0,1% TFA. Центральна фракци затем подвергалась лио- фильной сушке, получают 89,2 мг целевого пептида, чистота которого превышает 98%.

Пример 2. Синтез пептида DLeu ,Nle hpGRF(1-29)MH2, Н, Tyr-Ala-Asp-Ala-I.le-Phe-Thr-Asn-Ser- Tyr Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser- Ala-Arg-Lys-Leu-DLeu-His-Gln-Tle-Hle Ser-Arg-NH осуществл ют методом последовательных стадий с использованием пептидного синтезатора Бекман 990 на смоле МВНА по примеру 1.

Суд по данным TLC и .HPLC, пептид получен существенно чистым, выход 165 мгГо -53,3(, уксусна кислота).

Пример 3. В этих же услови х получены пептиды: DLeu ,Nle rGRf(1-29) H-His-Ala-Asp-Ala-Ile- Phe-Thr-Ser- Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu- Gly-Gln-DLeu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu- DLeu-His-Gln-Jle-Nle-Asn-ArgNH, выход 226,7 МГ, -51,2(, уксусна кислота). TLC и HPLC подтвердили чистоту пептида.

ю 15 20 25 зо

4Б

50

55

1)G 1 n , N I г Ь pCR F ( I -29) Kfj ,: НТуг-А1л-Лчр-Л1 -Тle-Phc-Thr-Asn- Ser-Tyr-Ari -l.-ys-Vfll-Leu-Gly-Gln-Leu- Ser-Ab4-Arg-Lys-V.eu-Leu-Gl ii-DOln-I l.o- N1 o-Ser-Ari JJH „ ныход 204,4 мг, ofjp -50,0°(C 1, уксусна кислота).

N«MeTyг DGln JrhGrF(1-29)NHг: чХмеТуг-А a-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser- Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu- Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-DGln- Ile-Met-Asn-ArgNH, выход 52 мг, -51, У (, уксусьга кислота). Данные TLC и HPLC подтвердили существенную чистоту пепт1зда.

Дл - определени эффективности полученных синтетических пептидов в промотировании выделени гормона роста были осуществлены испытани in vitro с использованием синтетического hpGRF(1-40)-ОН в качестве стандарта. Испытывались пептиды в эквимол рных концентраци х. Примен емые культуры включали клетки гипофиза крысы, удаленного за 3-5 дней до эксперимента. Дл сравнительных испытаний использовали культуры, которые считаютс оптимальными дл секреции гормона роста.

Инкубирование с испытуемым веществом проводили в течение 3-4 ч, а/1ИК- воты культуральной среды отбирали и переносили дл измерени их содержимого в иммуноактивный GH(ir GH) и проводили испытани хорошо-охаракте- ризованньм радиоиммунным способом.

Результаты этого сравнени с hpGRF(1-40)OH дл эквимол рных концентраций представлены в таблице.

Испытани in vitro этих синтетических пептидов показывают, что каждый из них про вл ет полную внутреннюю биологическую активность hpGRF (1-40)-ОН.

Максимально эффективна концентраци дл tDLeu 3 , hpGRF(1- 29)NH2 1 нмоль.

Б дополнение к испытани м iti vitro цл секреции гормона роста провели эксперименты in vivo введением синтетических пептидов через вживленный катетер в свободно двигающегос нор- мально амца крысы после предварительной обработки их FLA-63, ингибитора допамин гидроксилазы, которьй подавл ет спонтанную секрецию GH без воздействи на реакцию к экзогенному GRF. Через тот же катетер сразу же, через 5 и 20 мин после введени были

514

вз ты образцы крови. Уровни GH в крови , измеренные радиоиммуиологически, показьгеают, что синтетические пептиды , полигенные в услови х способа, вл ютс мощными стимул торами секреции гипофизной GH и, кроме .того, про вл ют более длительное действие. Другие известные тесты GRF in vivo, которые вл ютс эффективными дл обнаружени секреции GH, использовали дл подтверждени этих результатов . Рассматривали дозы от 1бО кг до 50 мкг этих пептидов на кг живого веса, которые вл ютс эффективными в воздействии на GH секрецию.

Проведенными испытани ми установлено , что соединение по изобретению относитс к категории малотоксичных.

Таким образом, соединени , полу- ченные в УСЛОВИЯХ данного способа, обладают более высокой активностью в отношении промотировани секреции гормона роста, чем известный промотор hpGRF( 1-40)ОН, кроме того, они про- вл ют более длительное действие.

Claims

1.hpGRF(1-40)

2.t N MeTvr Nle JrGP.Fd29 ),

3. D-Leu-f ,Nle hpGRF(129 )HH2

4.tD-Leu ,Nle hpGRF(129 )NHj

5. D-Glu2,Nle 1hpGRF(129 )

2,2

9.3

7,2.

6,2

5,8