JPH0689035B2 - Grf類似体類 - Google Patents
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-
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明はヒトのその他の哺乳動物の下垂体の機能に影響
を与えるペプチドに関する。特に本発明は下垂体によ
る、成長ホルモンの放出を促進するペプチドを目的とす
る。
を与えるペプチドに関する。特に本発明は下垂体によ
る、成長ホルモンの放出を促進するペプチドを目的とす
る。
生理学者たちは視床下部が、各下垂体ホルモンの分泌を
刺激または抑制する視床下部産生特殊物質により腺下垂
体の分泌作用をコントロールすると長年にわたり認識し
てきた。1982年に、ヒト膵(腫瘍)放出因子(hpGRF)
がヒト膵臓腫瘍の抽出物から単離され、精製、特性確
認、合成および試験され、下垂体によるGHの放出を促進
することが発見された。対応するラツト視床下部GH放出
因子(rGRF)および対応するブタ視床下部GH放出因子
(pGRF)についても特性確認と合成を行なつた。
刺激または抑制する視床下部産生特殊物質により腺下垂
体の分泌作用をコントロールすると長年にわたり認識し
てきた。1982年に、ヒト膵(腫瘍)放出因子(hpGRF)
がヒト膵臓腫瘍の抽出物から単離され、精製、特性確
認、合成および試験され、下垂体によるGHの放出を促進
することが発見された。対応するラツト視床下部GH放出
因子(rGRF)および対応するブタ視床下部GH放出因子
(pGRF)についても特性確認と合成を行なつた。
合成ポリペプチドが合成されそして試験された。この合
成ポリペプチドは培養下垂体細胞からGHを放出し、そし
て、生体内における酵素分解に対して抵抗性である。こ
れらのペプチドは次の必須要件のうちの少なくともいず
れか1つの要件を満たす。(a)第1位における残基は
NαMe置換基またはCαMe置換基のいずれかを有する;
(b)D−Leuは第17−および/または第23位に存在す
る;および/または(c)D−GluまたはD−Aspは第25
位に存在する。これらのペプチドは(a)〜(c)の要
件のうちの1つ以上の要件を満たしていてもよく、ある
いは、全ての要件を満たすこともできる。第1位におけ
る残基はTyr,D−Tyr,Met,Phe,D−Phe,pCl−Phe,Leu,His
およびD−Hisであることもできる。(これらの残基は
α−炭素上またはα−アミノ基中のいずれかにメチル置
換基を有することもできる。)これらのペプチドは場合
により、第2位にD−Alaおよび/または第3位にD−A
spおよび/または第8位にD−ArgまたはD−Serおよび
/または第10位にD−Tyrおよび/または第15位にD−A
laを有することもできる。これらのペプチドはまた、第
27位のMetについて、D−Met,Nle,またはNvaのような置
換基を有することが好ましい。
成ポリペプチドは培養下垂体細胞からGHを放出し、そし
て、生体内における酵素分解に対して抵抗性である。こ
れらのペプチドは次の必須要件のうちの少なくともいず
れか1つの要件を満たす。(a)第1位における残基は
NαMe置換基またはCαMe置換基のいずれかを有する;
(b)D−Leuは第17−および/または第23位に存在す
る;および/または(c)D−GluまたはD−Aspは第25
位に存在する。これらのペプチドは(a)〜(c)の要
件のうちの1つ以上の要件を満たしていてもよく、ある
いは、全ての要件を満たすこともできる。第1位におけ
る残基はTyr,D−Tyr,Met,Phe,D−Phe,pCl−Phe,Leu,His
およびD−Hisであることもできる。(これらの残基は
α−炭素上またはα−アミノ基中のいずれかにメチル置
換基を有することもできる。)これらのペプチドは場合
により、第2位にD−Alaおよび/または第3位にD−A
spおよび/または第8位にD−ArgまたはD−Serおよび
/または第10位にD−Tyrおよび/または第15位にD−A
laを有することもできる。これらのペプチドはまた、第
27位のMetについて、D−Met,Nle,またはNvaのような置
換基を有することが好ましい。
本発明による医薬組成物は医療薬用または獣医薬用の液
状または固体状の担体中に分散された、長さが28〜44残
基の類似体またはその非毒性塩を含有する。このような
医薬組成物は治療目的および診断目的に投与するための
ヒトおよび獣類用の臨床薬に使用できる。更に、これら
の医薬組成物は温血動物(家禽類を含む)の生長および
冷血動物(例えば、魚類、ウナギ等)の養殖を促進する
のに使用できる。
状または固体状の担体中に分散された、長さが28〜44残
基の類似体またはその非毒性塩を含有する。このような
医薬組成物は治療目的および診断目的に投与するための
ヒトおよび獣類用の臨床薬に使用できる。更に、これら
の医薬組成物は温血動物(家禽類を含む)の生長および
冷血動物(例えば、魚類、ウナギ等)の養殖を促進する
のに使用できる。
ペプチドを規定するために用いられる命名法はシユレー
ダーおよびリユプケ著“ペプチド類”(アカデミツク・
プレス(1965)により明確にされたものである。ここで
は慣用の表現法に従つてN−末端を左側に表わし、C−
末端を右側に示す。“天然アミノ酸”とは、タンパク質
中に見出される共通の天然アミノ酸であり、Gly,Ala,Va
l,Leu.Ile,Ser,Thr,Lys,Arg,Asp,Asn,Glu,Gln,Cys,Met,
Phe,Tyr,Pro,TrpおよびHisのうちの1つを意味する。
“Nle"はノルロイシンのことであり、また、Nvaはノル
バリンのことである。アミノ酸残基が異性体の形をもつ
場合、特にことわらない限り、その異性体は表示されて
いるアミノ酸のL−形である。
ダーおよびリユプケ著“ペプチド類”(アカデミツク・
プレス(1965)により明確にされたものである。ここで
は慣用の表現法に従つてN−末端を左側に表わし、C−
末端を右側に示す。“天然アミノ酸”とは、タンパク質
中に見出される共通の天然アミノ酸であり、Gly,Ala,Va
l,Leu.Ile,Ser,Thr,Lys,Arg,Asp,Asn,Glu,Gln,Cys,Met,
Phe,Tyr,Pro,TrpおよびHisのうちの1つを意味する。
“Nle"はノルロイシンのことであり、また、Nvaはノル
バリンのことである。アミノ酸残基が異性体の形をもつ
場合、特にことわらない限り、その異性体は表示されて
いるアミノ酸のL−形である。
本発明により、下記の配列を有する合成ペプチドおよび
その非毒性塩が提供される。
その非毒性塩が提供される。
R1−Ala−Asp−Ala−Ile−Phe−Thr−R8−Ser−Tyr−Ar
g−R12−R13−Leu−Gly−Gln−R17−R18−Ala−Arg−Ly
s−Leu−R23−R24−R25−Ile−R27−R28−Arg−Gln−Gl
n−Gly−Y 〔式中、R1はTyr,NαMePhe,NαMeTyr,CαMe(4Cl)Phe
またはHis;R8はSerまたはAsn;R12はArgまたはLys;R13は
IleまたはVal;R17はLeuまたはD−Leu;R18はTyrまたはS
er;R23はLeuまたはD−Leu;R24はHisまたはGln;R25はGl
u,AspまたはD−Glu;R27はMetまたはNle;R28はAsnまた
はSer;YはNH2またはNHCH2CH3である。ただし(a)R1は
CαMeまたはNαMe置換基を有するか、または(b)R
17および/またはR23はD−Leuであるか、もしくは
(c)R25はD−Gluである。また、C末端から1〜4個
の残基は削除されていてもよい。〕 C−末端におけるアミノ酸残基のカルボキシ部分は−CO
OR,−CRO,−CONHNHR,−CON(R)(R′)または−CH2O
R基であることができる。ここで、RおよびR′は低級
アルキル、フルオロ低級アルキルまたは水素である。メ
チル、エチルおよびプロピルが好ましい低級アルキル基
である。前記の基は全て等価であると考えられる。通
常、C−末端における残基は遊離酸または単純なアミド
の形をしている。
g−R12−R13−Leu−Gly−Gln−R17−R18−Ala−Arg−Ly
s−Leu−R23−R24−R25−Ile−R27−R28−Arg−Gln−Gl
n−Gly−Y 〔式中、R1はTyr,NαMePhe,NαMeTyr,CαMe(4Cl)Phe
またはHis;R8はSerまたはAsn;R12はArgまたはLys;R13は
IleまたはVal;R17はLeuまたはD−Leu;R18はTyrまたはS
er;R23はLeuまたはD−Leu;R24はHisまたはGln;R25はGl
u,AspまたはD−Glu;R27はMetまたはNle;R28はAsnまた
はSer;YはNH2またはNHCH2CH3である。ただし(a)R1は
CαMeまたはNαMe置換基を有するか、または(b)R
17および/またはR23はD−Leuであるか、もしくは
(c)R25はD−Gluである。また、C末端から1〜4個
の残基は削除されていてもよい。〕 C−末端におけるアミノ酸残基のカルボキシ部分は−CO
OR,−CRO,−CONHNHR,−CON(R)(R′)または−CH2O
R基であることができる。ここで、RおよびR′は低級
アルキル、フルオロ低級アルキルまたは水素である。メ
チル、エチルおよびプロピルが好ましい低級アルキル基
である。前記の基は全て等価であると考えられる。通
常、C−末端における残基は遊離酸または単純なアミド
の形をしている。
前記のように、N−末端から約28の残基にまで伸びる断
片は生物学的効力を有する。このような生物学的に有効
な断片は本発明の範囲内に含まれるものと考えられる。
ペプチド断片が28残基にまでしか伸びていない場合、Y
はNH2または置換アミドでなければならない。断片が29
残基〜33残基のうちのいずれかにまで伸びている場合、
Yはアミドまたは置換アミドであることが好ましい。
片は生物学的効力を有する。このような生物学的に有効
な断片は本発明の範囲内に含まれるものと考えられる。
ペプチド断片が28残基にまでしか伸びていない場合、Y
はNH2または置換アミドでなければならない。断片が29
残基〜33残基のうちのいずれかにまで伸びている場合、
Yはアミドまたは置換アミドであることが好ましい。
これらのペプチドは適切な方法により、たとえば全固相
法により、部分的固相法により、断片縮合法により、古
典的な溶液カツプリング法により合成される。または近
年開発された組み換えDNA法により天然アミノ酸残基の
みを含有する類似体の一部を製造することもできる。例
えば、全固相合成法は文献“固相ペプチド合成”(スチ
ユワートおよびヤング著、フリーマン社、サンフランシ
スコ、1969年)に開示されており、米国特許第4,105,60
3号(1978年8月8日ベイルらに付与)明細書の記載に
より例証されている。古典的な溶液合成法は論文“Meth
oden der Organischen Chemie(Houben−Weyl):Syn−t
hese von Peptiden",E.Wunsch(編者)(1974)Georg T
hieme Verlag(西独、シユトツトガルト)中に詳細に説
明されている。断片縮合による合成法は米国特許第3,97
2,859号明細書(1976年8月3日)に例示されている。
他に用いられる合成法は米国特許第3,842,067号(1974
年10月15日)および同第3,862,925号(1975年1月28
日)各明細書により例示される。
法により、部分的固相法により、断片縮合法により、古
典的な溶液カツプリング法により合成される。または近
年開発された組み換えDNA法により天然アミノ酸残基の
みを含有する類似体の一部を製造することもできる。例
えば、全固相合成法は文献“固相ペプチド合成”(スチ
ユワートおよびヤング著、フリーマン社、サンフランシ
スコ、1969年)に開示されており、米国特許第4,105,60
3号(1978年8月8日ベイルらに付与)明細書の記載に
より例証されている。古典的な溶液合成法は論文“Meth
oden der Organischen Chemie(Houben−Weyl):Syn−t
hese von Peptiden",E.Wunsch(編者)(1974)Georg T
hieme Verlag(西独、シユトツトガルト)中に詳細に説
明されている。断片縮合による合成法は米国特許第3,97
2,859号明細書(1976年8月3日)に例示されている。
他に用いられる合成法は米国特許第3,842,067号(1974
年10月15日)および同第3,862,925号(1975年1月28
日)各明細書により例示される。
前記のような合成に一般的なことは、各種アミノ酸部分
の不安定な側鎖基をこの部位で化学反応が起こるのを阻
止する適切な保護基によつて、この基が最終的に除去さ
れるまで保護することである。同様に通常一般的である
のは、アミノ酸または断片上のα−アミノ基を保護し、
その間にこれがカルボキシル基において反応し、次いで
α−アミノ保護基を選択的に除去してこの部位で次ぎの
反応が起こりうる状態にすることである。従つて合成の
一工程として、ペプチド鎖中に希望する順序で位置する
各アミノ酸残基を含みかつ側鎖保護基が適切な残基に結
合した中間化合物を合成することが一般に行われる。
の不安定な側鎖基をこの部位で化学反応が起こるのを阻
止する適切な保護基によつて、この基が最終的に除去さ
れるまで保護することである。同様に通常一般的である
のは、アミノ酸または断片上のα−アミノ基を保護し、
その間にこれがカルボキシル基において反応し、次いで
α−アミノ保護基を選択的に除去してこの部位で次ぎの
反応が起こりうる状態にすることである。従つて合成の
一工程として、ペプチド鎖中に希望する順序で位置する
各アミノ酸残基を含みかつ側鎖保護基が適切な残基に結
合した中間化合物を合成することが一般に行われる。
同様に本発明の範囲内にあると考えられるものは次式の
中間体である。
中間体である。
X1−R1(XまたはX2)−R2−R3(X3)−Ala−Ile−Phe
−Thr(X4)−R8(X4またはX5)−Ser(X4)−R
10(X2)−Arg(X6)−R12(X6またはX7)−R13−Leu−
R15−Gln(X5)−R17−R18(X2)−Ala−Arg(X6)−Ly
s(X7)−Leu−R23−R24(XまたはX5)−R25(X3)−I
le−R27−R28(X4またはX5)−Arg(X6)−Gln(X5)−
Gln(X5)−Gly−Glu(X3)−R34(X4またはX6)−Asn
(X5)−Gln(X5)−Glu(X3)−R38(X5またはX6)−R
39(X6)−R40(X4)−Arg(X6)−R42−R43(X5または
X6)−R44(X8)−X9 上記式中X1は水素原子またはα−アミノ基保護基であ
る。X1により意図されるα−アミノ基保護基はポリペプ
チドの段階的合成の分野で有用であることが知られてい
るものである。X1として使用できるα−アミノ基保護基
には下記のものがある。
−Thr(X4)−R8(X4またはX5)−Ser(X4)−R
10(X2)−Arg(X6)−R12(X6またはX7)−R13−Leu−
R15−Gln(X5)−R17−R18(X2)−Ala−Arg(X6)−Ly
s(X7)−Leu−R23−R24(XまたはX5)−R25(X3)−I
le−R27−R28(X4またはX5)−Arg(X6)−Gln(X5)−
Gln(X5)−Gly−Glu(X3)−R34(X4またはX6)−Asn
(X5)−Gln(X5)−Glu(X3)−R38(X5またはX6)−R
39(X6)−R40(X4)−Arg(X6)−R42−R43(X5または
X6)−R44(X8)−X9 上記式中X1は水素原子またはα−アミノ基保護基であ
る。X1により意図されるα−アミノ基保護基はポリペプ
チドの段階的合成の分野で有用であることが知られてい
るものである。X1として使用できるα−アミノ基保護基
には下記のものがある。
(1)芳香族ウレタン型保護基、たとえばフルオレニル
メチルオキシカルボニル(FMOC)、ベンジルオキシカル
ボニル基(Z)、および置換されたZ、たとえばp−ク
ロルベンジルオキシカルボニル基、p−ニトロベンジル
オキシカルボニル基、p−ブロムベンジルオキシカルボ
ニル基、p−メトキシベンジルオキシカルボニル基、
(2)脂肪族ウレタン保護基、たとえばt−ブチルオキ
シカルボニル基(BOC)、ジイソプロピルメチルオキシ
カルボニル基、イソプロピルオキシカルボニル基、エト
キシカルボニル基、アリルオキシカルボニル基、(3)
シクロアルキルウレタン型保護基、たとえばシクロペン
チルオキシカルボニル基、アダマンチルオキシカルボニ
ル基およびシクロヘキシルオキシカルボニル基などであ
る。第1位にNαMe−置換残基が存在している場合であ
つても、好ましいα−アミノ基保護基はBOCである。
メチルオキシカルボニル(FMOC)、ベンジルオキシカル
ボニル基(Z)、および置換されたZ、たとえばp−ク
ロルベンジルオキシカルボニル基、p−ニトロベンジル
オキシカルボニル基、p−ブロムベンジルオキシカルボ
ニル基、p−メトキシベンジルオキシカルボニル基、
(2)脂肪族ウレタン保護基、たとえばt−ブチルオキ
シカルボニル基(BOC)、ジイソプロピルメチルオキシ
カルボニル基、イソプロピルオキシカルボニル基、エト
キシカルボニル基、アリルオキシカルボニル基、(3)
シクロアルキルウレタン型保護基、たとえばシクロペン
チルオキシカルボニル基、アダマンチルオキシカルボニ
ル基およびシクロヘキシルオキシカルボニル基などであ
る。第1位にNαMe−置換残基が存在している場合であ
つても、好ましいα−アミノ基保護基はBOCである。
Xは水素またはHisのイミダゾールチツ素のためのTosの
ような保護基である。
ような保護基である。
X2はTyrのフエノール性水酸基のための適当な保護基で
あり、テトラヒドロピラニル基、t−ブチル基、トリチ
ル基、Bzl、CBZ、4Br−CBZおよび2,6−ジクロルベンジ
ル基などである。
あり、テトラヒドロピラニル基、t−ブチル基、トリチ
ル基、Bzl、CBZ、4Br−CBZおよび2,6−ジクロルベンジ
ル基などである。
好ましい保護基は2,6−ジクロルベンジル基である。X2
は水素であつてもよい。これはその位置のアミノ酸残基
上に側鎖保護基がないことを意味する。
は水素であつてもよい。これはその位置のアミノ酸残基
上に側鎖保護基がないことを意味する。
X3は水素原子、またはAspもしくはGluのカルボキシル基
のための適当なエステル形成型保護基であり、ベンジル
(OBzl)、2,6−ジクロルベンジル基、メチル基および
エチル基などである。
のための適当なエステル形成型保護基であり、ベンジル
(OBzl)、2,6−ジクロルベンジル基、メチル基および
エチル基などである。
X4はThrおよびSerの水酸基のための適当な保護基であ
り、アセチル基、ベンゾイル基、t−ブチル基、トリチ
ル基、テトラヒドロピラニル基、Bzl、2,6−ジクロルベ
ンジル基およびCBZなどである。好ましい保護基はBzlで
ある。X4は水素原子であつてもよい。これは水酸基に保
護基がないことを意味する。
り、アセチル基、ベンゾイル基、t−ブチル基、トリチ
ル基、テトラヒドロピラニル基、Bzl、2,6−ジクロルベ
ンジル基およびCBZなどである。好ましい保護基はBzlで
ある。X4は水素原子であつてもよい。これは水酸基に保
護基がないことを意味する。
X5は水素であるか、またはAsnあるいはGlnの側鎖アミノ
基のための適当な保護基である。キサンチル(Xan)が
好ましい。
基のための適当な保護基である。キサンチル(Xan)が
好ましい。
X6はArgのグアニジン基のための適当な保護基であり、
ニトロ基、Tos、CBZ、アダマンチルオキシカルボニル基
およびBOCなどである。X6はあるいは水素原子である。
ニトロ基、Tos、CBZ、アダマンチルオキシカルボニル基
およびBOCなどである。X6はあるいは水素原子である。
X7は水素原子またはLysの側鎖アミノ基のための保護基
である。適切な側鎖アミノ基保護基の具体例は2−クロ
ルベンジルオキシカルボニル基(2−Cl−Z)、Tos、
t−アミルオキシカルボニル基およびBOCである。
である。適切な側鎖アミノ基保護基の具体例は2−クロ
ルベンジルオキシカルボニル基(2−Cl−Z)、Tos、
t−アミルオキシカルボニル基およびBOCである。
X8は水素原子であるか、または、前記のような適当な側
鎖保護基である。
鎖保護基である。
Metは酸素によつて随意に保護することができる。しか
し、保護しないままにしておくことが好ましい。
し、保護しないままにしておくことが好ましい。
側鎖アミノ基保護基の選択は厳密なものではないが、た
だし合成に際してα−アミノ基の脱保護中に除去されな
いものでなければならない。しかし、Hisのようなアミ
ノ酸の場合、カツプリングが完了した後は保護しておく
必要は一般的にない。また保護基は同一であつてもよ
い。
だし合成に際してα−アミノ基の脱保護中に除去されな
いものでなければならない。しかし、Hisのようなアミ
ノ酸の場合、カツプリングが完了した後は保護しておく
必要は一般的にない。また保護基は同一であつてもよ
い。
X9はエステル形成基X3のような、C−末端カルボキシル
基のための適当な保護基であるか、または、固体樹脂支
持体に結合するために固相合成で使用される定着結合で
あるか、若しくはdes−X9(この場合、C−末端におけ
る残基は前記のようなYからなるカルボキシル部分を有
する)である。このような固体樹脂支持体を使用する場
合、この樹脂支持体は広義には保護基であると考えられ
る。例えば、−O−CH2−樹脂支持体、−NH−ベンズヒ
ドリルアミン(BHA)樹脂支持体または−NH−パラメチ
ルベンズヒドリルアミン(MBHA)樹脂支持体のような当
分野で公知のもののいずれであつてもよい。非置換アミ
ドが所望の場合、解離すると直接、アミドを生成するの
でBHAまたはMBHA樹脂を使用することが好ましい。N−
メチルアミドを所望する場合、これはN−メチルBHA樹
脂から生成できる。その他の置換アミドを所望する場
合、または、C−末端に遊離酸以外の基を必要とする場
合、Houben−Weylの教科書に述べられているような古典
的な方法によりペプチドを合成することが好ましいであ
ろう。
基のための適当な保護基であるか、または、固体樹脂支
持体に結合するために固相合成で使用される定着結合で
あるか、若しくはdes−X9(この場合、C−末端におけ
る残基は前記のようなYからなるカルボキシル部分を有
する)である。このような固体樹脂支持体を使用する場
合、この樹脂支持体は広義には保護基であると考えられ
る。例えば、−O−CH2−樹脂支持体、−NH−ベンズヒ
ドリルアミン(BHA)樹脂支持体または−NH−パラメチ
ルベンズヒドリルアミン(MBHA)樹脂支持体のような当
分野で公知のもののいずれであつてもよい。非置換アミ
ドが所望の場合、解離すると直接、アミドを生成するの
でBHAまたはMBHA樹脂を使用することが好ましい。N−
メチルアミドを所望する場合、これはN−メチルBHA樹
脂から生成できる。その他の置換アミドを所望する場
合、または、C−末端に遊離酸以外の基を必要とする場
合、Houben−Weylの教科書に述べられているような古典
的な方法によりペプチドを合成することが好ましいであ
ろう。
中間体の構造式において、X−基のうちの少なくとも1
つは保護基またはX9含有樹脂支持体である。従つて、本
発明は、(a)少なくとも1個の保護基を有し、次式
(II) X1−R1(XまたはX2)−R2−R3(X3)−Ala−Ile−Phe
−Thr(X4)−R8(X4またはX5)−Ser(X4)−Tyr
(X2)−Arg(X6)−R12(X6またはX7)−R13−Leu−Gl
y−Gln(X5)−R17−R18(X2)−Ala−Arg(X6)−Lys
(X7)−Leu−R23−R24(XまたはX5)−R25(X3)−Il
e−R27−R28(X4またはX5)−Arg(X6)−Gln(X5)−G
ln(X5)−Gly−Glu(R3)−R34(X4またはX6)−Asn
(X5)−Gln(X5)−Glu(X3)−R38(X5またはX6)−R
39(X6)−R40(X4)−Arg(X6)−R42−R43(X5または
X6)−R44(X8)−X9 (式中、X、X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7およびX8は各
々、水素または保護基である;X9は保護基または樹脂支
持体への定着結合若しくはdes−X9(この場合、C−末
端の残基はYからなるカルボキシ部分を有する)であ
る。)のペプチド中間体を生成し;(b)式(II)の前
記ペプチドから保護基または定着結合を除去し;そし
て、(c)所望により、得られたペプチドを対応する非
毒性塩に転化させることからなる、ペプチドの製造方法
が提供される。
つは保護基またはX9含有樹脂支持体である。従つて、本
発明は、(a)少なくとも1個の保護基を有し、次式
(II) X1−R1(XまたはX2)−R2−R3(X3)−Ala−Ile−Phe
−Thr(X4)−R8(X4またはX5)−Ser(X4)−Tyr
(X2)−Arg(X6)−R12(X6またはX7)−R13−Leu−Gl
y−Gln(X5)−R17−R18(X2)−Ala−Arg(X6)−Lys
(X7)−Leu−R23−R24(XまたはX5)−R25(X3)−Il
e−R27−R28(X4またはX5)−Arg(X6)−Gln(X5)−G
ln(X5)−Gly−Glu(R3)−R34(X4またはX6)−Asn
(X5)−Gln(X5)−Glu(X3)−R38(X5またはX6)−R
39(X6)−R40(X4)−Arg(X6)−R42−R43(X5または
X6)−R44(X8)−X9 (式中、X、X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7およびX8は各
々、水素または保護基である;X9は保護基または樹脂支
持体への定着結合若しくはdes−X9(この場合、C−末
端の残基はYからなるカルボキシ部分を有する)であ
る。)のペプチド中間体を生成し;(b)式(II)の前
記ペプチドから保護基または定着結合を除去し;そし
て、(c)所望により、得られたペプチドを対応する非
毒性塩に転化させることからなる、ペプチドの製造方法
が提供される。
ペプチドの合成に用いられる特定の側鎖保護基を選択す
る際には、下記の基準に従う。(a)保護基はその保護
特性を保持することが好ましく、カツプリング条件下で
は離脱されてはならない。(b)保護基は試薬に対して
安定でなければならず、またXanを除いて、合成の各段
階においてα−アミノ保護基を除去するために選ばれる
試薬に対して同条件下で安定であることが好ましい。
(c)側鎖保護基は希望するアミノ酸配列を含む合成が
終了した時点で、ペプチド鎖を変化させない条件下にお
いて除去されなければならない。
る際には、下記の基準に従う。(a)保護基はその保護
特性を保持することが好ましく、カツプリング条件下で
は離脱されてはならない。(b)保護基は試薬に対して
安定でなければならず、またXanを除いて、合成の各段
階においてα−アミノ保護基を除去するために選ばれる
試薬に対して同条件下で安定であることが好ましい。
(c)側鎖保護基は希望するアミノ酸配列を含む合成が
終了した時点で、ペプチド鎖を変化させない条件下にお
いて除去されなければならない。
ペプチドを組み換えDNA技法により合成しない場合、ペ
プチドはメリフイールド〔J.Am.Chem.Soc.,85,2149(19
63)〕により記述されるように、固相合成法を用いて製
造されることが好ましい。ただし前記のように当業界で
知られている他の相当する化学合成法も用いることがで
きる。固相合成はペプチドのC−末端から、保護された
α−アミノ酸を適切な樹脂にカツプリングさせることに
より行われる。この種の出発物質はα−アミノ基を保護
されたアミノ酸をエステル結合によりクロルメチル化樹
脂もしくはヒドロキシメチル樹脂に結合させるか、また
はアミド結合によりBHA樹脂もしくはMBHA樹脂に結合さ
せることによつて製造することができる。ヒドロキシメ
チル樹脂の製造についてはボダンスキーら〔Chem.Ind.
(ロンドン)38,1597−98(1966)〕により記述されて
いる。クロルメチル化樹脂はバイオ・ラド・ラボラトリ
ーズ社(カリフオルニア州リツチモンド)およびラボ−
システムズ社から市販されている。この種の樹脂の製造
についてはスチユワートらにより“固相ペプチド合成”
(フリーマン社、サンフランシスコ、1969年)、第1
章、1〜6頁に記載されている。BHAおよびMBHA樹脂系
支持体は市販されており、合成される目的ポリペプチド
がC−末端にα−カルボキシアミド基をもつ場合にのみ
一般に用いられる。
プチドはメリフイールド〔J.Am.Chem.Soc.,85,2149(19
63)〕により記述されるように、固相合成法を用いて製
造されることが好ましい。ただし前記のように当業界で
知られている他の相当する化学合成法も用いることがで
きる。固相合成はペプチドのC−末端から、保護された
α−アミノ酸を適切な樹脂にカツプリングさせることに
より行われる。この種の出発物質はα−アミノ基を保護
されたアミノ酸をエステル結合によりクロルメチル化樹
脂もしくはヒドロキシメチル樹脂に結合させるか、また
はアミド結合によりBHA樹脂もしくはMBHA樹脂に結合さ
せることによつて製造することができる。ヒドロキシメ
チル樹脂の製造についてはボダンスキーら〔Chem.Ind.
(ロンドン)38,1597−98(1966)〕により記述されて
いる。クロルメチル化樹脂はバイオ・ラド・ラボラトリ
ーズ社(カリフオルニア州リツチモンド)およびラボ−
システムズ社から市販されている。この種の樹脂の製造
についてはスチユワートらにより“固相ペプチド合成”
(フリーマン社、サンフランシスコ、1969年)、第1
章、1〜6頁に記載されている。BHAおよびMBHA樹脂系
支持体は市販されており、合成される目的ポリペプチド
がC−末端にα−カルボキシアミド基をもつ場合にのみ
一般に用いられる。
Alaのα−アミノ基保護基を除去したのち、残りのα−
アミノ基および側鎖を保護されたアミノ酸を希望する順
に段階的にカツプリングさせ、前記の中間化合物を得る
か、あるいは合成に際し各アミノ酸を別個に添加する代
わりにこれらのうち幾つかを固相反応器に添加すること
ができる。適切なカツプリング試薬を選択することは当
技術分野に含まれる。カツプリング試薬として特に適切
なものはN,N′−ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC
I)である。
アミノ基および側鎖を保護されたアミノ酸を希望する順
に段階的にカツプリングさせ、前記の中間化合物を得る
か、あるいは合成に際し各アミノ酸を別個に添加する代
わりにこれらのうち幾つかを固相反応器に添加すること
ができる。適切なカツプリング試薬を選択することは当
技術分野に含まれる。カツプリング試薬として特に適切
なものはN,N′−ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC
I)である。
ペプチドの固相合成に用いられる活性化試薬はペプチド
技術において周知である。適切な活性化試薬はたとえば
N,N−ジイソプロピルカルボジイミド、N−エチル−
N′−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド
のようなカルボジイミドである。ペプチドのカツプリン
グにおける他の活性化試薬およびそれらの使用について
はシユレーダーおよびリユプケにより前出の文献、III
章に、およびカプール(Kapoor)によりJ.Phar.Sci.,5
9,1−27(1970)に記述されている。
技術において周知である。適切な活性化試薬はたとえば
N,N−ジイソプロピルカルボジイミド、N−エチル−
N′−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド
のようなカルボジイミドである。ペプチドのカツプリン
グにおける他の活性化試薬およびそれらの使用について
はシユレーダーおよびリユプケにより前出の文献、III
章に、およびカプール(Kapoor)によりJ.Phar.Sci.,5
9,1−27(1970)に記述されている。
保護された各アミノ酸またはアミノ酸配列を約4倍また
はそれ以上過剰に固相反応器に導入し、ジメチルホルム
アミド(DMF):CH2Cl2(1:1)の媒体中で、またはDMF
もしくはCH2Cl2単独の中でカツプリング反応を行うこと
ができる。不完全なカツプリング反応が起こつた場合、
次のアミノ酸のカツプリングを行う前に、α−アミノ基
保護基の除去前に上記のカツプリング操作を繰り返す。
カツプリング反応を作手業でおこなう場合、合成の各段
階におけるカツプリング反応の成功は、E.カイザーら
〔Anal.Biochem.,34,595(1970)〕により記述されてい
るようにニンヒドリン反応によつて監視される。カツプ
リング反応はRivierらが“Biopolymers"、1979,17,pp.1
927〜1938に報告したようなプログラムを使用し、Beckm
an990自動合成機などにより自動的に行なうこともでき
る。希望するアミノ酸配列が終了したのち、樹脂からペ
プチドを離脱させるだけでなく残存するすべての側鎖保
護基X、X2、X3、X4、X5、X6、X7およびX8と定着結合X9
ならびにα−アミノ基保護基X1(使用した場合)をも離
脱させる試薬(たとえば液体フツ化水素)で処理するこ
とにより、支持体樹脂から中間体ペプチドを分離し、遊
離酸の形のペプチドを得る。アミノ酸配列中にMetが存
在する場合、トリフルオロ酢酸(TFA)/エタンジチオ
ールを使用してBOC保護基を最初に除去し、次いで、HF
で樹脂からペプチドを解離することにより、S−アルキ
ル化がおこることを防止する。解離のためにフツ化水素
を用いる場合は、脱除のためにアニソールおよび硫化メ
チルエチルを反応器に装入することができる。
はそれ以上過剰に固相反応器に導入し、ジメチルホルム
アミド(DMF):CH2Cl2(1:1)の媒体中で、またはDMF
もしくはCH2Cl2単独の中でカツプリング反応を行うこと
ができる。不完全なカツプリング反応が起こつた場合、
次のアミノ酸のカツプリングを行う前に、α−アミノ基
保護基の除去前に上記のカツプリング操作を繰り返す。
カツプリング反応を作手業でおこなう場合、合成の各段
階におけるカツプリング反応の成功は、E.カイザーら
〔Anal.Biochem.,34,595(1970)〕により記述されてい
るようにニンヒドリン反応によつて監視される。カツプ
リング反応はRivierらが“Biopolymers"、1979,17,pp.1
927〜1938に報告したようなプログラムを使用し、Beckm
an990自動合成機などにより自動的に行なうこともでき
る。希望するアミノ酸配列が終了したのち、樹脂からペ
プチドを離脱させるだけでなく残存するすべての側鎖保
護基X、X2、X3、X4、X5、X6、X7およびX8と定着結合X9
ならびにα−アミノ基保護基X1(使用した場合)をも離
脱させる試薬(たとえば液体フツ化水素)で処理するこ
とにより、支持体樹脂から中間体ペプチドを分離し、遊
離酸の形のペプチドを得る。アミノ酸配列中にMetが存
在する場合、トリフルオロ酢酸(TFA)/エタンジチオ
ールを使用してBOC保護基を最初に除去し、次いで、HF
で樹脂からペプチドを解離することにより、S−アルキ
ル化がおこることを防止する。解離のためにフツ化水素
を用いる場合は、脱除のためにアニソールおよび硫化メ
チルエチルを反応器に装入することができる。
下記の具体例は固相法によりペプチドを合成するための
好ましい方法を示したものである。もちろん対応するよ
り短かいペプチド断片の合成は同じ方法で、単に鎖のい
ずれかの端において必要な数のアミノ酸を除去すること
により行われることは理解されるであろう。しかし、生
物活性をもつ断片はN−末端にここに示した配列を含む
べきであると現在は考えられる。
好ましい方法を示したものである。もちろん対応するよ
り短かいペプチド断片の合成は同じ方法で、単に鎖のい
ずれかの端において必要な数のアミノ酸を除去すること
により行われることは理解されるであろう。しかし、生
物活性をもつ断片はN−末端にここに示した配列を含む
べきであると現在は考えられる。
参考例1 次式、 NαMeHis−Ala−Asp−Ala−Ile−Phe−Thr−Ser−Ser
−Tyr−Arg−Arg−Ile−Leu−Gly−Gln−Leu−Tyr−Ala
−Arg−Lys−Leu−Leu−His−Glu−Ile−Met−Asn−Arg
−Gln−Gln−Gly−Glu−Arg−Asn−Gln−Glu−Gln−Arg
−Ser−Arg−Phe−Asn−OH で示されるペプチド〔NαMeHis1〕−rGRF(1−43)−
OHの合成をBeckman990ペプチド合成機を用いてクロルメ
チル化樹脂(約0.1〜0.5ミリモル/g樹脂の置換範囲を有
する)上で段階的に行なつた。BOC−Asn(Xan)の樹脂
へのカツプリングは前掲の“Chemistry Letters"に開示
された一般法により、KFのDMF溶液を使用し、約60℃で2
4時間撹拌しながら行なつた。樹脂1gにつき約0.35ミリ
モルのAsnの置換が行なわれた。
−Tyr−Arg−Arg−Ile−Leu−Gly−Gln−Leu−Tyr−Ala
−Arg−Lys−Leu−Leu−His−Glu−Ile−Met−Asn−Arg
−Gln−Gln−Gly−Glu−Arg−Asn−Gln−Glu−Gln−Arg
−Ser−Arg−Phe−Asn−OH で示されるペプチド〔NαMeHis1〕−rGRF(1−43)−
OHの合成をBeckman990ペプチド合成機を用いてクロルメ
チル化樹脂(約0.1〜0.5ミリモル/g樹脂の置換範囲を有
する)上で段階的に行なつた。BOC−Asn(Xan)の樹脂
へのカツプリングは前掲の“Chemistry Letters"に開示
された一般法により、KFのDMF溶液を使用し、約60℃で2
4時間撹拌しながら行なつた。樹脂1gにつき約0.35ミリ
モルのAsnの置換が行なわれた。
脱保護基および中和ののち、ペプチド鎖を樹脂上に段階
的に形成させた。脱保護基、中和、および各アミノ酸の
添加は一般にJ.Riverが“J.Amer.Chem.Soc."、96,2986
〜2992(1974)に詳細に開示した方法により行なつた。
用いた溶剤は全て不活性ガス(例えば、ヘリウムまたは
チツ素)を噴入することにより注意深く脱ガスされ、Me
t残基のイオウ原子を不本意に酸化する可能性のある酸
素の不在を確実なものにした。
的に形成させた。脱保護基、中和、および各アミノ酸の
添加は一般にJ.Riverが“J.Amer.Chem.Soc."、96,2986
〜2992(1974)に詳細に開示した方法により行なつた。
用いた溶剤は全て不活性ガス(例えば、ヘリウムまたは
チツ素)を噴入することにより注意深く脱ガスされ、Me
t残基のイオウ原子を不本意に酸化する可能性のある酸
素の不在を確実なものにした。
脱保護は次のスケジユールAに従つて行なうことが好ま
しい。
しい。
カツプリングは次のスケジユールBに従つて行なうこと
が好ましい。
が好ましい。
要約すると、樹脂1gにつき塩化メチレン中のBOC−保護
アミノ酸1〜2ミリモル、および塩化メチレン中の1.0M
DCCI1当量を2時間使用した。BOC−Arg(TOS)をカツ
プリングさせる場合は、50%DMFおよび塩化メチレンの
混合物を用いた。SerおよびThrの側鎖水酸基の保護基と
してはBzlエーテルを使用した。DCCカツプリングを使用
することが好ましい場合、AsnまたはGlnのアミド基はXa
nによつて保護する。また、AsnまたはGlnのカルボキシ
ル末端を活性化させるのにp−ニトロフエニルエステル
(ONp)を使用することもできる。例えば、DMFと塩化メ
チレンの50%混合物中でHOBt1当量を使用し、BOC−Asn
(ONp)を一晩カツプリングさせることができる。この
場合、DCCは添加されない。Lys側鎖の保護基としては2
−クロル−ベンジルオキシカルボニル(2Cl−Z)を用
いた。Argのグアニジノ基およびHisのイミダゾールチツ
素を保護するためにはTosを用い、GluおよびAspの側鎖
カルボキシル基はOBzlで保護されたTyrのフエノール性
水酸基は2,6−ジクロルベンジル(DCB)により保護され
た。合成終了時に、下記の組成物が得られた。
アミノ酸1〜2ミリモル、および塩化メチレン中の1.0M
DCCI1当量を2時間使用した。BOC−Arg(TOS)をカツ
プリングさせる場合は、50%DMFおよび塩化メチレンの
混合物を用いた。SerおよびThrの側鎖水酸基の保護基と
してはBzlエーテルを使用した。DCCカツプリングを使用
することが好ましい場合、AsnまたはGlnのアミド基はXa
nによつて保護する。また、AsnまたはGlnのカルボキシ
ル末端を活性化させるのにp−ニトロフエニルエステル
(ONp)を使用することもできる。例えば、DMFと塩化メ
チレンの50%混合物中でHOBt1当量を使用し、BOC−Asn
(ONp)を一晩カツプリングさせることができる。この
場合、DCCは添加されない。Lys側鎖の保護基としては2
−クロル−ベンジルオキシカルボニル(2Cl−Z)を用
いた。Argのグアニジノ基およびHisのイミダゾールチツ
素を保護するためにはTosを用い、GluおよびAspの側鎖
カルボキシル基はOBzlで保護されたTyrのフエノール性
水酸基は2,6−ジクロルベンジル(DCB)により保護され
た。合成終了時に、下記の組成物が得られた。
BOC−NαMeHis(X)−Ala−Asp(X3)−Ala−Ile−Ph
e−Thr(X4)−Ser(X4)−Ser(X4)−Tyr(X2)−Arg
(X6)−Arg(X6)−Ile−Leu−Gly−Gln(X5)−Leu−
Tyr(X2)−Ala−Arg(X6)−Lys(X7)−Leu−Leu−Hi
s(X)−Glu(X3)−Ile−Met−Asn(X5)−Arg(X6)
−Gln(X5)−Gln(X5)−Gly−Glu(X3)−Arg(X6)
−Asn(X5)−Gln(X5)−Glu(X3)−Gln(X5)−Arg
(X6)−Ser(X4)−Arg(X6)−Phe−Asn(X5)−X9 (式中、XはTosであり、X2はCDBであり、X3はOBzlであ
り、X4はBzlであり、X5はXanであり、X6はTosであり、X
7は2Cl−Zであり、そして、X9は−O−CH2−樹脂支持
体である。)Xanはα−アミノ保護基を脱保護するのに
使用されるTFA処理により部分的に、または、完全に除
去することもできる。
e−Thr(X4)−Ser(X4)−Ser(X4)−Tyr(X2)−Arg
(X6)−Arg(X6)−Ile−Leu−Gly−Gln(X5)−Leu−
Tyr(X2)−Ala−Arg(X6)−Lys(X7)−Leu−Leu−Hi
s(X)−Glu(X3)−Ile−Met−Asn(X5)−Arg(X6)
−Gln(X5)−Gln(X5)−Gly−Glu(X3)−Arg(X6)
−Asn(X5)−Gln(X5)−Glu(X3)−Gln(X5)−Arg
(X6)−Ser(X4)−Arg(X6)−Phe−Asn(X5)−X9 (式中、XはTosであり、X2はCDBであり、X3はOBzlであ
り、X4はBzlであり、X5はXanであり、X6はTosであり、X
7は2Cl−Zであり、そして、X9は−O−CH2−樹脂支持
体である。)Xanはα−アミノ保護基を脱保護するのに
使用されるTFA処理により部分的に、または、完全に除
去することもできる。
得られた保護されたペプチド鎖を分離し、保護基を除去
するため、これをペプチド鎖1gにつきアニソール1.5m
l、硫化メチルエチル0.5mlおよびフツ化水素(HF)15ml
で−20℃において1/2時間、および0℃において1/2時間
処理した。高度の真空下でHFを除去したのち、残存する
樹脂−ペプチドを乾燥ジエチルエーテルおよびクロロホ
ルムで交互に洗浄し、次いでペプチドを脱ガスした2N酢
酸水溶液で抽出し、過することにより樹脂から分離し
た。
するため、これをペプチド鎖1gにつきアニソール1.5m
l、硫化メチルエチル0.5mlおよびフツ化水素(HF)15ml
で−20℃において1/2時間、および0℃において1/2時間
処理した。高度の真空下でHFを除去したのち、残存する
樹脂−ペプチドを乾燥ジエチルエーテルおよびクロロホ
ルムで交互に洗浄し、次いでペプチドを脱ガスした2N酢
酸水溶液で抽出し、過することにより樹脂から分離し
た。
分離され、保護基を除去されたこのペプチドを次いで0
〜5%酢酸に溶解し、セフアデツクスG−50微細ゲル
過のような手段で精製した。
〜5%酢酸に溶解し、セフアデツクスG−50微細ゲル
過のような手段で精製した。
次いで、このペプチドは、Rivierらが“Peptides:Struc
ture and Biological Function"、(1979)pp125〜8お
よびMarkiらが“J.Amer.Chem.Soc.",103,3178(1981)
に開示したような分取または半分取HPLCにより精製す
る。Waters Associates社製LC−500にあうカートリツジ
にはVydac社15−20 C18シリカ(300Å)が充てんされて
いる。CH3CN/TEAP勾配はJ.Rivierが“Liq.Chromatograp
hy"1,343〜367(1978)に開示したような低圧Eldex勾配
により製造されている。クロマトグラフした画分はHPLC
により入念にモニターし、実質的な純度を示した画分の
みを集めた。純度を各々チエツクされた精製画分をCH3C
N/0.1%TFA勾配で脱塩した。次いで、中央画分を凍結乾
燥し、所望のペプチドを生成した。このペプチドの純度
は98%以上であつた。
ture and Biological Function"、(1979)pp125〜8お
よびMarkiらが“J.Amer.Chem.Soc.",103,3178(1981)
に開示したような分取または半分取HPLCにより精製す
る。Waters Associates社製LC−500にあうカートリツジ
にはVydac社15−20 C18シリカ(300Å)が充てんされて
いる。CH3CN/TEAP勾配はJ.Rivierが“Liq.Chromatograp
hy"1,343〜367(1978)に開示したような低圧Eldex勾配
により製造されている。クロマトグラフした画分はHPLC
により入念にモニターし、実質的な純度を示した画分の
みを集めた。純度を各々チエツクされた精製画分をCH3C
N/0.1%TFA勾配で脱塩した。次いで、中央画分を凍結乾
燥し、所望のペプチドを生成した。このペプチドの純度
は98%以上であつた。
MBHA樹脂を用いてこの合成をくりかえした。Valeらの米
国特許第4,292,313号に開示された最初の方法によりAsn
をMBHA樹脂に結合させることにより、アミド化C−末端
を有する同一のペプチドを製造した。
国特許第4,292,313号に開示された最初の方法によりAsn
をMBHA樹脂に結合させることにより、アミド化C−末端
を有する同一のペプチドを製造した。
参考例2 次式、 H−CαMeHis−Ala−Asp−Ala−Ile−Phe−Thr−Ser−
Ser−Tyr−Arg−Arg−Ile−Leu−Gly−Gln−Leu−Tyr−
Ala−Arg−Lys−Leu−Leu−His−Glu−Ile−Met−Asn−
Arg−Gln−Gln−Gly−Glu−Arg−Asn−Gln−Glu−Gln−
Arg−Ser−NH2 で示される40残基アミド化ペプチドの合成を、Valeらの
米国特許第4,292,313号明細書に一般的に説明されてい
るように、Beckman990ペプチド合成機を用いて、MBHA樹
脂上で段階的に行なつた。TLCおよびHPLCにより、この
ペプチドは、おおむね純粋であることが確認された。
Ser−Tyr−Arg−Arg−Ile−Leu−Gly−Gln−Leu−Tyr−
Ala−Arg−Lys−Leu−Leu−His−Glu−Ile−Met−Asn−
Arg−Gln−Gln−Gly−Glu−Arg−Asn−Gln−Glu−Gln−
Arg−Ser−NH2 で示される40残基アミド化ペプチドの合成を、Valeらの
米国特許第4,292,313号明細書に一般的に説明されてい
るように、Beckman990ペプチド合成機を用いて、MBHA樹
脂上で段階的に行なつた。TLCおよびHPLCにより、この
ペプチドは、おおむね純粋であることが確認された。
参考例3 次式、 NαMeMet−Ala−Asp−Ala−Ile−Phe−Thr−Ser−Ser
−Tyr−Arg−Arg−Ile−Leu−Gly−Gln−Leu−Tyr−Ala
−Arg−Lys−Leu−Leu−His−Glu−Ile−Leu−Asn−Arg
−Gln−Gln−Gly−Glu−Arg−Asn−Gln−Glu−Gln−Arg
−Ser−Arg−Phe−Asn−OH で示されるrhGRF類似体、即ち、〔NαMe−Met1,Le
u27〕−rGRF(1−43)−OHの合成を、参考例1に述べ
たように、Beckman990ペプチド合成機を用いて、クロル
メチル化樹脂上で段階的に行なつた。TLCおよびHPLCに
より、このペプチドは、おおむね純粋であることが確認
された。
−Tyr−Arg−Arg−Ile−Leu−Gly−Gln−Leu−Tyr−Ala
−Arg−Lys−Leu−Leu−His−Glu−Ile−Leu−Asn−Arg
−Gln−Gln−Gly−Glu−Arg−Asn−Gln−Glu−Gln−Arg
−Ser−Arg−Phe−Asn−OH で示されるrhGRF類似体、即ち、〔NαMe−Met1,Le
u27〕−rGRF(1−43)−OHの合成を、参考例1に述べ
たように、Beckman990ペプチド合成機を用いて、クロル
メチル化樹脂上で段階的に行なつた。TLCおよびHPLCに
より、このペプチドは、おおむね純粋であることが確認
された。
実施例1 次式、 H−CαMePhe(4Cl)−Ala−Asp−Ala−Ile−Phe−Thr
−Asn−Ser−Tyr−Arg−Lys−Val−Leu−Gly−Gln−Leu
−Ser−Ala−Arg−Lys−Leu−Leu−Gln−Asp−Ile−Met
−Ser−Arg−Gln−Gln−Gly−NH2 で示されるhpGRF類似体断片、即ち、〔CαMePhe(4C
l)1〕−hpGRF(1−32)−NH2の合成を、参考例2に述
べたように、Beckman990ペプチド合成機を用いて、MBHA
樹脂上で段階的に行なつた。TLCおよびHPLCにより、こ
のペプチドは、おおむね純粋であることが確認された。
−Asn−Ser−Tyr−Arg−Lys−Val−Leu−Gly−Gln−Leu
−Ser−Ala−Arg−Lys−Leu−Leu−Gln−Asp−Ile−Met
−Ser−Arg−Gln−Gln−Gly−NH2 で示されるhpGRF類似体断片、即ち、〔CαMePhe(4C
l)1〕−hpGRF(1−32)−NH2の合成を、参考例2に述
べたように、Beckman990ペプチド合成機を用いて、MBHA
樹脂上で段階的に行なつた。TLCおよびHPLCにより、こ
のペプチドは、おおむね純粋であることが確認された。
この合成を2回くりかえし、〔4Cl−Phe1〕−hpGRF(1
−32)−NH2および〔NαMePhe1〕−hpGRF(1−32)−
NH2を製造した。
−32)−NH2および〔NαMePhe1〕−hpGRF(1−32)−
NH2を製造した。
実施例2 次式、 NαMeTyr−Ala−Asp−Ala−Ile−Phe−Thr−Asn−Ser
−Tyr−Arg−Lys−Val−Leu−Gly−Gln−Leu−Ser−Ala
−Arg−Lys−Leu−Leu−Gln−Asp−Ile−Met−Ser−Arg
−NH2 で示されるhpGRF類似体断片、即ち、〔NαMeTyr1〕−h
pGRF(1−29)−NH2の合成を、参考例2に述べたよう
に、Beckman990ペプチド合成機を用いて、MBHA樹脂上で
段階的に行なつた。TLCおよびHPLCにより、このペプチ
ドは、おおむね純粋であることが確認された。
−Tyr−Arg−Lys−Val−Leu−Gly−Gln−Leu−Ser−Ala
−Arg−Lys−Leu−Leu−Gln−Asp−Ile−Met−Ser−Arg
−NH2 で示されるhpGRF類似体断片、即ち、〔NαMeTyr1〕−h
pGRF(1−29)−NH2の合成を、参考例2に述べたよう
に、Beckman990ペプチド合成機を用いて、MBHA樹脂上で
段階的に行なつた。TLCおよびHPLCにより、このペプチ
ドは、おおむね純粋であることが確認された。
実施例3 次式、 NαMePhe−Ala−Asp−Ala−Ile−Phe−Thr−Ser−Ser
−Tyr−Arg−Arg−Ile−Leu−Gly−Gln−Leu−Tyr−Ala
−Arg−Lys−Leu−Leu−His−Glu−Ile−Met−Asn−Arg
−NH2 で示されるrGRF断片、即ち、〔NαMePhe1〕−rGRF(1
−29)−NH2の合成を、参考例2に述べたように、Beckm
an990ペプチド合成機を用いて、MBHA樹脂上で段階的に
行なつた。TLCおよびHPLCにより、このペプチドは、お
おむね純粋であることが確認された。
−Tyr−Arg−Arg−Ile−Leu−Gly−Gln−Leu−Tyr−Ala
−Arg−Lys−Leu−Leu−His−Glu−Ile−Met−Asn−Arg
−NH2 で示されるrGRF断片、即ち、〔NαMePhe1〕−rGRF(1
−29)−NH2の合成を、参考例2に述べたように、Beckm
an990ペプチド合成機を用いて、MBHA樹脂上で段階的に
行なつた。TLCおよびHPLCにより、このペプチドは、お
おむね純粋であることが確認された。
実施例4 次式、 NαMeLeu−Ala−Asp−Ala−Ile−Phe−Thr−Asn−Ser
−Tyr−Arg−Lys−Val−Leu−Gly−Gln−Leu−Ser−Ala
−Arg−Lys−Leu−Leu−Gln−Asp−Ile−Ile−Ser−Arg
−Gln−Gln−Gly−NH2 で示される〔NαMeLeu1,Ile27〕−hpGRF(1−32)−
NH2の合成を、参考例2に述べたように、Beckman990ペ
プチド合成機を用いて、MBHA樹脂上で段階的に行なつ
た。TLCおよびHPLCにより、このペプチドは、おおむね
純粋であることが確認された。
−Tyr−Arg−Lys−Val−Leu−Gly−Gln−Leu−Ser−Ala
−Arg−Lys−Leu−Leu−Gln−Asp−Ile−Ile−Ser−Arg
−Gln−Gln−Gly−NH2 で示される〔NαMeLeu1,Ile27〕−hpGRF(1−32)−
NH2の合成を、参考例2に述べたように、Beckman990ペ
プチド合成機を用いて、MBHA樹脂上で段階的に行なつ
た。TLCおよびHPLCにより、このペプチドは、おおむね
純粋であることが確認された。
実施例5 次式、 H−CαMePhe(4Cl)−Ala−Asp−Ala−Ile−Phe−The
−Ser−Ser−Tyr−Arg−Arg−Ile−Leu−Gly−Gln−Leu
−Tyr−Ala−Arg−Lys−Leu−Leu−His−Gln−Ile−Met
−Asn−Arg−NH2 で示されるrhGRF類似体断片、即ち、〔CαMe(4Cl)1〕
−rGRF(1−29)−NH2の合成を、参考例2に述べたよ
うに、Beckman990ペプチド合成機を用いて、MBHA樹脂上
で段階的に行なつた。TLCおよびHPLCにより、このペプ
チドは、おおむね純粋であることが確認された。
−Ser−Ser−Tyr−Arg−Arg−Ile−Leu−Gly−Gln−Leu
−Tyr−Ala−Arg−Lys−Leu−Leu−His−Gln−Ile−Met
−Asn−Arg−NH2 で示されるrhGRF類似体断片、即ち、〔CαMe(4Cl)1〕
−rGRF(1−29)−NH2の合成を、参考例2に述べたよ
うに、Beckman990ペプチド合成機を用いて、MBHA樹脂上
で段階的に行なつた。TLCおよびHPLCにより、このペプ
チドは、おおむね純粋であることが確認された。
実施例6 次式、 H−NαMeTyr−Ala−Asp−Ala−Ile−Phe−Thr−Ser−
Ser−Tyr−Arg−Arg−Ile−Leu−Gly−Gln−Leu−Tyr−
Ala−Arg−Lys−Leu−Leu−His−Glu−Ile−Met−Asn−
Arg−NH2 で示されるrGRF類似体断片、即ち、〔NαMeTyr1〕−rG
RF(1−29)−NH2の合成を、参考例2に述べたよう
に、Beckman990ペプチド合成機を用いて、MBHA樹脂上で
段階的に行なつた。TLCおよびHPLCにより、このペプチ
ドは、おおむね純粋であることが確認された。
Ser−Tyr−Arg−Arg−Ile−Leu−Gly−Gln−Leu−Tyr−
Ala−Arg−Lys−Leu−Leu−His−Glu−Ile−Met−Asn−
Arg−NH2 で示されるrGRF類似体断片、即ち、〔NαMeTyr1〕−rG
RF(1−29)−NH2の合成を、参考例2に述べたよう
に、Beckman990ペプチド合成機を用いて、MBHA樹脂上で
段階的に行なつた。TLCおよびHPLCにより、このペプチ
ドは、おおむね純粋であることが確認された。
参考例4 次式、 H−CαMeLeu−Ala−Asp−Ala−Ile−Phe−Thr−Ser−
Ser−Tyr−Arg−Arg−Ile−Leu−Gly−Gln−Leu−Tyr−
Ala−Arg−Lys−Leu−Leu−His−Glu−Ile−Met−Asn−
Arg−Gln−Gln−Gly−Glu−Arg−Asn−Gln−Glu−Gln−
Arg−Ser−Arg−Phe−Asn−Val−NH2 で示される〔CαMeLeu1〕−rhGRF−〔Val44−NH2〕の
合成を、参考例2に述べたように、Beckman990ペプチド
合成機を用いて、MBHA樹脂上で段階的に行なつた。TLC
およびHPLCにより、このペプチドは、おおむね純粋であ
ることが確認された。
Ser−Tyr−Arg−Arg−Ile−Leu−Gly−Gln−Leu−Tyr−
Ala−Arg−Lys−Leu−Leu−His−Glu−Ile−Met−Asn−
Arg−Gln−Gln−Gly−Glu−Arg−Asn−Gln−Glu−Gln−
Arg−Ser−Arg−Phe−Asn−Val−NH2 で示される〔CαMeLeu1〕−rhGRF−〔Val44−NH2〕の
合成を、参考例2に述べたように、Beckman990ペプチド
合成機を用いて、MBHA樹脂上で段階的に行なつた。TLC
およびHPLCにより、このペプチドは、おおむね純粋であ
ることが確認された。
参考例5 次式、 NαMeTyr−Ala−Asp−Ala−Ile−Phe−Thr−Ser−Ser
−Tyr−Arg−Arg−Ile−Leu−Gly−Gln−Leu−Tyr−Ala
−Arg−Lys−Leu−D−Leu−His−Glu−Ile−Met−Asn
−Arg−Gln−Gln−Gly−Glu−Arg−Asn−Gln−Glu−Gln
−Arg−Ser−Arg−Phe−Asn−OH で示されるペプチド〔NαMeTyr1,D−Leu23〕−rGRF
(1−43)−OHの合成を、参考例1に述べたように、Be
ckman990ペプチド合成機を用いて、クロルメチル化樹脂
(樹脂1gあたり約0.1〜0.5ミリモルの置換範囲を有す
る。)上で段階的に行なつた。
−Tyr−Arg−Arg−Ile−Leu−Gly−Gln−Leu−Tyr−Ala
−Arg−Lys−Leu−D−Leu−His−Glu−Ile−Met−Asn
−Arg−Gln−Gln−Gly−Glu−Arg−Asn−Gln−Glu−Gln
−Arg−Ser−Arg−Phe−Asn−OH で示されるペプチド〔NαMeTyr1,D−Leu23〕−rGRF
(1−43)−OHの合成を、参考例1に述べたように、Be
ckman990ペプチド合成機を用いて、クロルメチル化樹脂
(樹脂1gあたり約0.1〜0.5ミリモルの置換範囲を有す
る。)上で段階的に行なつた。
合成終了時点で、次の組成が得られた。
BOC−NαMeTyr(X2)−Ala−Asp(X3)−Ala−Ile−Ph
e−Thr(X4)−Ser(X4)−Ser(X4)−Tyr(X2)−Arg
(X6)−Arg(X6)−Ile−Leu−Gly−Gln(X5)−Leu−
Tyr(X2)−Ala−Arg(X6)−Lys(X7)−Leu−D−Leu
−His(X)−Glu(X3)−Ile−Met−Asn(X5)−Arg
(X6)−Gln(X5)−Gln(X5)−Gly−Glu(X3)−Arg
(X6)−Asn(X5)−Gln(X5)−Glu(X3)−Gln(X5)
−Arg(X6)−Ser(X4)−Arg(X6)−Phe−Asn(X5)
−X9 (式中、X2はDCBであり、X3はOBzlであり、X4はBzlであ
り、X5はXanであり、X6はTosであり、X7は2Cl−Zであ
り、そして、X9は−O−CH2−樹脂支持体である。)α
−アミノ保護基の脱保護に使用されるTFA処理によりXan
を部分的に、または完全に除去することができる。
e−Thr(X4)−Ser(X4)−Ser(X4)−Tyr(X2)−Arg
(X6)−Arg(X6)−Ile−Leu−Gly−Gln(X5)−Leu−
Tyr(X2)−Ala−Arg(X6)−Lys(X7)−Leu−D−Leu
−His(X)−Glu(X3)−Ile−Met−Asn(X5)−Arg
(X6)−Gln(X5)−Gln(X5)−Gly−Glu(X3)−Arg
(X6)−Asn(X5)−Gln(X5)−Glu(X3)−Gln(X5)
−Arg(X6)−Ser(X4)−Arg(X6)−Phe−Asn(X5)
−X9 (式中、X2はDCBであり、X3はOBzlであり、X4はBzlであ
り、X5はXanであり、X6はTosであり、X7は2Cl−Zであ
り、そして、X9は−O−CH2−樹脂支持体である。)α
−アミノ保護基の脱保護に使用されるTFA処理によりXan
を部分的に、または完全に除去することができる。
参考例1に述べたように保護ペプチド−樹脂を解離さ
せ、脱保護し、そして、精製した。純度を各々チエツク
された精製画分の脱塩はCH3CN/0.1%TFA勾配により行な
つた。次いで中央画分を凍結乾燥し、所望のペプチドを
得た。このペプチドの純度は98%以上であつた。
せ、脱保護し、そして、精製した。純度を各々チエツク
された精製画分の脱塩はCH3CN/0.1%TFA勾配により行な
つた。次いで中央画分を凍結乾燥し、所望のペプチドを
得た。このペプチドの純度は98%以上であつた。
MBHA樹脂を使用し、この合成をくりかえした。Valeらの
米国特許第4,292,313号に開示された最初の方法によりA
snをMBHA樹脂に結合させ、アミド化C−末端を有する同
一のペプチドを製造した。
米国特許第4,292,313号に開示された最初の方法によりA
snをMBHA樹脂に結合させ、アミド化C−末端を有する同
一のペプチドを製造した。
参考例6 次式、 H−CαMeHis−Ala−Asp−Ala−Ile−Phe−Thr−Asn−
Ser−Tyr−Arg−Lys−Val−Leu−Gly−Gln−Leu−Ser−
Ala−Arg−Lys−Leu−D−Leu−Gln−Asp−Ile−Met−S
er−Arg−Gln−Gln−Gly−Glu−Ser−Asn−Gln−Glu−A
rg−Gly−Ala−NH2 で示される40残基アミド化ペプチド〔CαMeHis1,D−Le
u23〕−hpGRF(1−40)−NH2の合成を、Valeらの米国
特許第4,292,313号明細書に一般的に説明されているよ
うに、Beckman990ペプチド合成機を用いて、MBHA樹脂上
で段階的に行なつた。TLCおよびHPLCにより、このペプ
チドは、おおむね純粋であることが確認された。
Ser−Tyr−Arg−Lys−Val−Leu−Gly−Gln−Leu−Ser−
Ala−Arg−Lys−Leu−D−Leu−Gln−Asp−Ile−Met−S
er−Arg−Gln−Gln−Gly−Glu−Ser−Asn−Gln−Glu−A
rg−Gly−Ala−NH2 で示される40残基アミド化ペプチド〔CαMeHis1,D−Le
u23〕−hpGRF(1−40)−NH2の合成を、Valeらの米国
特許第4,292,313号明細書に一般的に説明されているよ
うに、Beckman990ペプチド合成機を用いて、MBHA樹脂上
で段階的に行なつた。TLCおよびHPLCにより、このペプ
チドは、おおむね純粋であることが確認された。
参考例7 次式、 NαMeMet−Ala−Asp−Ala−Ile−Phe−Thr−Ser−Ser
−Tyr−Arg−Arg−Ile−Leu−Gly−Gln−Leu−Tyr−Ala
−Arg−Lys−Leu−D−Leu−His−Glu−Ile−Nle−Asn
−Arg−Gln−Gln−Gly−Glu−Arg−Asn−Gln−Glu−Gln
−Arg−Ser−Arg−Phe−Asn−OH で示される〔NαMe−Met1,D−Leu23,Nle27〕−rGRF
(1−43)−OHの合成を、参考例1に述べたように、Be
ckman990ペプチド合成機を用いて、クロルメチル化樹脂
上で段階的に行なつた。TLCおよびHPLCにより、このペ
プチドは、おおむね純粋であることが確認された。
−Tyr−Arg−Arg−Ile−Leu−Gly−Gln−Leu−Tyr−Ala
−Arg−Lys−Leu−D−Leu−His−Glu−Ile−Nle−Asn
−Arg−Gln−Gln−Gly−Glu−Arg−Asn−Gln−Glu−Gln
−Arg−Ser−Arg−Phe−Asn−OH で示される〔NαMe−Met1,D−Leu23,Nle27〕−rGRF
(1−43)−OHの合成を、参考例1に述べたように、Be
ckman990ペプチド合成機を用いて、クロルメチル化樹脂
上で段階的に行なつた。TLCおよびHPLCにより、このペ
プチドは、おおむね純粋であることが確認された。
実施例7 次式、 H−Tyr−Ala−Asp−Ala−Ile−Phe−Thr−Asn−Ser−T
yr−Arg−Lys−Val−Leu−Gly−Gln−Leu−Ser−Ala−A
rg−Lys−Leu−D−Leu−Gln−Asp−Ile−Met−Ser−Ar
g−Gln−Gln−Gly−NH2 で示されるhpGRF類似体断片、即ち、〔D−Leu23〕−hp
GRF(1−23)−NH2の合成を、参考例2に述べたよう
に、Beckman990ペプチド合成機を用いて、MBHA樹脂上で
段階的に行なつた。TLCおよびHPLCにより、このペプチ
ドは、おおむね純粋であることが確認された。
yr−Arg−Lys−Val−Leu−Gly−Gln−Leu−Ser−Ala−A
rg−Lys−Leu−D−Leu−Gln−Asp−Ile−Met−Ser−Ar
g−Gln−Gln−Gly−NH2 で示されるhpGRF類似体断片、即ち、〔D−Leu23〕−hp
GRF(1−23)−NH2の合成を、参考例2に述べたよう
に、Beckman990ペプチド合成機を用いて、MBHA樹脂上で
段階的に行なつた。TLCおよびHPLCにより、このペプチ
ドは、おおむね純粋であることが確認された。
この合成を2回くりかえし、〔D−Leu23,D−Glu25〕−
hpGRF(1−32)−NH2および〔D−Leu23,Nle27〕−hp
GRF(1−32)−NH2を製造した。
hpGRF(1−32)−NH2および〔D−Leu23,Nle27〕−hp
GRF(1−32)−NH2を製造した。
実施例8 次式、 H−Tyr−Ala−Asp−Ala−Ile−Phe−Thr−Asn−Ser−T
yr−Arg−Lys−Val−Leu−Gly−Gln−Leu−Ser−Ala−A
rg−Lys−Leu−D−Leu−Gln−D−Asp−Ile−Nle−Ser
−Arg−NH2 で示されるhpGRF類似体断片、即ち、〔D−Leu23,D−As
p25,Nle27〕−hpGRF(1−29)−NH2の合成を、参考例
2に述べたように、Beckman990ペプチド合成機を用い
て、MBHA樹脂上で段階的に行なつた。TLCおよびHPLCに
より、このペプチドは、おおむね純粋であることが確認
された。
yr−Arg−Lys−Val−Leu−Gly−Gln−Leu−Ser−Ala−A
rg−Lys−Leu−D−Leu−Gln−D−Asp−Ile−Nle−Ser
−Arg−NH2 で示されるhpGRF類似体断片、即ち、〔D−Leu23,D−As
p25,Nle27〕−hpGRF(1−29)−NH2の合成を、参考例
2に述べたように、Beckman990ペプチド合成機を用い
て、MBHA樹脂上で段階的に行なつた。TLCおよびHPLCに
より、このペプチドは、おおむね純粋であることが確認
された。
実施例9 次式、 H−His−Ala−Asp−Ala−Ile−Phe−Thr−Ser−Ser−T
yr−Arg−Arg−Ile−Leu−Gly−Gln−Leu−Tyr−Ala−A
rg−Lys−Leu−D−Leu−His−Glu−Ile−Nle−Asn−Ar
g−NH2 で示される〔D−Leu23,Nle27〕−rGRF(1−29)−NH
2の合成を、参考例2に述べたように、Beckman990ペプ
チド合成機を用いて、MBHA樹脂上で段階的に行なつた。
TLCおよびHPLCにより、このペプチドは、おおむね純粋
であることが確認された。
yr−Arg−Arg−Ile−Leu−Gly−Gln−Leu−Tyr−Ala−A
rg−Lys−Leu−D−Leu−His−Glu−Ile−Nle−Asn−Ar
g−NH2 で示される〔D−Leu23,Nle27〕−rGRF(1−29)−NH
2の合成を、参考例2に述べたように、Beckman990ペプ
チド合成機を用いて、MBHA樹脂上で段階的に行なつた。
TLCおよびHPLCにより、このペプチドは、おおむね純粋
であることが確認された。
この合成をくりかえし、〔D−Leu17,Nle27〕−rGRF
(1−29)−NH2を合成した。
(1−29)−NH2を合成した。
実施例10 次式、 H−Tyr−Ala−Asp−Ala−Ile−Phe−Thr−Asn−Ser−T
yr−Arg−Lys−Val−Leu−Gly−Gln−Leu−Ser−Ala−A
rg−Lys−Leu−Leu−Gln−D−Glu−Ile−Nle−Ser−Ar
g−NH2 で示される〔D−Glu25,Nle27〕−hpGRF(1−29)−N
H2の合成を、参考例2に述べたように、Beckman990ペプ
チド合成機を用いて、MBHA樹脂上で段階的に行なつた。
TLCおよびHPLCにより、このペプチドは、おおむね純粋
であることが確認された。
yr−Arg−Lys−Val−Leu−Gly−Gln−Leu−Ser−Ala−A
rg−Lys−Leu−Leu−Gln−D−Glu−Ile−Nle−Ser−Ar
g−NH2 で示される〔D−Glu25,Nle27〕−hpGRF(1−29)−N
H2の合成を、参考例2に述べたように、Beckman990ペプ
チド合成機を用いて、MBHA樹脂上で段階的に行なつた。
TLCおよびHPLCにより、このペプチドは、おおむね純粋
であることが確認された。
実施例11 次式、 H−His−Ala−Asp−Ala−Ile−Phe−Thr−Ser−Ser−T
yr−Arg−Arg−Ile−Leu−Gly−Gln−Leu−Tyr−Ala−A
rg−Lys−Leu−Leu−His−D−Glu−Ile−Nle−Asn−Ar
g−NH2 で示される〔D−Glu25,Nle27〕−rGRF(1−29)−NH
2の合成を、参考例2に述べたように、Beckman990ペプ
チド合成機を用いて、MBHA樹脂上で段階的に行なつた。
TLCおよびHPLCにより、このペプチドは、おおむね純粋
であることが確認された。
yr−Arg−Arg−Ile−Leu−Gly−Gln−Leu−Tyr−Ala−A
rg−Lys−Leu−Leu−His−D−Glu−Ile−Nle−Asn−Ar
g−NH2 で示される〔D−Glu25,Nle27〕−rGRF(1−29)−NH
2の合成を、参考例2に述べたように、Beckman990ペプ
チド合成機を用いて、MBHA樹脂上で段階的に行なつた。
TLCおよびHPLCにより、このペプチドは、おおむね純粋
であることが確認された。
参考例8 次式、 H−D−Tyr−Ala−Asp−Ala−Ile−Phe−Thr−Asn−Se
r−Tyr−Arg−Lys−Val−Leu−Gly−Gln−Leu−Ser−Al
a−Arg−Lys−Leu−D−Leu−Gln−Asp−Ile−Met−Ser
−Arg−Gln−Gln−Gly−Glu−Arg−Asn−Gln−Glu−Gln
−Gly−Ala−Arg−Val−Arg−Leu−NH2 で示される〔D−Tyr1,D−Leu23〕−pGRF(1−44)NH2
の合成を、Valeらの米国特許第4,292,313号明細書に一
般的に説明されているように、Beckman990ペプチド合成
機を用いて、MBHA樹脂上で段階的に行なつた。TLCおよ
びHPLCにより、このペプチドは、おおむね純粋であるこ
とが確認された。
r−Tyr−Arg−Lys−Val−Leu−Gly−Gln−Leu−Ser−Al
a−Arg−Lys−Leu−D−Leu−Gln−Asp−Ile−Met−Ser
−Arg−Gln−Gln−Gly−Glu−Arg−Asn−Gln−Glu−Gln
−Gly−Ala−Arg−Val−Arg−Leu−NH2 で示される〔D−Tyr1,D−Leu23〕−pGRF(1−44)NH2
の合成を、Valeらの米国特許第4,292,313号明細書に一
般的に説明されているように、Beckman990ペプチド合成
機を用いて、MBHA樹脂上で段階的に行なつた。TLCおよ
びHPLCにより、このペプチドは、おおむね純粋であるこ
とが確認された。
参考例9 次式、 H−D−His−Ala−Asp−Ala−Ile−Phe−Thr−Ser−Se
r−Tyr−Arg−Arg−Ile−Leu−Gly−Gln−D−Leu−Tyr
−Ala−Arg−Lys−Leu−D−Leu−His−D−Gln−Ile−
Nle−Asn−Arg−Gln−Gln−Gly−Glu−Arg−Asn−Gln−
Glu−Gln−Arg−Ser−Arg−Phe−Asn−OH で示される〔D−His1,D−Leu17,23,D−Glu25,Nle27〕
−rGRF(1−43)−OHの合成を、参考例1に述べたよう
に、Beckman990ペプチド合成機を用いて、クロルメチル
化樹脂上で段階的に行なつた。TLCおよびHPLCにより、
このペプチドは、おおむね純粋であることが確認され
た。
r−Tyr−Arg−Arg−Ile−Leu−Gly−Gln−D−Leu−Tyr
−Ala−Arg−Lys−Leu−D−Leu−His−D−Gln−Ile−
Nle−Asn−Arg−Gln−Gln−Gly−Glu−Arg−Asn−Gln−
Glu−Gln−Arg−Ser−Arg−Phe−Asn−OH で示される〔D−His1,D−Leu17,23,D−Glu25,Nle27〕
−rGRF(1−43)−OHの合成を、参考例1に述べたよう
に、Beckman990ペプチド合成機を用いて、クロルメチル
化樹脂上で段階的に行なつた。TLCおよびHPLCにより、
このペプチドは、おおむね純粋であることが確認され
た。
実施例12 次式、 H−Tyr−D−Ala−Asp−Ala−Ile−Phe−Thr−Asn−Se
r−Tyr−Arg−Lys−Val−Leu−Gly−Gln−D−Leu−Ser
−Ala−Arg−Lys−Leu−D−Leu−Gln−D−Asp−Ile−
Met−Ser−Arg−Gln−Gln−Gly−NH2 で示される〔D−Ala2,D−Leu17,23,D−Asp25〕−hpGRF
(1−32)−NH2の合成を、参考例2に述べたように、B
eckman990ペプチド合成機を用いて、MBHA樹脂上で段階
的に行なつた。TLCおよびHPLCにより、このペプチド
は、おおむね純粋であることが確認された。
r−Tyr−Arg−Lys−Val−Leu−Gly−Gln−D−Leu−Ser
−Ala−Arg−Lys−Leu−D−Leu−Gln−D−Asp−Ile−
Met−Ser−Arg−Gln−Gln−Gly−NH2 で示される〔D−Ala2,D−Leu17,23,D−Asp25〕−hpGRF
(1−32)−NH2の合成を、参考例2に述べたように、B
eckman990ペプチド合成機を用いて、MBHA樹脂上で段階
的に行なつた。TLCおよびHPLCにより、このペプチド
は、おおむね純粋であることが確認された。
実施例13 次式、 H−D−Tyr−D−Ala−D−Asp−Ala−Ile−Phe−Thr
−D−Asn−Ser−D−Tyr−Arg−Lys−Val−Leu−D−A
la−Gln−D−Leu−Ser−Ala−Arg−Lys−Leu−D−Leu
−Gln−D−Asp−Ile−D−Met−Ser−Arg−NH2 で示される〔D−Tyr1,D−Ala2,D−Asp3,D−Asn8,D−Ty
r10,D−Ala15,D−Leu17,23,D−Asp25,D−Met27〕−hpGR
F(1−29)−NH2の合成を、参考例2に述べたように、
Beckman990ペプチド合成機を用いて、MBHA樹脂上で段階
的に行なつた。TLCおよびHPLCにより、このペプチド
は、おおむね純粋であることが確認された。
−D−Asn−Ser−D−Tyr−Arg−Lys−Val−Leu−D−A
la−Gln−D−Leu−Ser−Ala−Arg−Lys−Leu−D−Leu
−Gln−D−Asp−Ile−D−Met−Ser−Arg−NH2 で示される〔D−Tyr1,D−Ala2,D−Asp3,D−Asn8,D−Ty
r10,D−Ala15,D−Leu17,23,D−Asp25,D−Met27〕−hpGR
F(1−29)−NH2の合成を、参考例2に述べたように、
Beckman990ペプチド合成機を用いて、MBHA樹脂上で段階
的に行なつた。TLCおよびHPLCにより、このペプチド
は、おおむね純粋であることが確認された。
参考例10 次式、 H−D−His−Ala−Asp−Ala−Ile−Phe−Thr−D−Ser
−Ser−Tyr−Arg−Arg−Ile−Leu−Gly−Gln−Leu−Tyr
−Ala−Arg−Lys−Leu−D−Leu−His−Glu−Ile−Nle
−Asn−Arg−Gln−Gln−Gly−Glu−Arg−Asn−Gln−Glu
−Gln−Arg−Ser−Arg−Phe−Asn−OH で示される〔D−His1,D−Ser8,D−Leu23,Nle27〕−rG
RF(1−43)−OHの合成を、参考例1に述べたように、
Beckman990ペプチド合成機を用いて、クロルメチル化樹
脂上で段階的に行なつた。TLCおよびHPLCにより、この
ペプチドは、おおむね純粋であることが確認された。
−Ser−Tyr−Arg−Arg−Ile−Leu−Gly−Gln−Leu−Tyr
−Ala−Arg−Lys−Leu−D−Leu−His−Glu−Ile−Nle
−Asn−Arg−Gln−Gln−Gly−Glu−Arg−Asn−Gln−Glu
−Gln−Arg−Ser−Arg−Phe−Asn−OH で示される〔D−His1,D−Ser8,D−Leu23,Nle27〕−rG
RF(1−43)−OHの合成を、参考例1に述べたように、
Beckman990ペプチド合成機を用いて、クロルメチル化樹
脂上で段階的に行なつた。TLCおよびHPLCにより、この
ペプチドは、おおむね純粋であることが確認された。
実施例14 次式、 NαMeTyr−Ala−Asp−Ala−Ile−Phe−Thr−Ser−Ser
−Tyr−Arg−Arg−Ile−Leu−Gly−Gln−Leu−Tyr−Ala
−Arg−Lys−Leu−Leu−His−D−Glu−Ile−Met−Asn
−Arg−NH2 で示されるrGRF類似体断片、即ち、〔NαMeTyr1,D−Gl
u25〕−rGRF(1−29)−NH2の合成を、参考例2に述べ
たように、Beckman990ペプチド合成機を用いて、MBHA樹
脂上で段階的に行なつた。TLCおよびHPLCにより、この
ペプチドは、おおむね純粋であることが確認された。
−Tyr−Arg−Arg−Ile−Leu−Gly−Gln−Leu−Tyr−Ala
−Arg−Lys−Leu−Leu−His−D−Glu−Ile−Met−Asn
−Arg−NH2 で示されるrGRF類似体断片、即ち、〔NαMeTyr1,D−Gl
u25〕−rGRF(1−29)−NH2の合成を、参考例2に述べ
たように、Beckman990ペプチド合成機を用いて、MBHA樹
脂上で段階的に行なつた。TLCおよびHPLCにより、この
ペプチドは、おおむね純粋であることが確認された。
参考例11 次式、 H−CαMeLeu−Ala−Asp−Ala−Ile−Phe−Thr−Ser−
Ser−Tyr−Arg−Arg−Ile−Leu−Gly−Gln−Leu−Tyr−
Ala−Arg−Lys−Leu−D−Leu−His−D−Glu−Ile−Nl
e−Asn−Arg−Gln−Gln−Gly−Glu−Arg−Asn−Gln−Gl
u−Gln−Arg−Ser−Arg−Phe−Asn−Val−NH2 で示される〔CαMeLeu1,D−Leu23,D−Glu25,Nle27〕
−rGRF−〔Val44〕−NH2の合成を、参考例2に述べたよ
うに、Beckman990ペプチド合成機を用いて、MBHA樹脂上
で段階的に行なつた。TLCおよびHPLCにより、このペプ
チドは、おおむね純粋であることが確認された。
Ser−Tyr−Arg−Arg−Ile−Leu−Gly−Gln−Leu−Tyr−
Ala−Arg−Lys−Leu−D−Leu−His−D−Glu−Ile−Nl
e−Asn−Arg−Gln−Gln−Gly−Glu−Arg−Asn−Gln−Gl
u−Gln−Arg−Ser−Arg−Phe−Asn−Val−NH2 で示される〔CαMeLeu1,D−Leu23,D−Glu25,Nle27〕
−rGRF−〔Val44〕−NH2の合成を、参考例2に述べたよ
うに、Beckman990ペプチド合成機を用いて、MBHA樹脂上
で段階的に行なつた。TLCおよびHPLCにより、このペプ
チドは、おおむね純粋であることが確認された。
実施例で製造した様々な合成ペプチドを試験管内検定に
より合成hpGRF(1−40)−OHと比較し、そして、この
合成ペプチドは全て、GHの分泌について一層高い効力を
示し、そして、同等の固有活性を有することが発見され
た。
より合成hpGRF(1−40)−OHと比較し、そして、この
合成ペプチドは全て、GHの分泌について一層高い効力を
示し、そして、同等の固有活性を有することが発見され
た。
成長ホルモンの放出を促進するペプチドの有効性を判定
するため、標準物質として合成hpGRF(1−40)−OHを
用いて、当モル濃度のその他の様々な合成類似体および
断片との密接な比較のもとに試験管内検定をおこなつ
た。試験管内検定は以下のようにして行った。250gの雄
スプラグドーリーラットから下垂体細胞を摘出し、多穴
プレート中で2%ウシ胎児血清を補充したβ−PJ培地で
3〜5日間単層培養した。この細胞を洗浄し、0.1%BSA
および2.5×10-4Mアスコルビン酸を含むβ−PJ培地
で、種々の濃度の被験ペプチドとともに4時間インキュ
ベートした。培養上清中のGHレベルをRIAにより測定
し、分泌されたGH濃度を決定した。
するため、標準物質として合成hpGRF(1−40)−OHを
用いて、当モル濃度のその他の様々な合成類似体および
断片との密接な比較のもとに試験管内検定をおこなつ
た。試験管内検定は以下のようにして行った。250gの雄
スプラグドーリーラットから下垂体細胞を摘出し、多穴
プレート中で2%ウシ胎児血清を補充したβ−PJ培地で
3〜5日間単層培養した。この細胞を洗浄し、0.1%BSA
および2.5×10-4Mアスコルビン酸を含むβ−PJ培地
で、種々の濃度の被験ペプチドとともに4時間インキュ
ベートした。培養上清中のGHレベルをRIAにより測定
し、分泌されたGH濃度を決定した。
等モル濃度で行なわれたこの比較試験の結果を下記の表
Iに示す。
Iに示す。
これらの合成ペプチドの試験管内試験により、これらの
ペプチドは各々hpGRF(1−40)−OHの完全な固有生物
活性を有することが示された。〔D−Leu23,Nle27〕−
hpGRF−(1−29)−NH2の最大有効濃度は約1ナノモル
である。
ペプチドは各々hpGRF(1−40)−OHの完全な固有生物
活性を有することが示された。〔D−Leu23,Nle27〕−
hpGRF−(1−29)−NH2の最大有効濃度は約1ナノモル
である。
生長ホルモンの分泌に関する試験管内試験の他に、生体
内試験も行なつた。生体内試験は以下のようにして行っ
た。230〜250gの雄のスプラグドーリーラットを検定の
2時間前にウレタンで麻酔した(150〜200mg/100g体
重、ip)。最初の血液サンプル(0.3nl)を頸静脈から
採取した後、速やかに試験物質を注入した(0.1%BSA、
0.01%アスコルビン酸/生理食塩水で希釈)。血液サン
プルを一定時間ごとに採取した。血液は、EDTA(60mg/m
l20l/ml)を含む試験管に集め、氷上に置き、60分以内
に遠心して分離した血清を凍結した。RIAによりGHレベ
ルを測定した。
内試験も行なつた。生体内試験は以下のようにして行っ
た。230〜250gの雄のスプラグドーリーラットを検定の
2時間前にウレタンで麻酔した(150〜200mg/100g体
重、ip)。最初の血液サンプル(0.3nl)を頸静脈から
採取した後、速やかに試験物質を注入した(0.1%BSA、
0.01%アスコルビン酸/生理食塩水で希釈)。血液サン
プルを一定時間ごとに採取した。血液は、EDTA(60mg/m
l20l/ml)を含む試験管に集め、氷上に置き、60分以内
に遠心して分離した血清を凍結した。RIAによりGHレベ
ルを測定した。
すべての検定において、対照(ビークル)、3〜5種類
の用量の標準(hpGRF−40)および被験GRF類似体を用い
た。それぞれについて、5〜6匹のラットに投与した。
の用量の標準(hpGRF−40)および被験GRF類似体を用い
た。それぞれについて、5〜6匹のラットに投与した。
本発明のペプチドの生体内における有効時間を下記の表
1に示す。
1に示す。
その結果を下記の表1に示す。本発明のペプチドは下垂
体GHの分泌を刺激する強力な刺激剤であること、およ
び、rGRF(1−29)−NH2およびhpGRF(1−32)−NH2
よりも相当長い有効期間を有することが判明した。GHの
分泌を検出するのに有効なことが知られているその他の
公知のGRFを生体内試験に使用し、この結果を確認し
た。体重1kgあたりこのペプチド約100ナノグラム〜約50
μgの投与量はGH分泌をおこさせるのに有効であると思
われる。
体GHの分泌を刺激する強力な刺激剤であること、およ
び、rGRF(1−29)−NH2およびhpGRF(1−32)−NH2
よりも相当長い有効期間を有することが判明した。GHの
分泌を検出するのに有効なことが知られているその他の
公知のGRFを生体内試験に使用し、この結果を確認し
た。体重1kgあたりこのペプチド約100ナノグラム〜約50
μgの投与量はGH分泌をおこさせるのに有効であると思
われる。
このような合成hpGRF類似体および多分rGRFならびにpGR
F類似体類は、医者がGH産生量を高める必要があると考
えるヒトに投与するのに有用である。このような類似体
によるGH分泌の刺激は外生GRFの生産不足によりひきお
こされた完全な、または、相対的なGH欠如を有するヒト
に著効を示す。更に、GH分泌量の増大およびそれに付随
する生長増大は正常なGHレベルのヒトまたは動物におい
てもおこるだろうと思われる。また、投与により脂肪含
量が変更され、そして、その他のGH−依存性代謝、免疫
および生殖過程も変化される。例えば、これらの類似体
は火傷の治療中のヒトの蛋白同化作用を刺激する手段と
して有用である。その他の例としては、これらの類似体
類はニワトリ、七面鳥、ブタ、ヤギ、ウシおよびヒツジ
のような商業的温血動物に投与することもでき、また、
魚類およびその他の冷血水棲動物(例えば、海ガメ、お
よびウナギ)の養殖にも使用できる。斯くして、有効量
のペプチドを投与することによつて蛋白質対脂肪の比率
を高め、生長を促進させることができる。
F類似体類は、医者がGH産生量を高める必要があると考
えるヒトに投与するのに有用である。このような類似体
によるGH分泌の刺激は外生GRFの生産不足によりひきお
こされた完全な、または、相対的なGH欠如を有するヒト
に著効を示す。更に、GH分泌量の増大およびそれに付随
する生長増大は正常なGHレベルのヒトまたは動物におい
てもおこるだろうと思われる。また、投与により脂肪含
量が変更され、そして、その他のGH−依存性代謝、免疫
および生殖過程も変化される。例えば、これらの類似体
は火傷の治療中のヒトの蛋白同化作用を刺激する手段と
して有用である。その他の例としては、これらの類似体
類はニワトリ、七面鳥、ブタ、ヤギ、ウシおよびヒツジ
のような商業的温血動物に投与することもでき、また、
魚類およびその他の冷血水棲動物(例えば、海ガメ、お
よびウナギ)の養殖にも使用できる。斯くして、有効量
のペプチドを投与することによつて蛋白質対脂肪の比率
を高め、生長を促進させることができる。
これらの合成ペプチドはヒトに投与するためには少なく
とも93%好ましくは少なくとも98%の純度をもたなけれ
ばならない。この純度は、目的とするペプチドが存在す
る類似ペプチドおよびペプチド断片すべてのうちで上記
の重量%を構成しなければならないことを意味する。生
長を促進させ、そして、脂肪含量を低下させるためにこ
れらの合成ペプチドを商業的動物およびその他の動物に
投与する場合には、約5%低度の低純度あるいは更に、
0.01%程度の低純度であつてもかまわない。
とも93%好ましくは少なくとも98%の純度をもたなけれ
ばならない。この純度は、目的とするペプチドが存在す
る類似ペプチドおよびペプチド断片すべてのうちで上記
の重量%を構成しなければならないことを意味する。生
長を促進させ、そして、脂肪含量を低下させるためにこ
れらの合成ペプチドを商業的動物およびその他の動物に
投与する場合には、約5%低度の低純度あるいは更に、
0.01%程度の低純度であつてもかまわない。
これらの合成ペプチドまたはその無毒性塩を、薬剤組成
物を形成する薬剤学的にまたは獣医薬的に受容できるキ
ヤリヤーと組み合わせてヒトを含む哺乳動物に静脈内、
皮下、筋肉内、経皮(例えば経鼻腔)または経口的に投
与することができる。この投与は、治療されるべき受容
者がこの種の治療を必要とする場合に、成長ホルモンの
放出を刺激するために医師により採用することができ
る。必要な用量は治療される特定の状態、状態の重症
度、および目的とする治療の期間に応じて変わるであろ
う。
物を形成する薬剤学的にまたは獣医薬的に受容できるキ
ヤリヤーと組み合わせてヒトを含む哺乳動物に静脈内、
皮下、筋肉内、経皮(例えば経鼻腔)または経口的に投
与することができる。この投与は、治療されるべき受容
者がこの種の治療を必要とする場合に、成長ホルモンの
放出を刺激するために医師により採用することができ
る。必要な用量は治療される特定の状態、状態の重症
度、および目的とする治療の期間に応じて変わるであろ
う。
この種のペプチドはしばしば、無毒性の塩たとえば酸付
加塩、またはたとえば亜鉛、鉄などとの金属錯体(これ
らは本発明の目的のための塩と考えられる)の形で投与
される。この種の酸付加塩の具体例は塩酸塩、臭化水素
酸塩、硫酸塩、リン酸塩、マレイン酸塩、酢酸塩、クエ
ン酸塩、安息香酸塩、コハク酸塩、リンゴ酸塩、アスコ
ルビン酸塩、酒石酸塩などである。活性成分を錠剤の形
で経口投与すべきである場合、錠剤には結合剤、たとえ
ばトラガカント、コーンスターチもしくはゼラチン;崩
壊剤、たとえばアルギン酸;および滑沢剤、たとえばス
テアリン酸マグネシウムが含有されていてもよい。液状
での投与を希望する場合、甘味剤および/または香味剤
を用いてもよく、等張食塩液、リン酸塩緩衝液などに入
れて静脈内投与することも行われる。
加塩、またはたとえば亜鉛、鉄などとの金属錯体(これ
らは本発明の目的のための塩と考えられる)の形で投与
される。この種の酸付加塩の具体例は塩酸塩、臭化水素
酸塩、硫酸塩、リン酸塩、マレイン酸塩、酢酸塩、クエ
ン酸塩、安息香酸塩、コハク酸塩、リンゴ酸塩、アスコ
ルビン酸塩、酒石酸塩などである。活性成分を錠剤の形
で経口投与すべきである場合、錠剤には結合剤、たとえ
ばトラガカント、コーンスターチもしくはゼラチン;崩
壊剤、たとえばアルギン酸;および滑沢剤、たとえばス
テアリン酸マグネシウムが含有されていてもよい。液状
での投与を希望する場合、甘味剤および/または香味剤
を用いてもよく、等張食塩液、リン酸塩緩衝液などに入
れて静脈内投与することも行われる。
これらのペプチドは医師の指導のもとにヒトに投与され
るべきであり、薬剤組成物は通常はペプチドを、慣用さ
れる薬剤学的に受容できる常用の固体または液体キヤリ
ヤーと共に含有するのであろう。通常、非経口投与量は
受容者の体重1kg当たりペプチド約100ナノグラム〜約50
μgであろう。
るべきであり、薬剤組成物は通常はペプチドを、慣用さ
れる薬剤学的に受容できる常用の固体または液体キヤリ
ヤーと共に含有するのであろう。通常、非経口投与量は
受容者の体重1kg当たりペプチド約100ナノグラム〜約50
μgであろう。
本発明者らに現在知られている最良の形態を構成する好
ましい実施態様に関して本発明を記述したが、特許請求
の範囲に示した本発明の範囲を逸脱することなく当業者
に明らかな各種の変更および修正を行うことができると
解すべきである。たとえばペプチド鎖における変更、特
にペプチドのカルボキシ末端に始まる削除を今日既知の
実験慣例に従つて行い、ペプチドの生物学的効力のすべ
てまたはきわめて実質的な部分を保持するペプチドまた
はペプチド断片を製造することができ、これらのペプチ
ドは本発明の範囲内にあると考えられる。さらにいずれ
かの末端もしくは両末端に付加を行い、および/または
一般にペプチド化学の全般的技術において周知のように
天然残基の代わりに一般的に等しい残基を用いて、本発
明の範囲から逸脱することなく特許請求の範囲に記載さ
れたポリペプチドの効力の少なくとも実質的な部分をも
つ同族体を製造することができる。
ましい実施態様に関して本発明を記述したが、特許請求
の範囲に示した本発明の範囲を逸脱することなく当業者
に明らかな各種の変更および修正を行うことができると
解すべきである。たとえばペプチド鎖における変更、特
にペプチドのカルボキシ末端に始まる削除を今日既知の
実験慣例に従つて行い、ペプチドの生物学的効力のすべ
てまたはきわめて実質的な部分を保持するペプチドまた
はペプチド断片を製造することができ、これらのペプチ
ドは本発明の範囲内にあると考えられる。さらにいずれ
かの末端もしくは両末端に付加を行い、および/または
一般にペプチド化学の全般的技術において周知のように
天然残基の代わりに一般的に等しい残基を用いて、本発
明の範囲から逸脱することなく特許請求の範囲に記載さ
れたポリペプチドの効力の少なくとも実質的な部分をも
つ同族体を製造することができる。
フロントページの続き (56)参考文献 Nature (London),300 (5889),P.276−278(1982)
Claims (8)
- 【請求項1】次式で示される合成ペプチドまたはその非
毒性塩: R1−Ala−Asp−Ala−Ile−Phe−Thr−R8−Ser−Tyr−Ar
g−R12−R13−Leu−Gly−Gln−R17−R18−Ala−Arg−Ly
s−Leu−R23−R24−R25−Ile−R27−R28−Arg−Gln−Gl
n−Gly−Y [式中、R1はTyr、NαMePhe、NαMeTyr、CαMe(4C
l)PheまたはHis;R8はSerまたはAsn;R12はArgまたはLy
s;R13はIleまたはValであり;R17はLeuまたはD−Leu;R
18はTyrまたはSer;R24はHisまたはGln;R25はGlu、Aspま
たはD−Glu;R27はMetまたはNle;R28はAsnまたはSer;Y
はNH2またはNHCH2CH3である;ただし(a)R1はCαMe
またはNαMe置換基を有するか、または(b)R17およ
び/またはR23はD−Leuであるか、もしくは(c)R25
はD−Gluであり、また、C末端から1〜4個の残基は
削除されていてもよい]。 - 【請求項2】R25はD−Gluである、特許請求の範囲第1
項に記載のペプチド。 - 【請求項3】R23はD−Leuである、特許請求の範囲第1
項または2項に記載のペプチド。 - 【請求項4】R17はD−Leuである、特許請求の範囲第1
項、2項または3項に記載のペプチド。 - 【請求項5】R27はNleである、特許請求の範囲第1項、
2項、3項または4項に記載のペプチド。 - 【請求項6】R17はLeuであり、R23はD−Leuであり、R
25はGluであり、R27はNleであり、そして、R30〜R33残
基は除去されている、特許請求の範囲第1項に記載のペ
プチド。 - 【請求項7】R1はHisであり、R8はSerであり、R12はArg
であり、R13はIleであり、R18はTyrであり、R24はHisで
あり、そして、R28はAsnである、特許請求の範囲第1項
に記載のペプチド。 - 【請求項8】R1はCαMeまたはNαMe置換基を有する特
許請求の範囲第1項〜第5項のいずれかに記載のペプチ
ド。
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US545094 | 1983-10-25 | ||
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CA1271600A (en) * | 1985-01-07 | 1990-07-10 | David Howard Coy | Growth hormone-releasing peptides and method of treating mammals therewith |
EP0193910A3 (en) * | 1985-03-06 | 1988-11-23 | Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited | Synthesis of a derivative of grf and intermediate peptides |
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ES2001203A6 (es) * | 1985-08-12 | 1988-05-01 | Syntex Inc | Procedimiento para preparar el polipeptido factor liberador de la hormona del crecimiento bovina |
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