KR0163033B1 - Grf 유사체 viia - Google Patents
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Abstract
본 발명은 사람을 포함한 동물에서 뇌하수체 GH의 분비를 자극하는데 극히 효능이 있고 또한 체내에서 효소의 분해를 견디는 합성 팹티드를 제공하는 것이다.
펩티드는 다음 서열을 갖는다.
(B) R1- R2- R3- Ala-(Q1)R5- Phe- Thr- R8- Ser- (Q2)R10- Arg- R12- (Q3)R13- Leu- R15- Gln- (Q4)Leu- R18- (Q5)Ala- Arg- R21- (Q6)R22- (Q7)Leu- R24- R25- (Q8)R26- (Q9)R27- R28- Arg- Gln- Gln- Gly- Glu- R34- Asn- Gln- Glu- R38- R39- R40- Arg- R42- R43- R44(식에서, R1은 Tyr, D-Tyr, Met, Phe, D-Phe, pCl-Phe, Leu, His 또는 D-His;B는 H, CaMe, NaMe, 데스아미노, Ac 또는 For; R2는 Ala, D-Ala NMA 또는 D-NMA;R3은 Asp 또는 D-Asp; R5는 Ile 또는 Leu; R8은 Ser, Ans, Lys, Arg, Asp 또는 Glu; R10은 Tyr, D-Tyr 또는 Phe; R12는 Arg 또는 Lys; R13은 Ile, Val, Leu 또는 Ala;R15는 Gly 또는 Ala; R18는 Ser 또는 Tyr; R21은 Lys, D-Lys, Arg또는 D-Arg; R22는 Leu, Ile, Ala 또는 Val;R24는 Gln 또는 His ; R25는 Asp 또는 Glu;R26은 Ile또는 Leu;R27은 Met,D-Met,Ala,Nle,Ile,Leu,Nva 또는 Val;R28는 Asn또는 Ser;R34는 Ser또는 Arg;R38는 Arg 또는 Gln;R39는 Gly또는 Arg;R40은 Ala또는 Ser;R42는 Phe,Ala 또는 Val; R43은 Asn 또는 Arg;R44는 천연아미노산;Q1-Q9는 H 나 CaMe이며, 단, Q1,Q4,Q7,Q8및 Q9중 하나 이상은 CaMe이다. 이러한 펩티드는 또한 진단용으로 사용될수 있고, C-말단은 잔기 29까지 짧아질 수 있다)
Description
[발명의 명칭]
GRF유사체 VIIA
[발명의 상세한 설명]
본 발명은 사람 및 다른 동물에서 뇌하수체의 기능에 영향을 미치는 펩티드에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 뇌하수체에 의한 성장 호르몬 분비를 촉진시키는 펩티드에 관한 것이다.
[발명의 배경]
생리학자들은 시상하부가 각 놔하수체 호르몬의 분비를 자극하거나 억제하는 시상하부 생성의 특유 물질로 뇌하수체 선부의 분비 기능을 조절한다는 것을 오랫동안 인지해 왔다. 시상하부의 억제 인자는 성장 호르몬(GH)의 분비를 억제하는 소마토스타틴(somotostatin) 형태로 1972년에 규명되었다. 1982년에는, 사람 췌장(종양)의 방출 인자(hpGRF)를 사람췌장의 종양 추출물로부터 분리하고, 정제하고, 특성을 규명하고, 합성 및 시험하였는데, 이는 뇌하수체에 의한 GH의 분비를 촉진시키는 것으로 밝혀졌다. 이러한 뇌하수체 기능 자극 인자는 전체 합성에 의해 만들어졌고, 천연 구조의 유사체도 합성되었다. 사람 시상 하부의 GH 방출 인자도 정확히 같은 구조를 가지므로 hGRF가 이하에서 사용된다.
[발명의 요약]
현재 합성 폴리펩티드가 합성되었으며, 배양된 뇌하수체 세포로부터 GH를 분비시키고, 체내에서 효소적 분해에 대해 증가된 저항성을 가지며 매우 실질적으로 증가된 효능을 보이는 것으로 시험되었다. 이러한 장점은 알파 나선 형태의 증가된 안정성을 갖는 펩티드로부터 기인하는데, 이 펩티드는 하나 이상의 위치 5, 17, 23, 26 및 27에서, 알파 탄소 원자(CaMe)상에서 메틸기로 치환된 하나 이상의 잔기를 가지며, 바람직하게는 수 개의 잔기가 이렇게 치환된다. 메탈기로 치환된 알파 탄소 원자를 갖는 Ala는 약어 CMA 또는 Aib(아미노-이소부틸산)로 표시되는 반면 메틸기로 치환된 알파 탄소 원자를 갖는 Leu은 CML로 표시한다.
전술한 것 뿐 아니라, 본 펩티드는 천연 호르몬에서 발견된 여러 잔기에 대한 다른 치환을 포함할 수 있다. 예컨대, D-Ala, NaCH3-D-Ala(D-NMA) 또는 NMA는 2-위치에서 치환될 수 있다. CaMeLeu(CML) 또는 Nle는 바람직하게 Met 대신 27-위치에 존재하나; D-Met 또는 Nva 또는 다른 잔기들도 존재할 수 있다. 또한 본 펩티드는 1-위치에 다음의 잔기 중 하나를 가질 수 있다. Tyr, D-Tyr, Met, Phe, D-Phe, pCl-Phe, Leu, His 및 D-His, 이 잔기는 알파 탄소 또는 알파 아미노기에서의 임의로 메틸 치환될 수 있거나, 알파 아미노기는 삭제될 수 있고(desamino), 또한 이 잔기는 알파 아미노기가, 바람직하게는 아세틸(Ac)이나 포르밀(For)에 의해 아실화될 수 있다. 본 펩티드는 당분야에서 공지된 바의 다른 치환, 예컨대, 3-위치에서 D-Asp 및/또는 12-위치에서 Arg 및/또는 10-위치에서 Phe 또는 D-Tyr 및/또는 15-위치에서 Ala 및/또는 28-위치에서 Asn을 임의로 함유할 수 있다.
본 발명에 따라 제약 조성물은 제약학적으로 또는 수의학적으로 허용 가능한 액체 또는 고체 담체에 분산된, 길이가 약 29 내지 44 잔기인 상기 유사체 또는 이들의 임의의 무독성염을 포함한다. 이러한 제약 조성물은 사람과 동물의 치료 목적을 위한 투여를 위해 임상 약품으로 및 진단 목적으로 사용될 수 있다. 또한, 이들은 가금을 포함한 항은 동물의 성장을 촉진시키기 위해서 수경법으로 사용될 수 있다.
[발명의 상세한 설명]
펩티드를 정의하기 위해 사용되는 명명법은, Schroder와 Lubke, The Peptides, Academic Press (1965)에 상술되어 있으며, 여기에서 통상적인 표현법에 따라 N-말단의 아미노기는 왼쪽에 나타내고 C-말단의 카르복실기는 오른쪽에 나타낸다. 천연 아미노산이란, Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Thr, Lys, Arg, Asp, Asn, Glu, Gln, Cys, Met, Phe, Tyr, Pro, Trp 및 His로 구성되는, 단백질에서 발견되는 일반적인 천연적으로 존재하는 아미노산 중 하나를 의미한다. Nle는 노르류신을 의미하고, Nva는 노르발린을 의미한다. 아미노산 잔기가 이성질체 형태일 때, 달리 특별히 표시하지 않는 한 아미노산의 L형태를 나타낸다. D-NNA는 알파 아미노기가 메틸로 치환되는 알라닌의 D 이성질체를 표시한다.
일반적으로 본 발명은 다음 서열(I)을 갖는 합성 펩티드를 제공한다: (B)R1-R2-R3-Ala-(Q1)R5-Phe-Thr-R8-Ser-(Q2)R10-Arg-R12-(Q3)R13-Leu-R15-Gln-(Q4)Leu-R18-(Q5)Ala-Arg-R21(Q6)R22-(Q7)Leu-R24-R25-(Q8)R26-(Q9)R26-(Q9)R27-R28-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-R34-Asn-Gln-Glu-R38-R39-R40-Arg-R42-R43-R44, 여기에서, R1은 Tyr, D-Tyr, Met, Phe, D-Phe, pCl-Phe, Leu, His 또는 D-His; B 는 H, CaMe, NaMe, 데스아미노, Ac 또는 For; R2는 Ala, D-Ala, NMA또는D-NMA; R3는 ASP또는 D-Asp; R5는 Ile 또는 Leu; R8은 Ser, Asn, Lys, Arg, Asp 또는 Glu; R10은 Tyr, D-Tyr또는 Phe; R12는 Arg 또는 Lys; R13은 Ile, Val, leu 또는 Ala;R15는 Gly 또는 Ala; R18은 Ser 또는 Tyr; R21은 Lys, D-Lys, Arg 또는 D-Arg; R22는 Leu, Ile, Ala또는 Val; R24는 Gln 또는 His; R25는 Asp 또는 Glu; R26은 Ile 또는 Leu; R27은 Met, D-Met, Ala, Nle, Ile, Leu, Nva 또는 Val; R28은 Asn 또는 Ser; R34는 Ser 또는 Arg; R38은 Arg 또는 Gln; R39는 Gly 또는 Arg; R40은 Ala 또는 Ser; R42는Phe, Ala 또는 Val; R43은 Asn 또는 Arg; R44는 천연 아미노산이고; Q1-Q9는 H 또는 CaMe이며, 단, R30과 R44사이의 모든 잔기 또는 이들의 임의의 서열은 C-말단에서 시작되어 삭제될 수 있고, 또한, Q1, Q4, Q7, Q8및 Q9중 하나 이상은 CaMe이다. 전술한 것의 바람직한 서브클래스에서, F5는 Ile, R18은 Ser, R24는 Gln, R25는 Asp, R26은 Ile, R34는 Ser, R38은 Arg, R39는 Gly 및 R40은 Ala이다. 펩티드가 위치-44 까지 연장되면, R44는 바람직하게는 Leu 또는 Val 이다.
다른 바람직한 서브클래스는 다음 서열을 갖는 펩티드이다:
(B)R1-R2-R3-Ala-(Q1)Ile-Phe-Thr-R8-Ser-(Q2)R10-Arg-R12-(Q3)R13-Leu-R15-Gln-(Q4)Leu-Ser-(Q5)Ala-Arg-R21-(Q6)R22-(Q7)Leu-Gln-Asp-(Q8)Ile-(Q9)R27-R28-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-R42-R43-R44,여기에서, R1은 Tyr, D-Tyr, Met, Phe, D-Phe, pCl-Phe, Leu, His 또는 D-His; B 는 H, CaMe, NaMe, 데스아미노, Ac 또는 For; R2는 Ala, D-Ala, NMA또는D-NMA; R3는 Asp 또는 D-Asp; R8은 Ser, Asn, Lys, Arg, Asp 또는 Gln; R10은 Tyr, D-Tyr 또는 Phe; R12는 Arg 또는 Lys; R13은 Ile, Val, Leu 또는 Ala; R15는 Gly 또는 Ala; R21은 Lys, D-Lys, Arg 또는 D-Arg; R22는 Leu, Ile, Ala또는 Val; R27은 Met, D-Met, Ala, Nle, Ile, Leu, Nva 또는 Val; R28은 Asn 또는 Ser; R42는 Phe, Ala 또는 Val; R43은 Asn 또는 Arg; R44는 천연 아미노산; Q1-Q9는 H 또는 CaMe 이며, 단, R30과 R44사이의 임의의 또는 모든 잔기는 C-말단에서 시작하는 서열에서 제거될 수 있고, 또한 Q1, Q4, Q7, Q8및 Q9중 하나 이상은 CaMe이다. 이러한 펩티드 중 어떤 것에서, C-말단에 있는 아미노산 잔기의 카르복실 부분은 다음 라디칼 중 하나가 될 수 있디: -COOR, -CRO, -CONHNHR, -CON(R)(R') 또는 -CH2OR이며, R과 R'은 저급 알킬, 플루오로 저급 알킬, 또는 수소이며; 메틸, 에틸 및 프로필이 바람직한 저급 알킬기이다. 바람직하게는, -CONHR이며, R은 H 또는 저급 알킬이다.
본 발명에 의해 제공되는 또 다른 펩티드의 바람직한 서브 클래스는 다음 식에 따른 것이다;
(B)R1-R2-Asp-Ala-(Q1)Ile-Phe-Thr-R8-Ser-(Q2)R10-Arg-R12-(Q3)R13-Leu-R15-Gln-(Q4)Leu-R18-(Q5)Ala-Arg-R21-(Q6)R22-(Q7)Leu-R24-R25-(Q8)R26-(Q9)R27-R28-Arg-Gln-Gln-Gly-Y, 여기에서, R1은 Tyr, D-Tyr, Phe, D-Phe, His 또는 D-His; B 는 H, CaMe, NaMe; R2는 Ala, D-Ala, NMA또는D-NMA; R8은 Ser, Asn, Lys, Arg, Asp 또는 Glu; R10은 Tyr, D-Tyr 또는 Phe; R12는 Arg 또는 Lys; R13은 Ile, Val, Leu 또는 Ala; R15는 Gly 또는 Ala;R18은 Ser 또는 Tyr; R21은 Lys, D-Lys, Arg 또는 D-Arg; R22는 Leu, Ile, Ala또는 Val; R24는 Gln 또는 His;R25는 Asp 또는 Glu;R27은 Met, Ala, Nle, Ile, Leu, Nva 또는 Val; R28은 Asn 또는 Ser; Y는, R이 H이거나 저급 알킬인 NHR; Q1-Q9는 H 또는 CaMe이며, 단, Gly, Gln- Gly 또는 Gln-Gln-Gly는 C-말단에서 삭제될 수 있고, 또한, Q1,Q4,Q7,Q8및 Q9중 하나 이상은 CaMe이다.
전술한 바와 같이, N-말단부터 잔기-29가지의 단편은 뇌하수체에 의해 GH를 방출시키는 작용의 생물학적 효능을 가지며, C-말단이 아미드 또는 치환 아미드를 갖는 생물학적으로 활성이 있는 길이 29 또는 32 잔기의 단편이 가장 바람직하다. 펩티드가 40 이상의 잔기를 가질 때는, C-말단 성분으로 뚜렷하게 좋은 것은 없다.
펩티드는 단독 고체상 기술, 부분 고체상 기술, 단편 축합 또는 용액 커플링과 같은 적당한 방법에 의해 합성된다. 예컨대, 단독 고체상 합성 기술은 교과서 Solid-Phase Peptide Synthesis, Stewart Young, Freeman Co., San Francisco, 1969에 상술되어 있고, Vale et al. 에게 1987년 8월 8일 특허한 미국특허 제 4,105,603호의 명세서에 예시되어 있다. 용액 합성은 보고서 Methoden der Organischen Chemic(Houben-wayl): Synthese von peptiden, E.Wunsch(저자)(1974) Georg Thieme Verlag, Stuttgart, W. Ger.에 상세히 기술되어 있다. 단편 축합 합성 방법은 미국특허 제 3,972,859호(1976.8.3)에 예시되어 있다. 이용할 수 있는 다른 합성법은 미국특허 3,842,067(1974.10.15)과 미국 특허 3,862,925(1975.1.28)에 예시되어 있다.
이러한 합성에서 공통적인 것은 각종 아미노산 성분의 불안정한 측쇄기를 적당한 보호기로 보호하여, 그 곳에서 화학반응이 일어나는 것을 방해하고 최종적으로는 제거하는 것이다. 또한 일반적으로 아미노산 또는 단편상의 알파-아미노기를 카르복실기에서 반응이 일어나는 동안 보호한 후 알파 아미노 보호기를 선택적으로 제거하여 그 위치에서 후속 반응이 일어나도록한다. 따라서, 합성의 단계로서, 각 아미노산 잔기가 펩티드 사슬에 원하는 서열에 위치해 있고 측쇄 보호기가 적절한 전기에 연결된 중간 화합물이 제조된다.
이 점에서, 본 발명은 일반식(II)의 중간물질을 생성한다.
X1-(B)R1(X 또는 X2)-R2-R3(X3)-Ala(Q1)R5-Phe-Thr(X4)-R8(X8)-Ser(X4)-(Q2)R10(X2)-Arg(X6)-R12(X6또는 X7)-(Q3)R13-Leu-R15-Gln(X5)-(Q4)Leu-R18(X2또는 X4)-(Q5)Ala-Arg(X6)-R21(X6또는 X7)-(Q6)R22-(Q7)Leu-R24(X5또는 X)-R25(X3)-(Q8)R26-(Q9)R27-R28(X4또는 X5)-Arg(X6)-Gln(X5)-Gln(X5)-Gly-Glu(X3)-R34(X4또는 X6)-Asn(X5)-Gln(X5)-Glu(X3)-R38(X6또는 X5)-R39(X6)-R40(X2)-Arg(X6)-R42-R43(X5또는 X6)-R44(X8)-X9, 여기에서, X1은 수소 또는 알파 아미노 보호기이다, X1으로 여겨지는 알파 아미노 보호기는 폴리 펩티드의 단계 합성 기술에 유용한 것으로 공지된 것들이다. X1으로서 사용될 수 있는 알파 아미노 보호기 중류 중 (1) 플루오레닐메틸옥시카르보닐(FMOC), 벤질옥시카르보닐(Z), 및 p-클로로벤질옥시카르보닐, p-니트로벤질옥시카르보닐, p-브로모벤질옥시카르보닐 및 p-메톡시벤질옥시카르보닐 같은 치환된 Z와 같은 방향족 우레탄형 보호기; (2)t-부틸옥시카르보닐(BOC), 디이소프로메틸옥시카르보닐, 이소프로필옥시카르보닐, 에톡시카르보닐, 알릴옥시카르보닐 같은 지방족 우레탄 보호기 및 (3)시클로펜틸옥시카르보닐, 아다만틸옥시카르보닐 및 시클로헥실옥시카르보닐 같은 시클로알킬 우레탄형 보호기이다. 바람직한 알파 아미노 보호기는, NaMe 치환 잔기가 1위치에서 사용될 BOC이며, 물론 B가 데스아미노일때 X1은 H이다.
X는 수소, 또는 Tos 같은 His의 이미다졸 질소에 대한 보호기이다.
X2는 테트라하이드로피라닐, 3급-부틸, 트리틸, Bzl, CBZ, 4Br-CBZ 및 2,6-디클로로벤질(DCB) 같은, Tyr의 페놀성 히드록실기에 대한 적당한 보호기일 수 있다. 바람직한 보호기는 2,6-디클로벤질이다. X2는 그 위치에서 아미노산 잔기상에 측쇄 보호기가 없는 것을 의미하는 수소일 수 있다.
X3는 수소, 또는 벤질(OBzl), 2,6-디클로로벤질, 메틸 및 에틸 같은 Asp 또는 Glu의 카르복실기에 대한 적당한 에스테르 형성 보호기이다.
X4는 아세틸, 벤조일, 3급-부틸, 트리틸, 테트라하이드로피라닐, Bzl, 2,6-디클로로벤질 및 CBZ 같은 Thr또는 Ser의 히드록실기에 대한 적당한 보호기일 수 있다. 바람직한 보호기는 Bzl이다. X4는 수소일 수 있으며, 이는 히드록실기 상에 보호기가 없는 것을 의미한다.
X5는 수소, 또는 Asn 또는 Gln의 측쇄 아미도기에 대한 적당한 보호기이다. 바라직하게는 크산틸(Xan)이다.
X6은 니트로, Tos, CBZ, 아다만틸옥시카르보닐, 및 BOC 같은 Arg의 구아니도기를 위한 적당한 보호기 또는 수소이다.
X7은 수소, 또는 Lys의 측쇄 아미노기를 위한 적당한 보호기이다. 적당한 측쇄 아미노 보호기의 예는 2-클로로벤질옥시카르보닐(2-Cl-Z), Tos, t-아밀옥시카르보닐 및 BOC이다.
X8은 수소 또는 일반적으로 전술한 바와 같은 적당한 측쇄 보호기이다.
Met는 임의로 산소에 의해 보호될 수는 있으나 바람직하게는 보호되지 않은채로 둔다.
측쇄 아미노 보호기의 선택은 일반적으로 합성하는 동안 알파 아미노기의 탈보호 동안 제거되지 않는 것이 선택되는 것을 제외하고는 중요하지 않다. 그러나, 어떤 아미노산, 예컨대 His을 위한 보호는 일반적으로 커플링이 완료된 후는 필요하지 않고, 보호기는 같을 수 있다.
X9는 에스테르 형성기 X3같은 C-말단 카르복실기에 대한 적당한 보호기이거나, 고체 수지 지지체에 연결하기 위한 고체상 합성에서 사용되는 고정 결합체이거나, C-말단의 잔기가 전술한 바와 같이 Y인 카르복실 성분인 경우 데스-X9이다. 고체수지 지지체가 사용될 때 구조식 -O-CH2-수지 지지체, -NH- 벤즈하이드릴아민(BHA) 수지 지지체 또는 -NH-파라메틸벤즈하이드릴아민(MBHA) 수지 지지체 같은 당 분야에서 공지된 임의의 것일 수 있다. 불포화 아미드를 원할 때는, BHA 또는 MBHA 수지를 사용하는 것이 바람직한데, 그 이유는 절단에 의해 직접 아미드가 생성되기 때문이다. N-메틸 아미드를 원하는 경우에 이것은 N-메틸 BHA 수지로부터 생성될 수 있다. 다른 치환 아미드를 원하면, 미국 특허 제4,569,967호의 지침이 사용될 수 있거나, C-말단에서 유리산 외의 다른 기를 원하면 Houben-Weyl 전문에서 기술되는 바와 같은 용액 합성 방법을 사용하여 펩티드를 합성하는 것이 바람직할 수 있다.
중간 물질에 대한 구조식에서, 하나 이상의 X기가 보호기이거나 X9는 수지 지지체를 포함한다. 따라서, 본 발명은 (a) 하나 이상의 보호기와 일반 식(II)(식에서, X, X1,X2,X3,X4,X5,X6,X7및 X8은 각각 수소 또는 보호기이며, X9는 보호기 또는 수지 지지체에 대한 고정 결합체이거나, 데스-X9이며, 이 경우, C-말단에서 잔기는 원하는 카르복시 성분을 가질 수 있다)를 갖는 펩티드를 형성하고;
(b) 일반식(II) 펩티드로부터 보호기(들) 또는 고정 결합체를 분리하고;
(c) 원하면, 결과 생성된 서열(I) 펩티드를 이의 무독성 염으로 전환시킴에 의하여 원하는 펩티드를 제조하기 위한 방법도 제공한다.
펩티드 합성에서 사용되는 특별한 측쇄 보호기를 선택함에 있어서, 다음의 일반 규칙을 따른다.
(a) 보호기는 바람직하게는 그의 보호 성질을 가지며 커플링 조건하에서 분리되지 않으며, (b) 보호기는 시약세 안정해야 하고, Xan을 제외하고, 바람직하게는 각 단계의 합성에서 알파 아미노 보호기를 제거하기 위해 선택되는 반응 조건 하에서 안정해야 하며 (c) 측쇄 보호기는 원하는 아미노산 서열을 갖는 합성의 완료시, 펩티드 사슬을 바람직하지 않게 변경시키지 않을 반응 조건 하에서 제거될 수 있어야 한다.
펩티드는, 당분야에서 공지된 다른 동등한 화학적 합성법들이 전술한 바와 같이 사용될 수 있다 하더라도, 일반적으로 Merrifield, J, Am. Chem., Soc., 85, p 2149(1963)에 의해 기술된 것과 같은 고체상 합성을 사용하여 바람직하게 제조된다. 고체상 합성은 보호된 알파 아미노산을 적당한 수지와 커플링하여 펩티드의 C-말단으로부터 시작된다. 이러한 출발 물질은 클로로메틸화된 수지에 또는 히드록시메틸 수지에 대한 에스테르 결합에 의해, 또는 BHA 수지 또는 MBHA수지에 대한 아미드 결합에 의해 알파 아미노 보호 아미노산을 부착함으로써 제조될 수 있다. 히드록시메틸수지의 제조는 Bodansky et al., Chem. Ind. (런던) 38,1597-98(1966)에 의해 기술된다. 쿨로로메틸화된 수지는 Bio Rad Laboratories, Richmond, California 및 Lab. Systems, Inc 로부터 시판된다. 이러한 수지의 제조는 Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis(Freeman Co., San Francisco 1969), 1과, pp 1-6에 기술되어 있다. BHA 및 MBAH 수지 지지체는 시판되며, 일반적으로 합성될 원하는 폴리 펩티드가 C-말단에서 비치환 아미드를 가질 때만 사용된다.
BOC 및 Xan에 의해 보호되는 C-말단 아미노산, 예컨대 Asn은, 예컨대 래트의 GRF(rGRF)의 43-잔기 유리산 유사체가 합성될 때 DMF 중의 KF를 약 60℃에서 교반하면서 24시간동안 사용하는, Chemistry Letters, K. Horiki et al. pp165-168(1978)에 상술된 방법에 따라 클로로메틸화된 수지에 처음으로 커플링될 수 있다. BOC-보호 아미노산을 수지 지지체에 커플링한 후, 염화 메틸렌 중의 트리플루오로아세트산(TFA) 또는 TFA 만을 사용하여 알파 아미노 보호기를 제거한다. 탈보호는 약 0℃내지 실온의 온도에서 수행된다. 디옥산중의 HCl 같은 다른 표준 분리 시약 및 특정한 알파 아미노 보호기의 제거를 위한 조건은 Schroder Lubke, The Peptides, 1, pp72-75(Academic Press 1965)에 기술된 바와 같이 사용할 수 있다.
알파 아미노 보호기의 제거 후, 남은 알파 아미노- 및 축쇄 보호 아미노산은 원하는 순서로 한단계씩 커플린하여 전술한 중간 화합물을 얻거나, 대안으로서 합성에서 각 아미노산을 따로 첨가하여, 이들 중 얼마는 고체상 반응기에 첨가하기 전에 서로 결합될 수 있다. 적절한 커플링제의 선택은 당분야의 기술 내에 있다. 커플링제로서는 N,N′-디시클로헥실 카보드이미드(DCCI)가 특히 적당하다.
펩티드의 고체상 합성에서 사용되는 활성 시약은 펩티드 분야에서 공지된 것이다. 적당한 활성 시약의 예는 N, N′-디이소프로필카보디이미드 및 N-에틸-N′-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드 같은 카보디이미드이다. 펩티드 커플링에서 다른활성화제 및 이들의 사용은 Schroder Lubke supra, III과 및 Kapoor, J.Phar. Sci.,59, pp 1-27(1970) 에 의해 기술된다.
각각의 보호 아미노산 또는 아미노산 서열은 약 4배 이상의 과량으로 고체상 반응기에 도입되고, 커플링은 디메틸포름아미드(DMF): CH2Cl2(1:1) 의 매질에서 또는 DMF나 CH2Cl2단독에서 수행될 수 있다. 불완전한 커플링이 일어날 경우, 커플링 공정은, 다음 아미노산의 커플링 전 알파 아미노 보호반응기의 제거 전에 반복된다. 수작업으로 수행되면 합성의 각 단계에서 커플링 반응의 성공은 E. Kaiser et al. Anal. Biochem. 34, 595(1790)에 의해 기술되는 바와 같이, 닌히드린 반응으로 적절하게 검사한다. 커플링 반응은 Rivier et al. Biopolymer, 1978, 17, pp 1927-1938에 보고된 바와 같은 그러한 프로그램을 사용하는, Beckman 990 자동합성기 상에서와 같이 자동적으로 수행될 수 있다.
원하는 아미노산 서열이 완성된 후, 중간 생성의 펩티드는 액체 불소화 수소 같은 시약으로 처리하여 수지 지지체로부터 제거될 수 있으며, 수지로부터 펩티드를 분리시킬 뿐 아니라 모든 남아있는 측쇄 보호기들 X, X2, X3, X4, X5, X6, X7및 X8과, 고정결합제 X9를 분리시키며, 또한 하나가 사용되면 알파 아미노 보호기 X1를 분리시켜 유리산 형태로 펩티드를 얻을 수 있다. Met가 서열 내에 존재하면, BOC 보호기는 바람직하게는 처음에 HF로 수지로부터 펩티드를 분리하기 전에 트리플루오로아세트산(TFA)/에탄디티올을 사용하여 제거하여 잠재적인 S- 알킬화를 제거한다. 분리를 위해 불소화 수소를 사용할 때, 아니솔과 메틸에틸 술파이드는 반응 용기 내에서 스캐빈저로서 포함된다.
다음의 실시예 1은 고체상 기술에 의해 펩티드를 합성하는 바람직한 방법을 설명한다. 해당되는 긴 펩티드의 합성은 사슬의 C-말단에서 필요한 아미노산 수를 단지 첨가함으로써 같은 방법으로 실행됨은 물론 알 수 있을 것이다. 생물학적 활성 단편은 N-말단에서 표시된 서열을 함유해야 하고, N-말단에 잔기를 첨가하는 것은 유익하지 않을 것으로 여겨진다.
[실시예 1]
식: NaMeTyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-CML-Asn-Arg-NH2를 갖는 펩티드[NaMeTyr1, Ala15, CML27, Asn28]-hGRF(1-29)-NH2의 합성은 Vale et. al 미국 특허 제 4,292,313호에 일반적으로 기술된 바와 같이 시판되는 MBHA 수지상에서 베크만(Beckman) 990펩티드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 수행된다. 수지에 대한 BOC-Arg(Tos)의 커플링은 수지 그램당 Arg 약 0.35mmol의 치환을 생기게 한다.
탈블로킹과 중화 후, 펩티드 사슬을 수지상에서 한 개씩 조립한다. 탈블로킹, 중화 및 각 아미노산 첨가는 일반적으로 Rivier, J., J.Amer. Chem. Soc., pp96, 2986-2992(1974)에 상세히 기술된 방법에 따라 수행된다. 사용되는 모든 용매는 불활성 기체, 예컨대 헬륨 또는 질소로 스퍼지하여 조심스럽게 가스를 빼서, Met 잔기의 황을 바람직스럽지 않게 산화시키게 하는 산소의 부재를 확실하게 한다.
탈블로킹은 다음의 항목 A에 따라 바람직하게 수행된다.
커플링은 다음의 항목 B에서 상세히 설명하는 바와 같이 바람직하게 수행된다.
간략하게는, 수지 그램당 메틸렌 클로라이드 중의 BOC-보호 아미노산 1내지 2mmol을 사용하고, 2시간 동안 메틸렌 클로라이드 중의 1.0M DCCI 1당량을 첨가한다. BOC-Arg(Tos)가 카플링될 때, 50% DMF와 메틸렌 클로라이드의 혼합물이 사용된다. Bzl에테르가 Ser 및 Thr을 위한 히드록실 측쇄보호기로서 사용된다. Asn이나 Gln의 아미도기는 DCC 커플링이 바람직하게 이용될 때 Xan에 의해 보호된다. p-니트로페닐 에스테르(ONp) 또한 Asn이나 Gln이 카르복실말단을 활성화하기 위해 사용될 수 있고, 예컨대, BOC-Asn(ONp)는 DMF와 메틸렌 클로라이드의 50% 혼합물 중에서 HOBt 1당량을 사용하여 하룻밤 동안 커플링 할 수 있고, 이 경우에 DCC는 첨가되지 않는다. 2-클로로-벤질옥시 카르보닐(2C1-Z)은 Lys 측쇄에 대한 보호기로서 사용된다. Tos는 Arg의 구아니도기와 His의 이미다졸 질소를 보호하는데 사용되고, Glu 또는 Asp 측쇄 카르복실기는 OBzl로 보호된다. Tyr의 페놀성 히드록실기는 2, 6-디클로로벤질(DCB)로 보호한다. 합성의 끝부분에서, 다음 조성물이 얻어진다.
BOC-NaMeTyr(X)2-Ala-Asp(X3)-Ala-Ile-Phe-Thr(X4)-Asn(X5)-Ser(X4)-Thr(X2)-Arg(X6)-Lys(X7)-Val-Leu-Ala-Gln(X5)-Leu-Ser(X4)-Ala-Arg(X6)-Lys(X7)-Leu-Leu-Gln(X5)-Asp(X3)-Ile-CML-Asn(X5)-Arg(X6)-X9, 여기에서, X2는 DCB, X3는 OBzl, X4는 Bzl, X5는 Xzn, X6은 Tos, X7은 2Cl-Z과 X9는 NH-MBHA-수지 지지체이다. Xan은 알파 아미노 보호기를 탈블록킹하기 위해 사용되는 TFA 처리에 의해 부분적으로 또는 전체적으로 제거될 수 있다.
보호된 펩티드 수지를 분리하고 탈보호하기 위해서, 펩티드 수지 그램당 1.5ml 아니솔, 0.5ml 메틸에틸술파이드 및 15ml 불소화수소 (HF)를 20℃에서 처리한다. 고진공하에서 HF를 제거한 후, 수지-펩티드 잔여물을 무수 디에틸 에테르와 클로로포름으로 교대로 세척한 다음 펩티드를 가스를 뺀 2N 아세트산 수용액으로 추출하고 여과에 의해 수지로부터 분리한다.
분리 및 탈보호된 펩티드를 0-5%아세트산에 용해시킨 다음 세파덱스 G-50미세겔 여과를 포함할 수 있는 정제를 하였다.
그런 다음 펩티드를 River et al., Peptides:Structure and Biological Function, (1979) pp125-8 및 Marki et al. J. Am. Chem. Soc. 103, 3178(1981)에 기술된 바와 같은 예비 또는 반예비 HPLC에 의해 더 정제한다. 카트리지 피팅 워터스 어소시에이츠 프레프(Catridges fitting Waters Associates prep) LC-500을 Vydac(300A)로부터 15-20μ C18실리카로 충전한다. TEAP 중의 CH3CN 구배는 Rivier, J., J. Lig. Chromatograpy 1,343-367(1978)에 기술된 바와 같이 낮은 압력의 Eldex 구배 제조기에 의해 생성된다. 크로마토그래피 분획은 HLPC에 의해 조심스럽게 검사되고, 실질적인 순도를 보이는 분획만을 모은다. 정제된 분획의 탈염은 0.1% TFA 중의 CH3CN 구배를 사용하여 수행되며 순도는 독립적으로 검사한다. 그런다음 중앙부절단을 얼림건조하여 98% 이상이어야 하는 원하는 순도의 펩티드를 얻는다.
정제된 펩티드의 광학 회전은 Perkin-Elmer 폴로리미터를 사용하여 측정한 결과 [α]D=-152.0˚± (c=1, 1% 아세트산)였다.
[실시예 2]
식: H-CaMeHis-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-
Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-CML-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-NH2를 갖는 40개 잔기의 아미노화된 펩티드[CaMeHis1, D-NMA2, CML27]-hGRF(1-40)-NH2의 합성은 미국 특허 4,292,313(Vale et al.)에 일반적으로 기술된 바와 같이 MBHA 수지상에서 베크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 수행된다. 펩티드는 TLC 및 HPLC를 사용하여 실질적으로 순수한 것으로 판명된다.
[실시예 3]
식 : H-His-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-CML-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Gln-Gln-Arg-Ser-Arg-Phe-Asn-OH를 갖는 [D-NMA2, CML27]-rGRF(1-43)-OH의 합성은 Chemistry, Letters, supra에 기술된 바와 같이 클로로 메틸화 된 수지를 초기 커플링으로 상응하는 베크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 수행한 후 실시예 1에 일반적으로 기술된 방법으로 수행된다. 펩티드는 TLC 및 HPLC를 사용하여 실질적으로 순수한 것으로 판명된다.
[실시예 4]
식 : NaMeTyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Lys-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-CML-Asn-Arg-NH2를 갖는 hGRF 유사체 단편 [NaMeTyr1, Lys8, Ala15, CML27, Asn28]-hGRF(1-29)-NH2의 합성은 실시예 1에서와 같이 MBHA 수지상에서 베크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 수행된다. 이 유사체는 TLC및 HPLC를 사용하여 실질적으로 순수한 것으로 판명된다.
합성은 N-말단 잔기를 변화시킴을 반복하여 [NaMeHis1, Lys8, Ala15, CML27, Asn28]-hGRF(1-29)-NH2를 생성한다.
[실시예 5]
식: NaMeTyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-D-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-CML-Ser-Arg-NH2를 갖는 hGRF 유사체 단편 [NaMeTyr1, D-Lys21, CML27] -hGRF(1-29)-NH2의 합성은 실시예 1에서와 같이 MBHA 수지상에서 베크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 수행된다. 펩티드는 TLC및 HPLC를 사용하여 실질적으로 순수한 것으로 판명된다.
[실시예 6]
식: NaMe-His-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Lys-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-D-Arg-Leu-Leu-His-Glu-Ile-CML-Asn-Arg-NH2를 갖는 [NaMeHis1, D-NMA2, Lys8, D-Arg21, CML27] -hGRF(1-29)-NH2의 합성은 실시예 1에서와 같이 MBHA 수지상에서 베크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 수행된다. 펩티드는 TLC및 HPLC를 사용하여 실질적으로 순수한 것으로 판명된다.
[실시예 7]
식 : NaMeTyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-CaMe-D-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-D-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-CML-Ser-Arg-NH2를 갖는 [NaMeTyr1, CaMe-D-Tyr10, D-Lys21, CML27]-hGRF(1-29)-NH2의 합성은 실시예 1에서와 같이 MBHA의 합성은 실시예 1에서와 같이 MBHA 수지상에서 베크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 수행된다. 펩티드는 MBHA및 HPLC를 사용하여 실질적으로 순수한 것으로 판명된다.
[실시예 8]
식: H-His-D-NMA-Asp-Ala-CML-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-D-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Nva-Asn-Arg-NH2를 갖는 [D-NMA2, CML5, D-Lys21, Nva27]-rGRF(1-29)-NH2의 합성은 실시예 1에서와 같이 MBHA 수지상에서 베크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 수행된다. 펩티드는 TLC및 HPLC를 사용하여 실질적으로 순수한 것으로 판명된다.
[실시예 9]
식 : H-D-Phe-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Glu-Ser-CaMeTyr-Arg-Lys-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-CML-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-NH2를 갖는 [D-Phe1, D-NMA2, Glu8, CaMeTyr10, Ile13, CML23]-hGRF(1-32)-NH2의 합성은 미국특허 4,292,313(Vale et al)에 일반적으로 기술된 바와 같이 MBHA 수지상에서 베크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 수행된다. 펩티드는 TLC및 HPLC를 사용하여 실질적으로 순수한 것으로 판명된다.
[실시예 10]
식 : NaMeHis-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-CaMeVal-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-CML-Ser-Arg-NH2를 갖는[NaMeHis1, D-NMA2, CaMeVal13-CML27]-hGRF(1-29)-NH2의 합성은 미국특허 4,292,313(Val et al)에 기술된 바와 같이 MBHA 수지상에서 베크만 990 펩티드 합성기를 사용하면 단계적인 방법으로 수행된다. 펩티드는 TLC및 HPLC를 사용하여 실질적으로 순수한 것으로 판명된다.
[실시예 11]
식 : For-Tyr-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser- CaMeTyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-CMA-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-CML-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-NH2를 갖는 hGRF 유사체 단편 [For-Tyr1, D-NMA2,CaMeTyr10, CMA19, CML27, Asn28]-hGRF(1-32)-NH2의 합성은 실시예 1에서와 같이 MBHA 수지상에서 베크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 수행된다. 이 유사체는 TLC및 HPLC를 사용하여 실질적으로 순수한 것으로 판명된다.
[실시예 12]
식 : H-His-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Lys-CaMeIle-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-CMA-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-CML-Asn-Arg-NH2를 갖는 [D-NMA2, Lys12, CaMeIle13, CMA19, CML27]-rGRF(1-29)-NH2의 합성은 실시예 1에서와 같이 MBHA 수지상에서 베크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 수행된다. 펩티드는 TLC및 HPLC를 사용하여 실질적으로 순수한 것으로 판명된다.
[실시예 13]
식 : H-Tyr-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Arg-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-CML-Gln-Asp-Ile-Ile-Ser-Arg-NH2를 갖는 hGRF 유사체 단편 [D-NMA2, Arg12, CML23, Ile27]-hGRF(1-29)-NH2의 합성은 실시예 1에서와 같이 MBHA 수지상에서 베크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 수행된다. 펩티드는 TLC 및 HPLC를 사용하여 실질적으로 순수한 것으로 판명된다.
[실시예 14]
식 : H-D-Phe-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-CaMeVal-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-CML-Gln-Asp-Ile-D-Met-Ser-Arg-NH2를 갖는[D-Phe1, D-NMA2, CaMeVal13, Ala15, CML23, D-Met27]-hGRF(1-29)-NH2의 합성은 실시예 1에서와 같이 MBHA 수지상에서 베크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 수행된다. 이 유사체는 TLC 및 HPLC를 사용하여 실질적으로 순수한 것으로 판명된다.
[실시예 15]
식 : H- Tyr-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-D-Arg-Leu-CML-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-NH2를 갖는[D-NMA2, D-Arg21,CML23]-hGRF(1-32)-NH2의 합성은 실시예 1에서와 같이 MBHA 수지상에서 베크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 수행된다. 이 유사체는 TLC 및 HPLC를 사용하여 실질적으로 순수한 것으로 판명된다.
[실시예 16]
식 :desNH2His-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Lys-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu- Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Asp-CML-Met-Asn-Arg-NH2를 갖는[desaminoHis1, D-NMA2, Lys8, Asp25, CML26]-rGRF(1-29)-NH2의 합성은 실시예 1에서와 같이 MBHA 수지상에서 베크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 수행된다. 펩티드는 TLC 및 HPLC를 사용하여 실질적으로 순수한 것으로 판명된다.
[실시예 17]
식 : Ac-D-His-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Arg-Ser-CaMeTyr-Arg-Arg-CMA-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Ile-CML-Asn-Arg-NH2를 갖는 [Ac-D-His1, D-NMA2, Arg8, CaMeTyr10, CMA13, CML27]-rGRF(1-29)-NH2의 합성은 실시예 1에 일반적으로 기술된 방법으로, MBHA 수지상에서 베크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 수행된다. 이 펩티드는 TLC와 HPLC를 사용하여 실질적으로 순수한 것으로 판명된다.
[실시예 18]
식 : H-Tyr-D-Ala-D-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-CaMeTyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu- Ser-CMA-Arg-Lys-Leu-CML-Gln-Asp-Ile-CML-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-NH2를 갖는 [D-Ala2, D-Asp3, CaMeTyr10, CMA19, CML23, CML27]-hGRF(1-32)-NH2의 합성은 실시예 1에서와 같이 MBHA 수지상에서 베크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 수행된다. 이 유사체는 TLC 및 HPLC를 사용하여 실질적으로 순수한 것으로 판명된다.
[실시예 19]
식 : H-D-Tyr-D-NMA-Asp-Ala-CML-Phe-Thr-Lys-Ser-CaMe-D-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-D-Met-Ser-Arg-NH2를 갖는 [D-Tyr1, D-NMA2, CML5, Lys8, CaMe-Tyr10, Ala15, D-Met27]-hGRF(1-29)-NH2의 합성은 실시예 1에서와 같이 MBHA 수지상에서 베크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 수행된다. 이 유사체는 TLC및 HPLC를 사용하여 실질적으로 순수한 것으로 판명된다.
[실시예 20]
식 : H-D-His-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Arg-Ser-Tyr-Arg-Arg-Leu-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-CMA-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-CML-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-NH2를 갖는 [D-His1, D-NMA2, Arg8, Leu13, CMA19, CML27]-rGRF(1-32)-NH2의 합성은 실시예 1에 기술된 방법으로, MBHA 수지상에서 베크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 수행된다. 펩티드는 TLC및 HPLC를 사용하여 실질적으로 순수한 것으로 판명된다.
[실시예 21]
식: desNH2Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-CML-His-Glu-Ile-Met-Asn-Arg-NH2를 갖는 rGRF 유사체 단편 [desaminoTyr1, CML23]-rGRF(1-29)-NH2의 합성은 실시예 1에서와 같이 베크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 수행된다. 펩티드는 TLC 및 HPLC를 사용하여 실질적으로 순수한 것으로 판명된다.
[실시예 22]
식 : Ac-D-Tyr-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-CaMeTyr-Arg-Lys-CaMeVal-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-CMA-Arg-Lys-Leu-CML-Gln-Asp-Ile-Nle-Ser-Arg-NH2를 갖는 [Ac-D-Tyr1, D-NMA2, CaMeTyr10, CaMeVal13, CMA19, CML23, Nle27]-hGRF(1-29)-NH2의 합성은 미국 특허 4,292, 313(Vale at al.) 에 기술된 바와 같이 MBHA 수지상에서 베크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 수행된다. 펩티드는 TLC 및 HPLC를 사용하여 실질적으로 순수한 것으로 판명된다.
[실시예 23]
식 : H-CML-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Glu-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-CMA-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-CML-Asn-Arg-NH2를 갖는 [CML1, D-NMA2, Glu8, CMA19, Glu25, CML27]-rGRF(1-29)-NH2의 합성은 실시예 1에서와 같이 MBHA 수지상에서 베크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 수행된다. 펩티드는 TLC및 HPLC를 사용하여 실질적으로 순수한 것으로 판명된다.
[실시예 24]
식 : For-D-Tyr-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-CaMeVal-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-CMA-Arg-Arg-Leu-CML-Gln-Asp-Ile-Met-Asn-Arg-NH2를 갖는[For-D-Tyr1, D-NMA2, CaMeVal13, CMA19, Arg21, CML23, Asn28]-hGRF(1-29)-NH2의 합성은 미국 특허 4,292, 313호(Vale at al.) 에 기술된 바와 같이 MBHA 수지상에서 베크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 수행된다. 펩티드는 TLC 및 HPLC를 사용하여 실질적으로 순수한 것으로 판명된다.
[실시예 25]
식 :H-Tyr-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-CaMeVal-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-CML-Ser-Arg-NH2를 갖는[NMA2, CaMeVal13, CML27]-hGRF(1-29)-NH2의 합성은 미국 특허 4,292, 313호(Vale at al.) 에 기술된 바와 같이 MBHA 수지상에서 베크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 수행된다. 펩티드는 TLC 및 HPLC를 사용하여 실질적으로 순수한 것으로 판명된다. 그런다음 물에 펩티드를 용해시키고 IN 아세트산을 첨가하여 아세테이트염을 제조한다. 결과 생성의 용액을 동결 건조하여 아세테에트염을 수득한다.
[실시예 26]
식 : H-Tyr-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Arg-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-CMA-Arg-Lys-Leu-CML-Gln-Asp-Ile-Nle-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-NH2를 갖는 hGRF 유사체 [D-NMA2, Arg8, CMA19, CML23, Nle27]-hGRF(1-32)-NH2의 합성은 실시예 1에서와 같이 MBHA 수지상에서 베크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 수행된다. 이 유사체는 TLC 및 HPLC를 사용하여 실질적으로 순수한 것으로 판명된다.
[실시예 27]
식 : H-HiS-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-CML-Tyr-Ala-Arg-Arg-Leu-Leu-HiS-Gln-Ile-Nle-Nle-Asn-Arg-NH2를 갖는[CML17, Arg21, Nle27]-rGRF(1-29)-NH2의 합성은 실시예 1에서와 같이 MBHA 수지상에서 베크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 수행된다. 펩티드는 TLC 및 HPLC를 사용하여 실질적으로 순수한 것으로 판명된다.
[실시예 28]
식 : H-Tyr-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-CaMeVal-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-CMA-Arg-Lys-Leu-CML-Gln-Asp-Ile-Nle-Asn-Arg-NH2를 갖는hGRF유사체 [D-NMA2, CaMeVal13, CMA19, CML23, Nle27, Asn28]-hGRF(1-29)-NH2의 합성은 실시예 1에서와 같이 MBHA 수지상에서 베크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 수행된다. 펩티드는 TLC및 HPLC를 사용하여 실질적으로 순수한 것으로 판명된다.
[실시예 29]
식 : NaMeTyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Glu-CML-Nle-Asn-Arg-NH2를 갖는[NaMeTyr1, Ala15, CML26, Nle27, Asn28]-hGRF(1-29)-NH2의 합성은 실시예 1에서와 같이 MBHA 수지상에서 베크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 수행된다. 펩티드는 TLC 및 HPLC를 사용하여 실질적으로 순수한 것으로 판명된다. 정제된 펩티드의 광학 회전은 광전 폴로리미터(polorimeter)를 사용하여 측정한 결과 [α]D=-43.5˚±1(c=1, 1% 아세트산) 이었다.
[실시예 30]
식 : H-Met-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-CMA-Arg-Arg-Leu-Leu-His-Glu-Ile-CML-Asn-Arg-NH2를 갖는[Met1, CMA19, Arg21, CML27]-rGRF(1-29)-NH2의 합성은 실시예 1에서와 같이 MBHA 수지상에서 베크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 수행된다. 펩티드는 TLC 및 HPLC를 사용하여 실질적으로 순수한 것으로 판명된다.
[실시예 31]
식 : H-pCl-Phe-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-CaMeTyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-CMA-Arg-Arg-Leu-Leu-His-Asp-Ile-CML-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Arg-Ser-Arg-Phe-Asn-OH를 갖는 [pCL-Phe1, D-NMA2, CaMeTyr10, CMA19, Arg21, CML27]-rGRF(1-43)-OH의 합성은 실시예 3에서와 같이 클로로 메틸화된 수지상에서 베크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 수행된다. 펩티드는 TCL 및 HPLC를 사용하여 실질적으로 순수한 것으로 판명된다.
[실시예 32]
식 : NaMeTyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Glu-Ile-Nle-Asn-Arg-NH2를 갖는[NaMeTyr1, Ala15, CML23, Nle27, Asn28]-hGRF(1-29)-NH2의 합성은 실시예 1에서와 같이 MBHA 수지상에서 베크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 수행된다. 펩티드는 TLC및 HPLC를 사용하여 실질적으로 순수한 것으로 판명된다. 정제된 펩티드의 광학 회전은 광전 폴리리미터를 사용하여 측정한 결과 [α]D=-44.0˚±1(c=1, 1% 아세트산) 이었다.
[실시예 33]
식:NaMeTyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-CML-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Glu-Ile-CML-Asn-Arg-NH2를 갖는 [NaMeTyr1, CML13, Ala15, CML27, Asn28]-hGRF(1-29)-NH2의 합성은 실시예 1에서와 같이 MBHA 수지상에서 베크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 수행된다. 펩티드는 TLC 및 HPLC를 사용하여 실질적으로 순수한 것으로 판명된다.
[실시예 34]
식: NaMeTyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-CMA-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Glu-Ile-Nle-Asn-Arg-NH2를 갖는 [NaMeTyr1, Ala15, CMA19, Asn28]-hGRF(1-29)-NH2의 합성은 실시예 1에서와 같이 MBHA 수지상에서 베크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 수행된다. 펩티드는 TLC 및 HPLC를 사용하여 실질적으로 순수한 것으로 판명된다.정제된 펩티드의 광학 회전은 광전 폴리리미터를 사용하여 측정한 결과 [α]D=-45.5˚±1(c=1, 1% 아세트산) 이었다.
[실시예 35]
식 : NaMeTyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-CML-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Glu-Ile-Nle-Asn-Arg-NH2를 갖는 [NaMeTyr1, Ala15, CLM17, Nle27, Asn28]-hGRF(1-29)-NH2의 합성은 실시예 1에서와 같이 MBHA 수지상에서 베크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 수행된다. 펩티드는 TLC 및 HPLC를 사용하여 실질적으로 순수한 것으로 판명된다.정제된 펩티드의 광학 회전은 광전 폴리리미터를 사용하여 측정한 결과 [α]D=-49.0˚±1(c=1, 1% 아세트산) 이었다.
[실시예 36]
식: NaMeTyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-CML-Gln-Glu-Ile-Nle-Asn-Arg-NH2를 갖는 [NaMeTyr1, Ala15, CLM23, Nle27, Asn28]-hGRF(1-29)-NH2의 합성은 실시예 1에서와 같이 MBHA 수지상에서 베크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 수행된다. 펩티드는 TLC및 HPLC를 사용하여 실질적으로 순수한 것으로 판명된다.
[실시예 37]
식 : NaMeTyr-Ala-Asp-Ala-CML-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Glu-Ile-Nle-Asn-Arg-NH2를 갖는 [NaMeTyr1, CLM5, Ala15, Nle27, Asn28]-hGRF(1-29)-NH2의 합성은 실시예 1에서와 같이 MBHA 수지상에서 베크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 수행된다. 펩티드는 TLC및 HPLC를 사용하여 실질적으로 순수한 것으로 판명된다.정제된 펩티드의 광학 회전은 광전 폴리리미터를 사용하여 측정한 결과 [α]D=-45.0˚±1(c=1, 1% 아세트산) 이었다.
[실시예 38]
식 : NaMeTyr-Ala-Asp-Ala-CML-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-CML-Leu-Ala-Gln-CML-Ser-CMA-Arg-Lys-CML-Leu-Gln-Glu-Ile-CML-Asn-Arg-NH2를 갖는 [NaMeTyr1, CLM5,13,17,22,27 ,Ala15, CMA19Asn28]-hGRF(1-29)-NH2의 합성은 실시예 1에서와 같이 MBHA 수지상에서 베크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 수행된다. 펩티드는 TLC및 HPLC를 사용하여 실질적으로 순수한 것으로 판명된다.
[실시예 39]
식 : NaMeTyr-Ala-Asp-Ala-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-CML-Leu-Gln-Glu-Ile-CML-Asn-Arg-NH2를 갖는 [NaMeTyr1, Ala15, CLM22,27, Asn28]-hGRF(1-29)-NH2의 합성은 실시예 1에서와 같이 MBHA 수지상에서 베크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 수행된다. 펩티드는 TLC및 HPLC를 사용하여 실질적으로 순수한 것으로 판명된다.
[실시예 40]
식 : NaMeTyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-CMA-Arg-Lys-Leu-CML-Gln-Glu-Ile-Nle-Asn-Arg-NH2를 갖는 [NaMeTyr1, Ala15, CMA19, CMA23, Nle27Asn28]-hGRF(1-29)-NH2의 합성은 실시예 1에서와 같이 MBHA 수지상에서 베크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 수행된다. 펩티드는 TLC및 HPLC를 사용하여 실질적으로 순수한 것으로 판명된다.
[실시예 41]
식 : NaMeTyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-CML-Ser-CMA-Arg-Lys-CML-Leu-Gln-Glu-Ile-CML-Asn-Arg-NH2를 갖는 [NaMeTyr1, Ala15, CML17,22,27,CMA19, Asn28]-hGRF(1-29)-NH2의 합성은 실시예 1에서와 같이 MBHA 수지상에서 베크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 수행된다. 펩티드는 TLC및 HPLC를 사용하여 실질적으로 순수한 것으로 판명된다.
[실시예 42]
H-CaMeHis-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-CML-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2를 갖는 40개 잔기의 아미노산화된 펩티드 [CaMeHis1, D-NMA2, CML27]-hGRF(1-44)NH2의 합성은 미국 특허 4,292, 313(Vale at al.) 에 기술된 바와 같이 MBHA 수지상에서 베크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 수행된다. 펩티드는 TLC및 HPLC를 사용하여 실질적으로 순수한 것으로 판명된다.
실시예들에서 제조된 합성 펩티드를 시험관 내에서 제조한 합성 hpGRF(1-40)-OH와 비교한 결과 GH 분비에 있어서 대개 더 큰 효능을 보이며, 유사한 내부 활성을 보이는 것으로 밝혀졌다. 이러한 합성 펩티드 전부는 생물학적으로 활성이 있으며, 뇌하수체에 의한 GH 분비를 자극하는데 유용한 것으로 생각된다.
성장 호르몬의 분비를 촉진시키는 대표적인 합성 펩티드의 상대적인 효능을 시험관 내에서 측정하는 것은, 표준 물질로서 합성 hpGRF(1-40)-OH를 사용하고 합성된 대표적인 유사체들의 등몰 농도를 나란히 비교함으로 수행된다. 3 내지 5일 전에 미리 제거한 래트의 뇌하수체 세포를 포함하는 배양물이 사용된다. 이러한 배양물은 성장 호르몬의 분비에 적절하며 Vale et al. 의 Endocrinology, 91, 562-572(1972) 및 보다 상세하게는 Vale et al. Endocrinology, 112, 1553, 1555(1983)에 기술된 방법으로 비교 테스트를 위해 사용된다. 시험되는 물질의 배양은 3내지 4시간 동안 수행되며, 배양매질의 부분표본을 옮겨 처리하고 잘 규정된 방사성 면역법에 의해 면역반응성 GH(irGH)의 함량을 측정한다.
등몰 농도에 대한 이 비교 테스트의 결과는 표 I에 나타낸다.
성장호르몬의 분비에 대한 시험관 내 테스트 뿐 아니라, 생체 실험은 합성 펩티드를 우레탄으로 마취시칸 수컷 래트에 정맥 내에 주사하고 이들의 외생 GRF에 대한 반응을 폐하지 않으면서 자연적인 GH분비를 막는 것을 측정한다. 혈액 시료를 주사전, 주사후 10분, 30분 및 60분 후 즉시 취하고 혈액에서의 GH 수준을 방사성 면역법으루 측정한다. 이러한 합성 팹티드의 생체 테스트 각각은 hpGRF(1-40)에 의한 것보다 더 큰 생물학적 효능을 가지며 상당히 긴 효능의 지속시간을 가짐을 보여주는데 이는 IV의 주사후 30분과 60분에서 측정할 때 뇌하수체 GH의 혈액수준에서 나타난다. GH의 분비를 검사하는데 유효한 것으로 알려진 다른 공지의 GRF 생체 내 시험이 이러한 결과를 확인하기 위해 사용된다. 체중 kg당 이러한 펩티드 약 500ng 내지 50μg의 투여가 GH 분비를 일으키는데 유효한 것으로 생각된다.
이러한 합성 hGRF 유사체와 아마도 rGRF 유사체는 의사가 GH 생성을 높이고자 하는 사람에게 적용하는데 유용해야 한다. 이러한 유사체에 의한 GH 분비의 자극은 내생 GRF의 생산 부족에서 기인되는 완전 또는 상대적 GH결핍증 환자에게 중요하다. 또한 GH 분비 증가와 수반되는 성장의 증대는 정상의 GH 수준을 가진 사람이나 동물에서도 얻을 수 있다. 더욱이 이것의 투여는 몸의 지방 함량을 변화시키고 다른 GH의존성 대사, 면역 및 발육과정을 변형시켜야한다. 예컨대 이러한 유사체는 화상을 입은 후와 같은 상황 하에서 사람의 동화작용을 자극하는 방법으로 유용할 수 있다. 다른 예로는, 이러한 유사체가 닭, 칠면조, 돼지, 염소, 소 및 양 같은 상업적 사육의 온혈동물에 투여될 수 있고, 사육 물고기와 냉혈 바다동물, 예컨대 바다거북과 뱀장어 및 양서류에 대하여 수경법으로 사용하여 성장을 초긴시키고 펩티드의 유효량 공급에 의해 늘어난 지방에 대한 단백질의 비율을 증가시킨다.
사람에게 투여하기 위해서는, 이들 합성 펩티드가 약 93% 이상 바람직하게는 98% 이상의 순도를 가져야 한다. 순도는 이 적용 목적을 위하여, 존재하는 모든 펩티드와 펩티드 단편의 상기 중량 %로 구성되는 예정된 펩티드에 관한 것이다. 성장을 촉진시키고 지방함량을 감소시키기 위해서 상업적 동물 및 다른 동물에 이러한 합성 펩티드를 투여하는데 낮은 순도도 허용될 수 있다.
제약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 담체와 배합하여 제약학적 조성물을 형성하는 이러한 합성 펩티드 또는 이의 무독성 염은 사람을 포함한 동물에, 정맥내, 피하, 근육내, 경피, 예컨대 비내 또는 경구로 투입할 수 있다. 투여는 의사에 의해 수행되어, 처치되는 숙주가 이러한 치료를 필요로하는 경우 GH의 분비를 자극할 수 있다. 필요한 투여량은 처치되는 특별한 상태, 상태의 심각성 및 원하는 처치기간에 따라 변할 것이다.
이러한 펩티드는 산부가염 또는 아연 철등(이 적용 목적을 위한 염으로 생각된다)과의 금속 복합체 같은 무독성염 형태로 종종 투여된다. 이러한 산부가염의 예는 염산염, 브롬산염, 술페이트, 포스페이트, 말레이트, 아세테이트, 시트레이트, 벤조에이트, 숙시네이트, 말레이트, 아스코르베이트, 타르트레이트 등이다. 활성 성분이 정제 형태로 경구 투여 될 경우, 정제는 트라가칸드, 콘스타치 또는 젤라틴 같은 결합체, 알긴산 같은 붕해제, 마그네슘 스테아레이트 같은 활택제를 함유하고 있다. 액체 형태로 투여하기를 원하면, 감미제 및 향미제가 사용될 수 있고, 등장의 염수, 인산염 완충용액 중에서 정맥내 투여가 실행될 수 있다.
펩티드는 의사의 지시하에 사람에게 투여되어야하고, 제약학적 조성물은 대개 통상의 고체 또는 액체의 제약학적으로 허용가능한 담체와 배합된 펩티드를 사용한다. 보통, 비경구 투여는 숙주의 체중 kg당 펩티드 약 0.01내지 약 1μg이다.
또한 이러한 펩티드를 1회 투여로부터 장기간, 예컨대 1주 내지 1년동안에 걸쳐 가하는 것이 바람직할 수 있고, 느린 방출 데포(depot) 또는 임플랜트 투여 형태가 사용될 수 있다. 예컨대, 투여 형태는 체액에 낮은 용해도를 갖는 화합물의 제약적으로 허용가능한 무독성염, 예컨대 다염기산을 갖는 산부가염, 다가 금속 양이온을 갖는 염, 또는 두염의 배합물을 함유할 수 있다. 또한 비교적 불용성인 염은 겔에, 에컨대 알루미늄 스테아레이트겔에 배합될 수 있다. 또한 주사를 위한 적당한 느린 방출 데포 제형은 예컨대 이국 특허 3,773,919에 기술된 바와 같이 서서히 분해하는 폴리아세트산/폴리글콜산 중합체 같은 무독성 또는 비황원성 중합체에 분산시키거나 피낭 시킨 펩티드 또는 이의 염을 포함할 수 있다. 또한 이러한 화합물은 실란성 충전물과 배합될 수 있다.
Meyer. B.R. et al., Clin. Pharm. Therapeutices,44, 6, 607-612(1988)에 보고된 바와 같이, 전류를 사용하는 시간을 확장하면서 사람에 펩티드를 피부 투여 하는 것도 가능하다. 예컨대, 9-볼트 배터리를 사용하여 사람 피부에 약 0.2 밀리암페어의 전류를 지속적으로 가하여 진피를 통해 혈류로 펩티드를 효과적으로 공급하는 피부패치가 사용될 수 있다.
본 발명은 현재 발명가들에게 알려진 가장 좋은 형식으로 구성된 바람직한 구체예에 관해 기술했지만, 당분야에서 통상의 기술을 가진 사람에게 명백한 바와 같이 여러가지 변형과 변이가 첨부되는 특허 청구범위에 상술된 본 발명의 범위를 이탈함이 없이 이루어 질 수 있다. 예컨대, 펩티드 사슬에서의 변형, 특히 팹티드의 카르복실 말단에서 시작하여 약 29 위치까지의 삭제는 공지된 실험방법에따라 수행될 수 있어, 펩티드의 생물학적 효능의 모든부분 또는 매우 실질적인 부분을 갖는 펩티드나 펩티드 단편을 생성하는데 시간이 걸리고, 이러한 펩티드는 본 발명의 범위 내에 있는 것과 같은 것으로 생각된다. 더욱이, 첨가가 양쪽말단 중 한쪽에서, 또는 양쪽에서 이루어질 수 있고/또는 일반적으로 동량의 자나기가 천연적으로 존재하는 잔기를 치환시킬 수 있으며, 펩티드 화학의 전 분야에서 잘 알려진 바와 같이, 본 발명의 범위를 이탈함이 없이 청구되는 폴리펩티드의 실질적인 부분 이상의 효능을 갖는 다른 유사체를 제조한다. 더우기, 변형은 이 기술의 상태에 따라 C-말단에서 바람직한 -NH기로 이루어질 수 있으며, 예컨대 C-말단에서 아미노산 잔기의 카르복실 성분은 라디칼 -COOR, -CRO, -CONHNHR, -CON(R)(R')또는 -CHOR일 수 있고, R과 R'은 저급 알킬, 플루오로 저급알킬 또는 수소이며 이러한 변형을 위하여 본 발명으로부터 벗어남이 없이 동량의 합성 펩티드들 생성한다.
본 발명의 여러 특징들은 다음의 청구범위에서 강조된다.
Claims (3)
- 다음식을 갖는 합성 펩티드: [NaMeTyr1, Ala15, CML23, Nle27, Asn28]-hGRF(1-29)-NH2; [NaMeTyr1, Ala15, CML17, Nle27, Asn28]-hGRF(1-29)-NH2; [NaMeTyr1, Ala15, CML23, Nle26, Asn28]-hGRF(1-29)-NH2; 또는 [NaMeTyr1, Ala15, CML27, Asn28]-hGRF(1-29)-NH2.
- 다음서열을 갖는 함성 펩티드, 또는 그의 무독성 염 : (B) R1-R2-R3-Ala(Q1)R5-Phe-Thr-R8-Ser(Q2)R10-Arg-R12-(Q3)R13-Leu-R15-Gln-(Q4)Leu-R18-(Q5)Ala-Arg-R21-(Q6)R22-(Q7)Leu-R24-R25-(Q8)R26-(Q9)R27-R28-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-R34-Asn-Gln-Glu-R38-R39-R40-Arg-R42-R43-R44(식에서, R1은 Tyr, D-Tyr, Met, Phe, D-Phe, pCl-Phe, Leu, His 또는 D-His; B는 H, CaMe, NaMe, 데스아미노, Ac 또는 For; R2는 Ala, NMA 또는 D-NMA;R3은 Asp 또는 D-Asp; R5는 Ile 또는 Leu; R8은 Ser, Ans, Lys, Arg, Asp 또는 Glu; R10은 Tyr, D-Tyr 또는 Phe; R12는 Arg 또는 Lys; R13은 Ile, Val, Leu 또는 Ala; R15는 Gly 또는 Arg 또는 Ala; R18은 Ser 또는 Tyr; R21은 Lys, D-Lys, Arg 또는 D-Arg; R22는 Leu, Ile, Ala 또는 Val;R24는 Gln 또는 His ; R25는 Asp 또는 Glu;R26은 Il또는e Leu;R27은 Met,D-Met,Ala,Nle,Ile,Leu,Nva 또는 Val;R28은 Asn또는 Ser;R34는 Ser또는 Arg;R38은 Arg또는 Gln;R39는 Gly또는 Arg;R40은 Ala또는 Ser;R42는 Phe,Ala또는 Val; R43은 Asn또는 Arg;R44는 천연아미노산;Q1-Q9는 H 또는 CaMe이며, 단, R30과 R44사이의 임의의 잔기 또는 모든 잔기는 C-말단에서 시작하는 서열에서 삭제될 수 있고, 또한 Q1,Q4,Q7,Q8및 Q9중 하나 이상은 CaMe이다)
- 다음 식을 갖는 합성 펩티드 , 또는 그의 무독성 염 ; (B) R1- R2- Asp- Ala- (Q1)Ile- Phe- Thr- R8- Ser(Q2)R10- Arg- R12- (Q3)R13- Leu- R15- Gln- (Q4)Leu- R18- (Q5)Ala- Arg- R21- (Q6)R22- (Q7)Leu- R24- R25- (Q8)R26- (Q9)R27- R28- Arg- Gln- Gly-Y(식에서, R1은 Tyr,D-Tyr, Phe, D-Phe, His또는 D-His;B는 H, CaMe 또는 NaMe; R2는 Ala, D-Ala, NMA 또는 D-NMA; R8은 Ser, Asn, Lys, Arg, Asp 또는 Glu; R10은 Tyr, D-Ty 또는 Phe; R12는 Arg 또는 Lys; R13은 Ile, Val, Leu 또는 Ala; R15는 Gly 또는 Ala; R18은 Ser 또는 Tyr; R21은 Lys, D-Lys, Arg 또는 D-Arg; R22는 Leu, Ile, Ala 또는 Val; R24는 Gln 또는 His; R25는 Asp 또는 Glu; R27은 Met, Ala, Nle, Ile, Leu, Nva 또는 Val; R28은 Asn또는 Ser;Y는, R이 H또는 저급알킬인 NHR;Q1-Q9는 H또는 CaMe이며, 단, Gly, Gln-Gly또는 Gln-Gln-Gly는 C-말단에서 삭제될 수 있고, 또한 Q1, Q4, Q7, Q8및 Q9그 중하나 이상은 CaMe이다.
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