FI94356B - Menetelmä farmaseuttisesti käyttökelpoisen kasvuhormonia vapauttavan tekijän synteettisen peptidianalogin tai sen ei-myrkyllisen suolan valmistamiseksi - Google Patents
Menetelmä farmaseuttisesti käyttökelpoisen kasvuhormonia vapauttavan tekijän synteettisen peptidianalogin tai sen ei-myrkyllisen suolan valmistamiseksi Download PDFInfo
- Publication number
- FI94356B FI94356B FI906240A FI906240A FI94356B FI 94356 B FI94356 B FI 94356B FI 906240 A FI906240 A FI 906240A FI 906240 A FI906240 A FI 906240A FI 94356 B FI94356 B FI 94356B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- arg
- leu
- ala
- gln
- ser
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 168
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 title claims description 9
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 title claims description 9
- 101710142969 Somatoliberin Proteins 0.000 title claims description 7
- 239000000095 Growth Hormone-Releasing Hormone Substances 0.000 title claims description 4
- 102000038461 Growth Hormone-Releasing Hormone Human genes 0.000 title claims 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 title description 16
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 44
- -1 Phe Chemical compound 0.000 claims abstract description 39
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 19
- OUYCCCASQSFEME-MRVPVSSYSA-N D-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-MRVPVSSYSA-N 0.000 claims abstract description 12
- XKCWNEVAXQCMGP-RXMQYKEDSA-N (2R)-2-amino-5-[carbamimidoyl(methyl)amino]pentanoic acid Chemical compound CN(CCC[C@@H](N)C(O)=O)C(N)=N XKCWNEVAXQCMGP-RXMQYKEDSA-N 0.000 claims abstract description 8
- QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N D-alanine Chemical compound C[C@@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N 0.000 claims abstract description 6
- HNDVDQJCIGZPNO-RXMQYKEDSA-N D-histidine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-RXMQYKEDSA-N 0.000 claims abstract description 6
- COLNVLDHVKWLRT-MRVPVSSYSA-N D-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-MRVPVSSYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- SGCGMORCWLEJNZ-UWVGGRQHSA-N His-His Chemical compound C([C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C([O-])=O)C1=CN=CN1 SGCGMORCWLEJNZ-UWVGGRQHSA-N 0.000 claims abstract description 6
- CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N D-OH-Asp Chemical group OC(=O)C(N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- ODKSFYDXXFIFQN-SCSAIBSYSA-N D-arginine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-SCSAIBSYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N D-aspartic acid Chemical group OC(=O)[C@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N 0.000 claims abstract description 5
- FFEARJCKVFRZRR-SCSAIBSYSA-N D-methionine Chemical compound CSCC[C@@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-SCSAIBSYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 125000000393 L-methionino group Chemical group [H]OC(=O)[C@@]([H])(N([H])[*])C([H])([H])C(SC([H])([H])[H])([H])[H] 0.000 claims abstract description 5
- KDXKERNSBIXSRK-RXMQYKEDSA-N D-lysine Chemical compound NCCCC[C@@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-RXMQYKEDSA-N 0.000 claims abstract description 4
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 claims description 49
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 26
- 101150045312 CML27 gene Proteins 0.000 claims description 22
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 16
- 101150040295 CML23 gene Proteins 0.000 claims description 14
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 13
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 11
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 10
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 9
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 claims description 8
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 7
- SITWEMZOJNKJCH-WDSKDSINSA-N Ala-Arg Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N SITWEMZOJNKJCH-WDSKDSINSA-N 0.000 claims description 6
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 101150025758 CML17 gene Proteins 0.000 claims description 5
- 101150070418 CML5 gene Proteins 0.000 claims description 5
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 5
- 101150107707 CML26 gene Proteins 0.000 claims description 4
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical group [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- SITWEMZOJNKJCH-UHFFFAOYSA-N L-alanine-L-arginine Natural products CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCCNC(N)=N SITWEMZOJNKJCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 9
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 abstract description 6
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 abstract description 3
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 abstract description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 73
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 73
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 42
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 description 24
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 24
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 24
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 18
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 18
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 16
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 15
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 15
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 14
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 12
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 12
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 10
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Chemical compound CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 9
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 7
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 7
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 7
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 7
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 6
- SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N 2-aminopentanoic acid Chemical compound CCCC(N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N Fluorane Chemical compound F KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N L-norleucine Chemical compound CCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 5
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 5
- 102100022831 Somatoliberin Human genes 0.000 description 5
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 5
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 5
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- DHBXNPKRAUYBTH-UHFFFAOYSA-N 1,1-ethanedithiol Chemical compound CC(S)S DHBXNPKRAUYBTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- RDOXTESZEPMUJZ-UHFFFAOYSA-N anisole Chemical compound COC1=CC=CC=C1 RDOXTESZEPMUJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 4
- 229910000040 hydrogen fluoride Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- FUOOLUPWFVMBKG-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoisobutyric acid Chemical compound CC(C)(N)C(O)=O FUOOLUPWFVMBKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 3
- 206010062767 Hypophysitis Diseases 0.000 description 3
- 101000825738 Rattus norvegicus Somatoliberin Proteins 0.000 description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 150000001721 carbon Chemical group 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 3
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 3
- 150000002431 hydrogen Chemical class 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 210000003635 pituitary gland Anatomy 0.000 description 3
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 3
- 108010036509 somatotropin releasing factor 40 Proteins 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- WBIIPXYJAMICNU-AWEZNQCLSA-N (2s)-5-[amino-[(4-methylphenyl)sulfonylamino]methylidene]azaniumyl-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]pentanoate Chemical compound CC1=CC=C(S(=O)(=O)NC(N)=NCCC[C@H](NC(=O)OC(C)(C)C)C(O)=O)C=C1 WBIIPXYJAMICNU-AWEZNQCLSA-N 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100109397 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) arg-8 gene Proteins 0.000 description 2
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 2
- NYQBYASWHVRESG-MIMYLULJSA-N Phe-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 NYQBYASWHVRESG-MIMYLULJSA-N 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GELXFVQAWNTGPQ-UHFFFAOYSA-N [N].C1=CNC=N1 Chemical compound [N].C1=CNC=N1 GELXFVQAWNTGPQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 159000000021 acetate salts Chemical class 0.000 description 2
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 2
- 125000005076 adamantyloxycarbonyl group Chemical group C12(CC3CC(CC(C1)C3)C2)OC(=O)* 0.000 description 2
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 description 2
- 238000009360 aquaculture Methods 0.000 description 2
- 244000144974 aquaculture Species 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 2
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 2
- XYWDPYKBIRQXQS-UHFFFAOYSA-N di-isopropyl sulphide Natural products CC(C)SC(C)C XYWDPYKBIRQXQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 2
- 210000000744 eyelid Anatomy 0.000 description 2
- 125000005519 fluorenylmethyloxycarbonyl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000001153 fluoro group Chemical group F* 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 125000004029 hydroxymethyl group Chemical group [H]OC([H])([H])* 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910052751 metal Chemical class 0.000 description 2
- 239000002184 metal Chemical class 0.000 description 2
- UZKWTJUDCOPSNM-UHFFFAOYSA-N methoxybenzene Substances CCCCOC=C UZKWTJUDCOPSNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WXEHBUMAEPOYKP-UHFFFAOYSA-N methylsulfanylethane Chemical compound CCSC WXEHBUMAEPOYKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 125000001412 tetrahydropyranyl group Chemical group 0.000 description 2
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 125000002221 trityl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1C([*])(C1=C(C(=C(C(=C1[H])[H])[H])[H])[H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 2
- JOYRKODLDBILNP-UHFFFAOYSA-N urethane group Chemical group NC(=O)OCC JOYRKODLDBILNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 241000252073 Anguilliformes Species 0.000 description 1
- JQFZHHSQMKZLRU-IUCAKERBSA-N Arg-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N JQFZHHSQMKZLRU-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- 241000416162 Astragalus gummifer Species 0.000 description 1
- 125000006847 BOC protecting group Chemical group 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 101150052142 CML1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150022315 CML13 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150102810 CML22 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VOPWNXZWBYDODV-UHFFFAOYSA-N Chlorodifluoromethane Chemical compound FC(F)Cl VOPWNXZWBYDODV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229920002261 Corn starch Polymers 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N Dextrotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- NVEASDQHBRZPSU-BQBZGAKWSA-N Gln-Gln-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O NVEASDQHBRZPSU-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- JEFZIKRIDLHOIF-BYPYZUCNSA-N Gln-Gly Chemical compound NC(=O)CC[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O JEFZIKRIDLHOIF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 240000007058 Halophila ovalis Species 0.000 description 1
- 101100186490 Homo sapiens NAT8 gene Proteins 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N Hydrogen bromide Chemical compound Br CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SNDPXSYFESPGGJ-BYPYZUCNSA-N L-2-aminopentanoic acid Chemical compound CCC[C@H](N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 208000010415 Low Vision Diseases 0.000 description 1
- 101100170937 Mus musculus Dnmt1 gene Proteins 0.000 description 1
- FYYSQDHBALBGHX-YFKPBYRVSA-N N(alpha)-t-butoxycarbonyl-L-asparagine Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O FYYSQDHBALBGHX-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 102100032394 N-acetyltransferase 8 Human genes 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 241000286209 Phasianidae Species 0.000 description 1
- 229920000954 Polyglycolide Polymers 0.000 description 1
- 101100496428 Rattus norvegicus Cml6 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100187187 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) NMA2 gene Proteins 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000005157 Somatostatin Human genes 0.000 description 1
- 108010056088 Somatostatin Proteins 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001615 Tragacanth Polymers 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940022663 acetate Drugs 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000007825 activation reagent Substances 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000000783 alginic acid Substances 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 229960001126 alginic acid Drugs 0.000 description 1
- 150000004781 alginic acids Chemical class 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001370 alpha-amino acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 235000008206 alpha-amino acids Nutrition 0.000 description 1
- CEGOLXSVJUTHNZ-UHFFFAOYSA-K aluminium tristearate Chemical compound [Al+3].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O CEGOLXSVJUTHNZ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940063655 aluminum stearate Drugs 0.000 description 1
- 230000001195 anabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 108010062796 arginyllysine Proteins 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 229940072107 ascorbate Drugs 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 229940050390 benzoate Drugs 0.000 description 1
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1 WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003236 benzoyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000001584 benzyloxycarbonyl group Chemical group C(=O)(OCC1=CC=CC=C1)* 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 229940001468 citrate Drugs 0.000 description 1
- 239000008120 corn starch Substances 0.000 description 1
- 125000000753 cycloalkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- UNXNGGMLCSMSLH-UHFFFAOYSA-N dihydrogen phosphate;triethylazanium Chemical compound OP(O)(O)=O.CCN(CC)CC UNXNGGMLCSMSLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 108010078144 glutaminyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 239000001307 helium Substances 0.000 description 1
- 229910052734 helium Inorganic materials 0.000 description 1
- SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N helium atom Chemical compound [He] SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002260 hypophysiotrophic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000960 hypophysis hormone Substances 0.000 description 1
- 230000037189 immune system physiology Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000011261 inert gas Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000005928 isopropyloxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(OC(*)=O)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000004303 low vision Effects 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 230000001050 lubricating effect Effects 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 1
- 229940049920 malate Drugs 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N maleic acid Chemical compound OC(=O)\C=C/C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N 0.000 description 1
- BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N malic acid Chemical compound OC(=O)C(O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- MGJXBDMLVWIYOQ-UHFFFAOYSA-N methylazanide Chemical compound [NH-]C MGJXBDMLVWIYOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000449 nitro group Chemical group [O-][N+](*)=O 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 238000005897 peptide coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- UYWQUFXKFGHYNT-UHFFFAOYSA-N phenylmethyl ester of formic acid Natural products O=COCC1=CC=CC=C1 UYWQUFXKFGHYNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 1
- 239000004633 polyglycolic acid Substances 0.000 description 1
- 239000004626 polylactic acid Substances 0.000 description 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 1
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 1
- 238000002953 preparative HPLC Methods 0.000 description 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000011894 semi-preparative HPLC Methods 0.000 description 1
- UQDJGEHQDNVPGU-UHFFFAOYSA-N serine phosphoethanolamine Chemical compound [NH3+]CCOP([O-])(=O)OCC([NH3+])C([O-])=O UQDJGEHQDNVPGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000260 silastic Polymers 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N somatostatin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C3=CC=CC=C3NC=2)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)[C@@H](C)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)N)C(O)=O)=O)[C@H](O)C)C1=CC=CC=C1 NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N 0.000 description 1
- 229960000553 somatostatin Drugs 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 229940086735 succinate Drugs 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 1
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 229940095064 tartrate Drugs 0.000 description 1
- 238000006257 total synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 235000010487 tragacanth Nutrition 0.000 description 1
- 239000000196 tragacanth Substances 0.000 description 1
- 229940116362 tragacanth Drugs 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/60—Growth hormone-releasing factor [GH-RF], i.e. somatoliberin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Zoology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Diaphragms For Electromechanical Transducers (AREA)
- Oscillators With Electromechanical Resonators (AREA)
- Amplifiers (AREA)
- Electrophonic Musical Instruments (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
94356
Menetelmä farmaseuttisesti käyttökelpoisen kasvuhormonia vapauttavan tekijän synteettisen peptidianalogin tai sen ei-myrkyllisen suolan valmistamiseksi 5 Esillä oleva keksintö koskee menetelmää farmaseut tisesti käyttökelpoisen kasvuhormonia vapauttavan tekijän synteettisen peptidianalogin tai sen ei-myrkyllisen suolan valmistamiseksi.
Keksinnön tausta 10 Fysiologit ovat jo pitkään olleet perillä siitä, että alanäkökukkula säätelee aivolisäkkeen etulohkon eri-tysfunktioita, jolloin alanäkökukkula tuottaa erityisiä aineita, jotka stimuloivat tai inhiboivat kunkin aivoli-säkehormonin eritystä. Alanäkökukkulaliitteinen inhibitio-15 tekijä karakterisoitiin v. 1972 somatostatiinin muodossa, joka inhiboi kasvuhormonin (GH) eritystä. V. 1982 ihmisen haimaliitteisiä (kasvain-) vapautustekijöitä (hpGRF) eristettiin ihmisen haimakasvain -uutteista, ne puhdistettiin, karakterisoitiin, syntetisoitiin ja testattiin, jolloin 20 niiden todettiin edistävän GH:n vapautumista aivolisäkkeestä. Molemmat kyseiset hypofysiotrofiset tekijät on sittemmin tuotettu kokonaissynteesillä ja natiivien rakenteiden analogeja on syntetisoitu. Ihmisen alanäkökukkula-GH-vapautustekijän rakenne on tarkalleen sama; täten il-·. 25 maisua "hGRF" käytetään tästä eteenpäin.
Yhteenveto keksinnöstä
Nyt on syntetisoitu ja testattu synteettisiä poly-peptidejä, jotka vapauttavat GH:ta viljellyistä aivolisä-kesoluista, joiden vastustus entsymaattista hajoamista 30 vastaan elimistössä on kasvanut ja jotka osoittavat var-• sin huomattavasti lisääntynyttä tehoa. Nämä edulliset omi- ’ naisuudet ovat seurausta siitä, että kyseiset peptidit ovat alfa-heelikaalisessa muodossa, jonka stabiilisuus on aiempaa parempi, jolloin peptideissä on yhdessä tai useam-35 massa asemista 5, 17, 23, 26 ja 27 ainakin yksi jäännös, 2 94356 joka on substituoitu metyyliryhmällä alfa-hiiliatomissaan (CaMe), jolloin edullisesti useampi näistä jäännöksistä on täten substituoitu. Ala, jonka alfa-hiiliatomi on substituoitu metyyliryhmällä, on merkitty lyhenteellä CMA tai 5 Aib (nimestä aminoisovoihappo), kun taas Leu, jonka alfa-hiiliatomi on substituoitu metyyliryhmällä, merkitään lyhenteellä CML.
Edeltävän lisäksi peptidit voivat sisältää muita substituutioita natiiveissa hormoneissa tavattuihin eri-10 laisiin jäännöksiin. Esimerkiksi D-Ala, NaCH3-D-Ala (D-NMA) tai NMA voi olla substituoitu 2-asemaan. Asemassa 27 esiintyy edullisesti Met:in asemesta joko CaMeLeu (CML) tai Nle; kuitenkin läsnä voi olla D-Met tai Nva tai muita jäännöksiä. Peptideissä saattaa niinikään olla jokin seu-15 raava jäännös 1-asemassa: Tyr, D-Tyr, Met, Phe, D-Phe, pCl-Phe, Leu, His ja D-His, joka jäännös voi mahdollisesti käsittää metyylisubstituution joko alfa-hiilessä tai alfa-aminoryhmässä, tai alfa-aminoryhmä voi puuttua (des-amino); niinikään tämän jäännöksen alfa-aminoryhmä voi 20 olla asyloitu, edullisesti asetyylillä (Ac) tai formyylil-la (For). Peptidit voivat mahdollisesti sisältää muita alalla tunnettuja substituutioita? esim. D-Asp 3-asemassa ja/tai Arg 12-asemassa ja/tai Phe tai D-Tyr 10-asemassa ja/tai Ala 15-asemassa ja/tai Asn 28-asemassa.
·. 25 Selityksen sivulla 14 olevassa taulukossa I esite tyt aktiivisuustiedot osoittavat, että keksinnön mukaisesti valmistetuilla yhdisteillä, joilla on CaMe-modifikaatio ainakin yhdessä kohdista 5, 17, 23, 26 tai 27, on erittäin merkitsevästi suurempi bioteho eli 200 - 1000 % suurempi 30 teho kuin luonnon hormonilla.
; EP-hakemusjulkaisu 292334 kohdistuu tämän alan ai kaisiin tutkimuksiin, mutta millään siinä esitetyistä CaMe-Leu-substituutioista ei ollut osoitettavissa yhtään merkittävästi lisääntynyttä biotehoaa, vaikka substituutiot 35 eivät olleet haitallisiakaan. EP-hakemusjulkaisun sivulla 3 94356 13 olevassa taulukossa ei ole myöskään lueteltu yhdisteitä, joilla olisi tässä määritellyt spesifiset substituutiot, mikä on yhtäpäivää edellä mainitun kanssa. Tämän keksinnön mukaisesti valmistettavien yhdisteiden suurempi 5 teho on siten sekä merkittävä että yllättävä.
Kuvataan myös farmaseuttisia koostumuksia, jotka sisältävät sellaisia analogeja, joiden pituus on noin 29 -44 jäännöstä, tai jonkin näistä ei-myrkyllistä suolaa, dispergoituna farmaseuttisesti tai eläinlääketieteellises-10 ti hyväksyttävään nestemäiseen tai kiinteään kantajaan. Tällaisia farmaseuttisia koostumuksia voidaan käyttää kliinisessä lääketieteessä, sekä ihmis- että eläin-, annettaviksi terapeuttisiin tarkoituksiin, kuten myös diagnostisesta. Lisäksi niitä voidaan käyttää lämminveristen 15 eläinten, mukaan lukien siipikarja, kasvun edistämiseksi, sekä vesiviljelyssä.
Yksityiskohtainen kuvaus edullisista suoritusmuodoista
Peptidien määrittelemiseksi käytettynä nimikkeis-20 tönä on Schroderin & Lubken spesifioima, "The Peptides", Academic Press (1965), jolloin tavanomaisen esitystavan mukaan N-pään aminoryhmä merkitään vasemmalle ja C-pään karboksyyliryhmä oikealle. Luontaisella aminohapolla tarkoitetaan jotain tavallisista, luontaisesti esiintyvistä, 25 proteiineissa tavatuista aminohapoista, joita ovat Gly, Ala, Vai, Leu, Ile, Ser, Thr, Lys, Arg, Asp, Asn, Glu, Gin, Cys, Met, Phe, Tyr, Pro, Trp ja His. Nlerllä tarkoitetaan norleusiinia ja Nvarlla tarkoitetaan norvaliinia. Jos aminohappojäännöksellä on isomeerisiä muotoja, esite-30 tään nimenomaan aminohapon L-muoto, ellei toisin vartavas-; ten ole ilmoitettu. D-NMA merkitsee alaniinin D-isomeeriä, jossa alfa-aminoryhmä on substituoitu metyylillä.
Keksintö koskee mentelmää farmaseuttisesti käyttökelpoisen kasvuhormonia vapauttavan tekijän synteettisen 35 peptidianalogin tai sen ei-myrkyllisen suolan valmistami 4 94356 seksi, jonka peptidin sekvenssi on (B)R^Rj-Rj-Ala-(Q1 )1^-Phe-Thr-Rg-Ser- (Q2) R10-Arg-R12- (Q3)R13-Leu-R15-Gln- (Q4) Leu-R18- (Q5) Ala-Arg-R21- (Q8) ^22” (Q7) ^eu—R24—R28— (¾)R26~" (Q9) ^27-R28~ Gln-Gln-Gly-Glu-R34-Asn-Gln-Glu-R38-R39-R40-Arg-R42-R43-R44, 5 jossa R1 on Tyr, D-Tyr, Met, Phe, D-Phe, pCl-Phe, Leu, His tai D-His; B on H, CaMe, NaMe, desamino, Ac tai For; R2 on Ala, D-Ala, NMA tai D-NMA; R3 on Asp tai D-Asp; Rj on Ile tai Leu; Rg on Ser, Asn, Lys, Arg, Asp tai Glu; R10 on Tyr, D-Tyr tai Phe; R12 on Arg tai Lys; R13 on Ile, Vai, Leu tai 10 Ala; R15 on Gly tai Ala; R18 on Ser tai Tyr; R21 on Lys, D-Lys, Arg tai D-Arg; R22 on Leu, Ile, Ala tai Vai; R24 on Gin tai His; R25 on Asp tai Glu; R26 on Ile tai Leu; R27 on Met, D-Met, Ala, Nle, Ile, Leu, Nva tai Vai; R28 on Asn tai Ser; R34 on Ser tai Arg; R38 on Arg tai Gin; R39 on Gly tai Arg; 15 R40 on Ala tai Ser; R42 on Phe, Ala tai Vai; R43 on Asn tai
Arg; R44 on luontainen aminohappo; Q1 - Q9 ovat kukin joko H tai C®Me, edellyttäen kuitenkin, että kaikki jäännökset R30 - R44, mainitut rajat mukaan lukien, voivat - tai mikä tahansa sekvenssi niistä voi - puuttua, alkaen C-päästä, 20 ja edellyttäen samoin, että ainakin yksi Q^stä, Q4:stä, Q7:stä, Q8:sta ja Q9:stä on CaMe. Edeltävän eräässä edullisessa alaluokassa Rj on Ile, R18 on Ser, R24 on Gin, R25 on Asp, R26 on Ile, R34 on Ser, R38 on Arg, R39 on Gly ja R40 on Ala. Jos peptidi ulottuu asemaan 44, R44 on edullisesti Leu .# 25 tai Vai.
Toinen edullinen alaluokka ovat peptidit, joiden sekvenssi on seuraava: (B) R1-R2-R3-Ala- (Q^ Ile-Phe-Thr-Re-Ser- (Q2) R10-Arg-Ri2_ (Q3) R13-Leu-R15-Gln- (Q4) Leu-Ser- (Qs) Ala-Arg-R21- (Q6) R22-30 (Q7) Leu-Gln-Asp- (Q8) Ile- (Q9) R27-R28-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser- : Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-R42-R43-R44, jossa R1 on Tyr, D-Tyr, Met, Phe, D-Phe, pCl-Phe, Leu, His tai D-His; B on H, CaMe, NaMe, desamino, Ac tai For; R2 on Ala, D-Ala, NMA tai D-NMA; R3 on Asp tai D-Asp; R8 on Ser, Asn, Lys, Arg, 35 Asp tai Gin; R10 on Tyr, D-Tyr tai Phe; R12 on Arg tai Lys; 5 94356 R13 on Ile, Vai, Leu tai Ala; R15 on Gly tai Ala; R21 on Lys, D-Lys, Arg tai D-Arg; R22 on Leu, Ile, Ala tai Vai; R27 on Met, D-Met, Ala, Nle, Ile, Leu, Nva tai Vai; R28 on Asn tai Ser; R42 on Phe, Ala tai Vai; R43 on Asn tai Arg; R44 on 5 luontainen aminohappo; Q, - Q9 ovat kukin joko H tai CaMe, edellyttäen kuitenkin, että jotkin tai kaikki jäännökset R30 - R44, mainitut rajat mukaan lukien, voivat puuttua sekvenssistä alkaen C-päästä, ja edellyttäen, että ainakin yksi Q^stä, Q4:stä, Q7:stä, Q8:sta ja Q9:stä on CaMe. Missä 10 tahansa näistä peptideistä C-pään aminohappojäännöksen karboksyyliryhmä voi olla jokin seuraava radikaali: -COOR, -CRO, -CONHNHR, -CON(R)(R') tai -CH2OR, joissa R ja R' ovat kumpikin alempi alkyyli, fluori-(alempi alkyyli) tai vety; metyyli, etyyli ja propyyli ovat edulliset (alempi alkyy-15 li)-ryhmät. Edullisesti se on -CONHR, jossa R on H tai alempi alkyyli.
Edelleen seuraava edullinen alaluokka keksinnön mukaisesti saatavia peptidejä ovat ne, joiden kaava on: (B) R1-R2-Asp-Ala- (Q,) I le-Phe-Thr-R8-Ser- (Q2) R10-Arg-20 R12-(Q3) R13-Leu-R15-Gln- (Q4) Leu—R^8— (Q5) Ala—Arg—R2^— (Q8) Rjj- (Q7) ”
Leu-R24-R25-(Q8)R26-(Q9)R27-R28-Arg-Gln-Gln-Gly-Y, jossa R, on Tyr, D-Tyr, Phe, D-Phe, His tai D-His; B on H, c'fae, N°Me; R2 on Ala, D-Ala, NMA tai D-NMA; Rg on Ser, Asn, Lys, Arg, Asp tai Glu; R10 on Tyr, D-Tyr tai Phe; R12 on Arg tai Lys; • t 25 R13 on Ile, Vai, Leu tai Ala; R15 on Gly tai Ala; R18 on Ser tai Tyr; R21 on Lys, D-Lys, Arg tai D-Arg; R22 on Leu, Ile, Ala tai Vai; R24 on Gin tai His; R25 on Asp tai Glu; R27 on Met, Ala, Nle, Ile, Leu, Nva tai Vai; R28 on Asn tai Ser; Y on NHR, jossa R on H tai alempi alkyyli; Q1 - Q9 ovat ku-30 kin joko H tai CaMe, edellyttäen kuitenkin, että C-päästä ; voi puuttua Gly, Gln-Gly tai Gln-Gln-Gly, ja edellyttäen samoin, että ainakin yksi Q^stä, Q4:stä, Q7:stä, Qs:sta ja Q9: stä on C^e.
Kuten edellä on määritelty, fragmentit, jotka ulot-35 tuvat N-päästä jäännökseen 29 tämä mukaan lukien, ovat 6 94356 biologisesti tehokkaita aikaansaadessaan GH:n vapautumisen aivolisäkkeestä, ja sellaiset, pituudeltaan 29 - 32 jäännöksen biologisesti aktiiviset fragmentit, joiden C-pää on amidi tai substituoitu amidi, ovat kaikkein edullisimpia.
5 Silloin kun peptidissä on 40 jäännöstä tai tätä enemmän, ei ole selvää ensisijaisuutta C-pääryhmälle.
Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että (i) liitetään yhteen yksittäisiä aminohappoja tai lyhyitä peptidejä yhdisteen muodostamiseksi, joka sisältää 10 ainakin yhden suojaryhmän ja jolla on seuraava sekvenssi (II) tai tarkoituksen mukaisesti lyhennetty osa siitä: X1-(B)R1(Xtai X2)-R2-R3(X3)-Ala-(Qx)R5-Phe-Thr(X4)-Re(X8)-Ser-(x4) - (Q2) R10 (X2) - Arg (X6) -R12 (X6 tai X7) - (Qa) R13) - Leu-R15 -Gin (X5) -(Q4)Leu-R18(X2)-(Q5)Ala-Arg(X6)-R21 (X6 tai X7)-(Q6)R22-(Q7)Leu-15 R24(X5 tai X)-R25(X3)-(Q8)R26-(Q9)27-R28(X4 tai X5)-Arg(X6)-
Gln(X5)-Gln(X5)-Gly-Glu(X3)-R34(X4 tai X6)-Asn(X5)-Gln(X5)-Glu(X3)-R38(X6 tai X5)-R39(X6)-R40(X2)-Arg(X6)-R42-R43(X5 tai X6)-R44(X8)-X9, jossa (X), (X1), (X2), (X3), (X4), (X5), (X6), (X7) ja (X8) ovat kukin joko vety tai suojaryhmä ja (X9) on joko 20 amidi tai hydroksi tai suojaryhmä, ja (ii) näin saatua yhdistettä (II) käsitellään sopivalla reagenssilla suoja-ryhmän tai suojaryhmien poistamiseksi, jolloin saadaan kaavan (I) mukainen sekvenssi, ja (iii) puhdistetaan näin saatu peptidi.
·, 25 Peptidit syntetisoidaan siis sopivalla menetelmäl lä, kuten pelkästään kiinteäfaasitekniikoita käyttäen, osittaisia kiinteäfaasitekniikoita käyttäen, käyttämällä fragmenttikondensaatiota tai liuoskytkemisiä. Esimerkiksi tekniikoita pelkästään kiinteäfaasisynteesiä silmällä pi-30 täen esitetään käsikirjassa "Solid-Phase Peptide Syn-·' thesis", Stewart & Young, Freeman & Co., San Fransisco, 1969, ja niitä esittelee esimerkkiluontoisesti US-patent-tijulkaisu nro 4 105 603, joka myönnettiin 8. elokuuta 1978 Valelle et ai. Liuossynteesiä kuvataan yksityiskoh-. 35 taisesti julkaisussa "Methoden der Organischen Chemie 7 94356 (Houben-Weyl): Synthese von Peptiden", E. Wunsch (toimittaja) (1974) Georg Thieme Verlag, Stuttgart, (Länsi-)Saksa. Fragmenttikondensaatioon perustuvaa synteesimenetelmää esitellään US-patenttijulkaisussa nro 3 972 859 (3.
5 elokuuta, 1976). Muita käytettävissä olevia synteesejä esitellään US-patenttijulkaisussa nro 3 842 067 (15. lokakuuta, 1974) ja US-patenttijulkaisussa nro 3 862 925 (28. tammikuuta, 1975).
Yhteistä tällaisille synteeseille on eri aminohap-10 poryhmien labiilien sivuketjuryhmien suojaaminen sopivilla suojaryhmillä, jotka estävät kemiallisen reaktion tapahtumisen juuri tuossa kohdassa ryhmän lopulliseen pois-tamisajankohtaan asti. Tavallisesti niinikään yhteistä on aminohapon tai fragmentin alfa-aminoryhmän suojaaminen 15 siksi aikaa, kun tuon osuuden karboksyyliryhmä reagoi, minkä jälkeen alfa-aminoa suojaava ryhmä poistetaan selektiivisesti, jotta seuraava reaktio voi tapahtua tuossa kohdassa. Täten tavanomaista on, että synteesin yhtenä vaiheena muodostuu välituoteyhdiste, johon sisältyvät 20 kaikki aminohappojäännökset, jotka sijaitsevat tuotteelle halutussa sekvenssissä peptidiketjussa, jossa sivuketju-suo jaryhmät on kytketty tarkoituksenmukaisiin jäännöksiin.
Tässä suhtessa esillä oleva keksintö luo välituotteita, joiden kaava on (II) X1-(B)R,(X tai X2) -R2-R3 (X3) -. 25 Ala- (Q, ) R^Phe-Thr (X4) -RgfX8) -Ser (X4) - (Q2) R10(X2) -Arg (X6) -R12(X6 tai X7)-(Q3)R13-Leu-R15-Gln(X5)-(Q4)Leu-R18(X2 tai X4)-(Q5)Ala-Arg (X6) -R21 (X6 tai X7) -(Q6)R22-(Q7)Leu-R24(X5 tai X)-R25(X3)-(08^26-(09^27-½^ tai X5)-Arg(X6)-Gln(X5)-Gln(X5)-Gly-Glu-(X3)-R34(X4 tai X6)-Asn(X5)-Gln(X5)-Glu(X3)-R38(X6 tai X5)-R39-30 (X6) -R40 (X2) -Arg(X6) -R42-R43 (X5 tai X6)-R44 (X8)-X9, jossa X1 on ; joko vety tai alfa-aminon suojaryhmä. X1:nä esiintyvät al- fa-aminon suojaryhmät ovat alalla polypeptidien vaiheittain etenevässä synteesissä käyttökelpoisiksi hyvin tunnettuja ryhmiä. Alfa-aminosuojaryhmäluokkia, joita voidaan 35 käyttää x’:nä, ovat (1) aromaattiset uretaanityypin suoja- 8 94356 ryhmät, kuten fluorenyylimetyylioksikarbonyyli (FMOC), bentsyylioksikarbonyyli (Z) ja substituoitu Z, kuten p-klooribentsyylioksikarbonyyli, p-nitrobentsyylioksikarbo-nyyli, p-bromibentsyylioksikarbonyyli ja p-metoksibentsyy-5 lioksikarbonyyli; (2) alifaattiset uretaanisuojaryhmät, kuten t-butyylioksikarbonyyli (BOC), di-isopropyylimetyy-lioksikarbonyyli, isopropyylioksikarbonyyli, etoksikarbo-nyyli, allyylioksikarbonyyli; ja (3) sykloalkyyli-, ure-taanityypin suojaryhmät, kuten syklopentyylioksikarbonyy-10 li, adamantyylioksikarbonyyli ja sykloheksyylioksikarbo nyyli. Edullinen alfa-aminon suojaryhmä on BOC, silloinkin kun NaMe-substituoitua jäännöstä käytetään 1-asemassa; luonnollisesti X1 on H, kun B on desamino.
X on vety tai suojaryhmä His:in imidatsolitypelle, 15 kuten Tos.
X2 voi olla sopiva suojaryhmä Tyr:in fenolihydrok-syyliryhmälle, kuten tetrahydropyranyyli, tert-butyyli, trityyli, Bzl, CBZ, 4Br-CBZ ja 2,6-diklooribentsyyli (DCB). Edullinen suojaryhmä on 2,6-diklooribentsyyli. X2 20 voi olla vety, mikä merkitsee sitä, että kyseisessä ase massa olevassa aminohappojäännöksessä ei ole sivuketjun suojaryhmää.
X3 on vety tai sopiva esterin muodostava suojaryhmä Aspiin tai Glu:n karboksyyliryhmälle, kuten bentsyyli . 25 (OBzl), 2,6-diklooribentsyyli, metyyli ja etyyli.
• / X voi olla sopiva suojaryhmä Thriin tai Serrin hyd-roksyyliryhmälle, kuten asetyyli, bentsoyyli, tert-butyyli, trityyli, tetrahydropyranyyli, Bzl, 2,6-diklooribentsyyli ja CBZ. Edullinen suojaryhmä on Bzl. X4 voi olla ve-30 ty, mikä merkitsee, ettei hydroksyyliryhmässä ole suoja-·' ryhmää.
X5 on vety tai sopiva suojaryhmä Asn:in tai Giniin sivuketjun amidoryhmälle. Se on edullisesti ksantyyli (Xan).
9 94356 X6 on sopiva suojaryhmä Arg:in guanidoryhmälle, kuten nitro, Tos, CBZ, adamantyylioksikarbonyyli ja BOC, tai se on vety.
X7 on vety tai sopiva suojaryhmä Lysrin sivuketju-5 aminoryhmälle. Edustavia sopivia sivuketjuaminon suojaryh-miä ovat 2-klooribentsyylioksikarbonyyli (2-Cl-Z), Tos, t-amyylioksikarbonyyli ja BOC.
X8 on vety tai sopiva sivuketjun suojaryhmä edellä yleisesti spesifioidun mukaisesti.
10 Metriä voi mahdollisesti suojata happi, mutta se jätetään edullisesti suojaamatta.
Sivuketjuaminon suojaryhmän valinta ei ole ratkaisevan tärkeätä paitsi, että yleensä valitaan sellainen suojaryhmä, joka ei poistu poistettaessa suojaryhmiä alfa-15 aminoryhmistä synteesin aikana. Kuitenkaan joidenkin aminohappojen, esim. Hisrin, suojaaminen ei ole yleensä tarpeellista sen jälkeen, kun kytkeminen on saatettu päätökseen, jolloin (toisaalta) suojaryhmät voivat olla samoja.
X9 on sopiva suojaryhmä C-pään karboksyyliryhmälle, 20 kuten esterin muodostava ryhmä X3, tai se on ankkurisidos, jota käytetään kiinteäfaasisynteesissä kytkemisen kiinteään hartsikantajaan suorittamiseksi, tai se on des-X9, missä tapauksessa C-pääjäännös käsittää karboksyyliosuu-den, joka on Y, edellä määritellyn mukaisesti. Käytettäes-25 sä kiinteää hartsikantajaa, se voi olla mikä tahansa alal- k la tunnetuista, kuten kantaja, jonka kaava on: -0-CH2-hart-sikantaja, -NH-bentshydryyliamiini- (BHA-) hartsikantaja tai -NH-parametyylibentshydryyliamiini- (MBHA-) hartsikantaja. Haluttaessa substituoimaton amidi käytetään edulli-30 sesti BHA- tai MBHA-hartsia, koska pilkkomalla saadaan : suoraan kyseinen amidi. Siinä tapauksessa, että halutaan saada N-metyyliamidi, tämä voidaan muodostaa N-metyyli-BHA-hartsista. Jos kuitenkin halutaan muita substituoituja amideja, voidaan käyttää US-patenttijulkaisun nro 35 4 569 967 oppeja, tai jos edelleen C-päähän halutaan muita 10 94356 ryhmiä kuin vapaa happo, peptidin syntetisointi käyttäen liuossynteesimenetelmiä Houben-Weylin tekstissä esitetyn mukaisesti saattaa olla edullista.
Välituotteen kaavassa ainakin yksi X-ryhmistä on 5 suojaryhmä tai X9 sisältää hartsikantajan.
Valittaessa tiettyä sivuketjun suojaryhmää käytettäväksi kyseisten peptidien synteesissä noudatetaan seu-raavia yleisiä sääntöjä: (a) suojaryhmä edullisesti säi lyttää suojaavat ominaisuutensa eikä saa irrota kytkentä-10 olosuhteissa, (b) suojaryhmän tulisi olla stabiili rea-genssin suhteen ja Xan:ia lukuunottamatta on edullisesti stabiili reaktio-olosuhteissa, jotka valitaan alfa-aminon suojaryhmän poistamiseksi synteesin kussakin vaiheessa, ja (c) sivuketjun suojaryhmän tulee olla poistettavissa, kun 15 halutun aminohapposekvenssin käsittävä synteesi on saatettu päätökseen, reaktio-olosuhteissa, jotka eivät epätoivottavalla tavalla muuta peptidiketjua.
Nämä peptidit valmistetaan edullisesti käyttäen kiinteäfaasisynteesiä, kuten sitä synteesiä, jota kuvaa 20 yleisesti Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85 (1963) 2149, vaikka muitakin alalla tunnettuja samanarvoisia kemiallisia synteesejä voidaan käyttää, kuten aiemmin mainittiin.
Kiinteäfaasisynteesi aloitetaan peptidin C-päästä kytkemällä suojattu alfa-aminohappo sopivaan hartsiin. 25 Tällainen lähtömateriaali voidaan valmistaa kiinnittämäl- t lä aminohappo, jonka alfa-amino on suojattu, esterikytken-nän välityksellä klorometyloituun hartsiin tai hydroksime-tyylihartsiin, tai amidisidoksen välityksellä BHA-hartsiin tai MBHA-hartsiin. Hydroksimetyylihartsin valmistusta ku-30 vaavat Bodansky et ai.. Chem. Ind. (London) 38 (1966) : 1597-1598. Klorometyloituja hartseja on kaupallisesti saa tavana valmistajilta Bio Rad Laboratories, Richmond, Kalifornia, sekä Lab. Systems, Inc. Tällaisen hartsin valmistusta kuvaavat Stewart et ai.. "Solid Phase Peptide Syn-35 thesis" (Freeman & Co., San Fransisco, 1969), luku 1, ss.
11 94356 1-6. BHA- ja MBHA-hartsikantajia on kaupallisesti saatavana, ja niitä käytetään yleensä vain silloin, kun syntetisoitavaksi haluttu polypeptidi sisältää substituoimattoman amidin C-päässä.
5 C-pään aminohappo, esim. Asn, joka on suojattu BOCrllä tai Xan:illa, voidaan ensin kytkeä klorometyloi-tuun hartsiin menettelyn mukaan, joka esitetään julkaisussa K. Horiki et ai. . Chemistry Letters (1978) 165-168, käyttäen KF:ää DMF:ssä noin 60 °C:ssa 24 tunnin ajan sekä 10 sekoitusta, jos on määrä syntetisoida esimerkiksi rotan GRF:n (rGRF) 43-jäännöksen vapaa happo -analogi. Sen jälkeen kun BOC-suojattu aminohappo on kytketty hartsikanta-jaan, alfa-aminon suojaryhmä poistetaan, esim. käyttäen trifluorietikkahappoa (TFA) metyleenikloridissa tai pelk-15 kää TFA:ta. Suojaryhmän poistaminen suoritetaan lämpötilassa noin 0 °C:sta huoneenlämpötilaan. Muita vakiopilkko-misreagensseja, kuten HCl:ää dioksaanissa, ja -olosuhteita spesifisten alfa-aminosuojaryhmien poistamiseksi voidaan käyttää kuten kuvataan kirjassa Schroder & Lubke, "The 20 Peptides", 1, Academic Press, 1965, ss. 72-75.
Kun alfa-aminon suojaryhmä on poistettu, loput aminohapot, joiden alfa-aminot ja sivuketjut on suojattu, kytketään vaihe kerrallaan halutussa järjestyksessä edellä määritellyn välituoteyhdisteen saamiseksi, tai kunkin . 25 aminohapon lisäämisen erikseen synteesiin vaihtoehtona jotkut niistä voidaan kytkeä toisiinsa ennen lisäämistä kiinteäfaasireaktoriin. Sopivan kytkentäreagenssin valinta kuuluu alan ammattitaitoon. Erityisen sopiva kytkentä-reagenssi on N,N1-disykloheksyylikarbodi-imidi (DCCI).
30 Peptidien kiinteäfaasisynteesissä käytetyt akti- ; vointireagenssit tunnetaan hyvin peptidi(kemian) alalla.
Esimerkkejä sopivista aktivointireagensseista ovat karbo-di-imidit, kuten N,N1-di-isopropyylikarbodi-imidi ja N-etyyli-N'-(3-dimetyyliaminopropyyli)karbodi-imidi. Muita 35 aktivointireagensseja ja niiden käyttöä peptidikytkennäs- 12 94356 sä kuvataan kirjassa Schroder & Lubke, suura, luvussa III, ja kuvaa Kapoor, J. Pharm. Sei. 59 (1970) 1-27.
Kutakin suojattua aminohappoa tai aminohapposekvenssiä viedään kiinteäfaasireaktoriin noin 4-kertainen 5 tai suurempi ylimäärä, ja kytkeminen voidaan suorittaa väliaineessa, joka koostuu dimetyyliformamidista (DMF) ja metyleenikloridista (CH2C12) (1:1), tai pelkästään DMF:ssä tai CH2Cl2:ssa. Jos ilmenee epätäydellistä kytkeytymistä, kytkentämenettely toistetaan ennen alfa-aminon suojaryh-10 män poistamista seuraavan aminohapon kytkemistä silmällä pitäen. Jos synteesi suoritetaan manuaalisesti, kytkentä-reaktion onnistumista synteesin kussakin vaiheessa tarkkaillaan edullisesti ninhydriinireaktiolla, E. Kaiserin et ai.. Anal. Biochem. 34 (1970) 595, kuvaaman mukaan. Kyt-15 kentäreaktiot voidaan suorittaa automatisoidusti, kuten käyttäen automaattista Beckman 990 -syntetisaattoria, ja jotain ohjelmaa, kuten ohjelmaa, josta raportoidaan julkaisussa Rivier et ai., Biopolvmers 17 (1978) 1927-1938.
Sitten kun haluttu aminohapposekvenssi on saatu 20 valmiiksi, välituotepeptidi voidaan poistaa hartsikanta-jasta käsittelemällä jollain reagenssilla, kuten nestemäisellä fluorivedyllä, joka ei ainoastaan pilko peptidiä hartsista, vaan pilkkoo niinikään kaikki jäljellä olevat sivuketjun suojaryhmät X, X2, X3, X4, X5, X6, X7 ja X8 sekä . 25 ankkurisidoksen X9 sekä myös alfa-aminon suojaryhmän X1, jos tällaista on käytetty, jolloin saadaan peptidi vapaan hapon muodossa. Jos sekvenssissä esiintyy Met, BOC-suoja-ryhmä poistetaan edullisesti ensin käyttäen trifluorietik-kahappo (TFA)/etaaniditiolia ennen peptidin lohkaisemista 30 hartsista HF:llä mahdollisen S-alkyloitumisen eliminoimi-: seksi. Käytettäessä fluorivetyä lohkaisussa reaktioastiaan sisällytetään anisolia ja metyylietyylisulfidia sieppaajiksi.
Seuraavassa esimerkissä 1 esitetään edullinen me-35 netelmä peptidien syntetisoimiseksi kiinteäfaasitekniikal- 13 94356 la. Tulee luonnollisesti ymmärtää, että vastaavasti pitempi peptidi syntetisoidaan samalla tavalla vain lisäämällä tarvittava luku aminohappoja ketjun C-päähän. Tällä hetkellä arvellaan, että biologisesti aktiivisten fragment-5 tien tulisi sisältää osoitettu sekvenssi N-päässä, jolloin jäännöksien lisäämistä N-päähän ei katsota edulliseksi.
Esimerkeissä valmistettuja synteettisiä peptidejä verrataan synteettiseen hpGRF(l-40)-OH:hon in vitro -määrityksissä, jolloin niiden todetaan osoittavan yleisesti 10 suurempia tehoja GH:n ja samankaltaisten luontaisten aktiivisuuksien erittämiseksi. Kaikki nämä synteettiset peptidit katsotaan biologisesti aktiivisiksi ja mahdollisesti käyttökelpoisiksi GH:n vapautumisen aivolisäkkeestä sti-muloimiseksi.
15 Tiettyjen edustavien synteettisten peptidien suh teellisen tehon edistää kasvuhormonin vapautumista määrittämiseksi suoritetaan in vitro -määrityksiä käyttäen synteettistä hpGRF(1-40)-OH:ta standardina rinnakkaisvertai-lussa ekvimolaarisiin pitoisuuksiin (nyt) syntetisoituja 20 edustavia analogeja. Käytetään viljelmiä, jotka sisältävät rotan aivolisäkesoluja, jotka on otettu eläimestä noin 3 -5 päivää aiemmin. Tällaiset viljelmät katsotaan optimaalisiksi kasvuhormonin eritykselle, ja niitä käytetään vertailutestauksessa sillä yleisellä tavalla, jota kuva-. 25 taan julkaisussa Vale et ai. . Endocrinology 91 (1972) 562- 572, ja jota tarkemmin kuvataan julkaisussa Vale et ai. . Endocrinology 112 (1983) 1553-1555. Inkuboinnin testat tavalla aineella annetaan kestää 3-4 tunnin ajan, minkä jälkeen kasvualustasta otetaan näytteitä, joita prosessoi-30 daan niiden immunoreaktiivisen GH- (ir GH) sisällön mit-: taamiseksi perusteellisesti karakterisoidulla radioimmuu- nimäärityksellä.
Tulokset tästä vertailutestauksesta ekvimolaarisil-la pitoisuuksilla esitetään taulukossa I.
14 94356
Taulukko I
Peptidi Tehot in vitro
hGRF(1-40)-OH
(tämän kokeen standardi) 1,0 5 [NaMeTyr1,Ala15,CML27, 10,00 (5,2 - 20,1)
Asn28] -hGRF (1-29) -NH2 [NaMeTyr1,Ala15,CML26, 6,44 (4,0 - 10,3)
Nle27, Asn28] -hGRF (1-29) -NH2 [NaMeTyr1,Ala15,CML23, 1,96 (1,1 - 3,3) 10 Nle27, Asn28] -hGRF (1-29) -NH2 [NaMeTyr1,Ala15,CML17, 5,41 (3,5 - 8,3)
Nle27, Asn28] -hGRF (1-29) -NH2 [NaMeTyr1, CML·5, Ala15, 3,59 (2,3 - 5,5) N1 e27, Asn28 ] -hGRF (1 -2 9) -NH2.
15
Kasvuhormonin erityksen in vitro -kokeiden lisäksi in vivo -kokeissa synteettisiä peptidejä ruiskutetaan laskimonsisäisesti uretaanilla nukutettuihin urospuolisiin rottiin, jolloin saadaan määritetyksi, että nämä peptidit 20 suppressoivat spontaania GH-eritystä tuhoamatta vastetta eksogeeniselle GRF:lie. Verinäytteet, jotka on otettu välittömästi ennen ruiskeiden antoa sekä 10, 30 ja 60 minuutin kuluttua tästä, sekä veren GH-tasot mitataan radioim-muunimäärityksellä. Tässä näiden synteettisten peptidien . 25 in vivo -testauksessa ilmenee, että niistä jokaisella on suurempi biologinen teho kuin hpGRF(l-40)-OH:n osoittama ja että niistä jokaisen tehokkuus on kestoltaan oleellisesti pitempi, minkä osoittavat sekä 30 että 60 minuutin kuluttua i.v.-ruiskeesta mitatut veren aivolisäke-GH-ta-30 sot. Muita tunnettuja in vivo -GRF-kokeita, jotka tiede-: tään tehokkaiksi GH-erityksen toteamiseksi, käytetään näi den tuloksien varmistamiseksi. Näiden peptidien annostuksia noin 500 nanogrammaa - noin 50 mikrogrammaa kohden kilogrammaa ruumiin painoa pidetään tehokkaina GH-erityk-35 sen aikaansaamiseksi.
i, 15 94356 Tällaiset synteettiset hGRF-analogit ja mahdollisesti rGFR-analogit ovat oletettavasti käyttökelpoisia humaanikäyttösovellutuksissa, joissa lääkäri haluaa nostaa GH-tuotantoa. GH-erityksen stimulointi tällaisilla 5 analogeilla on kiinnostavaa potilailla, jotka potevat täydellistä tai suhteellista GH-vajausta, jonka on aiheuttanut endogeenisen GRF:n liian alhainen tuotanto. Edelleen ilmeisestikin lisääntynyt GH-eritys liittyvine kasvuli-säyksineen voitaisiin saada ihmisissä tai eläimissä, joi-10 den GH-tasot ovat normaalit. Lisäksi (näiden aineiden) antaminen oletettavasti muuttaa elimistön rasvasisältöä ja modifioi muita GHrsta riippuvaisia aineenvaihdunnallisia ja immunologisia prosesseja ja kehitysprosesseja. Esimerkiksi nämä analogit saattavat olla käyttökelpoisia keinona 15 stimuloida anabolisia prosesseja henkilöillä, jotka ovat esimerkiksi palovammojen syntymistä seuraavissa tiloissa. Toisena esimerkkinä näitä analogeja voidaan antaa kaupallisille lämminverisille eläimille, kuten kanoille, kalkkunoille, sioille, vuohille, nautakarjalle ja lampaille, ja 20 niitä voidaan käyttää vesiviljelyssä kalojen ja muiden kylmäveristen merieläinten kasvattamiseksi, esim. merikil-pikonnien ja ankeriaiden, ja sammakkoeläinten, kasvun lisäämiseksi ja proteiini/rasva-suhteen nostamiseksi, mihin päästään syöttämällä tehokkaita määriä kyseisiä peptidejä.
. 25 Silmällä pitäen (niiden) antoa ihmiselle näiden < synteettisten peptidien puhtauden tulisi olla ainakin noin 93 % ja edullisesti ainakin 98 %. Puhtaudella tämän patenttijulkaisun tarkoituksiin viitataan siihen, että tarkoitettu peptidi muodostaa ilmoitetun paino-%:n kaikista 30 läsnä olevista peptideistä ja peptidifragmenteista. Täl-: laisten synteettisten peptidien antamiseksi kaupallisille ja muille eläimille kasvun edistämiseksi ja rasvasisällön vähentämiseksi alhaisemmat puhtaudet saattavat olla hyväksyttäviä .
16 94356 Näitä synteettisiä peptidejä tai niiden ei-myrkyl-lisiä suoloja, yhdistettyinä farmaseuttisesti tai eläin-lääketieteellisesti hyväksyttävään kantajaan farmaseuttisen koostumuksen muodostamiseksi, voidaan antaa eläimil-5 le, mukaan lukien ihmisille, joko laskimonsisäisesti, ihonalaisesti, lihaksensisäisesti, ihon kautta, esim. ne-nänsisäisesti tai myös suun kautta. Lääkäri saattaa määrätä näitä aineita GH:n vapautumisen stimuloimiseksi tapauksissa, joissa hoidettava kohde tarvitsee tällaista tera-10 peuttista hoitoa. Tarvittava annostus vaihtelee hoidettavan nimenomaisen tilan mukaan, tilan vakavuuden mukaan sekä halutun hoidon keston mukaan.
Tällaisia peptidejä annetaan usein ei-myrkyllisten suolojen muodossa, kuten happoadditiosuoloina tai metal-15 likomplekseina, jotka on muodostettu esim. sinkin, raudan tai muun samankaltaisen kanssa (ja jotka katsotaan suoloiksi tämän patenttijulkaisun tarkoituksiin). Esimerkkejä tällaisista happoadditiosuoloista ovat hydrokloridi, hyd-robromidi, sulfaatti, fosfaatti, maleaatti, asetaatti, 20 sitraatti, bentsoaatti, sukkinaatti, malaatti, askorbaat-ti, tartraatti ja muut samankaltaiset. Jos vaikuttava ainesosa on määrä antaa suun kautta tablettimuodossa, tabletti saattaa sisältää sideaineen, kutan traganttikumi, maissitärkkelys tai gelatiini; hajoamista edistävän ai-. 25 neen, kuten algiinihappo; ja voiteluaineen, kuten magne- siumstearaatti. Jos anto halutaan suorittaa nestemäisessä muodossa, voidaan käyttää makeutusta ja/tai flavorointia, ja suorittaa laskimonsisäinen lääkkeenanto isotoonisessa suolaliuoksessa, fosfaattipuskuriliuoksessa tai vastaavis-30 sa.
; Kyseisiä peptidejä tulisi antaa ihmisille lääkärin valvonnassa ja farmaseuttiset koostumukset sisältävät tavallisesti peptidin yhdistettynä tavanomaiseen, kiinteään tai nestemäiseen ja farmaseuttisesti hyväksyttävään kanta-35 jaan. Tavallisesti ruoansulatuskanavan ulkopuolinen annos- 17 94356 tus on noin 0,01 - noin 1 mikrogrammaa peptidiä kohteen ruumiin painokilogrammaa kohden.
Niinikään saattaa olla toivottavaa antaa tällaista peptidiä pitempien aikajaksojen ajaksi, esimerkiksi aika-5 jaksojen yhdestä viikosta yhteen vuoteen ajaksi, yhdellä yksittäisellä antokerralla, jolloin voidaan käyttää hitaan vapautumisen annostusmuotoja tai varasto- tai siirrean-nostusmuotoja. Esimerkiksi annostusmuoto voi sisältää yhdistettä, jonka liukoisuusaste ruumiin nesteisiin on al-10 hainen, tämän farmaseuttisesti hyväksyttävänä ei-myrkylli- senä suolana, esimerkiksi happoadditiosuolana, joka on muodostettu moniarvoisen hapon kanssa; suolana, joka on muodostettu moniarvoisen metallikationin kanssa; tai näiden kahden suolan yhdistelmänä. Suhteellisen niukkaliu-15 koinen suola voidaan niinikään koostaa geeliksi, esimerkiksi aluminiumstearaattigeeliksi. Sopiva hitaan vapautumisen varastokoostumus, joka annetaan ruiskeena, voi sisältää peptidin tai sen suolan myös dispergoituna tai kapseloituna hitaasti hajoavaan, ei-myrkylliseen tai ei-anti-20 geeniseen polymeeriin, kuten polymaitohappo/polyglykoli- happopolymeeriin, esimerkiksi kuten kuvataan US-patentti-julkaisussa nro 3 773 919. Nämä yhdisteet voidaan niinikään koostaa Silastic-luonteisiksi siirteiksi.
On samoin mahdollista antaa kyseisiä peptidejä ih-. 25 misille ihon kautta pitkähkön aikajakson ajan sähkövirtaa käyttäen, kuten raportoidaan julkaisussa Meyer, B.R., et ai., Clin. Pharm. & Therapeutics 44:6 (1988) 607-612. Esimerkiksi voidaan käyttää ihon kautta lääkettä imeyttäviä lääkelaastareita, joihin liitetään 9 voltin paristo, joka 30 kohdistaa jatkuvasti noin 0,2 milliamperin virran ihmisen ; iholle ja joka siten vie peptidit tehokkaasti orvaskeden läpi verenkiertoon.
Esimerkki 1
Peptidi [NaMeTyrx, Ala15, CML27, Asn28] -hGRF( 1-29 ) -NH2, 35 jonka kaava on N*MeTyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser- 18 94356
Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-GlnAsp-Ile-CML-Asn-Arg-NH2, syntetisoidaan vaiheittain etenevällä tavalla käyttäen Beckman 990 -peptidisyntetisaat-toria ja kaupallisesti saatavana olevaa MBHA-hartsia kuten 5 yleisesti kuvataan julkaisussa Vale et ai.. US-patentti-julkaisu nro 4 292 313. B0C-Arg(Tos):in kytkeminen hartsiin johtaa noin 0,35 millimoolin (mmol) Arg:ia substituutioon kohden hartsigrammaa.
Suojaryhmien poiston ja neutraloinnin jälkeen pep-10 tidiketjua rakennetaan vaihe kerrallaan hartsiin. Suoja-ryhmien poisto, neutralointi ja kunkin aminohapon lisääminen suoritetaan yleisesti julkaisussa Rivier, J., J. Amer. Chem. Soc. 96 (1974) 2986-2992, yksityiskohtaisesti esitetyn menettelyn mukaan. Kaikista käytetyistä liuotti-15 mistä poistetaan huolellisesti kaasut juoksuttamalla niihin inerttiä kaasua, esim. heliumia tai typpeä, jotta varmistetaan, ettei läsnä ole happea, joka saattaisi epätoivottavasta hapettaa rikin Met-jäännöksessä.
Suojaryhmien poistaminen suoritetaan edullisesti 20 seuraavan kaavion A mukaan:
Kaavio A
Reaaenssl Sekoitusaika (min) 1. 60 % TFA/2 % etaaniditioli 10 2. 60 % TFA/2 % etaaniditioli 15 ,25 3. IPA/1 % etaaniditioli 0,5 4. Et3N (10 %) CH2C12: ssa 0,5 5. MeOH 0,5 6. Et3N (10 %) CH2C12:ssa 0,5 7. MeOH (kahdesti) 0,5 30 8. CH2C12 (kahdesti) 0,5 *
Kytkennät suoritetaan edullisesti seuraavassa kaaviossa B esitetyn mukaisesti: 19 94356
Kaavio A
Reaaenssi Sekoitusaika (min)
9. DCCI
10. BOC-aminohappo 50 - 90 5 li. MeOH (kahdesti) 0,5 12. CH2C12 (kahdesti) 0,5 13. Ac20 (3M) CH2Cl2:ssa 15,0 14. CH2C12 0,5 15. MeOH 0,5 10 16. CH2C12 (kahdesti) 0,5
Lyhyesti grammaa hartsia kohden käytetään 1-2 mmol BOC-suojattua aminohappoa metyleenikloridissä sekä yksi ekvivalentti 1,0 M DCCI:tä metyleenikloridissa kah-15 den tunnin ajan. Kytkettäessä BOC-Arg(Tos):ia käytetään seosta, jossa on 50 % DMF:ää ja metyleenikloridia. Sertin ja Thriin sivuketjuhydroksyylin suojaryhmänä käytetään Bzl-eetteriä. Asm in tai Giniin amidoryhmä suojataan Xamilla DCC-kytkemistä käytettäessä, kuten edullisesti 20 tehdään. Asmin tai Giniin karboksyylipään aktivoimiseksi voidaan käyttää myös p-nitrofenyyliesteriä (ONp), ja esimerkiksi BOC-Asn(ONp) voidaan kytkeä yön yli käyttäen yksi ekvivalentti HOBtitä 50 %in seoksessa DMFiää ja metyleenikloridia, missä tapauksessa ei lisätä DCCitä. Lys-25 sivuketjun suojaryhmänä käytetään 2-klooribentsyylioksi-karbonyyliä (2C1-Z). Tosi ia käytetään Argiin guanidoryh-män ja Hisiin imidatsolitypen suojaamiseksi, ja Glu- tai Asp-sivuketjukarboksyyliryhmä suojataan OBzlillä. Tyriin fenolihydroksyyliryhmä suojataan 2,6-diklooribentsyylillä 30 (DCB). Synteesin päätteeksi saadaan seuraava koostumusi BOC-N^eTyr (X2) -Ala-Asp(X3) -Ala-Ile-Phe-Thr (X4) -Asn-(X5) -Ser (X4) -Tyr (X2) -ArgfX6) -Lys(X7) -Val-Leu-Ala-Gln (X5) -Leu-Ser (X4) -Ala-Arg (X6) -Lys (X7) -Leu-Leu-Gin (X5) -Asp (X3) -Ile-CML-Asn(X5)-Arg (X6)-X9, jossa X2 on DCB, X3 on OBzl, X4 on Bzl, 35 X5 on Xan, X6 on Tos, X7 on 2C1-Z ja X9 on NH-MBHA-hartsi- 20 94356 kantaja. Xan on voinut poistua osittain tai kokonaisuudessaan alfa-aminon suojaryhmän poistamiseksi käytetyssä TFA-käsittelyssä.
Suojatun peptidihartsin lohkaisemiseksi ja suoja-5 ryhmien poistamiseksi siitä sitä käsitellään 1,5 ml:11a anisolia, 0,5 ml:11a metyylietyylisulfidia ja 15 ml:11a fluorivetyä (HF) grammaa peptidihartsia kohden -20 °C:ssa % tunnin ajan ja 0 °C:ssa ¼ tunnin ajan. Sitten kun HF on poistettu tehokkaassa tyhjössä, hartsipeptidijäännöstä 10 pestään vuorotellen kuivalla dietyylieetterillä ja kloroformilla, minkä jälkeen peptidiä uutetaan etikkahapon 2 N vesiliuoksella, josta on kaasut poistettu, ja se erotetaan hartsista suodattamalla.
Lohkaistu ja vailla suojaryhmiä oleva peptidi liuo-15 tetaan sitten 0-5 %:iseen etikkahappoon ja sitä puhdistetaan, mikä saattaa käsittää Sephadex G-50 -hienogeeli-suodatuksen.
Peptidiä puhdistetaan sitten edelleen preparatii-visella tai puolipreparatiivisella HPLC:llä kuten kuvataan 20 julkaisuissa Rivier et ai. . Peptides: Structure and Biological Function 1979 125-128, ja Marki et ai. . J. Am. Chem. Soc. 103 (1981) 3178. Valmistajan Waters Associates prep LC-500 -laitteistoon sopivat panokset pakataan valmisteella 15 - 20 μ C18 Silica valmistajalta Vydac (300A) . 25 CHjCN-gradientti TEAP:ssä muodostetaan käyttämällä Eldex-matalapainegradienttimuodostajaa kuten kuvataan julkaisussa Rivier, J. , J. Lie. Chromatography 1 (1978) 343-367.
Kromatografiafraktioita tarkkaillaan huolellisesti HPLC-:llä, ja vain oleellisesti puhtaiksi osoittautuneet frak-30 tiot kerätään pooliin. Puhdistetuista fraktioista, joiden ; puhtaus on tarkastettu yksittäin, poistetaan suolat käyt täen CH3CN-gradienttia 0,l-%:isessa TFA:ssa. Keskiotos sitten kylmäkuivaamalla saadaan haluttu peptidi, jonka puhtauden tulisi olla yli 98 %.
21 94356
Puhdistetun peptidin optinen kierto mitataan käyttäen Perkin-Elmer-polarimetriä, ja optiseksi kierroksi todetaan [a]D = -52,0° +/- 1 (c = 1, l-%:inen etikkahappo) .
Esimerkki 2 5 40-jäännöksen amidoitu peptidi [C^eHis1, D-NMA2, CML27]-hGRF (1-40)-NH2, jonka kaava on H-CaMeHis-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-CML-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-NH2, syntetisoidaan 10 vaiheittain etenevällä tavalla käyttäen Beckman 990 -pep-tidisyntetisaattoria ja MBHA-hartsia kuten yleisesti kuvataan julkaisussa Vale et ai.. US-patenttijulkaisu nro 4 292 313. Peptidi todetaan oleellisesti puhtaaksi TLCrtä ja HPLC:tä käyttäen.
15 Esimerkki 3 [ D-NMA2, CML27) -rGRF (1-43) -OH, jonka kaava on H-His-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-CML-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Arg-Ser-Arg-Phe-Asn-20 OH, syntetisoidaan vaiheittain etenevällä tavalla käyttäen
Beckman 990 -peptidisyntetisaattoria ja klorometyloitua hartsia, jolloin ensimmäinen kytkeminen suoritetaan kuten kuvataan julkaisussa Chemistry Letters, supra. minkä jäl-‘ keen menetellään kuten kuvataan yleisesti esimerkissä 1.
25 Peptidi todetaan oleellisesti puhtaaksi TLCrtä ja HPLCrtä käyttäen.
Esimerkki 4 hGRF-analogif ragmentti, [I^MeTyr1, Ly s8, Ala15, CML27, Asn28]-hGRF (1-29)-NH2, jonka kaava on NaMeTyr-Ala-Asp-Ala-3 0 Ile-Phe-Thr-Lys-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-
Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-CML-Asn-Arg-NH2, syntetisoidaan vaiheittain etenevällä tavalla käyttäen Beckman 990 -peptidisyntetisaattoria ja MBHA-hartsia kuten esimerkissä 1. Tämä analogi todetaan oleellisesti puhtaaksi TLC-35 :tä ja HPLCrtä käyttäen.
22 94356
Synteesi toistetaan vaihtaen N-pääjäännös, jolloin saadaan [NaMeHis1, Lys8, Ala15, CML27, Asn28] -hGRF (1-29) -NH2.
Esimerkki 5 hGRF-analogif ragmentti [NaMeTyr1, D-Lys21, CML27] -hGRF-5 (1-29)-NH2, jonka kaava on NeMeTyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-
Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-D-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-CML-Ser-Arg-NH2, syntetisoidaan vaiheittain etenevällä tavalla käyttäen Beckman 990 -peptidi-syntetisaattoria ja MBHA-hartsia kuten esimerkissä 1. Pep-10 tidi todetaan oleellisesti puhtaaksi TLC:tä ja HPLCrtä käyttäen.
Esimerkki 6 [ NaMeHis1, D-NMA2, Lys8, D-Arg21, CML27] -rGRF (1-29) -NH2, jonka kaava on NaMe-His-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Lys-Ser-15 Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-D-Arg-Leu-Leu-
His-Glu-Ile-CML-Asn-Arg-NH2, syntetisoidaan vaiheittain etenevällä tavalla käyttäen Beckman 990 -peptidisynteti-saattoria ja MBHA-hartsia kuten esimerkissä 1. Peptidi todetaan oleellisesti puhtaaksi TLC:tä ja HPLC:tä käyttäen. 20 Esimerkki 7 [NaMeTyr1, C^e-D-Tyr10, D-Lys21, CML27] -hGRF (1-29) -NH2, jonka kaava on N^eTyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-CaMe-D-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-D-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-CML-Ser-Arg-NH2, syntetisoidaan vai-25 heittain etenevällä tavalla käyttäen Beckman 990 -pepti- disyntetisaattoria ja MBHA-hartsia kuten esimerkissä 1. Peptidi todetaan oleellisesti puhtaaksi TLC:tä ja HPLC:tä käyttäen.
Esimerkki 8 30 [D-NMA2,CML5,D-Lys21,Nva27]-rGRF(1-29)-NH2, jonka kaa va on H-His-D-NMA-Asp-Ala-CML-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-D-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Nva-Asn-Arg-NH2, syntetisoidaan vaiheittain etenevällä tavalla käyttäen Beckman 990 -peptidisyntetisaattoria ja 35 MBHA-hartsia kuten esimerkissä 1. Peptidi todetaan oleel lisesti puhtaaksi TLCrtä ja HPLCrtä käyttäen.
„ 94356 23
Esimerkki 9 [ D-Phe1, D-NMA2, Glu8, CeMeTyr10,1 le13, CML23 ] -hGRF (1-32)-NHZ, jonka kaava on H-D-Phe-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Glu-Ser-CaMeTyr-Arg-Lys-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-5 Leu-CML-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-NH2, synteti soidaan vaiheittain etenevällä tavalla käyttäen Beckman 990 -peptidisyntetisaattoria ja MBHA-hartsia kuten kuvataan yleisesti julkaisussa Vale et ai. . US-patenttijulkaisu nro 4 292 313. Peptidi todetaan oleellisesti puhtaaksi 10 TLCrtä ja HPLCrtä käyttäen.
Esimerkki 10 [N^eHis1, D-NMA2, C®MeVal13, CML27] -hGRF (1-29) -NH2, j onka kaava on NaMeHis-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-C^eVal-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-15 Asp-Ile-CML-Ser-Arg-NH2, syntetisoidaan vaiheittain ete nevällä tavalla käyttäen Beckman 990 -peptidisyntetisaattoria ja MBHA-hartsia kuten kuvataan yleisesti julkaisussa Vale et ai.. US-patenttijulkaisu nro 4 292 313. Peptidi todetaan oleellisesti puhtaaksi TLC:tä ja HPLCrtä 20 käyttäen.
Esimerkki 11 hGRF-analogif ragmentti, [ For-Tyr1, D-NMA2, C8MeTyr10, CMA19, CML27, Asn28] -hGRF (1-32) -NH2, jonka kaava on For-Tyr-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-CaMeTyr-Arg-Lys-Val-Leu-25 Gly-Gln-Leu-Ser-CMA-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-CML-Asn-
Arg-Gln-Gln-Gly-NH2, syntetisoidaan vaiheittain etenevällä tavalla käyttäen Beckman 990 -peptidisyntetisaattoria ja MBHA-hartsia kuten esimerkissä 1. Tämä analogi todetaan oleellisesti puhtaaksi TLCrtä ja HPLCrtä käyttäen.
30 Esimerkki 12 [D-NMA2, Ly s12, CaMeIle13, CMA19, CML27] -rGRF (1-29) -NH2, jonka kaava on H-His-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Lys-CaMeIle-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-CMA-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-CML-Asn-Arg-NH2, syntetisoidaan vaiheit-35 tain etenevällä tavalla käyttäen Beckman 990 -peptidisyn- 24 94356 tetisaattoria ja MBHA-hartsia kuten esimerkissä 1. Peptidi todetaan oleellisesti puhtaaksi TLCrtä ja HPLC:tä käyttäen.
Esimerkki 13 5 hGRF-analogifragmentti [D-NMA2, Arg12, CML23, Ile27] - hGRF(l-29)-NH2, jonka kaava on H-Tyr-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Arg-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-CML-Gln-Asp-Ile-Ile-Ser-Arg-NH2/ syntetisoidaan vaiheittain etenevällä tavalla käyttäen Beckman 990 10 -peptidisyntetisaattoria ja MBHA-hartsia kuten esimerkissä 1. Peptidi todetaan oleellisesti puhtaaksi TLC:tä ja HPLC:tä käyttäen.
Esimerkki 14 [ D-Phe1, D-NMA2, CaMeVal13, Ala15, CML23, D-Met27] -hGRF (1-15 29)-NH2, jonka kaava on H-D-Phe-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-
Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-CaMeVal-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-CML-Gln-Asp-Ile-D-Met-Ser-Arg-NH2, syntetisoidaan vaiheittain etenevällä tavalla käyttäen Beckman 990 -peptidisyntetisaattoria ja MBHA-hartsia kuten esimerkissä 1. 20 Tämä analogi todetaan oleellisesti puhtaaksi TLC:tä ja HPLCrtä käyttäen.
Esimerkki 15 [D-NMA2, D-Arg21, CML23]-hGRF (1-32)-NH2, jonka kaava on H-Tyr-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-25 Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-D-Arg-Leu-CML-Gln-Asp-Ile-Met-
Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-NH2, syntetisoidaan vaiheittain etenevällä tavalla käyttäen Beckman 990 -peptidisyntetisaattoria ja MBHA-hartsia kuten esimerkissä 1. Tämä analogi todetaan oleellisesti puhtaaksi TLC:tä ja HPLC:tä käyttäen. 30 Esimerkki 16 . [desaminoHis1, D-NMA2, Lys8, Asp25, CML26] -rGRF (1-29) -NH2, jonka kaava on desNH2His-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Lys-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Asp-CML-Met-Asn-Arg-NH2, syntetisoidaan vaiheittain 35 etenevällä tavalla käyttäen Beckman 990 -peptidisynteti- 25 94356 saattoria ja MBHA-hartsia kuten esimerkissä 1. Peptidi todetaan oleellisesti puhtaaksi TLCrtä ja HPLC:tä käyttäen .
Esimerkki 17 5 [Ac-D-His1,D-NMA2, Arg8, CaMeTyr10, CMA13, CML27] -rGRF (1- 29)-NHz, jonka kaava on Ac-D-His-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Arg-Ser-^MeTyr-Arg-Arg-CMA-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-CML-Asn-Arg-NHZ, syntetisoidaan vaiheittain etenevällä tavalla käyttäen Beckman 990 -pep-10 tidisyntetisaattoria ja MBHA-hartsia kuten yleisesti kuvataan esimerkissä l. Peptidi todetaan oleellisesti puhtaaksi TLCrtä ja HPLCrtä käyttäen.
Esimerkki 18
[D-Ala2, D-Asp3, C^eTyr10, CMA19, CML23, CML27] -hGRF (1-32)-15 NH2, jonka kaava on H-Tyr-D-Ala-D-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-CaMeTyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-CMA-Arg-Lys-Leu-CML-Gln-Asp-Ile-CML-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-NH2, syntetisoidaan vaiheittain etenevällä tavalla käyttäen Beckman 990 -peptidisyntetisaattoria ja MBHA-hartsia kuten esimer-20 kissä 1. Tämä analogi todetaan oleellisesti puhtaaksi TLC
rtä ja HPLCrtä käyttäen.
Esimerkki 19 (D-Tyr1, D-NMA2, CML5 # Lys8, CaMe-D-Tyr10, Ala15, D-Met27] -hGRF(1-29)-NH2, jonka kaava on H-D-Tyr-D-NMA-Asp-Ala-CML-25 Phe-Thr-Lys-Ser-C^e-D-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-
Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-D-Met-Ser-Arg-NH2, syntetisoidaan vaiheittain etenevällä tavalla käyttäen Beckman 990 -peptidisyntetisaattoria ja MBHA-hartsia kuten esimerkissä 1. Tämä analogi todetaan oleellisesti puhtaaksi TLC-30 rtä ja HPLCrtä käyttäen.
. Esimerkki 20 [D-His1, D-NMA2, Arg8, Leu13, CMA19, CML27] -rGRF (1-32) -NH2, jonka kaava on H-D-His-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Arg-Ser-Tyr-Arg-Arg-Leu-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-CMA-Arg-Lys-Leu-Leu-35 His-Glu-Ile-CML-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-NH2, syntetisoidaan 26 94356 vaiheittain etenevällä tavalla käyttäen Beckman 990 -pep-tidisyntetisaattoria ja MBHA-hartsia kuten kuvataan yleisesti esimerkissä 1. Peptidi todetaan oleellisesti puhtaaksi TLCrtä ja HPLCrtä käyttäen.
5 Esimerkki 21 rGRF-analogifragmentti eli [desaminoTyr^CML23]-rGRF(l-29)-NH2, jonka kaava on desNH2Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-CML-His-Glu-Ile-Met-Asn-Arg-NH2, syntetisoi-10 daan vaiheittain etenevällä tavalla käyttäen Beckman 990 -peptidisyntetisaattoria ja MBHA-hartsia kuten esimerkissä 1. Peptidi todetaan oleellisesti puhtaaksi TLC:tä ja HPLCrtä käyttäen.
Esimerkki 22 15 [ Ac-D-Tyr1, D-NMA2, C^eTyr10, C^eVal13, CMA19, CML23, Nle27] - hGRF(1—29)—NH2, jonka kaava on Ac-D-Tyr-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-CaMeTyr-Arg-Lys-CaMeVal-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-CMA-Arg-Lys-Leu-CML-Gln-Asp-Ile-Nle-Ser-Arg-NH2, syntetisoidaan vaiheittain etenevällä tavalla käyttäen Beckman 20 990 -peptidisyntetisaattoria ja MBHA-hartsia kuten ylei sesti kuvataan julkaisussa Vale et ai.. US-patenttijulkai-su nro 4 292 313. Peptidi todetaan oleellisesti puhtaaksi TLCrtä ja HPLCrtä käyttäen.
Esimerkki 23 25 [ CML1, D-NMA2, Glu8, CMA19, Glu25 , CML27] -rGRF (1-29) -NH2, jonka kaava on H-CML-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Glu-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-CMA-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-CML-Asn-Arg-NH2, syntetisoidaan vaiheittain etenevällä tavalla käyttäen Beckman 990 -peptidisynteti-30 saattoria ja MBHA-hartsia kuten esimerkissä 1. Peptidi todetaan oleellisesti puhtaaksi TLCrtä ja HPLCrtä käyttäen.
Esimerkki 24 [ For-D-Tyr1, D-NMA2, CaMeVal13, CMA19, Arg21, CML23, Asn28] -35 hGRF(1-29)-NH2, jonka kaava on For-D-Tyr-D-NMA-Asp-Ala-Ile- 27 94356
Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-CaMeVal-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-CMA-Arg-Arg-Leu-CML-Gln-Asp-Ile-Met-Asn-Arg-NH2, syntetisoidaan vaiheittain etenevällä tavalla käyttäen Beckman 990 -peptidisyntetisaattoria ja MBHA-hartsia kuten ylei-5 sesti kuvataan julkaisussa Vale et ai. . US-patenttijulkaisu nro 4 292 313. Peptidi todetaan oleellisesti puhtaaksi TLC:tä ja HPLC:tä käyttäen.
Esimerkki 25 [NMA2, CaMe Vai13, CML27] -hGRF (1-29) -NH2, jonka kaava on 10 H-Tyr-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-CaMeVal-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-CML-Ser-Arg-NH2, syntetisoidaan vaiheittain etenevällä tavalla käyttäen Beckman 990 -peptidisyntetisaattoria ja MBHA-hartsia kuten yleisesti kuvataan julkaisussa Vale et ai. . 15 US-patenttijulkaisu nro 4 292 313. Peptidi todetaan oleel lisesti puhtaaksi TLCttä ja HPLC:tä käyttäen. Sen jälkeen valmistetaan asetaattisuola liuottamalla peptidi veteen ja lisäämällä 1 N etikkahappoa. Saatu liuos kylmäkuivaamalla saadaan asetaattisuola.
20 Esimerkki 26 hGRF-analogi [D-NMA2,Arg\CMA19,CML23,Nle27]-hGRF(1-32)-NHz, jonka kaava on H-Tyr-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Arg-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-CMA-Arg-Lys-Leu-CML-Gln-Asp-Ile-Nle-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-NH2, synteti-25 soidaan vaiheittain etenevällä tavalla käyttäen Beckman 990 -peptidisyntetisaattoria ja MBHA-hartsia kuten esimerkissä 1. Tämä analogi todetaan oleellisesti puhtaaksi TLC-:tä ja HPLCrtä käyttäen.
Esimerkki 27 30 [CML17,Arg21,Nle27]-rGRF(l-29)-NH2, jonka kaava on H- . His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-
Gly-Gln-CML-Tyr-Ala-Arg-Arg-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Nle-Asn-Arg-NH2, syntetisoidaan vaiheittain etenevällä tavalla käyttäen Beckman 990 -peptidisyntetisaattoria ja MBHA-35 hartsia kuten esimerkissä 1. Peptidi todetaan oleellisesti puhtaaksi TLCrtä ja HPLC:tä käyttäen.
28 94356
Esimerkki 28 hGRF-analogi [ D-NMA2, CaMeVa 113, CMA19, CML23, Nle27, Asn28 ] -hGRF (1-29) -NH2, jonka kaava on H-Tyr-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-CaMeVal-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-CMA-5 Arg-Lys-Leu-CML-Gln-Asp-Ile-Nle-Asn-Arg-NH2, syntetisoidaan vaiheittain etenevällä tavalla käyttäen Beckman 990 -pep-tidisyntetisaattoria ja MBHA-hartsia kuten esimerkissä 1. Peptidi todetaan oleellisesti puhtaaksi TLC:tä ja HPLCctä käyttäen.
10 Esimerkki 29 [N®MeTy r1,A1 a15, CML26,Nle27,Asn28] -hGRF(1-29) -NH2, jonka kaava on NaMeTyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Glu-CML-Nle-Asn-Arg-NHg, syntetisoidaan vaiheittain etenevällä 15 tavalla käyttäen Beckman 990 -peptidisyntetisaattoria ja MBHA-hartsia kuten esimerkissä l. Peptidi todetaan oleellisesti puhtaaksi TLC:tä ja HPLCrtä käyttäen. Puhdistetun peptidin optinen kierto mitataan käyttäen valosähköistä polarimetriä, ja optiseksi kierroksi todetaan [a]0 = -43,5° 20 +/- 1 (c = 1, l-%:inen etikkahappo).
Esimerkki 30 [Met1, CMA19, Arg21, CML27] -rGRF (1-29) -NH2, jonka kaava on H-Met-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-CMA-Arg-Arg-Leu-Leu-His-Glu-Ile-CML-25 Asn-Arg-NH2, syntetisoidaan vaiheittain etenevällä tavalla käyttäen Beckman 990 -peptidisyntetisaattoria ja MBHA-hartsia kuten esimerkissä 1. Peptidi todetaan oleellisesti • puhtaaksi TLCrtä ja HPLCitä käyttäen.
Esimerkki 31 30 [pCl-Phe1, D-NMA2, CaMeTyr10, OMA19, Arg21, CML27] -rGRF (1- : · 43)-OH, jonka kaava on H-pCl-Phe-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-
Thr-Ser-Ser-CaMeTyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-CMA-Arg-Arg-Leu-Leu-His-Asp-Ile-CML-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Arg-Ser-Arg-Phe-Asn-OH, syntetisoidaan 35 vaiheittain etenevällä tavalla käyttäen Beckman 990 -pep- 29 94356 tidisyntetisaattoria ja klorometyloitua hartsia kuten esimerkissä 3. Peptidi todetaan oleellisesti puhtaaksi TLC:tä ja HPLCrtä käyttäen.
Esimerkki 32 5 [NaMeTyr1/Ala15,CML23,Nle27/Asn28]-hGRF(l-29)-NH2> jonka kaava on NaMeTyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Glu-Ile-Nle-Asn-Arg-NH2, syntetisoidaan vaiheittain etenevällä tavalla käyttäen Beckman 990 -peptidisyntetisaattoria ja 10 MBHA-hartsia kuten esimerkissä 1. Peptidi todetaan oleellisesti puhtaaksi TLC:tä ja HPLCrtä käyttäen. Puhdistetun peptidin optinen kierto mitataan käyttäen valosähköistä polarimetriä, ja optiseksi kierroksi todetaan [a]D = -44,0° +/- 1 (c = 1, l-%:inen etikkahappo).
15 Esimerkki 33 [ NaMeTyr1, CML13, Ala15, CML27, Asn28] -hGRF (1-29) -NH2, j onka kaava on NaMeTyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-CML-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Glu-Ile-CML-Asn-Arg-NH2, syntetisoidaan vaiheittain ete-20 nevällä tavalla käyttäen Beckman 990 -peptidisyntetisaattoria ja MBHA-hartsia kuten esimerkissä 1. Peptidi todetaan oleellisesti puhtaaksi TLCrtä ja HPLCrtä käyttäen.
Esimerkki 34 [N^eTyr1, Ala15, CMA19, Nle27, Asn28] -hGRF(1-29) -NH2, jonka 2 5 kaava on NaMeTyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-
Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-CMA-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Glu-Ile-Nle-Asn-Arg-NHj, syntetisoidaan vaiheittain etenevällä tavalla käyttäen Beckman 990 -peptidisyntetisaattoria ja MBHA-hartsia kuten esimerkissä 1. Peptidi todetaan oleel-30 lisesti puhtaaksi TLCrtä ja HPLCrtä käyttäen. Puhdistetun .' peptidin optinen kierto mitataan käyttäen valosähköistä polarimetriä, ja optiseksi kierroksi todetaan [a]D = -45,5° +/- 1 (c = 1, l-%rinen etikkahappo).
30 94356
Esimerkki 35 [ NaMeTyr1, Ala15, CML17, Nle27, Asn28] -hGRF (1-29) -NH2, j onka kaava on NaMeTyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-CML-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-5 Glu-Ile-Nle-Asn-Arg-NHj, syntetisoidaan vaiheittain etenevällä tavalla käyttäen Beckman 990 -peptidisyntetisaat-toria ja MBHA-hartsia kuten esimerkissä l. Peptidi todetaan oleellisesti puhtaaksi TLC:tä ja HPLCitä käyttäen. Puhdistetun peptidin optinen kierto mitataan käyttäen valo losähköistä polarimetriä, ja optiseksi kierroksi todetaan [a]0 = -49,0° +/- 1 (c = 1, l-%:inen etikkahappo) .
Esimerkki 36 [NaMeTyr1, Ala15, CML23, Nle27, Asn28] -hGRF (1-29) -NH2, jonka kaava on NaMeTyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-15 Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-CML-Gln-
Glu-Ile-Nle-Asn-Arg-NH2, syntetisoidaan vaiheittain etenevällä tavalla käyttäen Beckman 990 -peptidisyntetisaat-toria ja MBHA-hartsia kuten esimerkissä 1. Peptidi todetaan oleellisesti puhtaaksi TLC:tä ja HPLCrtä käyttäen.
20 Esimerkki 37 [NaMeTyr1,CML5,Ala15,Nle27,Asn28]-hGRF(1-29) -NH2, jonka kaava on NaMeTyr-Ala-Asp-Ala-CML-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-ArgLys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Glu-Ile-Nle-Asn-Arg-NH2, syntetisoidaan vaiheittain ete-25 nevällä tavalla käyttäen Beckman 990 -peptidisyntetisaa- ttoria ja MBHA-hartsia kuten esimerkissä 1. Peptidi todetaan oleellisesti puhtaaksi TLC:tä ja HPLCrtä käyttäen. Puhdistetun peptidin optinen kierto mitataan käyttäen valosähköistä polarimetriä, ja optiseksi kierroksi todetaan 30 [a]D = -4 5,0° +/- 1 (c = 1, l-%:inen etikkahappo).
Esimerkki 38 [NaMeTyr1, CML5'13*17'22,27, Ala15, CMA19, Asn28] -hGRF (1-29) -NH2, jonka kaava on N^eTyr-Ala-Asp-Ala-CML-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-CML-Leu-Ala-Gln-CML-Ser-CMA-Arg-Lys-CML-35 Leu-Gln-Glu-Ile-CML-Asn-Arg-NH2, syntetisoidaan vaiheit- 31 94356 tain etenevällä tavalla käyttäen Beckman 990 -peptidisyn-tetisaattoria ja MBHA-hartsia kuten esimerkissä 1. Peptidi todetaan oleellisesti puhtaaksi TLC:tä ja HPLCitä käyttäen.
5 Esimerkki 39 [ N®MeTyr1, Ala15, CML22'27, Asn28 ] -hGRF (1-29) -NH2, j onka kaava on N^eTyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-CML-Leu-Gln-Glu-Ile-CML-Asn-Arg-NH2, syntetisoidaan vaiheittain etenevällä 10 tavalla käyttäen Beckman 990 -peptidisyntetisaattoria ja MBHA-hartsia kuten esimerkissä 1. Peptidi todetaan oleellisesti puhtaaksi TLC:tä ja HPLC:tä käyttäen.
Esimerkki 40 [ N®MeTyr1, A la15, CMA19, CMA23, N1 e27, Asn28 ] -hGRF (1 -2 9) -NH2, 15 jonka kaava on N^eTyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-
Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-CMA-Arg-Lys-Leu-CML-Gln-Glu-Ile-Nle-Asn-Arg-NH2, syntetisoidaan vaiheittain etenevällä tavalla käyttäen Beckman 990 -peptidisyntetisaattoria ja MBHA-hartsia kuten esimerkissä 1. Peptidi todetaan 20 oleellisesti puhtaaksi TLC:tä ja HPLCitä käyttäen.
Esimerkki 41 [N^eTyr1, Ala15, CML17'22'27, CMA19, Asn28] -hGRF (1-29) -NH2, jonka kaava on NaMeTyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-CML-Ser-CMA-Arg-Lys-CML-Leu-Gln-25 Glu-Ile-CML-Asn-Arg-NH2, syntetisoidaan vaiheittain eten- « evällä tavalla käyttäen Beckman 990 -peptidisyntetisaattoria ja MBHA-hartsia kuten esimerkissä 1. Peptidi todetaan oleellisesti puhtaaksi TLCitä ja HPLCitä käyttäen.
Esimerkki 42 30 4 0-jäännöksen amidoitu peptidi [CaMeHis1,D-NMA2, CML27]-hGRF (1-44)-NH2, jonka kaava on H-CaMeHis-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-CML-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2, 35 syntetisoidaan vaiheittain etenevällä tavalla käyttäen 32 94356
Beckman 990 -peptidisyntetisaattoria ja MBHA-hartsia kuten yleisesti kuvataan julkaisussa Vale et ai. . US-patent-tijulkaisu nro 4 292 313. Peptidi todetaan oleellisesti puhtaaksi TLC:tä ja HPLC:tä käyttäen.
5 Vaikka keksintöä on kuvattu liittyen sen edullisiin suoritusmuotoihin, jotka muodostavat kyseisten keksijöiden tämänhetkisen tietämyksen mukaisen parhaan muodon, tulee ymmärtää, että erilaisia muutoksia ja modifikaatioita, jotka lienevät ilmeisiä tämän alan keskimääräiselle taita-10 jalle, voidaan tehdä poikkeamatta keksinnön kattamasta alueesta, joka esitetään oheisissa patenttivaatimuksissa. Esimerkiksi modifikaatioita peptidiketjuun, etenkin delee-tioita, jotka alkavat peptidin karboksyylipäästä ja jatkuvat noin asemaan 29, voidaan tehdä tämänhetkisesti tunnet-15 tujen kokeellisten käytäntöjen mukaisesti peptidien tai peptidifragmenttien luomiseksi, joilla on tallella peptidin biologinen teho kokonaisuudessaan tai hyvin huomattavin osin, jolloin tällaiset peptidit katsotaan keksinnön piiriin kuuluviksi. Lisäksi jompaankumpaan päähän, tai 20 kumpaankin päähän, voidaan tehdä lisäyksiä, ja/tai yleisesti ekvivalentteja jäännöksiä voidaan sijoittaa luontaisesti esiintyvien jäännöksien tilalle, kuten yleisen pep-tidikemian alalla hyvin tiedetään, muiden analogien tuottamiseksi, joilla on ainakin huomattava osa patenttivaati-25 muksissa määritellyn polypeptidin tehosta, ilman että poiketaan keksinnön kattamasta alueesta. Edelleen C-pään edulliseen -NH2-ryhmään voidaan tehdä modifikaatioita tämän alan tämänhetkisen teknisen tason mukaisesti; esimerkiksi C-pään aminohappojäännöksen karboksyyliosuutena voi olla 30 radikaali -COOR, -CRO, -CONHNHR, -CON(R)(R·) tai -CH2OR, .· joissa R ja R' ovat kumpikin alempi alkyyli, fluori-(alem- pi alkyyli) tai vety, ilman että poiketaan keksinnöstä, koska tällaisten modifikaatioiden tuloksena syntyy ekvivalentteja synteettisiä peptidejä.
35 Keksinnön eri piirteitä korostetaan seuraavissa pa tenttivaatimuksissa .
Claims (10)
1. Analogiamenetelmä farmaseuttisesti käyttökelpoisen kasvuhormonia vapauttavan tekijän synteettisen pepti-5 dianalogin, tai sen ei-myrkyllisen suolan valmistamiseksi, jonka peptidin sekvenssi on (B) R.,-R2-R3-Ala- (Qt) Rg-Phe-Thr-R8-Ser- (Q2) R10-Arg-R12- (Q3) R13-Leu-R15-Gln- (Q4) Leu-R18- (Q5) Ala-Arg-R21- (Q8) Rjz” (Q7) Leu—R24—R23— (¾) ^26- (Q9) ^27^^28-^^-Gin—^Gin— Gly-Glu-R34-Asn-Gln-Glu-R38-R39-R40-Arg-R42-R43-R44, jossa R1 on 10 Tyr, D-Tyr, Met, Phe, D-Phe, pCl-Phe, Leu, His tai D-His; B on H, C^e, NaMe, desamino, Ac tai For; R2 on Ala, D-Ala, NMA tai D-NMA; R3 on Asp tai D-Asp; Rj on Ile tai Leu; R8 on Ser, Asn, Lys, Arg, Asp tai Glu; R10 on Tyr, D-Tyr tai Phe; R12 on Arg tai Lys; R13 on Ile, Vai, Leu tai Ala; R1S on Gly 15 tai Ala; R18 on Ser tai Tyr; R21 on Lys, D-Lys, Arg tai D-Arg; R22 on Leu, Ile, Ala tai Vai; R24 on Gin tai His; R25 on Asp tai Glu; R26 on Ile tai Leu; R27 on Met, D-Met, Ala, Nle, Ile, Leu, Nva tai Vai; R28 on Asn tai Ser; R34 on Ser tai Arg; R38 on Arg tai Gin; R39 on Gly tai Arg; R40 on Ala 20 tai Ser; R42 on Phe, Ala tai Vai; R43 on Asn tai Arg; R44 on luontainen aminohappo; Q1 - Q9 ovat kukin joko H tai CaMe, edellyttäen kuitenkin, että jotkut tai kaikki ryhmät R30 -R44, mainitut rajat mukaan lukien, voivat puuttua sekvenssistä, joka alkaa C-päästä, ja edellyttäen samoin, että 25 ainakin yksi Q^stä, Q4:stä, Q?:stä, Q8:sta ja Q9:stä on • a , # C Me, tunnettu siitä, että (i) liitetään yhteen yksittäisiä aminohappoja tai lyhyitä peptidejä yhdisteen muodostamiseksi, joka sisältää ainakin yhden suojaryhmän ja jolla on seuraava sekvenssi (II) tai tarkoituksen mu-30 kaisesti lyhennetty osa siitä: x’-iBJR^X tai X2)-R2-R3 (X3)-Ala- (Q,) R^Phe-Thr (X4) -R^X8) -Ser (X4) - (Q2) R10(X2) -Arg (X6) -R12 (X6 tai X7)-(Q3)R13)-Leu-R15-Gln(X5)-(Q4)Leu-R18(X2)-(Q5)Ala-Arg-(X6)-R21(X6 tai X7)-(Q6)R22-(Q7)Leu-R24(X5 tai X)-R25 (X3) - (Q8) R26-(Q9) 27-R28(X4 tai X5) -Arg (X6) -Gin (X5) -Gin (X5) -Gly-Glu (X3) -R34 (X4 35 tai X6)-Asn(X5)-Gln(X5)-Glu(X3)-R38(X6 tai X5)-R39(X6)-R40(X2) - 34 94356 Arg(X6) -R42-R43(X5 tai X6) -R44 (X8) -X9, jossa (X), (X1), (X2), (X3) , (X4) , (X5) , (X6) , (X7) ja (X8) ovat kukin joko vety tai suojaryhmä ja (X9) on joko amidi tai hydroksi tai suoja-ryhmä, ja (ii) näin saatua yhdistettä (II) käsitellään 5 sopivalla reagenssilla suojaryhmän tai suojaryhmien poistamiseksi, jolloin saadaan kaavan (I) mukainen sekvenssi, ja (iii) puhdistetaan näin saatu peptidi.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että R27 on Nle.
3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että R15 on Ala ja R28 on Asn.
4. Patenttivaatimuksen 1, 2 tai 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että Q4 on C^e.
5. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen mene- 15 telmä, tunnettu siitä, että Q., on C®Me.
6. Jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukainen mene telmä, tunnettu siitä, että Q7 on CaMe.
7. Jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että Qe on C^e.
8. Patenttivaatimuksen 1 tai jonkin patenttivaati muksen 3-7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että Q9 on CaMe.
9. Jonkin patenttivaatimuksen 1-8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ryhmät 30 - 44 puut- 25 tuvat.
10. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan peptidi, jolla on kaava [N^eTyr1, CML5, Ala15, Nle27, Asn28] -hGRF(1-29) -NH2; 30 (N^eTyr1, Ala15, CML23, Nle27, Asn28] -hGRF (1-39) -NH2; [ N^eTyr1, Ala15, CML17, Nle27, Asn28] -hGRF (1-29) -NH2; [NaMeTyr1, Ala15,CML26,Nle27, Asn28]-hGRF(1-29) -NH2; tai [ NaMeTyr1, Ala15, CML27, Asn28] -hGRF (1-29) -NH2. 35 9 4 356
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/342,751 US5098995A (en) | 1987-05-22 | 1989-04-25 | GRF Analogs VIIA |
| US34275189 | 1989-04-25 | ||
| PCT/US1990/002224 WO1990012810A1 (en) | 1989-04-25 | 1990-04-24 | Grf analogs viia |
| US9002224 | 1990-04-24 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI906240A0 FI906240A0 (fi) | 1990-12-18 |
| FI94356B true FI94356B (fi) | 1995-05-15 |
| FI94356C FI94356C (fi) | 1995-08-25 |
Family
ID=23343123
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI906240A FI94356C (fi) | 1989-04-25 | 1990-12-18 | Menetelmä farmaseuttisesti käyttökelpoisen kasvuhormonia vapauttavan tekijän synteettisen peptidianalogin tai sen ei-myrkyllisen suolan valmistamiseksi |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5098995A (fi) |
| EP (1) | EP0423322B1 (fi) |
| JP (1) | JP2974254B2 (fi) |
| KR (1) | KR0163033B1 (fi) |
| AT (1) | ATE133687T1 (fi) |
| AU (1) | AU628558B2 (fi) |
| CA (1) | CA2030810C (fi) |
| DE (1) | DE69025123T2 (fi) |
| DK (1) | DK0423322T3 (fi) |
| ES (1) | ES2085350T3 (fi) |
| FI (1) | FI94356C (fi) |
| IL (1) | IL94171A (fi) |
| NO (1) | NO178031C (fi) |
| WO (1) | WO1990012810A1 (fi) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5756458A (en) * | 1989-06-16 | 1998-05-26 | Pharmacia & Upjohn Company | Stabilized potent GRF analogs |
| EP0668770A1 (en) * | 1991-04-24 | 1995-08-30 | Warner-Lambert Company | $g(a)-SUBSTITUTED POLYPEPTIDES HAVING THERAPEUTIC ACTIVITY |
| WO1992019253A1 (en) * | 1991-04-24 | 1992-11-12 | Warner-Lambert Company | CCK ANALOGS CONTAINING α-SUBSTITUTED AMINO ACIDS |
| US5262519A (en) * | 1991-05-15 | 1993-11-16 | The Salk Institute For Biological Studies | GRF analogs XI |
| CA2158782C (en) * | 1994-09-23 | 2010-01-12 | Pierrette Gaudreau | Marker for growth hormone-releasing factor receptors |
| DE60333270D1 (de) * | 2002-04-29 | 2010-08-19 | Euro Celtique Sa | Den orl-1-rezeptor bindende peptide mit eingeschränkter konformation |
| US9079974B2 (en) * | 2011-12-21 | 2015-07-14 | The University Of Miami | GH-RH analogs with potent agonistic effects |
| US9393271B2 (en) | 2012-12-21 | 2016-07-19 | University Of Miami | GHRH agonists for islet cell transplantation and function and the treatment of diabetes |
| US9855312B2 (en) | 2012-12-21 | 2018-01-02 | University Of Miami | GHRH agonists for the treatment of ischemic disorders |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4728726A (en) * | 1982-10-04 | 1988-03-01 | The Salk Institute For Biological Studies | GRF analogs IIIb |
| US4594329A (en) * | 1984-05-14 | 1986-06-10 | The Salk Institute For Biological Studies | CRF analogs |
| US4689318A (en) * | 1985-08-29 | 1987-08-25 | The Salk Institute For Biological Studies | GRF analogs |
| US5002931A (en) * | 1987-05-22 | 1991-03-26 | The Salk Institute For Biological Studies | GRF analogs VII |
-
1989
- 1989-04-25 US US07/342,751 patent/US5098995A/en not_active Expired - Lifetime
-
1990
- 1990-04-23 IL IL9417190A patent/IL94171A/en not_active IP Right Cessation
- 1990-04-24 AU AU55569/90A patent/AU628558B2/en not_active Ceased
- 1990-04-24 KR KR1019900702671A patent/KR0163033B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1990-04-24 WO PCT/US1990/002224 patent/WO1990012810A1/en active IP Right Grant
- 1990-04-24 DE DE69025123T patent/DE69025123T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-04-24 ES ES90907830T patent/ES2085350T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-04-24 DK DK90907830.5T patent/DK0423322T3/da active
- 1990-04-24 JP JP2507102A patent/JP2974254B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1990-04-24 CA CA002030810A patent/CA2030810C/en not_active Expired - Fee Related
- 1990-04-24 AT AT90907830T patent/ATE133687T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-04-24 EP EP90907830A patent/EP0423322B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-12-18 FI FI906240A patent/FI94356C/fi not_active IP Right Cessation
- 1990-12-20 NO NO905505A patent/NO178031C/no unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ATE133687T1 (de) | 1996-02-15 |
| KR0163033B1 (ko) | 1998-11-16 |
| CA2030810C (en) | 1999-12-14 |
| US5098995A (en) | 1992-03-24 |
| DK0423322T3 (da) | 1996-06-24 |
| DE69025123D1 (de) | 1996-03-14 |
| JP2974254B2 (ja) | 1999-11-10 |
| KR920700225A (ko) | 1992-02-19 |
| DE69025123T2 (de) | 1996-09-19 |
| IL94171A (en) | 1994-11-11 |
| AU628558B2 (en) | 1992-09-17 |
| FI94356C (fi) | 1995-08-25 |
| JPH04500526A (ja) | 1992-01-30 |
| EP0423322A1 (en) | 1991-04-24 |
| NO905505D0 (no) | 1990-12-20 |
| FI906240A0 (fi) | 1990-12-18 |
| NO905505L (no) | 1991-02-20 |
| IL94171A0 (en) | 1991-01-31 |
| ES2085350T3 (es) | 1996-06-01 |
| NO178031B (no) | 1995-10-02 |
| EP0423322B1 (en) | 1996-01-31 |
| AU5556990A (en) | 1990-11-16 |
| CA2030810A1 (en) | 1990-10-26 |
| NO178031C (no) | 1996-01-10 |
| WO1990012810A1 (en) | 1990-11-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI92210B (fi) | Menetelmä farmaseuttisesti käyttökelpoisten GRF-analogien valmistamiseksi | |
| FI88402C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av terapeutiskt anvaendbara grf-analoger | |
| CA1243016A (en) | Human grf peptide analogs | |
| US4529595A (en) | GRF Analogs | |
| FI87080B (fi) | Foerfarande foer framstaellning av grf -analoger. | |
| US5262519A (en) | GRF analogs XI | |
| CA1247601A (en) | Rat grf and analogs | |
| KR0138907B1 (ko) | 합성 펩티드 | |
| FI89499B (fi) | Foerfarande foer framstaellning av terapeutiskt anvaendbar peptid | |
| FI94356B (fi) | Menetelmä farmaseuttisesti käyttökelpoisen kasvuhormonia vapauttavan tekijän synteettisen peptidianalogin tai sen ei-myrkyllisen suolan valmistamiseksi | |
| CS276972B6 (en) | Peptides, process of their preparation and pharmaceutical containing thereof | |
| CZ3004U1 (cs) | Peptidy a farmaceutické prostředky s jejich obsahem |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| BB | Publication of examined application | ||
| MM | Patent lapsed |
Owner name: THE SALK INSTITUTE FOR BIOLOGICAL |