FI87080B - Foerfarande foer framstaellning av grf -analoger. - Google Patents

Description

1 87080

Menetelmä GRF-analogien valmistamiseksi Tämä keksintö koskee menetelmää peptidin valmistamiseksi, jolla on vaikutusta aivolisäkkeen toimintaan ihmi-5 sissä ja muissa eläimissä, erityisesti nisäkkäissä. Erityisesti tässä esitetään peptidiä, joka edistää kasvuhormonin vapautumista aivolisäkkeessä.

Fysiologit ovat jo pitkään havainneet, että hypotalamus kontrolloi kaikkea adenohypofysiksen eritystoimintaa 10 siten, että hypotalamus tuottaa erityisiä polypeptidejä, jotka laukaisevat kunkin aivolisäkkeen hormonin erityksen. Estävä tekijä on karakterisoitu ja se ehkäisee kasvuhormonin (GH) eritystä ja sitä nimitetään somatostatiiniksi.

Vastaava hypotalaminen vapautusteki jä aivolisäkkeen 15 GH:lle on viime aikoina eristetty ihmisen haimakasvaimesta, puhdistettu, karakterisoitu, syntetisoitu ja testattu. Tämän peptidin järjestys on seuraava: Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-20 Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu. Tämän peptidin amidoidun muodon uskotaan olevan ja siihen viitataan tämän jälkeen, hpGRFinä (ihmisen haimakasvaimen GH:ta vapauttavalle tekijälle).

Nyt on eristetty polypeptidi rotan hypotalamisista 25 uutteista, puhdistettu, karakterisoitu, syntetisoitu ja testattu, joka polypeptidi vapauttaa GH:ta viljellyistä ai-volisäkesoluista. Tämän 43-jäännöksen luonnollisesti esiintyvän peptidin järjestys on seuraava: H-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-30 Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Met-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-

Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Arg-Ser-Arg-Phe-Asn-OH. Peptidiin viitataan tämän jälkeen rhGRF:na (rotan hypotalamiselle GH:ta vapauttavalle tekij älle).

Tiettyjä hpGRFrn analogeja on nyt syntetisoitu ja 35 testattu, jotka analogit ovat tehokkaampia kuin hpGRF itse

2 87 0c G

ja monet näistä analogeista ovat lyhyempiä. Jotkut näistä analogeista perustuvat substituutioihin, jotka ovat yhdenmukaisia kaavan rhGRF kanssa, kun taas toiset perustuvat muihin substituutioihin. Tässä esitetään farmaseuttisia 5 koostumuksia, joihin lasketaan nämä hpGRF:n tai sen myrkyttömän suolan analogit, dispergoituna farmaseuttisesti hyväksyttävään nestemäiseen tai kiinteään kantaja-aineeseen. Sellaisia farmaseuttisia koostumuksia voidaan käyttää kliinisessä lääketieteessä sekä ihmis- että eläinlääketietees-10 sä, annosteltaviksi terapeuttisiin tarkoituksiin ja myös diagnostisesti. Lisäksi niitä voidaan käyttää lämminveristen eläinten, mukaan lukien siipikarjan, kasvamisen edistämiseen ja kylmäveristen eläinten, esim. kalojen, ankeriaiden jne. vesiviljelyyn.

15 Peptidin määrittämiseen käytetty nimistö on se, jon ka ovat eritelleet Schroder & Lubke teoksessa "The Peptides", Academic Press (1965), jossa tavanomaisen esityksen mukaan N-päätteen aminoryhmä näkyy vasemmalla ja C-päätteen karboksyyliryhmä oikealla. Luonnollisella aminohapolla tar-20 koitetaan tavallisia, luonnossa esiintyviä aminohappoja, joita on proteiineissa ja joihin kuuluvat Gly, Ala, Vai, Leu, Ile, Ser, Thr, Lys, Arg, Asp, Asn, Glu, Gin, Cys, Met, Phe, Tyr, Pro, Trp ja His. Milloin aminohappojäännöksellä on isomeerisiä muotoja, aminohapon L-muoto esitetään, ellei • - 25 muutoin ole erikseen mainittu. Tämän julkaisun tarkoituk siin rhGRF pidetään hpGRFtn analogina.

Keksinnön kohteena on menetelmä farmaseuttisesti aktiivisten peptidien valmistamiseksi, joilla on kaava (I): 30 H-R1-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-R8-Ser-R10-Arg-R12-R13-Leu-R15-

Gln-Leu-R18-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-R24-R25-Ile-R27-R28-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Arg-Ser-Arg-Phe-Asn-Y

3 87080 jossa Rx on Tyr, D-Tyr, Phe, Leu, D-His tai His; R8 on Ser tai Asn; R10 on Tyr, Phe tai D-Tyr; R12 on Arg tai Lys; R13 on Ile tai Vai; R15 on Gly tai D-Ala; R18 on Tyr tai Ser; R24 on His tai Gin; R25 on Glu tai Asp; R27 on D-Met, Met, Nle, 5 Ile tai Vai; R28 on Ser tai Asn; ja Y on -OH tai -NH2, edellyttäen kuitenkin, että joko (a) R27 on Ile, Vai, Nle tai D-Met; tai (b) R3 on D-Tyr, His, Phe tai D-His; tai (c) R10 on Phe tai D-Tyr; tai (d) R28 on Asn; tai (e) Re on Ser, R12 on Arg, R13 on Ile, R18 on Tyr, R24 on His, R25 on Glu ja R28 10 on Asn; ja edellyttäen myöskin, että korkeintaan 16 C-päät-teen aminohappoa saattaa puuttua; Y on edullisesti amidi.

hpGRF-analogit, joilla on yksi Met:lie nimitetyistä substituenteista 27-asemassa, on oleellisesti suurempi stabiilisuus, erityisesti hapettavissa olosuhteissa; lisäksi, 15 jos substituentti on D-isomeeri, entsyymiresistenssi voi suurentua. Ne pysyvät täysin biologisesti aktiivisina, ja tietyillä analogeilla on yllättävästi suurentunut teho testattuna in vitro. His:n substituutio 1-asemassa antaa yllättävän suuren tehon. Edelleen lisäksi aminohapon D-iso-20 meerin, esim. D-Tyr, substituutio pitää itsessään yllättävän määrän tehoa ja se voi olla aika arvokasta kun peptidiä tehdään resistentiksi tiettyjen entsyymien hajottavalle vaikutukselle.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, 25 että (a) muodostetaan peptidivälituote, jossa on vähintään yksi suojaava ryhmä ja kaava (II): X1-R1( X tai X2 )-Ala-Asp(X3)-Ala-Ile-Phe-Thr( X4 )-R8( X4 tai X5)-Ser(X4)-R10(X2)-Arg(X6)-R12(X6 tai X7)-R13-Leu-R15-Gln(X5)-Leu-30 R18( X2) -Ala-Arg- (X6) -Lys( X7) -Leu-Leu-R24( X tai X5) -R25( X3) -Ile- R27-R28(X4 tai X5 )-Arg-( X6 )-Gln( X5 )-Gln( X5 )-Gly-Glu( X3 )-Arg-(X6) -Asn( X5 )-Gln( X5) -Glu( X3) -Gln( X5) -Arg( X6) -Ser (X4) -Arg( X6) -Phe-Asn(X5)-X9 35 tai C-päätteestä tarkoituksen mukaisesti muunnos siitä; 4 87080 jossa X1 on vety tai α-amino-suojaava ryhmä, X on vety tai suojaava ryhmä His:n imidatsolitypelle, X2 on vety tai suo-jaava ryhmä Tyrin fenolihydroksyyliryhmälle; X3 on vety tai suojaava ryhmä Aspin tai Gluin karboksyyliryhmälle; X* on 5 vety tai suojaava ryhmä Serin tai Thrin alkoholihydroksyy-liryhmälle; X5 on vety tai suojaava ryhmä Asm n tai Ginin sivuketjun amidoryhmälle; X6 on vety tai suojaava ryhmä Argin guanidinoryhmälle; X7 on vety tai suojaava ryhmä Lys-in sivuketjun aminoryhmälle; ja X9 on -0-CH2-hartsikantaja 10 tai NH-hartsikantaja, kytkemällä jokainen aminohappo, jonka α-aminoryhmä ainakin on tarkoituksenmukaisesti suojattu suhteessa noin 1-2 millimoolia suojattua aminohappoa grammaa sopivassa liuottimessa olevaa hartsia kohti ja (b) poistetaan suojaavat ryhmät ja peptidi lohkaistaan hartsi-15 kantajasta käyttämällä TFAita sopivassa liuottimessa, minkä jälkeen käytetään HF ja anisolia tai metyylietyylisul-fidia tai niiden seosta alhaisessa lämpötilassa ja sitten peptidi liuotetaan sopivaan liuottimeen ja puhdistetaan tunnetuilla menetelmillä.

20 Kiinteän faasin synteesin tekniikat esitetään kir jassa Solid-Phase Peptide Synthesis, Stewart & Young, Freeman & Co., San Fransisco, 1969 ja siitä on esimerkkejä US-patenttijulkaisussa nro 4 105 603, julkaistu elokuun 8. 1978, Vale et ai. Synteesin fragmenttikondensaatiomenetel-25 mästä on esimerkkejä US-patentissa nro 3 972 859 (elokuun 3. 1976). Muita saatavilla olevia synteesejä on esimerkkeinä US-patentissa nro 3 842 067 (lokakuun 15. 1974) ja US-patentissa nro 3 862 925 (tammikuun 27. 1975).

Yhteistä kemiallisille synteeseille on erilaisten 30 aminohappo-osuuksien labiilien sivuketjuryhmien suojaus sopivilla suojausryhmillä, jotka estävät kemiallisen reaktion tapahtumista siinä kohdassa, kunnes ryhmä lopulta poistetaan. Tavallisesti on yhteistä myös alfa-aminoryhmän suojaus aminohapolla tai fragmentilla, kun kyseinen koko- 5 87080 naisuus reagoi karboksyyliryhmässä ja sen jälkeen alfa-aminosuojaavan ryhmän selektiivinen poisto reaktion tapahtumisen sallimiseksi siinä kohdassa. Sen mukaisesti on yhteistä, että synteesin vaiheena tuotetaan välituote, joka 5 sisältää kunkin aminohappojäännöksistä sijoitettuna sen toivottuun jaksoon peptidiketjussa ja sivuketjua suojaavat ryhmät ovat liittyneinä sopiviin jäännöksiin.

α-aminosuojaavat ryhmät, joita kuvataan X1:llä, tiedetään hyvin hyödyllisiksi polypeptidien vaiheittaisessa 10 synteesissä, α-amino-suojäävien ryhmien luokkien joukossa, joita voidaan käyttää X1:nä, on (1) aromaattisia uretaani-tyyppisiä suojaavia ryhmiä, kuten fluorenyylimetyylioksi-karbonyyli (FMOC), bentsyylioksikarbonyyli (Z) ja substi-tuoitu Z, kuten p-klooribentsyylioksikarbonyyli, p-nitro-15 bentsyylioksikarbonyyli-, p-bromibentsyylioksikarbonyyli ja p-metoksibentsyylioksikarbonyyli; (2) alifaattisia uretaa-ni-suojaavia ryhmiä, kuten t-butyylioksikarbonyyli (BOC), ei-isopropyylimetyylioksikarbonyyli,isopropyylioksikarbo-nyyli, etoksikarbonyyli, allyylioksikarbonyyli; ja (3) syk-20 loalkyyliuretaanityyppisiä suojaavia ryhmiä, kuten syklo- pentyylioksikarbonyyli, adamantyylioksikarbonyyli ja syklo-heksyylioksikarbonyyli. Edullinen α-amino-suo Jaava ryhmä on BOC.

X on vety tai suojaava ryhmä His:n imidatsolitypel-25 le, kuten Tos.

X2 voi olla sopiva suojaava ryhmä Tyr:n fenoliselle hydroksyyliryhmälle, kuten tetrahydropyranyyli, tert-butyy-li, trityyli, Bzl, CBZ, 4Br-CBZ ja 2,6-diklooribentsyyli (DCB). Edullinen suojaava ryhmä on 2,6-diklooribentsyyli. 30 X2 voi olla vety, mikä tarkoittaa, että aminohappojäännöksessä siinä asemassa ei ole sivuketjua suojaavaa ryhmää.

X3 on vety tai sopiva esterin muodostava suojaava ryhmä Asp:n tai Glu:n karboksyyliryhmän suojaamiseksi, kuten bentsyyli (OBzl), 2,6-diklooribentsyyli, metyyli Ja 35 etyyli.

6 87080 X4 voi olla sopiva suojaava ryhmä Thr:n tai Ser:n hydroksyyliryhmälle, kuten asetyyli, bentsoyyli, tertbutyy-li, trityyli, tetrahydropyranyyli, Bzl, 2,6-diklooribent-syyli ja CBZ. Edullinen suojaava ryhmä on Bzl. X4 voi olla 5 vety, mikä tarkoittaa, että hydroksyyliryhmällä ei ole suo-jaavaa ryhmää.

X5 on vety tai sopiva suojaava ryhmä Asn:n tai Gin:n sivuketjun amidoryhmälle. Se on edullisesti ksantyyli (Xan).

10 X6 on sopiva suojaava ryhmä Arg:n guanidiiniryhmäl- le, kuten nitro, Tos, CBZ, adamantyylioksikarbonyyli ja BOC tai se on vety.

X7 on vety tai sopiva suojaava ryhmä Lys:n sivuketjun aminoryhmälle. Kuvaavia sopiviksi sivuketjun aminoryh-15 mää suojääviksi ryhmiksi ovat 2-klooribentsyylioksikarbo-nyyli (2-C1-Z), Tos, t-amyylioksikarbonyyli ja BOC.

Met:a voi mahdollisesti suojata hapella, mutta edullisesti se jätetään suojaamatta.

Sivuketjun aminoryhmää suojaavan ryhmän valinta ei 20 ole kriittistä, paitsi yleisesti valitaan sellainen, joka ei poistu a-aminoryhmien suojauksen poiston aikana, synteesin aikana. Joillekin aminohapoille, esim. His, suojaus ei kuitenkaan yleisesti ole välttämätöntä, kun kytkeminen on saatu loppuun, ja suojaavat ryhmät voivat olla samoja.

25 Kiinteä hartsikantaja voi olla mikä tahansa alalla tunnettu, kuten sellainen, jonka kaava on: -0-CH2-hartsi-kantaja, -NH-bentshydryyliamiini (BHA) hartsikantaja tai -NH-parametyylibentshydryyliamiini (MBHA) hartsikantaja. Kun halutaan substituoimaton amidi, on edullista käyttää 30 BHA- tai MBHA-hartsia, koska lohkeaminen antaa suoraan amidin. Jos halutaan N-metyyliamidi, se voidaan generoida N-metyyli-BHA-hartsista. Jos halutaan muita substituoituja amideja tai muita ryhmiä kuin vapaata happoa C-päätteeseen, voi olla edullista syntetisoida peptidi käyttäen klassisia 35 menetelmiä, kuten esitetään Houben-Weylin tekstissä.

7 87080

Peptidien synteesissä käytettävän sivuketjua suojaavan ryhmän valinnassa seurataan seuraavia sääntöjä: (a) suoj aavan ryhmän täytyy pitää suoj aavat ominaisuutensa, eikä lohjeta pois liittymisolosuhteissa, (b) suojaavan ryhmän 5 pitäisi olla stabiili reaktio-olosuhteissa, jotka valitaan α-amino-suojaavan ryhmän poistamiseksi kussakin synteesin vaiheessa, ja (c) sivuketjua suojaavan ryhmän täytyy olla poistettava synteesin, jossa on haluttu aminohappojakso, mentyä loppuun, reaktio-olosuhteissa, jotka eivät muuta 10 peptidiketjua.

Kiinteän faasin synteesiä on yleisesti kuvannut Mer-rifield, J. Am. Chem. Soc., 85, s. 2149 (1963), vaikka muita yhtäläisiä alalla tunnettuja kemiallisia synteesejä voidaan myös käyttää, kuten aiemmin on mainittu. Kiinteän faa-15 sin synteesi alkaa C-päätteen päästä ketjua kytkemällä a-aminohappo sopivaan hartsiin. Tällainen lähtöaine voidaan valmistaa sitomalla α-amino-suojattu aminohappo esterisi-doksella kloorimetyloituun hartsiin tai hydroksimetyyli-hartsiin tai amidisidoksella BHA-hartsiin tai MBHA-hart-20 siin. Jos saatavaan polypeptidiin on tuotava metyyli, etyyli tai propyyliamidi, käytetään kloorimetyloitua tai hyd-roksimetyylihartsia, ja lohkeaminen saadaan sopivasti aikaan käyttäen sopivaa amiinia, esim. etyyliamiinia.

. Esimerkiksi valmistettaessa 40-jäännöspeptidiä, Ala, 25 jota suojaa BOC, liitetään kloorimetyloituun hartsiin Mona-hanin ja Gilonin menetelmän mukaan, Biopolymer 12, s. 2513-19, 1973. Seuraten B0C-Ala:n liittymistä hartsikantajaan poistetaan α-amino-suojaava ryhmä, käyttäen trifluorietik-kahappoa (TFA) metyleenikloridissa, TFA yksinään tai HC1 30 dioksaanissa. Suojauksen poisto suoritetaan 0°C ja huoneenlämpötilan välillä olevassa lämpötilassa. Muita standardi-aineita lohkomiseen ja olosuhteita erityisen a-amino-suo-jaavien ryhmien poistamiseksi voidaan käyttää, kuten on kuvattu Schroderin ja Lubken teoksessa "The Peptides", 1 s. 35 72-75 (Academic Press 1965).

8 87080

Phe:n o-amino-suojaavan ryhmän poistamisen jälkeen jäljelle jäävä α-amino- ja sivuketju-suojatut aminohapot yhdistetään vaiheittain halutussa järjestyksessä aiemmin määritetyn välituotteen saamiseksi tai vaihtoehtona kunkin 5 aminohapon lisäämiseksi erikseen synteesiin, jotkut niistä voidaan yhdistää toisiinsa ennen lisäämistä kiinteän faasin reaktoriin. Sopivan liittämisreagenssin valitseminen vaatii alan tuntemusta. Erityisen sopiva liittämisreagens-si on N,N'-disykloheksyylikarbodi-imidi (DCCI).

10 Peptidien kiinteän faasin synteesissä käytettävät aktivointireagenssit ovat hyvin tunnettuja peptidialalla. Esimerkkejä sopivista aktivointireagensseista ovat karbodi-imidit, kuten N,N'-isopropyylikarbodi-imidi, N-etyyli-N'-(3-dimetyyliaminopropyyli)karbodi-imidi. Muita aktivointi-15 reagensseja ja niiden käyttöä peptidinliittämisessä kuvaavat Schroder & Lubke supra, luvussa III, ja Kapoor, J. Phar. Sei., 59, s. 1-27 (1970).

Kukin suojattu aminohappo tai aminohappojakso tuodaan kiinteän faasin reaktoriin noin nelinkertaisena tai 20 suurempana ylimääränä, ja kytkentä voidaan suorittaa dime-tyyliformamidi(DMF) :CH2C12 (1:1) tai DMF tai CH2C12 yksi-—: nään toimiessa väliaineena. Niissä tapauksissa, joissa ta- pahtuu epätäydellistä kytkentää, kytkeminen toistetaan, ennen kuin poistetaan α-amino-suojaava ryhmä, ennen kuin 25 kytketään seuraavaa aminohappoa. Kytkemisreaktion kulkua kussakin synteesin vaiheessa valvotaan ninhydriinireaktiol-la, kuten on kuvannut E. Kaiser et ai., Anal. Biochem. 34, 595 (1970). Kytkemisreaktiot voidaan suorittaa automaattisesti, kuten Beckman 990 automaattisella syntetisoijalla, 30 käyttäen ohjelmaa, jota ovat kuvanneet Rivier et ai., Bio-polymers, 1978, 17, s. 1927-1938.

Kun haluttu aminohappojakso on saatu valmiiksi, vä-lituotepeptidi voidaan poistaa hartsikantajasta käsittelemällä reagenssilla, kuten nestemäisellä fluorivedyllä, joka 35 ei vain irrota peptidiä hartsilta, vaan lohkaisee kaikki 9 87080 sivuketjua suo jaavat ryhmät X, X2, X3, X4, X5, X6, ja X7 ja α-amino-suojaavan ryhmän X1, jolloin saadaan peptidi vapaan hapon muodossa. Jos Met on läsnä sarjassa, suojaava ryhmä BOC poistetaan edullisesti ensin käyttäen trifluori-5 etikkahappo(TFA)/etaaniditiolia ennen kuin lohkaistaan peptidi hartsista HF:lla mahdollisen S-alkyloinnin eliminoimiseksi. Käytettäessä fluorivetyä lohkaisemiseen, reaktioas-tiaan pannaan myös anisolia ja metyylietyylisulfidia puhdistusta varten.

10 Oleellista biologista aktiivisuutta saadaan pepti deillä, joissa on jopa vain 27-29 jäännöstä ja tällaisia lyhyempiä fragmentteja pidetään yleisesti ekvivalentteina moniin tarkoituksiin.

Seuraavassa esimerkissä esitetään edullinen menetel- 15 mä syntetisoida hpGRF-analogeja kiinteän faasin tekniikalla. On tietysti hyvä, että vastaavasti lyhyemmän peptidi-fragmentin synteesi suoritetaan samalla tavalla, mutta eliminoidaan pelkästään tarpeellinen määrä aminohappoja alkaen C-päästä.

20 Esimerkki I

[Nle27]-hpGRF( 1-32)-NH2:n synteesi, kun kaava on: H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-NH2, suoritetaan vaiheittaisesti käyttäen ... 25 Beckman 990 peptidisyntetisoijaaMBHA-vetykloridihartsilla, kuten sellaisella, jota saa Bachem Inc.rsta, jonka substi-tuutionopeus on noin 0,1 - 0,5 mmol/g hartsia. BOC-Gly:n kytkeminen hartsiin suoritetaan yleisellä menetelmällä, joka esitetään myöhemmin aikatauluissa A ja B, jota käytetään 30 läpi koko synteesin ja tuloksena on noin 0,35 Ala:n substituutio grammaa hartsia kohti. Kaikista käytettävistä liuottimista poistetaan huolellisesti kaasu suihkuttamalla inerttikaasulla, esim. heliumilla tai typellä, hapen poistumisen varmistamiseksi.

35 Purkamisen ja neutraloinnin jälkeen peptidiketju ra- 10 870S0 kennetaan vaiheittain hartsilla. Kunkin aminohapon purkaminen, neutralointi ja additio suoritetaan yleisesti menetelmällä, jota on yksityiskohtaisesti kuvannut Vale et ai., US-patentti nro 4 292 313.

5 Purkaminen suoritetaan edullisesti aikataulun A mu kaan seuraavasti:

Aikataulu A

Reagenssi Sekoitusaika (min) 10 1. 60% TFA/2% etaaniditioli 10 2. 60% TFA/2% etaaniditioli 15 3. IPA/1% etaaniditioli 0,5 4. Et3N (10%) CH2C12: ssa 0,5 5. MeOH 0,5 15 6. Et3N (10%) CH2C12:ssa 0,5 7. MeOH (kahdesti) 0,5 8. CH2C12 (kahdesti) 0,5

Kytkennät suoritetaan edullisesti, kuten on esitetty 20 seuraavassa aikataulussa B:

Aikataulu B

Reagenssi Sekoitusaika (min)

9. DCCI

25 10. Boc-aminohappo 50-90 11. MeOH (kahdesti) 0,5 12. CH2C12 (kahdesti) 0,5 13. Ac20 (3M) CH2C12:ssa 15,0 14. CH2C12 0,5 30 15. MeOH 0,5 16. CH2C12 (kahdesti) 0,5

Lyhyesti, yhdestä kahteen mmol BOC-suojattua aminohappoa metyleenikloridissa käytetään grammaa kohti hartsia 35 sekä yksi ekvivalentti 1,0 molaarista DCCI metyleeniklori- 11 87080 dissa kahden tunnin aikana. Kun BOC-Arg(TOS) kytketään, käytetään 50% DMF ja metyleenikloridin seosta. Bzl eetteriä käytetään hydroksyyli-sivuketjun suojaavana ryhmänä Senile ja Thrrlle. P-nitrofenyyliesteriä (ONp) käytetään 5 aktivoimaan Asn:n tai Gin:n karboksyylipäätä ja esimerkiksi BOC-Asn(ONp) kytketään yli yön käyttäen yksi ekvivalentti HOBt 50% seoksessa DMF ja metyleenikloridia, jossa tapauksessa DCC:tä ei lisätä. Asn:n tai Gin:n amidoryhmä suojataan Xan:lla, kun DCC-kytkentää käytetään aktiivisen este-10 rimenetelmän sijasta. 2-klooribentsyylioksikarbonyyliä (2C1 -Z) käytetään suojaavana ryhmänä Lys:n sivuketjulle. Tos käytetään suojaamaan Arg:n guanidinoryhmää ja Glu:n tai Asp:n karboksyyliryhmä suojataan Bzl-esterinä (OBzl). Tyr:n fenolihydroksyyliryhmä suojataan 2,6-diklooribentsyylillä 15 (DCB). Synteesin lopussa saadaan seuraavanlainen yhdistel mä : Xx-Tyr (X2)-Ala-Asp(X3)-Ala-Ile-Phe-Thr(X4)-Asn( X5)-Ser (X4) -Tyr (X2) -Arg( X6) -Lys (X7) -Val-Leu-Gly-Gln( X5) -Leu-Ser (X4) -Ala-Arg( X6 )-Lys( X7) -Leu-Leu-Gln( X5) -Asp( X3 ) -Ile-Nle-Ser(X4)-Arg(X6)-Gin(X5)-Gin(X5)-Gly-X8, jossa X1 on BOC, X2 20 on DCB, X3 on bentsyyliesteri, X4 on Bzl, X5 on Xan, X6 on Tos, X7 on 2C1-Z ja X8 on -NH-hartsikantaja. Xan voi olla osittain tai kokonaan poistettu TFA-käsittelyllä, jota käytetään purkamaan α-amino-suojaava ryhmä.

Kun viimeinen Tyr-jäännös on kytketty hartsiin, BOC 25 poistetaan 60%:sella TFA:lla CH2Cl2:ssa. Jotta voitaisiin lohkaista ja poistaa suojaus jäljelle jäävästä suojatusta peptidihartsista, sitä käsitellään 1,5 ml: 11a anisolia, 0,5 ml:11a metyylietyylisulfidia ja 15 ml:11a vetyfluoridia (HF) grammaa kohti peptidihartsia, -20°C lämpötilassa puoli 30 tuntia ja 0°C lämpötilassa puoli tuntia. Kun HF on poistettu suuressa vakuumissa, hartsi-peptidi-jäännös pestään vuorotellen kuivalla dietyylieetterillä ja kloroformilla ja sitten peptidi uutetaan 2N etikkahapon vesiliuoksella, josta on kaasu poistettu ja erotetaan hartsista suodattamalla. 35 Lohkaistu peptidi, josta on suojaus poistettu, liuo- 12 87080 tetaan sitten 0-5% etikkahappoon ja puhdistetaan menetelmällä, joka voi sisältää Sephadex® G-50 hienon geelisuoda-tuksen.

Peptidi puhdistetaan sitten edelleen preparatiivi-5 sella tai puolipreparatiivisella HPLC:lla, kuten ovat kuvanneet Rivier et ai. julkaisussa Peptides: Structure and Biological Function, (1979), s. 125-8 ja Marki et ai. J. Am. Chem. Soc. 103, 3178 (1981). Yhteenvetona panoksia, jotka sopivat Waters Associates prep LC-500:aan pakataan 10 15-20 C18Silicalla Vydacilta (300 A). CH3CN:n gradientti TEAP:ssa generoidaan alhaisen paineen Eldex-gradientinteki-jällä, kuten on kuvattu teoksessa Rivier, J., J. Liq. Chromatography 1, 343-367 (1978). Kromatografisia fraktioita valvotaan huolellisesti HPLC:lla ja vain ne fraktiot, jotka 15 osoittavat oleellista puhtautta, yhdistetään. Puhdistettujen fraktioiden, joiden puhtaus on erikseen tarkistettu, suolanpoisto suoritetaan käyttäen CH3CN:n gradienttia 0,1%: sessa TFA:ssa. Keskimmäinen jae lyofilisoidaan sitten, jolloin saadaan haluttua peptidiä, jonka puhtaus on yli 98%. 20 Optinen kierto mitataan fotosähköisellä polarimetrillä, [a]“ -57,8° ± 1 (C * 1, 1% etikkahappo, korjaamaton).

Synteesi toistetaan käyttäen kloorimetyloitua hartsia, saman peptidin valmistamiseksi vapaan hapon muodossa käyttäen menetelmiä, joita on yleisesti kuvattu julkaisussa 25 Rivier, J, J. Am. Chem. Soc. 96, 2986-2992 (1974).

Esimerkki II

hpGRF-analogin [D-Tyr1] -hpGRF( 1-32 )-NH2:n synteesi, kun kaava on: H-D-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-30 Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-NH2, suoritetaan vaiheit taisella menetelmällä käyttäen Beckman 990 peptidisynteti-soijaa MBHA-hartsilla esimerkissä I kuvatulla tavalla. Peptidi todetaan oleellisen puhtaaksi käyttäen TLC:tä ja HPLC: tä. Optinen kierto mitataan fotosähköisellä polarimetrillä, 35 [a]j;2 = -61,4° ± 1 (C = 1, 1% etikkahappo, korjaamaton).

13 87080

Esimerkki III

[Nle27] -hpGRF( 1-27 )-NH2:n synteesi, kun kaava on: H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-NH2, 5 suoritetaan vaiheittaisella menetelmällä käyttäen Beckman 990 peptidisyntetisoijaa MBHA-hartsilla, esimerkissä I kuvatulla menetelmällä. Peptidi todetaan oleellisen puhtaaksi käyttäen TLC ja HPLC. Optinen kierto on [a]D = -62,4° ± 1 (C = 1, 1% etikkahappo).

10 Esimerkki IV

[Ile27]-hpGRF( 1-32)-OH:n synteesi, kun kaava on: H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Ile-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-OH, suoritetaan vaiheittain käyttäen Beck-15 man 990 peptidisyntetisoijaa kloorimetyloidulla hartsilla, esimerkin I lopussa mainitulla tavalla. Peptidi todetaan oleellisen puhtaaksi käyttäen TLC ja HPLC. Optinen kierto mitataan fotosähköisellä polarimetrilla, [a]j;2 = -61,7° ± 1 (C = 1, 1% etikkahappo, korjaamaton).

20 Esimerkki V

[D-Met27]-hpGRF( 1-32 )-NH2:n synteesi, kun kaava on: H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-D-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-NH2, suoritetaan vaiheittaisella menetel-25 mällä käyttäen Beckman 990 peptidisyntetisoijaa MBHA-hartsilla esimerkissä I kuvatulla tavalla. Peptidi todetaan oleellisen puhtaaksi käyttäen TLC ja HPLC. Optinen kierto mitataan valosähköisellä polarimetrillä, [a]p2 = -54,5° ± 1 (C * 1, 1% etikkahappo, korjaamaton).

30 Esimerkki VI

[His1]-hpGRF(l-32)-NH2:n synteesi, kun kaava on: H-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-NH2 suoritetaan asteittaisella menetelmällä 35 käyttäen Beckman 990 peptidisyntetisoijaa MBHA-hartsilla 14 870S0 esimerkissä I kuvatulla tavalla. Peptidi todetaan oleellisen puhtaaksi käyttäen TLC ja HPLC. Optinen kierto mitataan fotosähköisellä polarimetrillä, [a]” = -58,7° ± 1 (C = 1, 1% etikkahappo, korjaamaton).

5 Synteesi toistetaan käyttäen Phe viimeisenä jäännök senä [Phe1 ]-hpGRF(l-32)-NH2:n valmistamiseksi. Optinen kierto mitataan fotosähköisellä polarimetrillä, [a]” = -58,2° ± 1 (C = 1, 1% etikkahappo, korjaamaton).

Esimerkki VII

10 [Phe10]-hpGRF(l-32)-NH2:n synteesi, kun kaava on: H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Phe-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-NH2, suoritetaan vaiheittaisella menetelmällä käyttäen Beckman 990 peptidisyntetisoijaa MBHA-hart-15 silla esimerkissä I kuvatulla tavalla. Peptidi todetaan oleellisen puhtaaksi käyttäen TLC ja HPLC. Optinen kierto mitataan fotosähköisellä polarimetrillä, [a]22 = -59,5° ± 1 (C - 1, 1% etikkahappo, korjaamaton).

Esimerkki VIII

20 [Vai27]-hpGRF( 1-32)-OH: n synteesi, kun kaava on: H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Val-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-OH, suoritetaan vaiheittaisesti käyttäen Beckman 990 peptidisyntetisoijaa kloorimetyloidulla hart-25 silla esimerkin I lopussa kuvatulla menetelmällä. Peptidi todetaan oleellisen puhtaaksi käyttäen TLC ja HPLC. Optinen kierto mitataan fotosähköisellä polarimetrillä, [a]22 -62,4°±1(C=1, 1% etikkahappo, korjaamaton).

Esimerkki IX

: 30 [His1, Nle27]-hpGRF( 1-32)-NH2:n synteesi, kun kaava on:H-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-NH2, suoritetaan vaiheittaisesti käyttäen Beckman 990 peptidisyntetisoijaa MBHA-hartsilla esi-35 merkissä I kuvatulla tavalla. Peptidi todetaan oleellisen 15 87080 puhtaaksi käyttäen TLC ja HPLC. Optinen kierto mitataan fotosähköisellä polarimetrillä, [a]22 = -59,3° ±1% (C - 1, 1% etikkahappo, korjaamaton).

Esimerkki X

5 rhGRF(1-43)-0H:n synteesi, kun kaava on: H-His-Ala-

Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Met-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Arg-Ser-Arg-Phe-Asn-OH, suoritetaan vaiheittaisella menetelmällä käyttäen Beckman 10 990 peptidisyntetisoijaa kloorimetyloidulla hartsilla, jonka substituutioalue on noin 0,1 - 0,5 mmol/g hartsia, esimerkissä IV esitetyllä tavalla. Peptidi todetaan oleellisen puhtaaksi käyttäen TLC ja HPLC. Optinen kierto mitataan fotosähköisellä polarimetrillä, [a]22 « -52,4° ± 1 (C 15 1, 1% etikkahappo, korjaamaton).

Esimerkki XI

[Leu1,Nle27]-rhGRF(l-29)-NH2:n synteesi, kun kaava on:H-Leu-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Nle-20 Asn-Arg-NH2, suoritetaan vaiheittaisella menetelmällä käyttäen Beckman 990 peptidisyntetisoijaa MBHA-hartsilla, kuten on yleisesti kuvattu esimerkissä I. Peptidi todetaan oleellisen puhtaaksi käyttäen TLC ja HPLC. Optinen kierto mitataan valosähköisellä polarimetrillä, [a]“ = -52,8° ± 1 (C 25 =1, 1% etikkahappo, korjaamaton).

Esimerkki XII

hpGRF-analogin synteesi, so. [Nle27]-rhGRF( 1-32)-NH2, jonka kaava on: H-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-30 His-Glu-Ile-Nle-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-NH2, suoritetaan vai heittaisella menetelmällä käyttäen Beckman 990 peptidisyntetisoijaa MBHA-hartsilla, kuten esimerkissä I. Analogi todetaan oleellisen puhtaaksi käyttäen TLC ja HPLC. Optinen kierto on [a]” = -55,8° ± 1 (C = 1, 1% etikkahappo).

35 Esimerkki XIII

16 87080 hpGRF-analogifragmentin synteesi, so. [D-Tyr1,xo]-rhGRF(1-29)-NH2, jonka kaava on H-D-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-D-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-lle-Met-Asn-Arg-NH2, suoritetaan 5 vaiheittaisella menetelmällä käyttäen Beckman 990 peptidi-syntetisoijaa MBHA-hartsilla, kuten esimerkissä I. Peptidi todetaan oleellisen puhtaaksi käyttäen TLC ja HPLC. Optinen kierto on: [a]“ = -63,6 ± 1 (C = 1, 1% etikkahappo).

Esimerkki XIV

10 [Nle27] -rhGRF( 1-29 )-NH2:n synteesi, kun kaava on: H-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Nle-Asn-Arg-NH2, suoritetaan vaiheittaisella menetelmällä käyttäen Beckman 990 peptidisyntetisoijaa MBHA-hartsilla, kuten esi- 15 merkissä I. Peptidi todetaan oleellisen puhtaaksi käyttäen TLC ja HPLC. Optinen kierto mitataan fotosähköisellä pola-rimetrillä, [a]22 = -52,6° ± 1 (C = 1, 1% etikkahappo, kor-j aamaton).

Esimerkki XV

20 hpGRF-analogin synteesi, so. [D-His1, D-Tyr10, D-

Ala15]-rhGRF( 1-29 )-NH2, jonka kaava on: H-D-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-D-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-D-Ala-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Met-Asn-Arg-NH2, suoritetaan vaiheittaisella menetelmällä käyttäen Beckman 990 ... 25 peptidisyntetisoijaa MBHA-hartsilla, kuten esimerkissä I.

Peptidi todetaan oleellisen puhtaaksi käyttäen TLC ja HPLC. Optinen kierto on: [α]“ = -64,5° ± 1 (C = 1, 1% etikkahappo).

Esimerkki XVI

30 hpGRF-analogin synteesi, so. [Tyr1]-rhGRF( 1-29 )-NH2, jonka kaava on: H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Met-Asn-Arg-NH2, suoritetaan vaiheittaisella menetelmällä käyttäen Beckman 990 peptidisyntetisoijaa MBHA- 35 hartsilla, kuten esimerkissä I. Peptidi todetaan oleellisen i7 87080 puhtaaksi käyttäen TLC ja HPLC. Optinen kierto on [a]82 = -49,7 ± 1 (C = 1, 1% etikkahappo).

Peptidien HPLC-analvvsituloksia 5 HPLC-olosuhteet: [A] = 1% TFA ja [B] = 60% asetonit- riiliä. 1% TFA kaikissa ajoissa. Pylväs on analyyttinen Vydac C18 5 pm.

Esimerkki * B i»okr*«ttln«n ratentlotllavuua (ai) 10 I [Nle27] -hpGRF( 1-32)-NH2 58 9,2 VI [His1] -hpGRF( 1-32) -NH2 54 9,0 IV [ Ile27] -hpGRF( 1-32 ) -OH 57 8,4 II [D-Tyr1] -hpGRF( 1-32 )-NH2 60 8,6 V [D-Met27] -hpGRF( 1-32) -NH2 57 7,6 15 VI [Phe1] -hpGRF( 1-32)-NH2 58 9,2 VII [Phe10]-hpGRF( 1-32 )-NH2 61 10,6 VIII [Vai27] -hpGRF( 1-32 ) -OH 58 7,6 IX [His1, Nle27]-hpGRF( 1-32 )-NH2 57 9,6 X rhGRF(1-43)-OH 51 8,9 20 III [Nle27]-hpGRF( 1-27 )-NH2 61 8,6 XIV [Nle27]-rhGRF( 1-29 )-NH2 55 7,8 XIII [D-Tyr110]-rhGRF( 1-29 )-NH2 61 9,0 XVI [Tyr1] -rhGRF( 1-29 )-NH2 59 7,8 XII [Nle27]-rhGRF( 1-32 )-NH2 55 8,4 25 XI [Leu1, Nle27]-rhGRF( 1-29 )-NH2 59 9,0 XV [D-His1, D-Tyr10, D-Ala15] - rhGRF(1-29)-NH2 60 7,6

Eri esimerkeissä valmistettuja synteettisiä pepti-30 dejä verrataan joko puhdistetun synteettisen hpGRF(l-40)- OH kanssa tai puhdistetun synteettisen hpGRF(1-40)-Phe-Gln-NH2 kanssa in vitro -kokeissa niiden tehokkuuden määrittämiseksi kasvuhormonin vapautumisen lisäämiseksi. Kaikilla näillä synteettisillä analogeilla on oleellista tehoa 35 aiheuttaa GH:n vapautuminen.

18 8 7 08 C

In vitro -kokeet suoritetaan käyttäen synteettistä hpGRF standardina rinnakkaisvertailussa ekvimolaaristen konsentraatioiden kanssa erilaisia syntetisoituja analogeja. Käytetään viljelmiä, joihin sisältyy rotan aivolisäke-5 rauhasten soluja, jotka on poistettu noin 4-5 päivää aiemmin. Viljelmiä, joita pidetään optimaalisina kasvuhormonin eritykselle, käytetään vertailevaan kokeeseen, yleisellä tavalla, jota kuvaavat Vale et ai. julkaisussa Endocrinology, 91, 562-572 (1972).

10 Inkubointia testattavan aineen kanssa suoritetaan 3- 4 tuntia ja viljelmän kerrannaisia poistetaan ja käsitellään niiden immunoreaktiivisen GH(ir GH):n pitoisuuden mittaamiseksi hyvin karakterisoidulla radioimmunomääritys-kokeella.

15 Tämän vertailevan kokeen, jossa käytetään ekvimolaa- risia konsentraatioita, tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa I:

Taulukko I

Peptidi Suhteellinen voimakkuus* 20 [Nle27] -hpGRF( 1-32 )-NH2 3,21(2,02-5,43) [His1]-hpGRF(1-32)-NH2 2,15(1,12-4,41) [Ile27] -hpGRF( 1-32 )-OH 0,20(0,11-0,35) [D-Tyr1] -hpGRF( 1-32 )-NH2 0,74(0,47-1,14) [D-Met27] -hpGRF(1 -32 )-NH2 0,22(0,13-0,36) 25 [Phe1]-hpGRF(1-32)-NH2 0,13(0,05-0,29) [Phe10] -hpGRF( 1-32 )-NH2 0,69(0,26-2,63) [Vai27]-hpGRF( 1-32 )-0H 0,31(0,21-0,45) [His1, Nle27]-hpGRF( 1-32 )-NH2 3,22(2,12-5,33) 30 *Suhteessa hpGRF(1-40)-Phe-Gln-NH2reen.

Näiden synteettisten peptidien in vitro -koe osoittaa, että EC50 vaihtelee 20-100 pikomolaarisen välillä ja alhaisin tehokas konsentraatio on 3-8 pikomolaarinen. Suurin tehokas konsentraatio hpGRF(1-40)NH2:11a oli 1 nanomo-35 laarinen.

19 87080

Erilaisten hpGRF-analogien ekvimolaaristen konsent-raatioiden vertailevan kokeen tulokset on esitetty taulukossa II.

Taulukko II 5

Peptidi Vertailu-%

hpGRF(1-40)-OH

(tämän kokeen standardi) 100% rhGRF(1-43)-OH 300% 10 rhGRF(1-29)-NH2 1100% [D-Tyr10] -rhGRF( 1-29 )-NH2 34% [D-Tyr1,10] -rhGRF( 1-29 )-NH2 600% [Tyr1]-rhGRF(1-29)-NH2 920% [Nle27] -rhGRF( 1-32 )-NH2 1390% 15 [Leu1, Nle27]-rhGRF( 1-29 )-NH2 480% [D-His1, D-Tyr10, D-Ala15] -rhGRF( 1-29 )-NH2 29% rhGRF- [ Val44-NH2] 670% Näiden synteettisten peptidien in vitro -koe osoit- 20 taa, että EC50 vaihtelee 20-100 pikomolaarisen välillä ja alhaisin tehokas konsentraatio on 3-8 pikomolaarinen. Suurin tehokas konsentraatio rhGRF(1-43)-OH:lie on 1 nanomo-laarinen.

Kasvuhormonin erityksen in vitro -kokeen lisäksi 25 suoritetaan in vivo -kokeita injektoimalla synteettistä peptidiä sisäisen katetrin kautta vapaasti juokseviin normaaleihin urosrottiin. Eläimet esikäsitellään FLA-63:lla, dopamiini-hydroksylaasi-inhibiittorilla, joka hävittää spontaanin GH-erityksen vaikuttamatta reaktioon eksogeeni-30 sen GRF:n kanssa. Verinäytteet otetaan läpi saman katetrin juuri ennen injektiota ja 5 ja 20 minuuttia niiden jälkeen; GH-määrät veressä mitataan radioimmuuniomäärityskokeella. Tulokset osoittavat, että synteettiset hpGRF-analogit ovat tehokkaita aivolisäkkeen GH:n erityksen stimuloijia. Annok-35 set, jotka ovat välillä noin 20 nanogrammaa - noin 25 mik- 20 8 7 O o Ö rogrammaa, ruumiinpainon kiloa kohti, on havaittu tehokkaiksi .

Edelleen koe osoittaa, että muissa esimerkeissä syntetisoiduilla synteettisillä hpGRF-analogeilla on oleellis-5 ta tehoa, ja tästä kokeesta voidaan tehdä joitakin yleisiä j ohtopäätöksiä: 1. C-päätteen amidointi ei näytä kasvattavan GRF-peptidien, joiden ketjunpituus on yli 39 jäännöstä, aktiivisuutta, mutta se kasvattaa 39 jäännöstä lyhyempien pepti-10 dien tehokkuutta. Esimerkiksi [ Ile27]-hpGRF( 1-32)-NH2 on tehokkaampi kuin [Ile27] -hpGRF( 1-32 )-0H; [D-Tyr1,Nle27]-hpGRF( 1-32 )-0H; ja [Ile27]-hpGRF( 1-29 )-NH2 on tehokkaampi kuin [Ile27] -hpGRF( 1-29 )-0H. Kuitenkin [Ile27]-hpGRF( 1-44)-NH2 on yhtä tehokas kuin [Ile27]-hpGRF( 1-44)-0H.

15 2. Amidoitujen peptidien sarjassa analogit, joissa on 32 jäännöstä, ovat oleellisesti yhtä tehokkaita kuin vastaavat pitemmät analogit; esimerkiksi [Nle27]-hpGRF( 1-32)-NH2 on suunnilleen yhtä vahva kuin [Nle27] -hpGRF( 1-44)-NH2.

20 3. Peptidien sarjassa, joilla on vapaa karboksipää- te, vastaavat analogit, joissa on yli 39 jäännöstä, ovat yhtä tehokkaita. Esimerkiksi [Vai27]-hpGRF(1-40)-0H ja [Vai27]-hpGRF(1-44)-0H ovat yhtä tehokkaita, kuten ovat [D-Tyr1, Nle27]-hpGRF( 1-40 )-0H ja [D-Tyr1, Nle27] -hpGRF( 1-44 )-25 OH.

Synteettisten hpGRF-analogien pitäisi olla hyödyllisiä sovellutuksissa, joissa lääkäri haluaa nostaa GH:n tuotantoa. GH-erityksen stimulointi hpGRF-analogeilla on tärkeää potilailla, joilla on täydellinen tai suhteellinen GH-30 puutos, jonka aiheuttaa endogeenisen GRF:n alituotanto. Edelleen on luultavaa, että lisääntynyttä GH:n eritystä ja siihen liittyvää kasvun lisäystä voitaisiin saada aikaan ihmisissä tai eläimissä, joiden GH-määrät ovat normaalit. Edelleen hpGRF-annostuksen pitäisi muuttaa ruumiin rasva-35 sisältöä ja modifioida muita GH:sta riippuvia metabolisia, 2i 87080

Immunologisia ja kehitysprosesseja. Esimerkiksi hpGRF-ana-logit voivat olla hyödyllisiä keinona stimuloida anabolisia prosesseja ihmisissä sellaisissa olosuhteissa kuin palohaavojen saamisessa. Toisessa esimerkissä hpGRF-analogeja voi-5 daan annostella kaupallisiin eläimiin, kuten kananpoikiin, kalkkunoihin, sikoihin, vuohiin, nautakarjaan ja lampaisiin kasvun lisäämiseksi ja proteiinin suhteen kasvattamiseksi rasvaan nähden. Niitä voidaan käyttää vesiviljelyssä kalojen ja muiden kylmäveristen vesieläinten, esimerkiksi meri-10 kilpikonnien ja ankeriaiden ja sammakkoeläinten kasvatuksessa. Ihmiselle annostettaessa synteettisen hpGRF-analo-gien puhtauden pitäisi olla vähintään noin 93% ja edullisesti vähintään 98%. Tämä puhtaus tarkoittaa, että haluttu peptidi käsittää mainitun paino-%:n kaikista läsnäolevista 15 samankaltaisista peptideistä ja peptidifragmenteista.

Synteettisten hpGRF-analogien antamiseksi kaupallisille tai muille eläimille kasvun lisäämiseksi ja rasvapitoisuuden vähentämiseksi jopa vain noin 5% tai jopa vain 0,001% puhtaus voidaan hyväksyä.

20 Synteettisiä hpGRF-analogeja tai niiden myrkyttömiä suoloja yhdistettyinä farmaseuttisesti tai eläinlääketieteellisestä hyväksyttävään kantaja-aineeseen farmaseuttisen yhdistelmän muodostamiseksi, voidaan annostella eläimiin, mukaan lukien ihmiset, joko suonensisäisesti, subkutaanis-25 ti, intramuskulaarisesti, intranasaalisesti tai oraalisesti. Annostamisen voi suorittaa lääkäri GH:n vapautumisen stimuloimiseksi, kun käsiteltävä potilas tarvitsee sellaista terapeuttista käsittelyä. Vaadittava annos vaihtelee . . kyseisten käsittelyolosuhteiden mukaan, tilan vakavuuden 30 mukaan ja halutun käsittelyn kestoajan mukaan.

Sellaisia peptidejä annostetaan usein farmaseuttisesti tai eläinlääketieteellisten myrkyttömien suolojen muodossa, kuten happoadditiosuoloina tai metallikompleksei-na esim. sinkin, raudan tms. kanssa (joita pidetään suoloi-35 na tämän sovellutuksen tarkoituksissa). Esimerkkejä tällai-

22 870SP

sista happoadditiosuoloista ovat vetykloridi, vetybromidi, sulfaatti, fosfaatti, maleaatti, asetaatti, sitraatti, bentsoaatti, sukkinaatti, malaatti, askorbaatti, tartraatti jne. Jos aktiivinen aineosa on annettava suun kautta tab-5 lettimuodossa, tabletti voi sisältää sitoja-aineen, kuten tragantti, maissitärkkelys tai gelatiini; desintegrointiai-neen, kuten algiinihappo; ja voiteluaineen, kuten magne-siumstearaatti. Jos annostus halutaan suorittaa nestemuodossa, makeutus- ja/tai makuainetta voidaan käyttää ja suo-10 nensisäisessä annostuksessa voidaan käyttää isotonista suolaliuosta, fosfaattipuskuriliuoksia tms.

Peptidit pitäisi annostaa ihmisiin lääkärin valvonnassa, ja farmaseuttiset yhdistelmät sisältävät tavallisesti peptidiä yhdessä tavanomaisen farmaseuttisesti hyväksyt-15 tävän kantaja-aineen kanssa. Parenteraalinen annostus on tavallisesti välillä 20 nanogrammaa - noin 25 mikrogrammaa peptidiä/kg ruumiinpainoa.

Vaikka keksintöä on kuvattu edullisien toteutusten suhteen, jotka käsittävät parhaan keksijöiden tietämän mal-20 Iin, olisi ymmärrettävä, että erilaiset muutokset ja modifioinnit voidaan suorittaa. Esimerkiksi modifiointeja pep-tidiketjussa, erityisesti poistamisissa alkaen peptidin karboksyylipäästä, voidaan tehdä tunnettujen tämän päivän käytäntöjen mukaisesti fragmenttien valmistamiseksi, jotka 25 säilyttävät kaikki tai hyvin oleelliset osuudet peptidin tehosta. Lisäksi voidaan tehdä lisäyksiä jompaankumpaan päätteeseen tai molempiin ja/tai yleisesti ekvivalentteja jäännöksiä voidaan korvata luonnossa esiintyvillä jäännöksillä, kuten on tunnettua peptidikemian alalla, analo-30 gien tuottamiseksi, joilla on ainakin oleellinen osuus alkuperäisen polypeptidin tehosta.

Claims (10)

23 87080

1. Menetelmä farmaseuttisesti aktiivisten peptidien valmistamiseksi, joilla on kaava (I): 5 H-R1-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-R8-Ser-R10-Arg-R12-R13-Leu-R15- Gln-Leu-R18-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-R24-R25-Ile-R27-R28-Arg-Gln- Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Arg-Ser-Arg-Phe-Asn-Y 10 jossa R2 on Tyr, D-Tyr, Phe, Leu, D-His tai His; R8 on Ser tai Asn; R10 on Tyr, Phe tai D-Tyr; R12 on Arg tai Lys; R13 on Ile tai Vai; R15 on Gly tai D-Ala; R10 on Tyr tai Ser; R24 on His tai Gin; R25 on Glu tai Asp; R27 on D-Met, Met, Nle, Ile tai Vai; R28 on Ser tai Asn; ja Y on -OH tai -NH2, edel-15 lyttäen kuitenkin, että joko (a) R27 on Ile, Vai, Nle tai D-Met; tai (b) R: on D-Tyr, His, Phe tai D-His; tai (c) R10 on Phe tai D-Tyr; tai (d) R28 on Asn; tai (e) R„ on Ser, R12 on Arg, R13 on Ile, R18 on Tyr, R24 on His, R25 on Glu ja R28 on Asn; ja edellyttäen myöskin, että korkeintaan 16 C-20 päätteen aminohappoa saattaa puuttua; tunnettu siitä, että (a) muodostetaan peptidivälituote, jossa on vähintään yksi suoj aava ryhmä j a kaava (II):

25 X1-R1(X tai X2)-Ala-Asp(X3)-Ala-Ile-Phe-Thr(X4)-R8(X4 tai X5)- Ser(X4)-R10( X2) -Arg( X6)-R12(X6 tai X7)-R13-Leu-R15-Gln( X5 )-Leu-R18( X2)-Ala-Arg- (X6) -Lys (X7) -Leu-Leu-R24( X tai X5) -R25( X3) -Ile-R27-R2e(X4 tai X5) -Arg- (X6) -Gln( X5) -Gln( X5) -Gly-Glu( X3) -Arg-(X6) -Asn(X5) -Gin(X5) -Glu (X3) -Gin(X5) - Arg (X6) -Ser (X4 ) - Arg (X6) -30 Phe-Asn(X5)-X9 tai C-päätteestä tarkoituksen mukaisesti lyhennetty muunnos siitä; jossa X1 on vety tai α-amino-suojaava ryhmä, X on vety tai 35 suojaava ryhmä His:n imidatsolitypelle, X2 on vety tai suo- 24 8 7 0 8 0 jaava ryhmä Tyr:n fenolihydroksyyliryhmälle; X3 on vety tai suojaava ryhmä Asp:n tai Glu:n karboksyyliryhmälle; X4 on vety tai suojaava ryhmä Ser:n tai Thr:n alkoholihydroksyy-liryhmälle; X5 on vety tai suojaava ryhmä Asn:n tai Gin:n 5 sivuketjun amidoryhmälle; X6 on vety tai suojaava ryhmä Arg:n guanidinoryhmälle; X7 on vety tai suojaava ryhmä Lys-:n sivuketjun aminoryhmälle; ja X9 on -0-CH2-hartsikantaja tai NH-hartsikantaja, kytkemällä jokainen aminohappo, jonka α-aminoryhmä ainakin on tarkoituksenmukaisesti suojattu 10 suhteessa noin 1-2 millimoolia suojattua aminohappoa grammaa sopivassa liuottimessa olevaa hartsia kohti ja (b) poistetaan suojaavat ryhmät ja peptidi lohkaistaan hartsi-kantajasta käyttämällä TFA:ta sopivassa liuottimessa, minkä jälkeen käytetään HF ja anisolia tai metyylietyylisul-15 fidia tai niiden seosta alhaisessa lämpötilassa ja sitten peptidi liuotetaan sopivaan liuottimeen ja puhdistetaan tunnetuilla menetelmillä.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että R27 on Nle.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että Rj on His.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että R! on Tyr.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n-25 n e t t u siitä, että Rx on D-Tyr.

6. Patenttivaatimuksen 1 tai 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että R10 on D-Tyr.

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että peptidi on rhGRF(1-43)-OH.

8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että peptidi on [Nle27]-rhGRF( 1-29 )-NH2.

9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että peptidi on [Nle27]-hpGRF( 1-32)-NH2.

10. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 35 tunnettu siitä, että peptidi on [Nle27]-rhGRF( 1-32 )-NH2. 25 87080