JPS61115098A - ポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は次のアミノ酸配列を有するポリペプ本ペプチド
は成長ホルモン放出因子（ｇｒｏｗｔｈｈｏｒｍｏｎｅ
　ｒｅｌｅａｓｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ　＋　ＧＲＦ）の
短鎖ペプチド誘導体である。

本ペプチドはＧＲＦと同様強い成長ホルモン分泌促進作
用を有することから、小人症等種々の成長ホルモン欠乏
症に有効であるばかシか、抗潰瘍剤、創傷の治療剤等と
しての利用も考えられ、医薬品として極めて有用である
〇 さらに本ペプチドはヒトばかりでなく種々の動物に対し
ても成長ホルモン分泌促進作用を有することよシ商用動
物における成長速度および成長度合の増大、商用動物に
おけるミルク収率の増加に有用である。

本ペプチドの製造法については既に固相法を用いる方法
が知られている（Ｎａｔｕｒｅ、８００．２７６（１９
８２））、　　Ｌかしながら一般に固相法の場合得られ
るペプチドの純度は低く最終工程での精製は容易ではな
く多くの困難を伴う。また大量合成が必要であるペプチ
ドの工業的製造法としても同相法は適当でない。

一方、液相法ではステップワイズ法とフラグメント縮合
法があるが、ステップワイズ法は、生成物の精製が困難
である等、固相法と同様の欠点を有することから７ヲグ
メント縮合法が最も望ましい。しかしながらフラグメン
ト縮合を行なう場合、多くのフラグメントの組み合せの
中からどのようにフラグメントを選択するかが重要な課
題となる。

本発明者らはペプチドフラグメントの溶媒に対する溶解
性、ペプチドフラグメントの反応性および生成物の精製
法等について種々検討し、ポリペプチド■を下記６個の
ペプチド７ラグメン）　（１）〜■に分けて合成し、そ
の後ペプチドフラグメント（工）から順次縮合させるこ
とが最も効率的であることを見出し、本発明を完成した
のである。

ペプチドフラグメント　（Ｉ） Ｌｅｕ−Ｇ１　ｎ−Ａｓ　ｐ−Ｉ　１　ｅ−Ｍｅ　を８
＠ｒ−Ａｒ　ｇ−ＮＨ２ベグチドフラグメント　（Ｊｌ
ｌＡ ｌ　ａ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕペ プチドフラグメント　（２） Ｇｌｙ−Ｇｉｎ−Ｌｅｕ−８ｅｒ ペプチドフラグメント　（Ｉｖ） Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｖａ　１−Ｌｅｕ ペプチドフラグメント　Ｍ Ｔｈｒ−Ａｓｎ−８ｅｒ−Ｔｙｒ ペプチドフラグメント　（財） Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−１）ｅ−Ｐｈｅ（式
中グリ７ンを除くすべてのアミノ酸はＬ体を表わす）即
ち本発明は保護基を有するペプチドフラグメント（Ｉ）
と保護基を有するペプチドフラグメン）　（ｆｔｌ　ｔ
　１ｍ合させ組合物を得、次いでこの組合物と保護基を
有するペプチドフラグメント（２）と縮合させる。以下
順次保護基を有するペプチドフラグメン）　（ｆｆｌ　
、　（Ｖ）　、および（２）を縮合させた後、脱保護す
ることを特徴とする高純度ポリペプチド−の製造法であ
る。） 本発明では、縮合方法としては、例えばアジド法、酸化
還元法、ジフェニルホヌホリルアジド法、ジシクロへキ
シルカルボジイミド（ＤＣＣ）＋添加物（Ｎ−ヒドロキ
ンコハク酸イミド、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール
、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，８−シカ〜
ポキシイミド等）法等、ラセミ化を起こさない方法が用
いられるが、アジド法が最も好ましい。

保護基の除去法としては、通常ペプチド合成分野で使用
される方法、例えばトリフルオロ酢酸法、メタ７スルホ
ン酸法、トリフルオロメタンヌＡ／　ホン酸法、フッ化
水素法、液体アンモニア−ナトリウム法等が適用される
。

本発明において用いられる保護基としては、アミノ酸の
アミノ基には例えばトシル基、ベンジルオキシカルボニ
ル基、第８級ブチルオキシカルボニル基、トリチル基、
ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル基、ホルミル ルオロアセチμ基等、またアミノ酸の力ρボキシρ基の
保護には例えばメチルエステル、エチルエステル、イソ
プロピルエステル、第８級ブチルエステル等の低級アル
キルエステルおよびベンジルエステル、ｐ−メトキシベ
ンジルエスチル、ｐ−ニトロベンジルエステル等のアラ
ルキルエステル等、ペプチド合成分野で通常使用されて
いる保護基をあげることができる０またセリン、スレオ
ニン、チロシンなどの水酸基の保護は必ずしも必須でな
いが、要すれば例えばアセチル基、ベンジル基、ベンジ
ルオキ７カルボニル基、第８級ブチμ基等、通常の水酸
基保護基によ−て保護することができるＯアルギニンの
グアニド基の保護には、例えばニトロ基、トシル基、ベ
ンジルオキシカルボ二μ基、アダマンチルオキシカルボ
二〜基、インポルニルオキシカルボニμ基、メシチレン
−２−スルホ二／Ｉ／基等を用いることができる。メチ
オニンは要すればスルホキシトとして保護することも可
能である。

本発明によって製造されるポリペプチド（資）のＭＷは
例えばイオン交換樹脂、分配クロマトグラフィー、ゲル
クロマトグラフィー、逆相型液体クロマトグラフィー等
、ペプチド化学の分野で通常用いられる方法を単独Ｋま
たは組み合わせて用いることによって行なうことができ
る０上記のごとく製造された高純度ポリペプチド罎は、
ラットを用いたインビボ（ｉｎ　ｖｉｖｏ）試験および
ラットの下垂体細胞を用いたインビトロ（ｉｎ　ｖｉｔ
ｒｏ）試験において強い成長ホルモン放出作用を示した
。

なお、本発明におけるベデチドフフグメント（Ｉ）〜尚
の合成については通常のペプチド合成法に従って行なう
ことができる０ 以下実施例をあけて本発明をさらに具体的に説明する。

なお、用いたアミノ酸はグリシンを除き、いずれもＬ型
の吃のであり、アミノ酸の略号は一般の用法に従い英字
名のはじめの８字で表わしている◇（例外としてＡｓｂ
−７７７＜ヲギン、Ｇ１ｎ＝グルタミン）その他の略号
は次に示すとおりであるＯＰＭＺ　：　ｐ−メトキシベ
ンジルオキシカルボニＡへＢｏａ：をプチルオキシカル
ポニρ、Ｍｔｓ：メシチレンー２−スルフオニＡ／、Ｏ
Ｎｐ：ｐ−ニトロフェノ−〜エステ／Ｌ’、８ｚ１：ベ
ンジＡｚ、Ｏ８ｕ：Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエヌ
テ１ノー・−５２ニベンジＡ／オキシカ／Ｌ−う１トζ
二／Ｌ／、ＴＦＡ　　ニトリフロロ酢酸、ＭｅＯＨ：エ
チルアルコール、ＥｔｌＮ：）リエチμアミン、ＴＨＦ
　：テトラヒドロフラン、ＥｔＯＨ：エチルアルコール
、ＤＭＦ　：　ジメチ〜ホルムア↓ド、ＤＭＳＯニジメ
チルスルフオキシド、ＩＡＮ：亜硝酸イソアミル、Ａｅ
ＯＮＨｌ：酢酸アンモニウム またＲｆ値はシリカゲ）Ｖ　（メルり社製キーゼルゲ二
■６０Ｆ２８４）上の薄層クロマドグ・ラフイ（ＴＬＣ
）にて下記混合溶媒を用いて測定したものであるＯＲｆ
、：クロロホルムーメタノール＝５＝１Ｒｆ２：クロロ
ホルム−メタノール−酢酸＝４：１：０．５Ｒｆ、：ク
ロロホルムーメタノールー水＝８：３：１参考例１ ＢｏＣ−Ｌｅｕ−Ｇｉｎ−Ａｓｐ（＋Ｂｚｌ　）−１）
ｅ−Ｍｅｔ（Ｏ）−８ｅｔ（Ｂｚｌ）−Ａｒｇ（Ｍｔｓ
　）−ＮＨ２（化合物Ｆ）の製造（１）Ｂｏａ−８ｓｒ
（Ｂｚｌ　）−Ａｒｇ（Ｍｔｓ）−ＮＨ！（化合物Ａ）
の製造ＰＭＺ−Ａｒｇ（Ｍｔ　ｓ　）−ＮＨ，５２，Ｏ
ｆをアニソール５０ｍｊｌ、塩化メチレン３００ｍＪの
混合液に溶解し、水冷下２０分間ＴＦＡ　２５０ｍＪＩ
にて処理し、溶媒を濃縮後、１−ヘキサンを１！加え、
上層を捨て、更にｎ−へキサンを５００ｍｊ加え、上層
を捨てる０下層をエーテルで粉末とした後戸取し、乾燥
し脱ＰＭＺ化物を得る。次にこの粉末をＴＨＦ２００ｍ
ｊに溶解しＮ−メチルピペリジン１）．８ｒｒｌで中和
する〇一方Ｂｏｃ−８ｅｒ（Ｂｚｌ　）−ＯＨ８８，１
ｆをＴＨＦ５００ｍＪに溶解し一１８℃にてクロル炭酸
イソブチル１４．８ｍＪとＮ−メチルピペリジン１２．
９ｍｌを加え混合酸無水物とする０この溶液に上記脱Ｐ
ＭＺ化物を含むＴＨＦ溶液を冷却したものを−１８〜−
１８℃にて滴下し、−１５℃にて１時間攪拌した後徐々
に室温に戻し、２４時部槽拌する。反応液を濃縮し残渣
に酢酸エチ／Ｉ／１．４Ｉと水１）を加え分液する。上
層を５％炭酸水素ナトリウム水、５％クエン酸水、飽和
食塩水の順に洗浄し硫酸マグネシウムにて乾燥後溶媒を
留去しｎ−ヘキサン５００ｍｊを加え再度溶媒を留去し
、得られた残渣を細かく砕つ覧・？・。

く０エーアＩＶ　５００　ｍｌを加え８０〜３５℃に温
め軟化後冷却して固化させ、ガラス棒で細かく砕いた後
戸取してエーテル洗浄し乾燥する。

収量５７．５９　（９０，９％）　　Ｒｆ、＝０．７１
融点９４−１）４℃　Ｃ’ｌｌ　　＋　１．１　（Ｃ＝
　１　、　ＭｅＯＨ）元素分析（Ｃ７ｎＨ１ｉＯｒＮｇ
Ｓとして）計算値ＨＣ５６，９４，Ｈ７，０１，Ｎ１８
．２８．Ｓ５．０７定測ｔｆＬｅ／ａ　　Ｃ５６，７７
、Ｈ７，１９，Ｎ１２．９７．Ｓ５．００（２）Ｈｏｅ
−ＭｅｔｆＯ）−８ｅｔ（Ｂｚｌ）−Ａｒｇ（Ｍｔｓ）
−ＮＨ２（化合物Ｂ）の製造 化合物Ａ５５．７Ｆを塩化メチレン１７６ｍＪに溶解し
、水冷下ＴＦＡ１７６ｍｊを加え、室温３０分攪拌し、
ｆｇ媒を留去した後、ｎ−ヘキサンを２００　ｍＡ加え
再び留去し、エーテルで粉末千μピペリジン１０．２　
ｍＡで中和する〇一方Ｈｏｅ−Ｍｅ　ｔ（０）−ＯＨ２
５，５ｆ　ｔ　ＴＨＦ’　２６０　ｍｌに溶解し、＝１
８℃にてクロル炭酸イソブチ１ｖ１２．４ｍＪとＮ−メ
チルピペリジン１）．８ｍＪを加えて混合酸無水物とす
る０この溶液に上記脱Ｂｏａ化物を含むＴＨＦ溶液を冷
却したものを−１８−１８℃にて滴下し、自然昇温させ
ながら３時間攪拌する０反応液を濃縮し酢酸エチ）ｖ２
．５Ａと水１４を加え分液し上層を５％炭酸水素ナトリ
ウム水、５％クエン酸水、水の順に洗浄し、溶媒を留去
し、残渣にＥｔＯＨを加え共沸脱水する。−夜減圧乾燥
しＭ　ｅ　ＯＨに溶解後、ａＭ４し、残渣に酢酸エチル
を１８０ｍＪ加え、攪拌下エーテル１．８ｇを加え結晶
化するＯ結晶をｐ取、エーテル洗浄し乾燥する０ 収ｉ　　６１．０ｆ（８８，８％）　　Ｒｆ、＝０．５
２融点１０４〜１）７℃　（”１Ｄ−５，５（Ｃ＝１．
ＭｅＯＨ）元素分析（Ｃ８５鵬、Ｏ，Ｎ、Ｓ、として）
計算値ｅ／ａＣ５８，９０，Ｈ６，８５，Ｎ１２．５７
．Ｓ８．２２実測値ｅ／Ｉ　　Ｃ５８，６０，Ｈ７，０
４，Ｎ１２．８８．Ｓ７．７９（３１Ｂｏａ−４１ｓ−
Ｍｅｔ（Ｏ）−８ｅｒ（Ｂｚｌ）−Ａｒｇ（Ｍｔｓ）−
ＮＨ，（化合物Ｃ）の製造 化合物Ｂ５９．９５Ｆを塩化メチレン２００ｍＪに溶解
し、水冷下ＴＦＡ２００ｍＪを加え、室温８０分攪拌し
、溶媒を留去し、ｎ−ヘキサン２００ｍＩＪを加えて再
び留去し、エーテルで粉末とし゛た後Ｐ取乾燥し脱Ｒｏ
ｅ化物を得る０次にこの粉末をＤＭＦ２００ｍｊに溶解
しＥｔ、Ｎ　１０．７　ｍｌで中和する。この溶液にＢ
ｏ　ｃ−Ｉ　１　＠−０８ｕ　２７．７　ｆを加えＥｔ
、Ｎで弱アルカリ性（ｐＨ７〜８）に保ち、室温で２４
時間攪拌する。反応液を５％クエン酸氷水２１５℃以下
で滴下し結晶化する。結晶を戸数し、水、エータμの順
に洗浄して乾燥し粗結晶を得る。

粗結晶を乳鉢で細かく砕き、酢酸エチル６００ｍｊに懸
濁し２０分間攪拌後、戸数し乾燥する。収量６１．４　
ｆ　（８９，５％’）　Ｒｆ、＝０．５２融点１５７−
１６１℃＠Ｄ−７，：Ｉｔ（Ｃ＝１、ＤＭＦ　）元素分
析（Ｃ４□ａＳ４Ｏ＋。Ｎ、Ｓ、として）計算値ｅ／ｌ
　　Ｃ５５，１４，Ｈ７，２２，Ｎ１２．５５．Ｓ７．
１８実測値％　Ｃ５５，０７、Ｈ７，８Ｂ　、Ｎ１２．
６２　、　Ｓ７．１０（４１ＢｏＣ−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ
）−ＩＩｓ−ＭｓｔＩｏ）−８ｓｒ（Ｂｚｌ）−Ａｒｇ
（Ｍｔｓ）−ＮＨ、（化合物Ｄ）の製造 化合物Ｃ６０，５Ｆを塩化メチレン８５０ｍＪＫ懸濁し
、水冷下ＴＦＡ８００ｍＪを加え、室温で３０分柑拌し
た後溶媒を留去し、ｎ−ヘキサン５００ｍ１を加え再び
留去し、エーテルで粉末とじた後戸数乾燥し脱Ｂｏａ化
物を得る０次にこの粉末をＤＭＦ９００ｍＪに溶解しＥ
ｔ、Ｎ９．４ｍＪで中和する。この溶液にＢｃｅ−Ａｓ
ｐ（ＯＢｚｌ　）−０Ｓｕ　８１．８　ｆを加えＥｔ、
Ｎで弱アルカリ性（ｐＨ７〜８）に保ち室温で２４時間
攪拌する。反応液を５％クエン酸氷水４ノ５℃以下で滴
下し結晶化する。Ｐ取し水、エーテルの順に洗浄し乾燥
し粗結晶を得る。粗結晶を酢酸エチ／Ｌ’　６００　ｍ
ｌに懸濁し４０℃にて８０分間橙拌し戸数乾燥する０収
賦７１．８　？　（９５，９％）　Ｒｆ、＝０．５０融
点１７６−１７９℃＠Ｄ−１０．８　（Ｃ＝　１、ＤＭ
Ｆ’　）元素分析（ＣｓｔＨｔｓＯｓｓＮ＊Ｓ２’Ｈ２
０として）計算値（至）　Ｃ５５，９５、Ｈ６，９５、
Ｎｌ　１．２９　、Ｓ５．７４実測値Ｐ／ＪＣ５５，９
０，Ｈ６，８２，Ｎ１）．２７．Ｓ５．７４（５）　　
　Ｂｏｃ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）−１）ｅ−Ｍｅ
ｔ（Ｏ）−８ｅｔ（Ｂｚ、１）　−Ａｒｇ（Ｍｔｓ　）
−ＮＨ２（化合物Ｅ）の製造化合物Ｄ　７０．３　Ｆを
塩化メチレン８００ｒｒ＋ｊ！に懸濁し、水冷下ＴＦＡ
２５０ｍＪを加え、室温で３０分攪拌し、溶媒を留去し
、ｎ−ヘキサン５００ｍノを加え再びｒ媒を留去しエー
テルで粉末とした後ｐ取乾燥し脱Ｂｏａ化物を得る０次
にこの粉末をＤＭＦ５１０ｒｒｌとＤＭＳＯ５０ｍＪの
混合液に溶解しＥｔ、Ｎ８ｆ１ｍＪで中和する０　この
溶液にＢ　ｏ　ｃ−Ｇ　１　ｎ−０Ｎｐ　２５，９　ｆ
を加えＥｔ３Ｎで弱アルカリ性（ｐＨ７〜８）に保ち室
温で２４時間攪拌する０反応液を５％クエン酸氷水２１
５℃以下で滴下し結晶化する。戸数し水、エーテルの順
に洗浄し乾燥し粗結晶を得る０粗結晶をＥｔＯＨ７５０
ｍＪ　Ｋ懸濁し４０℃で８０分間攪拌しｐ取乾燥する。

収量７２．３　？　（９２，１％）Ｒｆ、＝０．４４融
点１９７−１９９℃＠Ｄ−１０，８（Ｃ＝１、ＤＭＳＯ
） 元素分析（Ｃ５ｆＨ８３０１）Ｎ１）　ｓ、４Ｈ，ｏと
して）計算値％　Ｃ５５，４１，Ｈ６，８５，Ｎ１２．
４７．Ｓ５．１９実測値ｅ／Ｉ　　Ｃ５５，４５，Ｈ６
，８１，Ｎ１２．４８．Ｓ５．４９（６）　　Ｂｏａ−
Ｌｅｕ−Ｇｉｎ−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）−１）ｅ−Ｍｅｔ
■）−８ｅｔ（Ｂｚｌ　）−Ａｒｇ（Ｍｔｓ）−ＮＨ２
（化合物Ｆ）の製造化合物Ｅ７１．４Ｆを塩化メチレン
８５０ｍｌに懸濁し、氷冷下ＴＦＡ８００ｍＪを加え室
温で８０分攪拌し、溶媒を留去し、塩化メチレン８５０
ｍＪを加え再び溶媒を留去し、エーテルで粉末とした後
戸数乾燥し、脱Ｂｏｃ化物を得る０次にこの粉末をＤＭ
Ｆ４００ｍＪ　、ＤＭＳ０１５０ｍｊの混液 合物に溶解し氷冷下Ｂｏａ−Ｌａｕ−Ｏ８ｕ　２２．９
　ｆのＤＭＦ５０ｍＪ溶液を加えＥｔ、Ｎ８．１ｍｊで
中和しＥｔ、Ｎで弱アルカリ性（ｐＨ７〜８）に保ち室
温で２４時間攪拌する。反応液を５％クエン酸氷水４ｊ
１０℃で滴下し結晶化する。結晶をＦ取し水、エーテル
の順に洗浄した後乾燥し粗結晶を得る〇粗結晶を酢酸エ
チ／Ｉ／　７５０ｎｓＪに懸濁し、室温で８０分間攪拌
した後Ｆ取して乾燥する０次にＥｔＯＨ７２０ｍｊに懸
濁し、室温で８０分間撹拌しｐ取乾燥する◇　収量６８
．５Ｆ（８７，９％）Ｒｆ、±０．４６融点２２０−２
２２℃同一１０．７　（Ｃ電１、ＤＭＳＯ） 元素分析（ＣｓｓＬ４０＋ｓＮ、ｔ　Ｓｔとして）計算
値ｔＡＣ５６，４９，Ｈ７，０７，Ｎ１２．５５．Ｓ４
．７９実測Ｉｌ［％　Ｃ５６，８０，Ｎ７．０８．Ｎ１
２．４５．Ｓ４．５８実施例１ （１）　　　ＰＭＺ−Ａｌａ−Ａｒｇ（Ｍｔｓ）−Ｌｙ
ｅ）−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｉｎ−Ａｓｐ（ＯＢｚ　ｌ　
）−１）ｅ　−Ｍｅ　ｔ（０）−８ｓ　ｒ　（Ｂｚ　ｌ
　）−Ａｒｇ（Ｍｔ　ｓ　）−ＮＨ，（化合物Ｇ）の製
造 化合物Ｆ４６．９Ｆを塩化メチレン２８０ｍ１に懸濁し
、室温で１時間ＴＦＡ２３０ｍＪ！にて処理し、エーテ
ルで粉本とした後ｐ取乾燥し脱Ｈｏｅ化物を得る０ 次にこの粉末をＤＭＦ２８０ｍＪに溶かしＥｔ３Ｎ８０
．５ｍｌで中和するσ　一方、 ＰＭＺ　−Ａ　１　ａ　−Ａｒ　ｇ（Ｍｔ　ａ　）−Ｌ
：ｖ　５（Ｚ）−Ｌｅ　ｕ−ＮＨＮＨ２３６，１ｙをＤ
ＭＦ　１８０．５ｍＪに溶解し一２０℃にて４．４２規
定塩酸−ＤＭＦ溶液１８．２　ｍ　ｌとＩＡＮ５．４ｍ
Ｊｉを加えることによりアジドとし、Ｅ　ｔ　３Ｎ　１
０．４　ｍ　ｊで中和する。この溶液を前記の脱ＢｏＣ
化物を含むＤＭＦ溶液に加え、液性を弱アルカリ性（ｐ
Ｈ７〜８）として、−５℃にで２４時間伶拝する０反応
後ｆｇ液を酢酸で中性とした後、溶媒を濃縮し１２．５
１の水へ滴下して析出した粉末’ｅ　ＩＰ取し、水、ア
セトンの順に洗浄後ＤＭＦ／ＭｅＯＨより再沈殿する。

収ｆｉ６１−３Ｆ（８０，０％）Ｒｆ、＝ｏ、５７　、
　ＦｉＡ点２５２−２５８℃、（ロ）ｌ）−１７，９（
Ｃ＝１、ゐ ＤＭＳＯ）　　畳素分析（Ｃ□。鳥１２０２７Ｎ２□Ｓ
、として）計算値ｅ’ａ　　Ｃ５７，６２，Ｈ６，９１
，Ｎ１２．８０．８４．４０実測ｆｉｅ／ａＣ５７，５
２，Ｎ７．００．Ｎ１２．６４．Ｓ４．３１（２１ＰＭ
Ｚ−Ｇ１３Ｆ−ＧＩＰ−Ｌｅｕ−８ｅをＡｌａ−Ａｒｇ
（Ｍｔｓ）−Ｌｙｓ（Ｚ）−Ｌｅ　ｕ−Ｌｅ　ｕ−Ｇｌ
　ｎ−Ａｓ　ｐ　（ＯＢｚ　ｌ　）−Ｉ　１　ｅ　−Ｍ
ｅ　ｔＥ）−８ｅ　ｒ（Ｈｚ　ｌ）−Ａｒｇ（Ｍｔｓ　
）−ＮＨ２（化合物Ｈ）の製造化合物Ｇ　６０．２　ｆ
をアニソ−／Ｓ１５５ｍｊ　　と塩化メチレン２７５ｍ
１の混合液ＫＷｓ濁し、水冷下１時間ｊＦＡ２７５ｍＪ
にて処理し、エーテルでＣイｂ 粉末とした後ｐ取乾燥し、脱Ｂａ物を得る０次にこの粉
末をＤＭＳＯ４００ｒｒＪとＤＭＦ６００ｍｊの混合液
に溶解しＥｔ　！Ｎ　８．１　ｍｌで中和する〇一方。

ＰＭＺ−Ｇｌ　ｙ−Ｇｌ　ｎ−Ｌｅ　ｕ−８ｏ　ｒ−Ｎ
ＨＮＨ，２０，８ｆ　をＤＭＦ　８４０ｍｌに溶解し、
−２０℃にて４．４２規定塩酸−ＤＭＦ溶液１７．８ｍ
ｌとＩＡＮ５．３ｒ、ｇを加えることによりアジドとし
Ｅｔ、Ｎ　７．９６ｍＪで中和する。仁の溶液を前記の
脱ＰＭＺ化物を含むＤＭＦ−ＤＭＳＯ溶液に加え液性を
弱アルカ’）　（ｐＨ７〜８）とじて−５℃にて２４時
間攪拌する。反応後溶液を酢酸で中性とした後溶媒を濃
縮し水４Ｊに加えると粉末が析出する。これを戸数し水
、酢酸エチルの順に洗浄後、ＭｅＯＨ９００ｍｊに懸濁
し、８０分間攪拌し、戸数、乾燥し粗結晶を得る。

粗結晶をアセトン−水４：１（マ／マ）ＩＩに懸濁し１
時間攪拌しｐ取、アセトン洗浄して乾燥する。収量６４
．８　？　（９０，８％）Ｒｆ　、　＝０．４５　、融
点２６７−２６９℃、〔べ’−１８，０（Ｃ；１、ＤＭ
ＳＯ） 元素分析　（Ｃｔｔｔ　Ｈ、ｔｔ　０３、Ｎ、、Ｓ、−
Ｈ，０として）計算値ｆＡＣ５６，０７，Ｈ６，９６，
Ｎ１８．５１．Ｓ８．７１実測値ｅ／ｉ　　Ｃ５６，１
２，Ｈ６，９０，Ｎ１８．５６．８８．６６（３１ＰＭ
Ｚ−Ａｒｇ（Ｍｔｓ）−Ｌｙｓ（Ｚ）−Ｖａｌ−Ｌｓｕ
−Ｇｌｙ−Ｇｉｎ−Ｌａｕ−８ｅｒ−Ａｌａ−Ａｒｇ（
Ｍｔａ）−Ｌｙｓ（Ｚ）−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｉｎ−Ａ
ｓｐ（−ｅｌ、Ｂｚ　ｌ　）−Ｉ　１　ｅ　−Ｍｅ　ｔ
（０）−８ｓ　ｒ　（Ｂｚ　１　）−Ａｒｇ（Ｍｔ　ｓ
　）−ＮＨ，（化合物Ｉ）の製造 化合物Ｈ４１，２Ｆをアニソ−ＩＶ　４０　ｍｌと塩点 化メチレン２００ｍｊの混合１７ＫＭ濁し、水冷下１時
間ＴＦＡ２００ｍＪにて処理し、エーテルで粉末とした
後ｐ取乾燥し脱Ｂｏａ化物を得る。次にこの粉末をＤＭ
ＳＯ８２０ｍＪとＤＭＦ６４０ｒｒｌの混合液に溶解し
Ｅｔ、Ｎ　２．５ｍＪで中和する。

一方ＰＭＺ−Ａｒｇ（Ｍｔｓ）−Ｌｙｓ（Ｚ）−Ｖａｌ
−Ｌｅｕ−ＮＨＮＨ２１８，＃をＤＭＦ１６０ｍｊに溶
解し一２０℃にて４．４２規定塩酸−〇ＭＦ溶液９．２
　ｍＪとＩＡＮ２．７ｍＪを加えることによジアジドと
しＥｔ、Ｎ　５．９　ｍＪで中和する。

この溶液を前記の脱ＰＭＺ化物を含むＤＭＦ・ＤＭＳ　
Ｏ溶液に加え液性を弱アルカリ性（ｐＨ７〜８）として
−５℃にて２４時間攪拌する。反応後溶液を酢酸で中性
とした後溶媒を濃縮し水３Ｉに加えると粉末が析出する
。これを戸数し、水洗後酢酸エチ／Ｌ’ｌＪにｍ濁し１
時間攪拌した後戸数して乾燥し粗結晶を得る。粗結晶を
アセトン−水４　：　１　（ｖ／ｖ）　７５０ｍ１に懸
濁し５０℃２０分間役拌した後戸数してアセトン洗浄し
乾燥する。収ｆｆ１４５．９ｒ（８４，７％）Ｒｆ　ｓ
　＝０．４９　、融点２７９−２８０Ｃｒ！ｘＪＤ−１
４，８（Ｃ＝１、ＤＭＳＯ） 元素分析　（Ｃ＋５ｌＨｕｔ　Ｏｓ＊Ｎｚｓ　Ｓ４・Ｈ
，Ｏとして）計算値ｅ／ａ　　Ｃ＋５６．７９　Ｈ＋７
．０８　Ｎ＋１８．５７Ｓ　＋　８．７７ 実測ｆｉｌｅ／ｉ　　　Ｃ，５６，５６Ｈ１７，０１Ｎ
ｉ１８．４２Ｓ　ｉ　３．８９ （４１ＰＭＺ−Ｔｈｒ−ＡＩＩｎ−８ａｒ−Ｔｙｒ−Ａ
ｒｇ（Ｍｔｓ）−Ｌｙｓ（Ｚ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌ
ｙ−Ｇｉｎ−Ｌｅｕ−８ｅｒ−ＡｌをＡｒｇ（Ｍｔｓ　
）−Ｌｙｓ（Ｚｌ−Ｌｅｕ−Ｌ＠ｕ−Ｇｌ　ｎ−Ａｓ　
ｐ　（ｇＢｚ　ｌ　）−Ｉ　１　ｅ−Ｍｅ　ｔ　（４）
−８ｅ　ｔ（Ｂｚｌ）−Ａｒｇ（Ｍｔａ）−ＮＨ，（化
合物Ｊ）の製造化合物Ｉ８８．６Ｆをアニソ−／’　２
７　ｍｌ、　ｉ化メチレンｔａｓｍｌの混合液に懸濁し
、水冷下１０分間ＴＦＡ１３５ｍＪｆにて処理しｎ−ヘ
キサン１．８ｊを加え、上層を捨て下層をエーテｐで粉
本とした後粉本を戸数して乾燥し脱ＢＯＣ化物を得る・
次にこの粉末をＤＭＳｏ　２００ｍＪとＤＭＦ　４００
ｍＪの混合液に溶解しＥｔ、Ｎ　１．９ｍＪで中和する
〇一方ＰＰ１ｌｌＺ−Ｔｈ　ｒ−Ａｓ　ｎ−８ｅ　ｒ−
Ｔｙ　ｒ−ＮＨＮＨ。

１０．６　ｆをＤＭＦ２００ｍｊｌに〆解し、−２０℃
にて４．４２規定塩酸−ＤＭＦ溶液８．６７ｍＪとＩ　
ＡＮ　２．６　ｍｌを加えることによりアジドとしＥｔ
ｓＮ　５．８　ｍｌで中和する。この溶液を前記の脱Ｐ
ＭＺ化物を含むＤＭＰ　−ＤＭＳ　Ｏ溶液に加え液性を
弱アルカリ性（ｐＨ７〜８）として−５℃にて２４時間
攪拌する。反応後溶液を酢酸で中性とした後溶媒を１９
縮し水８ｊに加えると粉末が析出する０これを戸数し水
洗後酢酸エチ１）１に懸濁し、１．５時間攪拌した後戸
数して乾燥し粗結晶を得る。粗結晶をアセトン−水４　
：　１　（ｖ／ｖ）４００ｍｌに懸濁し５０℃で１５分
間攪拌した後戸数してアセトン洗浄、乾燥する。収（ｔ
　８９．　Ｏｆ（８８，８％）　Ｒｆ、＝０．４６融点
２８８−２８４℃（ロ）Ｄ−ｉｏ、５（Ｃ＝１．ＤＭＳ
Ｏ） 計Ｘｆｆ１Ｐ／ａＣ，５６，８０Ｈ１６，９２Ｎｉ１８
．７８Ｓ　ｉ　８８．２１ 実測ｇＸｆＡＣ＋５６．０２　Ｈ＋６．８１　Ｎ＋１８
．８５３＋８８．０４ （５ＦＭＺ−Ｔｒｙ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−４１ｅ
−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ａｇｎ−８ｅｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ（
Ｍｔｓ）　−ＬｙｑＣＺ）−Ｖ＋［−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−
Ｇｉｎ−Ｌｅｕ−８ｅをＡｌ　をＡｒｇ（Ｍｔｓ　）−
Ｌｙｑ（Ｚ）−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌ　ｎ−Ａ　ｎ　ｏ
　（ｇＢｚ　１　）−４１ｅ−Ｍｅ　ｔ　（４−８ｅ　
ｔ　（Ｂｚ　１　）−Ａｒｇ（Ｍｔｓ）−ＮＨ，（化合
物Ｋ）の製造 化合物Ｊ　８７．８５１’をアニソ−ｌ　２８　ｍｌ、
塩化メチレン１４０ｍＪの混合液に懸濁し、水冷下１０
分間ＴＦＡ　１４０ｍ１にて処理しｎ込キサン１．４Ｉ
加え上層を捨て下層をエーテｐで粉末とした後粉末を戸
数して乾燥し脱Ｈｏｅ化物を得る。次にこの粉末をＤＭ
Ｆ８５０ｍｊに溶解しＥｔ、Ｎ　１．５ｍＪで中和する
〇一方ＰＭＺ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ａｇｐ−Ａｌａ−１）
ｅ−Ｐｈｅ−ＮＨＭＨ２１２，９ｆをＤＭＦ１４０ｍＪ
に溶解し一２０℃にて４．４２規定塩酸−ＤＭＦ　ｆｌ
！液７．ａ２ｍＪとＩＡＮ２、２　ｍＡを加えることに
よジアジドとしＥｔ、Ｎ４．７ｍＪで中和する。この溶
液を前記の脱ＰＭＺ化物を含むＤＭＦ　ｆｇ液に加え液
性を弱アルカリ性（ＰＨ７〜８）として−５℃にて２４
時間攪拌する。反応後溶液を酢酸で中性とした後溶媒を
濃縮し水３１に加えると粉末が析出する。

これをｐ取し水洗後酢酸エチ／ｌ／１）に懸濁し、１．
５時間攪拌した後戸数して乾燥し粗結晶を口 得る。粗結晶をＮｅＯＨ４６０ｍｌに懸濁し室温で３０
分間攪拌し戸数してＭｅＯＨ洗浄後乾燥する。

収ｆｆｉ　４８．７９　（９８，８％）Ｒｆ３　＝０．
８５　　融点２７？−２７９℃　［ａｌ、：’　−ｔ　
２．７　（Ｃ＝１．０１、ＤＭＳＯ） 元素分析　（Ｃ，１５Ｈ，、、Ｏ，、Ｎ４４Ｓ４−２Ｈ
，Ｏとして）計算ｔＭｒＡＣ＋５６．５１　Ｈ＋６．８
８　Ｎ＋１３．４９Ｓ　＋　２．８１ 実測値Ｐ／ａＣ＋５６．２２　Ｈ＋６．７１　Ｎ＋１８
．１４Ｓ　ｌ　２．６９ （６）　　ポリペプチド醐の製造 化合物に６ｒをアニサー／’９ｒｎｌとメチルエ戒 千ｐスルフィド１．５ｍｌの混合物に懸濁しドライアイ
ス／エタノール冷却下、フ？化水１６０ｍ１を加える。

−２００で８０分間、ついで０℃で１時間攪拌し、減圧
濃縮する０残済ＫＴＦＡ　６０ｍＪを加えて溶解しエー
テ／’６００ｍｊに滴下し結晶を析出させる◇これをグ
ラスファイバーＰ紙でｐ取しエーテル洗浄し乾燥する。

この結晶を水４００ｍｊＫ溶解し、Ｎ−メチルメルカプ
トアセタミド２２２を加え３７℃で３８時間攪拌する。

度応液へｎ−ゲタノーｐ４００ｍＪとＫ　ｔＯＨ５７ｍ
　ｌを加え１規定水酸化ナトリウム水でｐＨ９，０とし
８０分間ハシ拝する０上層を分液し減圧′ａ縮後後アセ
トニトリル００ｍＪを加え結晶化する。この粗結晶を１
％酢酸水に溶解し、逆相カラムクロマト（ＭＭＣ−ＧＥ
ＬＯＤＣＳ　１５／３０）　５０ｘ６００ｍに吸着させ
、水、０．１Ｍ　Ａｃｏｘ’Ｎｐａｓ、ｏ）　余の順で
洗浄後、３５％ア七トニトリ／Ｌ／−６５％０．１　Ｍ
　Ａｃ０ＮＨ４水（ｐＨ５，０）で溶出する。８〜８．
４１の溶出画分を集め儂細波、凍結乾燥する。水１００
ｍＪ加え凍結乾燥を２回繰り返す。収量１．５２Ｆ。こ
れを１％酢酸水５゛００ｍＪに溶解し、逆相カラムクロ
マト（ＹＭＣ−ＧＥＬＯＤＳＳ　１５／３０）５０Ｘ６
００ｍｍに吸着させ、１％酢酸水１）で洗浄後、２２％
アセト＝トＩｊｔｖ−７８％　１％酢酸水で溶出する。

７．５〜８Ｉの溶出画分を集めアセトニトリルを減圧濃
縮で除いた後凍結乾燥することにより目的とするホリペ
ブチド（ｖｌｌ、０６ｐを得る。

（ロ）　　−６７（Ｃ＝０．１　、Ｈ，Ｏ）実施例１に
よシ得られた化合物Ｇ−Ｋ及び最終物質ポリペプチド■
のアミノ酸分析値を第１表に示す。

第１表 ・化合物　Ｇ〜にの値は６規定塩酸加水分解によるもの
である。

・カッコ内は理論値

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）保護基を有するペプチドフラグメント（ I ）と
   保護基を有するペプチドフラグメント（II）を縮合させ
   、縮合物を得、次いでこの縮合物と保護基を有するペプ
   チドフラグメント（III）とを縮合させる。以下順次保
   護基を有するペプチドフラグメント（IV）、（Ｖ）およ
   び（VI）を縮合させた後、脱保護することを特徴とする
   次のアミノ酸配列を有するポリペプチド（VI）の製造法
   。 【アミノ酸配列があります】 （VI） ただし、ペプチドフラグメント（ I ）〜（VI）は次の
   式で表わされる。 ペプチドフラグメント（ I ） Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ａ
   ｒｇ−ＮＨ＿２ペプチドフラグメント（II） Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ ペプチドフラグメント（III） Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ ペプチドフラグメント（IV） Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ ペプチドフラグメント（Ｖ） Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ ペプチドフラグメント（VI） Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ（式
   中グリシンをのぞくすべてのアミノ酸 はＬ−体を表わす。）
2. （２）保護基を有するペプチドフラグメント（II）、（
   III）、（IV）、（Ｖ）および（VI）の縮合法としてア
   ジド法を用いる特許請求の範囲第１項記載のポリペプチ
   ド（VII）の製造法。